（农产品加工及贮藏工程专业论文）美味牛肝菌发酵条件的优化及风味成分研究.pdf

摘要 美味牛肝菌是菌根菌中的一种，又名大脚菇，香味浓郁，味道鲜美，历来深受人 们的喜爱，在国内外均被广泛食用。目前该食用菌还不能完全人工栽培，野生产量还 远不能满足人们的需求。由于食用菌液态发酵可以在较短时间内获得大量菌丝体及其 发酵产物，在食用菌生产中具有广阔的应用前景。本文主要研究了响应曲面法优化美 味牛肝菌的液态发酵条件，在此基础上对美味牛肝菌子实体及发酵产物的风味物质组 分进行了探讨，主要研究结果如下： 本实验首先通过对美味牛肝菌生长的基础氮源、碳源、氮源及葵花籽油添加量的 单因子实验条件的优化，确定了美味牛肝菌发酵的最佳基础培养基，结果表明美味牛 肝菌发酵的最佳基础氮源是黄豆粉，碳源是麦芽糖，氮源是酵母膏，葵花籽油的添加 量为1 2 m l 1 。 通过对其发酵条件的单因子优化表明：在2 5 0 m l 三角瓶中美味牛肝菌的液态发酵 最适温度2 8 ，o h 6 0 ，转速1 8 0 r m i n ，装液量6 0 m 1 。 在单因子研究基础上选择麦芽糖、酵母膏和黄豆粉三个因子做通用旋转回归设计 实验。方程通过t 检验和f 检验，探讨了各因素间的交互作用。麦芽糖对菌丝体的生 成量影响最大，酵母膏次之。通过对模型方程求解得知，在主要因素分别为：麦芽糖 2 0 朗，酵母膏7 9 1 ，黄豆粉2 5 9 ，l 。其他因素为：葵花籽油添加量1 2 m l 1 ，最适温度2 8 ，p h 6 0 ，转速1 8 0 r m i n ，装液量6 0 m l ，k h 2 p 0 45g a ，m g s 0 4 7 h 2 03 9 a ，c a c 0 3 2 9 1 ，v b ll o m g n 。可获得最大的菌丝体生物量，预测为4 1 1 7 矿，方程的验证结果表 明该方程有很好的拟合性。 在对美味牛肝菌子实体的风味物质研究后发现，1 辛烯3 醇( 1 9 5 2 ) 、1 - 辛烯3 酮( 1 1 9 8 ) 和其他的八碳组分是美味牛肝菌子实体中的主要成分。经b 葡萄糖苷酶处 理的样品感观审评结果比未处理样品更圆润和柔和，b 葡萄糖苷酶酶解处理和未处理 的样品在5 水平上达到显著水平。在b 葡萄糖苷酶作用后的样品中有1 7 种新化合 物生成( 1 6 6 3 ) 。这表明b 葡萄糖苷酶对美味牛肝菌子实体有增香作用。 3 羟基一2 一丁酮( 9 5 1 5 ) 是美味牛肝菌发酵产物的主要风味组分。经酶作用后 新增的组分2 0 种，占总面积的3 3 6 。经酶水解的样品感观审评均更饱满、圆润 和柔和，其中美味牛肝菌深层发酵产物经b 葡萄糖苷酶作用后效果尤其显著，在1 水平上达到显著。这表明b - 葡萄糖苷酶对美味牛肝菌深层发酵产物有增香作用。 关键词：美味牛肝菌风味子实体发酵优化g c m s 响应曲面法限s m ) a b s t r a c t b o l e t u se d u l i s ，a ne e t o m y c o r r h i z a lf u n g u s ，a l s oc a l l e d d a j a n g u ；i ti s p o p u l a rw i t h p e o p l ea l lt h ew o r l df o rh e a v yf l a v o ra n dd e l i c i o u st e s f i n g u pt on o w , t h i sk i n do f m u s h r o o ms t i i ic a n ta r t i f i c i a lc n i t i v m i o n ，w h i c hm a d ew i l dm u s h r o o mp r o d u c t sc a n n o t m e e tp e o p l e sd e m a n d m u s h r o o ml i q u i df e r m e n t a t i o nc o u l dg e tl o t so fm y c e l i u ma n d f e r m e n t a t i o np r o d u c t s ，i t sh a sb r i g h ts u p p l y i n gp r o s p e c t i nt h i st h e s i s ，t h es u b m e r g e d f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sf o rb o 膪t u se d u l i sw e r eo p t i m i z e d b yu s i n gr e s p o n s es u r f a c e m e t h o d o l o g y ( r s m ) m e a n w h i l e ，t h ef l a v o rc o m p o n e n t si nt h ef r u i t i n gb o d i e sa n d f e r m e n t a t i o np r o d u c t so f b e d u l i sw e r ei n v e s t i g a t e d t h eo p t i m a lb a s a lm e d i u mw a so b t a i n e dt h r o u g ht h eo n e - f a c t o r - a t - a - t i m ep r o c e d u r e t h e o p t i m a ln i t r o g e ns o u r c e ，c a r b o ns o u r c e ，a n dn i t r o g e ns o u r c ew e r es o y b e a np o w d e r , m a l t o s e a n dy e a s te x t r a c t w i t ht h ea d d i t i o no f s u n f l o w e ro i la t1 2 m l 1 1 1 1 es i n g l e - f a c t o re x p e r i m e n t sr e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h eo p t i m a lt e m p e r a t u r ew a s 2 8 1 2 p h a t6 0 ，r o t a t i o ns p e e do f1 8 0 r r a i na n dt h eb r o t hc o n t e n to f 6 0 m li n2 5 0 m lf l a s k b a s e do nt h ef o r m a lr e s u l t s ，m a l t o s e ，s o y b e a np o w e ra n dy e a s te x t r a c tw e r ec h o s e n 鹤 t h ek e yf a c t o r st oo p t i m i z e db yr s m t h em o d e lw a so b t a i n e db yr e g r e s s i o no ft h e e x p e r i m e n t a lr e s u l t s t h ef i ts i g n i f i c a n to ft h em o d e lw a se v a l u a t e db yt - t e s ta n df - t e s t t h eo p t i m a lc o n d i t i o n sw g l ep r e d i c t e db yt h em o d e la sf o l l o w s ：m a l t o s e2 0 9 ，1 ，y e a s t e x t r a c t7 9 l ，s o y b e a np o w d e r2 5 妒，s u n f l o w e ro i l 1 2 m l l ，t e m p e r a t u r e2 8 c ，p h6 0 ， r o t a t i o ns p e e d18 0 r r a i n , b r o t hc o n t e n t6 0 m l ，k h 2 p 0 45 9 l ，m g s 0 4 7 h 2 03 9 l ，c a c o s2 9 a ， a n dv b ll o m g 1 t h em a x i m u mp r e d i c t e dy i e l do f m y c e l i ab i o m a s sw a s4 1 1 7 9 l ，w h i c h w a si ng o o da g r e e m e n tw i t ht h ee x p e r i m e n t a lv a l u e a r e rt h ei n v e s t i g a t i o no ft h ef l a v o rc o m p o n e n t s ，t h er e s u l t si n d i c m e dt h a t1 - o e t e n - 3 o l ( 1 9 5 2 ) ，1 - o c t e n - 3 - o n e ( 1 1 9 8 ) a n do t h e re i g h tc a r b o nc o m p o n e n t sw e r et h em a j o r v o l a t i l ec o m p o u n d si nd r y 丑e d u l i s t h es a m p l e st r e a t e dw i t hf l - g l u c o s i d a s ew e r eb e t t e r t h a nt h eu n t r e a t e do n e sb ys e n s o r ye v a l u a t i o nw i t ht h es i g n i f i c a n tl e v e la t5 1 7n e w c o m p o n e n t se m e r g e d ( 1 6 6 3 ) a f t e r f l - g l u c o s i d a s eh y d r o l y s i si n d i c a t i n gt h a t f l - g l u c o s i d a s e c o u l de n h a n c et h ef l a v o ro f m eb e d u l i s 3 - h y d r o x y - 2 b u t a n o n e ( 9 5 1 5 1i s t h em a i nf l a v o r c o m p o n e n ti n t h ef e r m e n t a t i o n p r o d u c t so f & e d u l i s a f t e r8 - g l u c o s i d a s eh y d r o l y s i s ，2 0n e wc o m p o n e n t se m e b e d a c c o u n t i n g3 3 6 o ft h et o t a lc o m p o n e n t s a l s o ，t h es a m p l e st r e a t e d 谢t h 毋g l u c o s i d a s e w e r eb e t t e rt h a nt h eu n t r e a t e do n e sb ys e n s o r ye v a l u a t i o nw i t ht h es i g n i f i c a n tl e v e la t1 t h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a tf l - g l u c o s i d a s ec o u l de n h a n c et h ef l a v o ro ft h ef i u i t i n gb o d i e s a n df e r m e n t a t i o np r o d u c t so f b e d u l i s k e yw o r d s ：b o & t 淞e d u l i s f l a v o r f i a f i t i n g b o d i e s f e r m e n t a t i o n o p t i m i z a t i o n c - c m s r e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y ( r s m ) l i 插图和附表清单 插图清单 图3 1l i k e n s - - n i c k e r s o n 同时蒸馏萃取装置1 9 图4 1 基础氮源对菌丝体生物量的影响2 1 图4 2 不同碳源对菌丝生物量的影响2 2 图4 - 3 不同氮源对美昧牛肝菌菌丝体生长的影响2 2 图4 4 葵花籽油添加量对美味牛肝菌菌丝体生物量的影响2 3 图4 - 5 不同温度对菌丝体生物量的影响2 4 图4 - 6 不同初始p h 值对美昧牛肝菌菌丝体生物量的影响2 4 图4 7 不同振荡速度对美昧牛肝菌菌丝生物量的影响2 5 图4 8 不同装液量对菌丝体生物量的影响2 5 图4 - 9 麦芽糖和酵母膏对菌丝体生物量交互影响效应的曲面图及其等高线2 8 图4 1 0 麦芽糖和黄豆粉对菌丝体生物量交互影响效应的曲面图及其等高线2 8 图4 1 1 酵母膏和黄豆粉对菌丝体生物量交互影响效应的曲面图及其等高线2 9 图4 1 2 美味牛肝菌发酵产物图f oo f o i 2 9 图4 1 3 美味牛肝菌未经伊葡萄糖苷酶酶解总离子流图3 4 图4 1 4 美味牛肝菌经伊葡萄糖苷酶酶解前后主要差异部分总离子流图3 5 图4 - 1 5 美味牛肝菌发酵产物及经伊葡萄糖苷酶作用的风味物质总离子流图3 5 附表清单 表3 - l 三因素五水平二次通用旋转回归设计因素水平编码表1 8 表4 1 三因素二次通用旋转回归设计实验结果处理表2 6 表4 2 检验结果2 7 表4 - 3 验证结果2 7 表4 - 4 美味牛肝菌及其发酵产物的定序实验结果3 0 表4 - 5 评价员，= 1 2 ，样品数为2 时的临界值3 1 表4 - 6 美味牛肝菌经蚤葡萄糖苷酶处理前后风味物质组分3 2 表4 - 7 美味牛肝菌发酵产物经1 3 葡萄糖苷酶处理前后风味物质组分3 6 v 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生虢一弘扯 时间：伽。7黾f 妇 关于论文使用授权的说明 本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：垄煞缅 时间：口哆年石月f ；同 第一导师签名：时间： o - ；年6 月f 伯 1 文献综述 菌根( m y c o r r h i z a ) 是自然界普遍存在的土壤真菌与绿色植物幼嫩的吸收根形成 的共生联合体。菌根分为三大主要类型：外生菌根( e c t o m y c o r r h i z a ) ，内生菌根 ( e n d o m y c o r r h i z a ) 和内外生菌根( e c t e n d o m y c o r r h i z a ) 。除此以外，还有混合菌根( m i x e d m y c o r r h i z a ) ，外围菌根( p c r t r o p h i em y c o r r h i z a ) ，假菌根( p s e u d om y c o r r h i z a ) 等。而食用 菌根真菌( e d i b l em y e o r r h i z a l 缸l g i ) 是指与植物形成菌根并能产生可供人类食用的子 实体的大型高等真菌。食用菌根真菌与植物形成的菌根大多是外生菌根i “2 】，菌根菌 依靠菌根从寄主植物上获取生活所需的碳水化合物和其他促进生长的物质，如葡萄 糖、氨基酸、维生素等。植物则通过菌根菌在土壤中的扩展延伸吸收到更多的水分和 养分，特别是由于菌根菌能分解土壤中的矿物质和难溶性磷，增强了植物对磷素和矿 物质的吸收。另外，菌根菌可分泌抗生素与生长激素物质【l 3 】，防御土壤病虫害对植 物的侵害，促进植物生长，提高了植物的抗逆性与抗病性。我国野生食用菌资源丰富， 在亟待开发的野生种中约有3 5 0 种是树木的外生菌根菌，占食用菌总数的5 6 【4 1 。据 统计，大约有3 的种子植物能形成外生菌根i ，j 。 近年来，随着研究方法的改进，在菌根构造、分类培养方法，菌根菌的液态发酵、 风味物质组分等方面进行了广泛深入的研究，并且已开始应用于农、林、工业生产中， 其中菌根性食用菌已经成为研究开发的一个新领域。 菌根性食用菌是一种高蛋白、低脂肪食品1 3 】，除含有极为丰富的蛋白质、氨基酸、 矿质元素外，还含有多糖等活性物质，具有很高的营养价值和食疗保健作用，据报道， 发现黑牛肝菌和华美牛肝菌均具有降血脂和抗氧化功能1 6 , 7 1 ，从变绿红菇( r v i r e s e e n s ) 中提出的粗多糖能明显降低小鼠淋巴细胞转化率、e 玫瑰花结形率及腹腔 巨噬细胞吞噬率，提示此多糖具有免疫抑制作用【s 】。由于菌根是菌根植物的根专性或 非专性的与菌根菌所形成的共生体【9 】，因此，分离、培养其中的一些真菌非常困难。 特别是使其形成子实体就更困难t l o j 。目前对菌根性食用茵的开发应用主要是一些能半 人工化栽培的子实体及进行纯培养的菌丝体，菌根性食用菌风味物质的研究方面开展 的较少。为了开发利用这些野生菌根性食用菌资源，现就菌根性食用菌的研究概况作 综述如下。 1 1 菌根性食用菌的种类 根据对宿主植物的专化性【2 】，食用菌根真菌可分为三种类群：( i ) 广性宿主真菌。 具有广泛宿主的菌根菌，可与多种植物形成共生。( 2 ) 中等专化性的真菌，子实体只 与一定量的植物联系在一起。( 3 ) 专性宿主真菌。只有很窄的共生范围，可与某个属 或某个种的植物形成菌根，其子实体也只是与某个属或种的植物联系在一起。 据m i l l e r ( 1 9 8 2 ) 统计世界上能形成外生菌根的真菌约5 0 0 0 种。我国已经报道的外 生菌根真菌约5 2 0 种隶属于2 个亚门子囊菌亚f l ( a s c o m y c o t i n a ) 和担子菌亚门 ( b a s i d i o m y e o t i n a ) ，4 1 科7 7 属【1 ”。 1 2 菌根性食用菌的营养及药用价值 菌根食用菌含有多种营养物质包括：蛋白质、脂肪、氨基酸，脂肪酸，矿质元素 和维生索等。对于不同的菌种，这些营养物质的含量也各不相同。e r e i f e j 等【】2 通过对 野生蘑菇和驯化蘑菇的品质鉴定表明：野生蘑菇在物理特性、化学组成和矿质组成方 面有明显的不同，粉褶蕈蛋白含量低但脂肪和能量较高，美味牛肝菌纤维和碳水化合 物较高。周家齐，徐鸿玺等i s t 3 】对十余种野生食用菌进行了氨基酸组成分析，结果表明： 各种野生食用菌氨基酸含量丰富，组成全面，且各具特色，有较高的营养价值。段玉 云等m 】也对1 6 种野生食用菌的化学成分进行分析，结果表明：野生食用菌中除了含 人体必需的大量元素kc a , m g ，s ，p 外还含有人体必需的微量元素z n ，c u ，f e ，m n ，b a , s r a i ，c r , n i ，w a 等，元素总量在2 3 7 4 5 9 之间，1 8 种氨基酸的总量在l o 7 1 2 4 8 1 之间，其中谷氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等的含量均比较高，粗蛋白含量范围 为1 7 4 6 ，远远超过一般的粮食作物，可与豆类作物媲美。黄谚谚等i ”】对小美牛 肝菌进行营养分析，发现小美牛肝菌不仅是高蛋白、低脂肪，且含有优质必需氨基酸， 其矿质元素含量也十分丰富，其f e 、m n 、z n 、c u 、1 2 等含量高于一般食用菌。这些 必需的微量元素是构成机体组成的重要材料，具有高度的生物活性，对人体生长、发 育、生殖等方面有促进作用。据报道：正红菇不仅含有十六种氨基酸，二十八种脂肪 酸，且含有五类多糖1 1 6 。脂肪酸特别是多价不饱和脂肪酸不仅能使血液中的胆固醇含 量下降，两且具有降低l d l ( 低密度脂蛋白) 效果【1 7 j 。构成食用菌细胞的多糖主要是几 丁质和非溶性p ( 1 - 3 ) d 葡聚糖，这两种物质对于激活免疫机能和抗癌活性都有效果 l t s l 。蓝黄红菇子实体提取物具有抗癌作用n 9 1 。松茸具有抗肿瘤作用，鸡油菌具有调 节机体代谢的作用，如清目利肺、益肠胃等功效，经常食用可治疗维生素a 缺乏所 引起的皮肤粗糙或干燥症，角膜软化症，眼炎等疾病，同时对癌细胞有一定的抑制作 用冽。可见，菌根性食用菌不仅含有丰富的营养物质，而且还具有一定的食疗保健作 用。 1 3 菌根性食用菌的生态环境、生态学和生理学研究 1 3 1 生态环境 1 ) 林分和植被 在显花植物中，很多都是可以和外生菌报形成菌根的植物。主要是北温带、南温 2 带和亚极地林区，包括松科( p i n a c e a e ) 、柏科( c u p r e s s a e e a e ) 、壳斗科( f a g a e e a e ) 、杨柳 科( s a l i c a c c ) 及桦木科( ( b e t u l a e e a e ) w l 激树种，温带亚热带的桃金娘科( m y r t a c e a e ) 一些树种，热带的龙脑香科( d i p t e r o c a r p a c e a e ) 大部分树种也是外生菌根成员，其它如 豆科( l e g u m i n o s a e ) ，槭树科( a c e r a c e a e ) 、大戟科( e u p h o r b i a e e a e ) 等科中的某些种也能 形成外生菌根。据统计，形成外生菌根的植物包括4 3 个科的1 3 9 个属的树种【2 i 】。菌 根菌便与这些树种形成共生树种。菌根菌的发生还与树龄有关田l 。 郁闭度和林下地被物对菌根真菌的分布也有很大影响。在森林郁闭度小于o 7 ， 和林下灌木及草本植物稀少的情况下，硬皮马勃科和须腹菌科等腹菌目的真菌主要为 外生菌根真菌类群，种类较少。随着郁闭度增加，松林下菌根真菌的类群趋于复杂， 种类繁多。牛肝茵类( b o l e t u ss p p ) 、红菇类( r u s s u l as p p ) 、乳菇类( l a c t a r i u ss p p ) 、 伞菌类( a g a i c u ss p p ) 、鹅膏菌类( a m a n i t a s p p ) 等伞菌目的真菌明显增多，形成优势种 群1 。 2 ) 土壤营养状况对菌根生长的影响 土壤中氮、磷、有机质含量及p h 值都会影响菌根的形成。有机质含量有利于菌 根的发育，特别是以腐殖质的形式施用不仅增加了土壤有机质的含量而且可使土壤酸 化，促进菌根的形成。如牛肝菌、红菇类、丝膜菌( c o r t i n a r i u ss p p ) 多发生在腐质殖 及枯枝落叶较丰富的森林土壤地区；而彩色豆马勃、多根硬皮马勃、乳牛肝等菌根真 菌子实体多发生在土壤较为贫瘠，林地腐质及枯枝落时较少的林下。黑抱块菌和夏块 菌一般都生长在松软的钙质土壤里，最理想的是石灰岩上发育而成的石灰质土壤，而 不宜生长于粘性或酸性土壤中洲。 3 ) 地理环境 地形、地貌、海拔高度和坡向，对林下外生菌根真菌出现的种群有一定影响。据 调查，在地形平缓的冲积平原，苗圃地和海拔低于1 0 0 m 的台地或低丘，南方松林下， 彩色豆马勃、须腹菌和硬皮马勃为最主要的菌根真菌种群；生长在低山或丘陵的南方 松林下菌根真菌的种类和数量增多，是菌根真菌属、种最丰富的地带田j 。 4 ) 生活方式 菌根性食用菌一般都有与其共生的树种，以单生、群生、散生、或混生于林地表 或地下。如块菌就是一种珍贵的地下食用菌。 1 3 2 生态学 1 ) 菌丝形态特征 菌丝有隔或无隔，分枝多或稀少，多呈锐角，多数具有锁状联合，无色、浅黄、 浅褐、灰色、金黄等不一，这些特征都可以作为菌根性食用菌分类的依据【2 卯。松茸菌 丝体为双核菌丝并有茵索形成【2 6 1 。子实体是由菌丝发展而形成的，单核的菌丝体在一 般情况下是不产生子实体的，但也有少数例外，如蜡伞属( h y g r o p h o r u s ) 的几个种。松 l z l 蘑经过二次菌丝的密集分化才形成子实体的【2 。”。子实体在形成过程中，菌丝的形态 和颜色都发生了变化【2 引。 2 ) 菌丝培养特征 在平板培养基上，菌丝大多呈白色，也有的呈黄色、灰褐色、金黄色、黄褐色等， 有的菌种有气生菌丝，且不同菌种不同培养基，气生菌丝的多寡不同，菌丝放射状平 铺、棉绒状、细绒状、葡甸状、鸭绒状不等，随着菌丝的生长，有的菌丝能分泌出色 素。中国块菌在固体培养基上，呈葡甸状，多基内菌丝，初为白色，后转为灰白色， 随着培养时间的延长，逐渐变为深灰色，灰褐色 2 9 1 。 3 ) 有性孢子研究 有性孢子如结合孢子、子囊孢予、担孢予等，担孢子( b a s i d i o s p o r e ) 是由担子发育 而来，担子是由处在子实层部位的双核菌丝的顶端细胞( 原担子) 膨大而成，原担子细 胞内的细胞核先经融合形成合子，一个二倍体的合子再经减数分裂后又产生4 个单倍 体的核，4 个核分别进入担子梗膨大部位，即发育成4 个外生单倍体的担孢子。孢子 椭圆形、长椭圆形、球形或近球形、菱形、纺锤形、卵形等形状不等，颜色多样，担 孢子表面一般光滑，但也有的孢子表面( 外壁) 还有毛刺、疣突、沟纹、翼翅等附属物 ( 孢子纹饰) 。有的担孢了甚至在内壁上也有小疣小刺、网纹等特征。上述特征都是担 子菌鉴定的重要依据咖。张林【3 5 】对1 8 种食用外生菌根进行了分离培养，并观察了孢 子的形态。 1 3 3 生理学研究 1 ) 生长发育的养分要求 碳源：部分菌根真菌要求简单的碳水化合物作碳源 3 6 - 3 9 1 ，如葡萄糖、果糖、麦 芽糖等。碳源的主要作用是构成细胞结构物质和提供生长繁殖所需的能量及代谢调节 物质。碳源是食用菌最重要的营养源，食用菌对碳源的需要量最大【帅1 。然而不同菌株 最适生长碳源条件不同，l a m b 对厚环乳牛肝菌( s u i l l u s g u e v i l l e 0 、褐环乳牛肝菌( s u i l l u s l u t e u s ) 等外生菌根进行培养，发现果胶是一种合适的碳源【3 9 】。对浓香乳菇来说，其生 长最好的碳源是葡萄糖、可溶性淀粉以及甘露糖，且在这些碳源的培养基上，浓香乳 菇能产生强烈的香味【4 l 】。花晓梅对外生菌根真菌彩色豆马勃( p i s o l i t h u s t i n c t o d u s ) 优良 菌株营养源的研究发现；彩色豆马勃不仅可以利用单糖、低聚糖，而且可以利用多糖 和多元醇。在单糖、低聚糖培养基中菌丝生长起动快，尔后进入平缓生长。而在多糖 培养基中则与之相反，朝起动较慢，但能维持很长的高生长率时期。所以单糖、低聚 糖类属“速效”碳源，而多糖，多元醇属“长效”碳源【4 2 1 。 氮源：大多数菌根真菌对有机氮化物利用最好，如谷氨酸，蛋白胨等，松茸不利 用尿素，其最理想的氮源是谷氨酞胺、( n i h ) 2 h p 0 4 ，酒石酸铵，其中尤以谷氨酞胺 4 为佳【4 3 】。其小分子有机氮可被菌丝直接吸收，而大分子的有机氮如蛋白质则必须通过 菌丝分泌的蛋白酶水解成氨基酸后才能被吸收。有机氮比无机氮更有利于菌丝的生 长，可能因为有机氮还可以作为碳源来利用，促进了营养平衡及物质转化【加】。而m i n 等对松茸d o u m 2 6 0 0 1 进行氮源对菌丝生长影响试验发现，酵母膏和蛋白胨是其最佳 氮源1 4 4 1 。黄空柄牛肝菌在供试的氮源中最易被吸收利用的是酒石酸氨，对硝态氮的利 用最差 4 s 】。但有些菌根菌则在无机氮上生长更好，如干巴菌在以硝酸钙为氮源的培养 基上菌丝生长速度最快，蛋白胨和尿素是其利用最差的氮源【舶】。许多外生菌根真菌在 铁盐中生长最快，部分能利用亚硝酸盐。一些则不能利用亚硝酸盐，例如口蘑科中的 一些菌不能在以亚硝酸盐作为唯一氮源的条件下生长【4 日。而发现牛肝菌属中的雅致牛 肝菌( e l e g a n s ) 能象利用铵盐一样有效地利用亚硝酸盐来促进生长【档l 。紫红菇，褐圆乳 牛肝菌等对硝态氮利用更好。因此对不同的菌根茵菌株应根据其营养特性选择氮源 【4 9 】。 矿质元素：一般研究结果认为磷可以促进菌根的形成，但土壤中含磷量高反而对 菌根有抑制作用【5 0 】。钾是一种必需元素，钾在吸收和释放负离子中起到中和作用。钙 是几乎所有菌根真菌都需要的元素【5 ”。在干巴菌菌丝生长过程中添加微量元素与不添 加微量元素对菌丝生长之间差异显著，其中以锰、铜对于巴菌菌丝生长的促进作用最 显著【柏5 2 1 。在松茸菌丝培养基中加入k h 2 p 0 4 ，n a c i 、柠檬酸铁、z n s 0 4 4 h 2 0 ， m n s 0 4 7 h 2 0 等矿质盐。对松茸菌丝生长影响明显；加入c u s 0 4 对菌丝生长不利； 在以上矿质盐中，缺乏m n s o , 7 h 2 0 ，k h 2 p 0 4 、柠橡酸铁、n a c i 菌丝不生长，说明 这些矿质盐是松茸菌丝生长所必需的【4 3 4 5 】。菌根对硫、镁、钾、钙、铁、锌等元素也 是必需的但需要量很小【4 l , 4 9 1 。除了基础的培养基中己有的无机元素外，铜、钻、镍能 促进大多数菌根菌的生长，且能使菌丝达到最大重量的浓度范围是o 0 1 0 5 m g m l t 5 3 1 。 生长因子：生长因子包括维生素、氨基酸及嘌呤( 或嘧啶) 、卟啉及其衍生物、 固醇、胺类等。生长因子的主要功能是提供食用菌细胞重要的化学物质( 蛋白质、核 酸和脂类) 、辅因子的组分并参与代谢。生长因子需求量虽然少，但不可缺少。大多 外生菌根菌生长需要某种维生素b 或生物素，否则生长不良，有些则需要肌醇、烟 酸、噻唑等以满足营养的需要。v c 对松茸菌丝没有促进作用，而v b l 、烟酸、对其 促进作用明显，烟酸促进其后期生长，v b i 、v b 2 对菌丝的起始生长有促进作用 4 2 , 4 6 ， 对干巴菌营养生理的研究，也证明了v b i 、v b 2 、v b 7 都可促进菌丝生长5 2 1 。有试 验结果表明：烟酸、烟酞胺、v b l 、生物素、叶酸、v b 2 有促进松口蘑菌丝生长或子 实体形成的作用。烟酸和v b l 混用具有增效作用，叶酸对担子和子实体形成的作用 较为显著i s 2 。a k i r a o h t a 等【5 珂报告了维生素及松口蘑原对松口蘑生长的影响，结果是： 生物素v b l 、v b c 及叶酸促使松口蘑菌丝生长良好，松口蘑原及松口蘑浸出液阻扰菌 丝生长。 生长发育的酸碱度要求：在培养条件下，p h 影响菌根真菌的生长，不管是普通 培养基还是缓冲性培养基i 5 4 - 5 6 1 。最适于菌丝生长的p h 值通常在4 0 7 0 之间。有的 稍低，如浓香乳菇其生长最适p h 值为3 0 4 0 ，在p h 值为2 2 时菌丝生长仍然旺盛， 而在p h 为7 时菌丝生长几乎停止【4 l , 4 2 1 。有的菌对生长发育时的p h 值适应性较广， 如灰盖牛肝菌( b o l e t u sg r i s e u s 和厚环乳牛肝菌( s u i l l u sg r e v i l l e ) 1 5 7 1 。 2 ) 生长发育的温湿度要求 温度要求：菌根菌菌丝的生长只有在一定的范围内才能进行，在极度高温和极度 低温条件下，菌根菌的各种生命活动都不能正常进行，甚至死亡。对于大多数外生菌 根真菌的最适宜的温度在8 2 7 之间；一般低生长温度为2 4 ，有的菌根真菌 在1 l 1 2 条件下能成活2 个月；最高生长温度在4 0 左右。毕国昌发现：绝大多 数菌株的最适生长温度为2 5 ，少数种为2 2 ，还有一些菌株则为2 7 ，研究 发现最适于菌丝对营养吸收的温度低于在培养条件下菌丝最适生长温度；形成子实体 的最适温度稍低于菌丝最适生长温度【5 3 j 。 湿度要求：湿度对外生菌根菌生长的影响也非常大，在土壤中，真菌能在饱和持 水量2 7 的条件下成活，在饱和持水量的1 0 1 5 时菌丝有一定程度的生长【5 9 1 ， 水分的供应对外生菌根真菌的子实体形成也起着重要作用。花晓梅对我国南方松外生 菌根资源进行了调查，发现降水量和降水方式是影响子实体形成的决定因素 2 3 1 。据相 关的资料分析，均匀的中小雨有利子水土保持和林地的通透性，空气相对湿度保持在 8 0 9 0 之间是绝大多数菌根菌子实体形成的最佳条件。如k i m 等对松茸人工栽培 的环境条件的研究发现，其湿度为8 0 8 3 t 6 0 1 。 1 4 食用菌液态发酵技术研究 采用发酵工程先进技术，培养食用真菌是当今食用菌研究中的一个热点。通过深 层发酵可在短期内获得大量的菌体和代谢物，不仅可生产液体菌种用于栽培食用菌子 实体，而且还可以直接用于医药和食品业上作为药品、调味品、饮料等的生产。食用 菌的深层发酵是在抗生素发酵技术的基础上发展起来的。1 9 4 7 年美国的汉姆非特首 先提出了用深层培养法生产菇类菌丝体。1 9 5 8 年沙克斯第一个在发酵罐内培养出了 羊肚菌菌丝球，并进行了大规模的生产试验。从此，食用菌的培植开始从农业领域跨 入了上业生产的领域。我国于1 9 5 8 年开始研究蘑菇和侧耳的深层发酵，正式大规模 采用深层发酵法生产食用菌是6 0 年代末，目前国内外食用菌深层发酵技术的使用己 经比较普遍。我国拥有丰富的真菌资源，对其深层发酵工艺进行深入、系统的研究， 为进一步开发利用奠定扎实的理论和实践基础，显得十分重要。 食用菌液体培养基的基本组成主要由碳源、氦源、无机盐、微量元素、维生素和 6 生长素等所组成 6 1 】。 1 1 碳源：食用真菌一般系低糖发酵，培养基中的糖浓度大约为2 6 ，绝大多 数真菌都能利用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和淀粉等。 2 ) 氮源：食用真菌可利用的氮源有无机氮源和有机氮源，无机氮源主要有： c o ( n h 2 2 、n h 3 h 2 0 ，n h 4 c i 、( n h 4 ) 2 s 0 4 、( n h 4 h h p 0 4 、( n 1 4 4 ) n 0 3 和n a n 0 3 等； 有机氮源主要有：黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、水解植物蛋白、蛋白胨、 氨基酸、酵母粉、酵母浸出物、鱼粉、麦粉、蚕蛹粉和酒糟；一般说来真菌对有机氦 源的利用效果比无机氦源好。其培养基中的氮源浓度一般为0 0 4 0 1 。碳氮比也影 响菌丝生长，真菌培养基中如果氮源过多易导致菌丝生长过于旺盛，使代谢产物积累 不足；如果碳源不足易弓l 起菌体衰老和自溶；通常食用菌菌丝细胞适宜的发酵培养基 的较好的碳氮比为8 , - - 1 2 ：1 ，另外由于菌丝生长过程中有5 0 碳源供呼吸消耗用， 5 0 用于组成菌体细胞，故培养基较理想的碳氮比为1 6 2 4 ：l ，多数菌的培养基的 碳氮比为2 0 ：1 。 3 ) 食用真菌所需矿质元素有p m g 、k 、c a 、n a , 、s 、z n 、m n 、c o 和c u 等， 其中以p 、m g 、k 最为重要。p 、k 常通过k h 2 p 0 4 加入得到，加入量约为o 1 5 ，m g 常通过m g s 0 4 加入得到，加入量约为0 0 7 5 。 4 ) 维生素：部分菌体深层发酵需添加某些维生素才能良好生长，己知水溶性维 生素比脂溶性维生素有更好的影响效果。v b l 对绝大多数菌有促进作用。 5 ) 水和p h ：菌体发酵一般环境要求在偏酸性中生长，适宜p h 范围在5 o 7 0 。 接种量，真菌液体发酵的接种量一般较大，在5 3 0 之间。另外据研究【6 2 】，适当增 加培养液粘度，有利于菌球缩小。 1 5 菌根食用菌的应用 1 5 1 在林业上的应用 i ) 作为生物防治剂的开发。目前，外生菌根菌剂在我国只局限于中国林科院生产 的p t 菌剂。在外生菌根的应用研究中，美国已采用液体发酵技术生产出数种外生菌 根菌剂，在林业上应用效果较为理想嗍，我国在这方面的研究开展得较少，童竟新等 曾采用液体通气方法扩大培养彩色豆马勃，用于接种国外松，取得了较好的效果删。 王学聘等【6 5 】对厚环乳牛肝菌发酵条件进行了研究，发酵结果表明：该菌株具有发酵周 期短，生长迅速易于工业化生产等特点。 2 ) 菌根化育苗。培育菌根化苗不但有利于苗木的生长，同时苗木根对真菌也是 一种库存保护，因而具有潜在的开发应用前景。 3 ) 逆境造林。研究证明，用菌根化苗木造林可以提高树木的抗旱性。 4 ) 菌根生物修复。研究人员利用菌根有效降解和转移环境污染物的特点，将其 7 应用到生物修复中。目前，国内外科研人员已将菌根生物修复技术用于污水污泥，固 体垃圾，有机污染物( 如石油，多环芳烃和酞酸酷，农药，杀虫剂，除草剂) 污染土壤 的综合治理。 1 5 2 菌根食用菌在食品工业上的应用 菌类作为一种无污染的天然食品，日益受到人们重视，从而刺激食用菌产业的发 展。然而菌根食用菌还不能离体培养，甚至许多菌种尚不能获得纯菌种，这是制约菌 根食用菌开发的关键因素之一，因此必须继续加强培养基改良、菌种分离等基础工作， 以获得更多的纯菌种资源，并对获得的纯培养菌种进行液体深层发酵的研究。由于菌 根食用菌子实体的培育十分困难，因此利用菌丝体代替子实体是开发利用这类真菌的 先决条件。目前，普遍采用的方式是液态发酵，其产品包括菌丝体和发酵液。采用液 态发酵工艺培养菌丝体替代子实体进行食品加工或生理活性物质提取是美味牛肝菌 研究和开发的方向，我们也可采用同样的方法或用深层发酵的方法来进行产品开发。 另外某些微量元素如锗、硒、锌等具有重要的生理功能，通过液态发酵技术，利用菌 类具有富集微量元素的特点，可将一些对人体有益的微量元素转变为食用菌体内的元 素，供人们食用；还可从发酵液中提取代谢产物【6 ”。如在松口蘑( t r i c h o l o m a m a t s u t a k e ) 发酵液中可提取到香昧极佳的松口蘑油和甲基桂皮酸。 对予实体的开发利用方面，曾报道利用野生松茸来加工制成速溶冲剂，胡慧蓉等 u o l 用干巴菌来加工制成千巴菌罐头，干巴菌韭菜花，这一系列产品的出现将大大丰富 人们的生活，合理利用我国野生菌根性食用菌资源起到好的促进作用。 日本的岩出亥之助和村桥俊介于1 9 3 4 年抽提出松茸的香味物质松茸原和甲基桂 皮酸的混合物，现已成为食品添加剂【6 引。r a p i o r l 6 9 j 等从l a c 驴i u sh e l v u 中分离出一种 挥发性的香气成分，这种成分可应用于食品和烟草工业中。 1 5 3 菌根食用菌生理活性物质的提取 在整个微生物界，高等真菌是食品和药物方面最具潜力的微生物种类之一，它能 够利用营养价值低的原料来生成高蛋白质和低脂肪含量的食物。在医药方面，随着微 生物研究的深入，在高等真菌中发现了许多酶、抗生素或其他具有药物活性的产物 7 1 - 7 3 j 。近年来随着发酵、分离和结构鉴定技术的不断发展，在高等真菌中发现了许多 具有药用价值的次级代谢产物，这为人类开发新型的医药、农药、保健食品、化妆品 等提供了重要的新资源，真菌的药效成分包括：多糖体、多肽体、糖苷肽、生物碱、 多烃类、醌类、类固醇类、类菇类、维生素类、嘌呤类和有机酸等多种活性物质。 食用菌中可以提取出脂肪酸【7 6 】、多糖1 7 8 1 等多种活性物质，其中许多外生菌根真 菌在纯培养条件下可以产生吲哚类化合物【7 5 ，7 6 】。g r a h a m 7 7 1 等先后研究了外生菌根产 生某些植物激素的规律，但普遍没有能对优良的外生菌根菌株进行系统的测定。李玉 8 萍等1 7 8 1 从美味红菇菌丝体发酵滤液中检测出玉米素( d 、异戊烯嗦吟( i p a ) ，吲哚3 乙酸 ( t a a ) 、脱落酸( a b a ) 、赤霉素( g a 3 ) 、激动素( o 六种植物内源激素，同时还发现 其中某些具有抗生物质，且这些物质的含量都比较多。赵志鹏等【57 】采用6 株菌根菌进 行了激素代谢的研究及拮抗活性物质的生物测定，检测出6 种植物激素。这有可能使 菌根真菌成