（遗传学专业论文）菊花再生体系的建立及ghereb2基因遗传转化的研究.pdf

摘要 菊花( c h r y s a n t h e m u mm o r i f o l i u mr a m a t ) 属菊科菊属，多年生草本植物，品种繁 多。茶菊( c h r y s a n t h e m u mm o r i f o l i u mc v c h a j u ) 是菊花中一种重要的药用品种，是河 南道地药材怀菊花的主栽品种之一。怀菊花栽培历史悠久，由于长期采用无性繁殖，致 使品种退化，对病害、干旱等因素的抗性减弱，培育对不良环境条件以及病虫害具有较 强抵抗力的品种是目前亟待解决的问题。g h e r e b 2 基因是从棉花体内提取的一种转录因 子基因，它能够调控p r 基因( p i t , p a t h o g e n s i sr e l a t e d ) ( 病原相关蛋白基因，如几丁质 酶基因、争l ，3 葡聚糖酶基因等) 和其它相关防御基因的表达，使植物对多种真菌病害 和非生物胁迫表现抗性。 本实验以菊花品种茶菊为实验材料，对茶菊的再生条件和转化体系进行了研究，并 用农杆菌介导g h e r e b 2 基因对茶菊进行遗传转化，旨在建立茶菊高效的再生体系及农 杆菌介导的转化体系，并获得具有对真菌病害及非生物胁迫具有广谱抗性的怀菊品种。 主要内容如下： ( 1 ) 利用茶菊的叶盘、茎段为外植体，在m s 培养基中添加不同浓度的6 - b a 和n a a ， 研究不同激素浓度配比对菊花直接再生不定芽和不定芽生根的影响。结果表明，诱导叶 盘、茎段直接再生不定芽的最适分化培养基分别是m s + 6 b a1 0m g l + n a a0 3m g l 和 m s + 6 - b a2 0m g l + n a a0 1m e j l ；不定芽在m s 、m s + n a a0 1 - 0 2m et , 、1 2m s + n a a o 1 o 2m g l 的生根培养基上生根率均可达到1 0 0 ；生根苗移栽成活率1 0 0 。优化了 茶菊再生条件，建立了茶菊叶盘和茎段的高效再生体系。 ( 2 ) 以叶盘为外植体，研究叶盘对潮霉素、头孢霉素的敏感性，确定转化过程中合 适的抗生素筛选压和抑菌浓度。结果表明，6m g l 潮霉素可抑制叶盘的分化，3m g l 潮霉素即可抑制小苗的生根。2 0 0m g l 的头孢唑啉钠对外植体分化再生影响很小，并可 有效抑制农杆菌再生，可以作为转化过程中的抑菌浓度。 ( 3 ) 利用农杆菌介导g h e r e b 2 基因对叶盘进行转化，研究转化过程中预培养时间、 a s 的添加方式、共培养时间、延迟筛选时间四个因素对转化率的影响。结果显示，侵 染时间采用8 1 0 分钟条件下，叶盘经预培养l 天，共培养2 3 天，在侵染液和共培养培 养基中添加1 0 0p m o l l 的乙酰丁香酮，延迟培养4 天，转化效率较高。叶盘经筛选培养 基m s + 6 一b a1 0m g l + n a ao 3m g l + c e f 2 0 0m g l + h y g6m g l 筛选培养，最后获得阳 性芽3 l 株，再把阳性芽转到生根培养基m s + n a ao 1m g l + h y g3m g l 上进行生根筛 选，获得1 1 株阳性植株；使用g h e r e b 2 和m g f p 5 基因引物对阳性植株进行p c r 扩增 检测，并对阳性植株叶肉细胞进行荧光检测，检测结果表明，有3 个植株中有目的基因 存在，初步证明了目的基因g h e r e b 2 导入并整合到茶菊基因组中。 关键词：茶菊，再生体系，根癌农杆菌，遗传转化，g h e r e b 2 基因 i i a b s t r a c t c h r y s a n t h e m u mm o r i f o l i u mr a m a t h a sm u l t i t u d i n o u sc u l t i v a r s c h r y s a n t h e m u mm o r i f o l i u m c c h a j u i s o n eo ft h e m , i ti st h em a i nc u l t i v a ro fg e n u i n em e d i c i n a lm a t e r i a l h u a ic h r y s a n t h e m u m m o r i f o l i u mr a m a t i nh e n a np r o v i n c e h u a ic h r y s a n t h e m u mm o r i f o l i u mr a m a t h a sal o n gp l a n t i n g h i s t o r y ，i t sr e s i s t a n c et od r o u g h ta n dd i a s e sh a sr e d u c e db e c a u s eo fa s e x u a lr e p r o d u c t i o nf o rl o n gt i m e t h eu r g e n tt a s ki st oo b t a i nn e wv a r i e t i e sw h i c hc a nr e s i s te n v i r o n m e n t a ls t r e s sa n dd i s e a s e s t r a n s c r i p t i o n f a c t o rg e n eg h e r e b 2w a sc l o n e df r o mc o t t o n , i tc a nr e g u l a t et h ee x p r e s s i o no fp rg e n eo gg e n e ： p a t h o g e n s i sr e l a t e dg e n e ，s u c ha sc h i t i n a s ea n dp l ，3 g i u c a n a s eg e n e s ) a n do t h e rp l a n td e f e n s eg e n e s ，a n d a l s oe n h a n c et h e i rr e s i s t a n c et o 删d i s e a s e sa n da b i o t i cs t r e s s t h i se x p e r i m e n tc h o s e sc h r y s a n t h e m u mm o r i f o l i u mc v c h a j u a sm a t e r i a lt os t u d yr e g e n e r a t i o n s y s t e ma n dt h es e n s i t i v i t yo fl e a fe x p l a n t st oh y g r o m y c i na n d c e f a l e x i n b a s e do nt h er e g e n e r a t i o ns y s t e m a n ds e n s i t i v i t yt oa n t i b i o t i c s ，g h e r e b 2 g e n ew a st r a n s f e r r e dt oc h r y s a n t h e m u mm e d i a t e db y a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s t h eo b j e c t i v e so ft h i ss t u d ya r et oe s t a b l i s ha ne f f i c i e n tr e g e n e r a t i o ns y s t e m a n dg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o ns y s t e m ，a n da l s ot oo b t a i nt r a n s f o r m e dp l a n t sw h i c hc a nr e s i s tt of u n g a ld i s e a s e s a n da b i o t i cs t r e s s t h em a j o rc o n t e n t sa r ef o l l o w i n g ： ( 1 ) b o t hl e a fa n ds t e me x p l a n t so fc h r y s a n t h e m u mm o r i f o l i u m c v c h a j u a 糟u s e dt oi n d u c e a d v e n t i t i o u ss h o o t s r e g e n e r a t i o ni nt h i sr e s e a r c h t h ee f f e c t so fm u r a s h i g e & s k o o gb a s a lm e d i u mw i t h d i f f e r e n th o r m o n e sp r o p o r t i o nt ot h er e g e n e r a t i o no fs h o o t sa n dr o o t sw e r es t u d i e d t h er e s u l t si n d i c a t et h a t , t h eo p t i m u mm e d i u mf o rl e a fa n ds t e me x p l a n t sc o n t a i n sm s + 6 - b a1 0m g l + n a a0 3m g la n d m s + 6 b a2 0m g l + n a a0 1m g l ，r e s p e c t i v e l y t h es h o o t sa r ee a s yt or o o tw i t har o o t i n ge f f i c i e n c yo f 1 0 0 o nm s ，m s + n a ao 1 0 2m g la n d1 2m s + n a a0 1 - 0 2m g l t h ep l a n t l e t ss u r v i v ea t a f r e q u e n c yo f10 0 w h e nt h e ya r et r a n s p l a n t e d ah i g h - e f f i c i e n c yr e g e n e r a t i o ns y s t e mh a sb e e n e s t a b l i s h e d ( 2 ) b a s e do nt h er e g e n e r a t i o ns y s t e m ，t h es e n s i t i v ec o n c e n t r a t i o n s t oh y g r o m y c i na n dc e f a l e x i nw e r e t e s t e df o rl e a fd i s c so fc h r y s a n t h e m u m ，t h er e s u l t ss h o wt h a t , h y g r o m y c i na t6m g li nt h em e d i u mg i v e s e f f e c t i v ei n h i b i t i o nt ot h er e g e n e r a t i o no fs h o o t sf r o mt h el e a fe x p l a n t s i na d d i t i o n , h y g r o m y c i na t3m g l i nt h em e d i u mo b v i o u s l yi n h i b i t st h er e g e n e r a t i o no fr o o t sf r o mt h es h o o t s ；c e f a l e x i na t2 0 0m g lc a n i i i o b v i o u s l yi n h i b i tt h eg r o w t ho f a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s ，b u tg i v e sl i t t l ei n h i b i t i o nt ot h er e g e n e r a t i o no f l e a fd i s c s c e f a l e x i na t2 0 0m g li st h e a p p r o p r i a t ec o n c e n t r a t i o ni ng e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n ( 3 ) m e d i a t e db ya g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s , g h e r e b 2g e n ew a st r a n s f e r r e di nl e a fe x p l a n t so f c h r y s a n t h e m u mi no r d e rt os t u d yt h ee f f e c t so ff o u rf a c t o r st ot h et r a n s f o r m a t i o nf r e q u e n c ys u c h 弱 p r e - c u l t u r et i m e ，a d d - w a yo fa s ，c o - c u l t u r et i m e ，d e l a y - s e l e c t i o nt i m e w h e nt h el e a fd i s c sw e r ei n f e c t e d w i t ha g r o b a c t e r i u mf o r8 10m i n u t e s ，t h eg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o nr a t ew a st h el l i g h e s tw h e nt h ee x p l a n t s w e r ep r e - e u l t u r e df o r1d a y , c o - c u l t i v a t e dw i t ha g r o b a c t e r i u mf o r2 - 3d a y s ，1 0 0l a m o l f ba ss u p p l e m e n t e d i nb o t ht h ei n f e c t - m e d i u ma n dc o - c u l t i v a t em e d i u m s ，d e l a y s e l e c t e df o r4d a y s a f t e rs e l e c t e do nt h e m e d i u mm s + 6 - b a1 0m g l + n a a0 3m g l + c e f2 0 0m g l + h y g6m g l ，31 h y g - r e s i s t a n tc l u s t e rs h o o t s w e r eo b t a i n e df r o mt h ei n f e c t e de x p l a n t s t h e s es h o o t sr o o t e do nm e d i u mm s + n a a0 1 m g l + h y g3 m g l ，ii h y g - r e s i s t a n tp l a n t s w e r ed i f f e r e n t i a t e d f i n a l l y p c ra n a l y s i s o ft h et r a n s g e n i c p l a n t s d e m o n s t r a t e dt h a t3w e r ep o s i t i v e t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tg h e r e b 2g e n eh a di n t e g r a t e di n t ot h e k e y w o r d s ：c h r y s a n t h e m u mm o r i f o l i u mc v c h a j u ，r e g e n e r a t i o ns y s t e m , a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s ， g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n , g h e r e b 2g e n e i v 缩略语表( a b b r e v i a t i o n ) v 独创性声明和论文使用授权说明 独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河南师范大学或其他教育机构的学位或证书 所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示了谢意。 签名：碰日期：至璺里2 ：堑：至签名：蔓丛j 土 日期：兰竺里z ：鱼：! 关于论文使用授权的说明 本人完全了解河南师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权河南师 范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 日期： 3 结果与分析 3 1 茶菊再生体系的建立 3 1 1 叶盘诱导不定芽分化 3 结果与分析 研究茶菊叶盘的最适分化条件时，设计了1 3 种不同浓度6 - b a 和n a a 的组合，分 化结果如表3 1 。比较1 3 种培养基上外植体的生长情况发现，在没有激素的m s 上叶盘 不能分化( 图3 1 ) ，最后褐化死亡；只添加n a a 的培养基上叶盘直接长出许多根，但 没有不定芽和愈伤产生；只有6 b a 的培养基上，叶盘也不能分化。 表3 1 不同激素组合对叶盘不定芽分化的影响 t a b 3 - 1e f f e c t so fd i f f e r e n th o r m o n e sp r o p o r t i o n0 1 1a d v e n t i t i o u ss h o o t sr e g e n e r a t i o n 兰量竺三：竺兰：接种外植体数( 个)分化外植体数( 个) 6 b an a a 芽再生频率 ( ) 只有在添加有6 - b a 和n a a 的培养基上，才能分化出愈伤组织或不定芽。这些叶 盘第一周表现为略微变黄，膨大加厚，叶缘切口处尤其叶柄附近形成点状愈伤，n a a 为lm g l 以上时，叶盘只表现为愈伤生长，不分化出丛生芽，在m s + 6 b a1 0m g l + n a a 2 0m g l 上诱导的愈伤组织长势最好( 图3 - 2 ) ；其它各个组合两周后均陆续有芽点出 现，并逐渐长成丛生芽，不定芽生长正常。在附加6 - b a1 0m g l + n a a0 3m g l 的培养 菊花再生体系的建立及g h e r e b 2 基因遗传转化的研究 基上诱导的不定芽长势最好，数量最多( 图3 - 3 ) 。故诱导叶盘直接分化的最适培养基 为m s + 6 - b a l 0 m 叽j 十n a ao 3 m g l 。 图3 - l 叶盘在m s 上的生长情况 f 追3 1l e a f d i 虻s o n m s 田f i 9 3 。3 2 - 2 叶c 盘a l i 诱a s 三n d 的u 愈c e d 伤f r 组o m 景e a f d i s e s il 圉3 - 3 叶盘诱导的不定芽 3 1 2 茎段诱导不定芽分化 以不同浓度的6 - b a 和n a a 组合1 0 组研究茎段的最适分化条件，结果见表3 - 2 。 茎段接种一周后，切口处开始膨大，形成的愈伤组织较松散，3 周后在愈伤组织上出现 嫩绿色芽点，并逐渐长出不定芽，形成从生小苗。其中在培养基6 - b a2 0m g l + n a a0l m g l 上茎段分化率最高，丛生芽数量最多，长势最好( 图3 4 ) 。在n a a 较多的培养 基上也只表现为愈伤生长，其中在培养基m s + 6 - b a1 0m g l + n a a2 0m 牡上诱导的 愈伤组织长势最好( 图3 5 ) 。茎段诱导不定芽与叶盘诱导不定芽相比，茎段分化率比 叶盘低，茎段每个外植体分化的芽数量也比叶盘低，而且在培养过程中很容易出现玻璃 化苗。所以在遗传转化时叶盘优于茎段。 ! 堕墨量笠堑 表，0 不同激蠢组合对茶蔫茎段不定芽分化影响 t a b3 - 2 e 疗b 出o f d i f f e r e n t h o r m o n e s p - o m r d o n o l i a d v e m i t i o u ss h o o t s 嘣卿哪6 蛐 竺兰兰! ! 竺竺：接种外置体数( 个)分化外植体敷( 个) 芽再生频翠 6 _ b an a a( ) ，嚣_ 慧怒黧黜。 f i o ms t e me x p l a n t s 3 l 3 不定芽生根 田3 - 5 茎段诱导的意伤组织 f i g3 - 5 c a l l u s j n d u g e d f r o ms t e me x p l a a t s 在实验设计的5 种培养基上，不定芽均能生根，生根情况见表3 3 。接种一周后均开 始有根生成，两周后试管苗生根数不再增加。相比之下，m s 培养基上生根晚，根细长， 无根毛；附加有n a a 的4 种培养基上根数量相差不大，均比m s 培养基上多且根粗壮， 有丰富的根毛。 由此可见，茶菊容易生根，附加较低浓度n a a 的培养基均适合其生根培养。芽在培 养基m s + n a ao1m 班上的生根情况如图3 - 6 。 菊花再生体系的建立及g h e r e b 2 基因遗传转化的研究 表3 3 不同培养基对不定芽生根的影响( 单位：m g 儿) t a b3 3 e f i e c t s o f d i f f e r e n tn l e d i u m so nr o o t i n g o f a d v e m i t i o u ss h o o t s 培养基种类接种幼芽数平均生根数 生根率根生长状况 图3 7 茶菊的移栽 f i g3 - 7 t r a n s p l a n t i n g o f c 掣甜踟m 堋c u l t i v a r c h q u 3 结果与分析 3 2 茶菊对抗生素的敏感性试验 3 2 1 潮霉素对叶盘分化不定芽的影响 为了确定在选择时所使用的h y g 浓度，有效淘汰非转化植株，同时避免过高浓度对 叶盘造成伤害影响不定芽再生，实验中选用2 0 天左右苗龄的叶片为外植体，观察不同 浓度h y g 浓度对叶盘分化的影响，实验结果见表3 4 ，图3 8 。 从表3 4 、图3 8 可知，茶菊叶盘对潮霉素比较敏感，随着h y g 浓度的增加，对叶 盘的伤害逐渐加重。对照组整个叶盘绿色，每个叶盘上都有大量不定芽出现，芽生长旺 盛，长势良好；但添加3m g l 潮霉素后，叶盘的再生能力急剧下降，每个叶盘上很多 区域黄化死亡，外植体保持绿色的区域有芽点再生，芽点数目少且长势很慢，再生率 5 3 3 ，；当潮霉素浓度为6m g l 时，多数叶盘白化死亡，少数叶盘部分区域保持绿色， 即使分化出少量芽点形成，继续培养也不能正常生长，最后死亡：潮霉素浓度增加到1 0 啦皿以上时，外植体伤害程度加深，再生率为0 ，叶盘白化死亡，边缘褐化。因此采用 6m e , l 的潮霉素作为转化时叶盘分化不定芽的筛选浓度。 表3 _ 4 不同浓度潮霉素对卧盘再生不定芽的影晌 t a b 3 - 4e f f e c t so f h y g r o m y c i na td i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so ni n d u c t i o no fa d v e n t i t i o u ss h o o t sf r o ml e a f d i s c s 菊花再生体系的建立及g h e r e b 2 基田遗传转化的研究 潮霉素浓度( r a g l ) ：0 图3 - 8 潮霉素对叶盘分化不定芽的影响 f 培3 - 8 e f f e c l s o f h y g r o m y c i no l l i n d u c t i o n o f a d v e m h i o u ss h o o t s f r o m l e a f d i 虻s 3 22 潮霉素对幼苗生根的影响 为了确定h y g 在生根时的筛选浓度，有效地淘汰假阳性植株，降低后期检测的工 作量，将未转化的茶菊不定芽分别接种到添加有不同浓度的h y g 生根培养基m s + n a a 0 1m 以上，观察不定芽的生根情况。实验结果见表3 - 5 ，图3 - 9 。 衰3 - 5 不同浓度潮霉素对无菌苗生根的影响 潮霉素度f r o g l ) 接种数生根的不定芽数生根率( )檀株的生长状态 3 6 1 0 1 5 3 0 3 0 3 0 3 0 3 0 小苗黄化，部分保持绿色 小曲黄化，极少区域绿色 植株内化死亡 植株白化死亡 植株白化死亡 潮霉素浓度( r a g l ) ：0 l o1 52 0 田3 - 9 潮霉素对不定芽生根的影响 f i g 3 - 9 e f f e c t s o f h y g m m y c i n o nr o o t i n g o f a d v e a f i t i o u ss h o o b 由表3 - 5 、图3 - 9 可知，小苗生根对潮霉素非常敏感，不定芽在对照组上长势旺盛， 生根良好。潮霉素浓度为3m g l 时，不定芽即不能生根，而且小苗不能正常生长，逐 渐黄化枯萎。潮霉素浓度继续增高，小苗整个植株白化死亡，甚至褐化。因此，3m 扎 的潮霉素可以作为抗性芽在生根筛选时的选择浓度。 3 2 3 头孢霉素对茶菊叶盘分化不定芽的影响 为了确定头孢霉素抑菌的适宜浓度，对头孢霉素影响茶菊叶盘分化不定芽的情况 进行了研究。结果发现，两种头孢霉素对茶菊叶盘的分化差别很大。头孢曲松钠对茶菊 叶盘有着强烈的抑制作用，各个浓度培养过程中外植体翘起；1 0 0 m g l 时6 0 的叶盘有 芽再生，分化的外植体上芽数量比对照组少；2 0 0m g l 时，外植体边缘褐化，3 7 6 的 叶盘有芽再生，分化的外植体上再生的芽数很少，再生率很低；3 0 0m g l 和4 0 0m g l 时叶盘边缘褐化严重，无芽再生。因此茶菊的转化中不采用头孢曲松钠做抑菌剂。而不 同浓度的头孢唑啉钠对外植体的影响差别较大，1 0 0m g l 的头孢唑啉钠能够促进叶盘的 分化，不定芽长势旺盛，每个叶盘上芽数较多；3 0 0m g l 时外植体的分化率仍然高达 8 3 3 并且芽长势良好，数目较多；4 0 0 m g l 时外植体的分化率下降为5 3 3 ( 表3 - 6 ， 图3 - 1 0 ) 。 菊花再生体系的建立及g h e r e b 2 基因遗传转化的研究 表3 不同浓度的头孢霉囊对叶盘分化不定芽的影响 t a b3 e f f e c t s o f d i 旋r e n t c e f c o n c e n i r a l i o no n f o r m a t i o n o f a d v e n t i t i o u ss h o o t s f r o m i e a f e x p l a i n s 抗生素及浓度接种叶盘分化出芽的叶分化率( )生长状态 ( m g ，l ) 数 盘数 03 03 01 0 0 不定芽生k 旺盛 头孢曲松钠1 0 0 头孢曲松钠2 0 0 头孢曲松钠3 0 0 头孢曲松钠4 0 0 头孢唑啉钠1 0 0 头孢唑啉钠2 0 0 头孢唑啉钠3 0 0 头孢唑啉钠4 0 0 3 0 3 0 1 8 1 1 叶盘翘起，不定芽生长较慢 叶盘卷曲翘起，边缘褐化，芽数 很少 叶盘卷曲，边缘褐化，无不定芽 形成 叶盘卷曲，褐化加重无不定芽 形成 不定芽生长旺盛，不定芽数较多 不定芽生长良好，不定芽教较多 不定芽长势良好 不定芽长势良好 抗生素浓度( m 肌) 0头孢曲松钠1 0 0头孢曲松钠2 0 0 头孢曲松钠3 0 0头孢曲松钠4 0 0头孢唑啉钠1 0 0 头孢唑啉钠2 0 0头孢唑啉钠3 0 0 头孢唑啉钠4 0 0 f l 一l如图3 。1 0 头孢霉素对u s 叶盘s h o 分0 30 e f i eo f c e f o n8 d v e n t i t o u ss h o o 化t sr 不e g 定e n 芽e r a 的t i o 髟n 响f i o m l e a f e x p l a n t sf l 一lc b1 e a f 印m 。 。 射鲫踟刚 0 0 凹罅 埘 加 如如孙 3 结果与分析 3 2 a 头孢唑啉钠抑菌浓度的确定 为观察头孢唑啉钠对农杆菌的抑制状况，在设计好的含头孢唑啉钠的培养基上培养 一周，观察外植体周围农杆菌的生长。结果见表3 _ 7 。图3 1 1 。 寰3 - 7 不同浓度的头孢唑啉钠对侵染叶盘的农杆菌的抑制效果 cef浓度0 1 0 02 0 03 0 0 4 0 0 ( m 叽) 实验结果表明，不加头孢唑咻钠，农杆菌生长旺盛，每个叶盘周围都有大量农杆菌 滋生：c e f 浓度为1 0 0 m g l 时3 6 7 的叶盘周围有农杆菌生长，生长数量也较对照组少； c d 浓度为2 g o 1 0 0 血叽时，叶盘周围没有农杆菌生长，能效抑制农杆菌的生长结合 c o l 对菊花叶盘分化再生的试验结果，应选用能够有效抑制农杆菌生长而对外植体分化 影响最小的抗生素浓度。因此选择2 0 0m g l 的头孢唑啉钠作为转化中的抑菌浓度。 头孢霉素浓度( l 叽 3 0 04 0 0 图3 - l l 头孢唑啉钠对农杆菌的抑制效果 f i g 3 - 1 1e f f e c t s o f c e f o n i n h i b i t i n g a g t o b a c t c d u m 菊花再生体系的建立及g h e r e b 2 基因遗传转化的研究 3 3 农杆菌介导的叶盘转化 3 3 1 预培养时间对转化的影响 一般认为，一定时间的预培养有利于提高外援基因的瞬时表达，可以促进细胞的分 裂，分裂状态的细胞更容易整合外援基因，对于植物是遗传转化具有重要意义。为了确 定茶菊遗传转化时最佳的预培养时间，结合其它菊花品种的预培养时间，设置了0 4 天 的实验变量。 表3 - 8 预培养时间对转化率的影响 t a b 3 8e f f e c t so fd i f f e r e n tp r e c u l t u r et i m eo nt r a n s f o r m a t i o nf r e q u e n c y 预培养时间( d )外植体数抗性芽数目 抗性芽诱导率( ) 实验结果( 表3 8 ) 发现，茶菊叶盘经预培养1 天抗性芽生成率最高，随着预培养 时间的延长，抗性芽再生率降低。这可能与外植体边缘的细胞开始修复，形成了一些小 分子酚类物质诱导农杆菌的v i r 基因表达，有利于t - d n a 的整合，提高了转化率。而预 培养时间继续延长，伤口开始愈合修复，使细胞不再敏感。抗性芽形成率降低。 3 3 2 共培养时间对转化的影响 外植体与农杆菌共培养的过程，外援基因开始向受体细胞转入并整合到受体细胞的 基因组，一般认为这至少需要1 6 小时以上。此次实验中共培养1 天，没有得到转化的 抗性苗，可能由于农杆菌增殖量太少。而共培养2 3 天具有较高的转化率，超过4 天， 农杆菌过度生长将叶盘包围，部分叶盘软腐死亡，使转化效率降低，由此可见，共培养 是怀菊花转化过程中不可缺少的环节，农杆菌转化茶菊最佳的共培养时间为2 3 天。 表3 - 9 共培养时间对转化率的影响 t a b 3 9e f f e c t so fd i f f e r e n tc o c u l t u r et i m eo nt r a n s f o r m a t i o nf r e q u e n c y 共培养时间( d ) 外植体数抗性芽数目抗性芽诱导率( ) 3 结果与分析 3 3 3a s 的添加方式对转化的影晌 乙酰丁香酮是一种酚类化合物，它可以活化n 质粒上v i r 区基因，有助于提高农杆 菌介导的转化率。实验结果( 表3 1 0 ) 表明：不添加a s ，没有抗性芽的形成，只在共 培养时加入与只在侵染液中加入效果基本相同；在侵染液和共培养培养基中同时添加的 处理方式转化率最高。 表3 1 0 乙酰丁香酮对转化率的影响 t a b 3 10e f f e c t so f a so nt r a n s f o r m a t i o n 3 3 4 延迟筛选时间对转化的影响 当外源基因进入受体细胞后，整合与表达及表达量的积累都需要有一个过程，因此 加入筛选压的时间及共培养后延迟多长时间进行筛选也将影响到转化率的高低。从表 3 1 1 可知，延迟筛选时间为o 天时，没有获得抗性芽，而2 8 天的共培养时间均有抗性 芽形成，可能是共培养结束后，不直接添加潮霉素可以使刚整合外源基因的细胞的生理 状态得到恢复，合成抗性物质，在随后的筛选中有更多存活的机会，从而提高转化率。 延迟筛选时间为4 8 天时抗性芽的诱导率变化不大，因此认为4 5 天的延迟筛选时间可 以获得较高的转化率。 表3 1 l 延迟筛选时间对转化率的影响 延迟筛选时间( d )外植体数抗性芽数抗性芽诱导率( ) 3 4 转基因植株的获得和鉴定 3 4 1 抗性芽的生根筛选 经过共培养、延迟筛选的叶盘在筛选培养基上开始分化，很多叶盘死亡，但有少数 3 5 菊花再生体系的建立及g h e r e b 2 基因遗传转化的研究 叶盘的边缘有不定芽形成，有些不定芽逐渐白化死亡，还有少数的不定芽能够始终保持 绿色，等这些抗性芽长到2c m 时，可将其转入含潮霉素的生根培养基中，部分抗性芽 能够生根，其余的则白化死亡。等生根筛选的抗性芽长到6c m 左右时，可以进行移栽 和检测。 图3 1 2 抗性筛选的阳性芽 f i g3 - 1 2 h y g - r c s i s t a n t s h 0 0 t s o ns e | e c t - m e d i u m 3 4 2 茶菊叶片基因组d n a 的电泳检测 所提取基因组d n a 的a 2 6 0 a 2 8 0 介于1 7 - 19 之间，纯度较高。电泳结果显示( 图 3 - 1 3 ) ，提取的茶菊基因组d n a 为大片段，是比较完整的d n a ，可以作为p c r 反应的 模板。 12 3 4567891 01 1 m 2 1 2 2 6 b p 圈3 1 3 茶菊叶片总d n a 的电泳图 f i g3 1 3 e l e c t r o p h o t e s i s o f t h e c h r y s a n t h e m 删g e n o m i c d n a f r o m l e a v e s m ；m a r k e r ( l a m b d a d n a i e e o r i + h i n d l l l l 片段大小为：2 1 2 2 6 5 1 4 8 4 9 7 3 4 2 6 8 ，3 5 3 0 2 0 2 7 1 9 0 4 ，1 5 8 4 ，1 3 7 5b p 1 - l i 为茶菊基因组d n a 3 4 3 转化植株的g h e r e b 2 基因的p c r 检测 对获得的抗性植株中目的基因g h e r e b 2 进行p c r 检测，结果有3 株扩增出7 5 0b p 的目的片段，结果初步证明g h e r e b 2 基因已经整合到菊花基因组d n a 中。部分阳性 ! 笪墨墨坌堑 植株的扩增产物电泳检测结果如图3 - 1 4 。 1 234567m 7 5 0 b p 1 2 0 0b p 8 0 0 b d 5 0 0 b p 2 0 0 b p 田3 - 1 4 湘霉囊抗性檀株g h e r e b 2 基园的p c r 幢测 m m a m - r ，从上到下依次是4 5 0 0 3 0 0 0 ，2 0 0 0 ，1 2 6 0 ，8 0 0 5 0 0 ，2 0 0 b p 1 ，4 5 转化的阳性檀株2 3 假阳性檀株，6 阳性对照，7 阴性对照 f i g3 - 1 4p e rd n 酬o f g h e r e b 2 咖e o f h y g - t e s i s t a n t t r a n s f o r m e d p l a n t s l a n e m ：d n a m a r k c r = l a n e1 , 4 5 h y g - t e s i s t a n t u n s f o m t e dp l a n = ；l a n e 2 , 3 t m t r a n s f o r m e dp l a n t s ； l a n e6p o s i t i v ec o n h o | ；l a n e 7 眦g 日t i v ec o n t r o l 3 4 4 转化植株的m g f p 5 基因的p c r 检测 对获得的抗性植株中标记基因m g f p 5 进行p c r 检测，结果有3 株扩增出7 3 0b p 的目的片段，结果初步证明m g f p 5 基因已经整合到菊花染色体基因组中。阳性植株的 扩增产物电泳检测结果如图3 一1 5 。 l2345m 7 3 0b p 1 2 0 0b p 8 0 0b p 5 0 0b p 2 0 0 b p 图3 - 1 5 潮霉素抗性植株m g f p 5 基因的p c r 检测 m ：m a r k e r 从上刘下依次是4 5 0 0 ，3 0 0 0 ，2 0 0 0 1 2 0 0 ，8 0 0 ，5 0 0 2 0 0b p i ，2 3 转化的阳性檀株一阴性对照。5 阳性对照 f i g3 - 1 5p c r d e t e c t i o n o f m g f p 5 9 e n eo f h y g - r e s i s t a n t t r a n s f o r m e d p l a n t s l a n e md n a m a r k e r ；l a n e l , 23 h y g - t e s i s t a m t r a n s f o r m e dp i 锄i s ；l a n e4n e g a t i v ec o n t r o l ；l a i l ( 15 p o s i t i v ec o n t r o l 菊花再生体系的建立及g h e r e b 2 基因遗传转化的研究 3 4 5m g f p 5 基因的在转化植株叶片中的表达检测 目的基因g h e p 也b 2 与g u s a 、m g f p 5 形成的是融合蛋白，检测g f p 基因的表 达比检测g u s a 基因的表达容易，对g f p 基因的表达进行检测，即可以说明问题。 图3 - 1 6 显示，转化植株的叶片分离出的细胞团在蓝光激发下发出绿色荧光，膜上有很 强的荧光激发。而未转化的植株的叶片的分离出的细胞团，由于叶绿素的存在激发出 暗红色的光。植株其它部分的表达情况未作观察。 - b 田3 - 1 6 m g f p 5 基因在叶内细胞中的裹达 a 未转化叶片的细胞发出的红色的荧光b 转化叶片的细胞发出的绿色荧光 f - 导3 1 6 m g f p 5e x p r e s s i o n i n t h ec e l l s o f u m s g e m e p l e a t s l e a f a c e l l s 丘岫l f o f i i 蛐n a n i g e i i j cs h o o t se m i t t e dr e d f l u o r e s c e a c e w h e n i r r a d i a t e d w i t h b l u e t i g h t b c e l i s f r o m l e a f o f a a n s g 矗l i cs h o o t se m i t t e d g r e e n f l u o r e 北e n c e w h e n i r r a d i a