（制糖工程专业论文）地榆抗过敏活性物质的研究.pdf

地榆抗过敏活性物质的研究 摘要 地榆( s a n g u i s o r b ao f f i c ir l a ii s ) ，是蔷薇科( r o s a c e a e ) 地榆属 ( s a n g u is o r b al ) 多年生草本植物，在我国东北、西北、华北、华南及广 西有广泛分布。地榆中含大量的鞣质、三萜皂甙等药理活性成分，具有很 强的开发价值。本实验以地榆为主要研究对象，以透明质酸酶抑制率来评 价其抗过敏作用，通过溶剂提取、大孔树脂吸附分离、超滤膜分离、聚酰 胺柱分离及凝胶柱分离等一系列分离纯化方法获得具有较高透明质酸酶抑 制率的单体，并通过薄层鉴定、试管预测、紫外及红外光谱初步解析分离 单体的化学结构。同时，测定了地榆粗提物的羟基自由基、过氧化氢和超 氧阴离子自由基清除率，通过与透明质酸酶抑制率的对比，初步预测地榆 的抗过敏作用机制。得到如下结论： 确定了地榆抗过敏成分有效提取条件为6 0 乙醇，粉碎粒度为4 0 6 0 目，提取温度5 0 c ，料液比1 ：4 0 ，1h 次，共提取四次；大孔树脂可以有 效的对抗过敏有效成分进行吸附分离，分离组分最高透明质酸酶抑制率可 以达到7 6 ；采用膜分离，聚酰胺分离及凝胶l h 一2 0 分离等纯化方法得到单 体样品i ，透明质酸酶抑制率为8 9 ( 2 m g m l - 1 ) ，为地榆提取物中透明质酸 酶抑制率最强的单体组分；样品i 在薄层层析板上遇三氯化铁显蓝色，遇 茴香醛一硫酸显橙色，同时可以与明胶、溴水反应产生沉淀，使香草醛一盐 f 酸变红，这些现象证明其为缩合单宁类物质，紫外，红外光谱也显示多酚 特性。 同时，地榆粗提物具有很强的氧自由基清除作用，地榆提取物大孔树脂 4 0 乙醇洗脱组分与原花青素标准品具有相似的氧自由基清除作用，羟基自 由基、过氧化氢和超氧阴离子自由基的清除率分别为9 8 ，7 3 和4 5 。通 过对比，地榆提取物的氧自由基清除率与透明质酸酶抑制率之间呈一定的 正相相关性，推测地榆的抗过敏作用机制可能与其对各种自由基清除作用 有关。 关键词：地榆抗过敏提取分离化学性质氧自由基 n t h er e s e r c ho fa n t i a ii e r g i ca c t i v i t yo fs a n g u j s o r b a o f f i c i n 8j s a b s t r a c t s a n g u i s o r b ao f f i c i n a l i sb e l o n g i n gt or o s a c e a es a n g u i s o r b alw a sa p e r e n n i a lh e r b a c e o u sp l a n t i td i s t r i b u t ei nn o r t h w e s t e r n , n o r t h e a s t e r n ，n o r t h e r n ， s o u t h e r nr e g i o na n dg u a n g x ii nc h i n ae x t e n s i v e l y t h er o o to f s a n g u i s o r b a ri s a b u n d a n ti nt a n n i s ，t r i t e r p e n o i ds a p o n i ne t cw h i c hw e r eb i o a c t i v ec o m p o n e n t s ， s oi tw a s w o r t h yo fd e v e l o p i n g t h es a n g u i s o r b ao f f i c i n a l i sr o o tw a su s e da st h e o b j e c t ，r e s t r a i n to fh y a l u r o n i d a s ea c t i v i t yw a su s e da sam e t h o dt oa p p r e c i a t et h e a n t i a l l e r g i co fs a m p l e s ，s o m ee x p e r i m e n t sw e r ec a r r i e do u tw h i c hc o n c l u d e e x t r a c t i n g w i t h a q u e o u se t h a n 0 1 s e p a r a t i n ga n dp u r i f y i n gw i t h d i a o i o n h p 一2 0 ，h y p e r f i l t r a t i o nm e m b r a n e ，p o l y a m i d e a n d s e p h a d e x l h - 2 0 t h e d e t e c t i o ne x p e r i m e n t sw e r ec a r d e do u ta tt h ee n do fs e p a r a t i o nw h i c hc o n c l u d e t h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y ，t u b et e s t i n g ，u va n di l lt h eo x y g e nf r e er a d i c a l s s c a v e n g i n gt e s tw e r ec a r r i e do u to nt h ee x t r a c t i n gs a m p l e si nt h es a m et i m e ，t h e a i mw a st oe v a l u a t et h ea n t i a l l e r g i cm e c h a n i s mo fs a n g u i s o r b ao f f i c i n a l i s s a m p l e t h er e s u l t sw e r es h o w e d t h a t ： t h eb e s te x t r a c t i n gc o n d i t i o n sw e r ec h o s e na s ：6 0 a q u e o u s e t h a n o l ，5 0 4 c ， s a m p l ew e i g h tt os o l v e n tv o l u m e ：1 4 0 ，l h o u r t i m e ，4 t i m e s m a e r o s p o r er e s i n i n h a db e t t e ra b s o r b a n c ea b i l i t yt ot h ea n t i a l l e r g i cm a t e r i a l ，s oi tc a r ls e p a r a t et h e a n t i a l l e r g i cm a t e r i a lw e l l ，t h eh i g h e s ta n t i a l l e r g yp r o p e r t i e so ft h ec o m p o n e n t s e p a r a t e db yh p 一2 0w a s7 6 t h es a m p l e 1w a ss e p a r a t e da n dp u r i f i e dw i t h h y p e r f i l t r a t i o nm e m b r a n e ，p o l y a m i d ea n ds e p h a d e xl h - 2 0 ，t h ei n h i b i t i o nr a t i o o fh y a l u r o n i d a s ew a s8 9 ( 2 m g m l 1 ) ，i tw a st h eb e s ti n h i b i t i o nc o m p o n e n to f s a n g u i s o r b ao f f i c i n a l i s t h es a m p l e it u r n e db l u ew h e n t o u c h i n g f e c l s ，t u r n e do r a n g ew h e nt o u c h i n ga n i s a l d e h y d e s u l f u r i ca c i d i tc a l ld e p o s i t e d g e l a t i na n db r o m i n ew a t e r t h e s ep h e n o m e n o n ss h o w e dt h a t i t b e l o n gt o c o n d e n s e dt a n l i d s t h e r ew e r ep o l y p h o n e sc h a r a c t e r so nu va n di rs p e c t r u m 。 a tt h es a m et i m e ，t h er a d i c a l ss c a v e n g i n ge f f e c to fe x t r a c t i o nf r o m s a n g u i s o r b ao f f i c i n a l i sw a sh i g h e r ，t h es a n g u i s o r b ao f f i c i n a l i ss a m p l ep u r i f i e d w i t hm a c r o s p o r er e s i nh p 一2 0e l u t e dw i t ha q u e o u s e t h a n o l ( 6 0 ：4 0 ，v v ) w a s s i m i l a rt op r o c y a n i d i n s ，t h es c a v e n g i n gr a t i oo f h y d r o x y lf r e er a d i c a l ，h y d r o g e n p e r o x i d ea n ds u p e r o x i d ea n i o nf r e er a d i c a l ( 0 2 3w a s9 8 ，7 3 a n d4 5 r e s p e c t i v e l y c o n t r a s t i n gt h ed a t e s ，t h e r ew a sap o s i t i v er e l a t i v i t yb e t w e e n a n t i a l l e r g i c a n da n t i - o x i d a t i o na c t i v i t i e s i t i m p l i e dt h a tt h ea n t i a u e r g i c m e c h a n i s mo fs a n g u i s o r b ao f f i c i n a l i ss a m p l ew a sr e l a t e dt ot h es c a v e n g i n g r a t i oo fo x y g e nf r e er a d i c a l s k e yw o r d s ：s a n g u i s o r b ao f f i c i n a l i s ；h y a l u o n i d a s e ；e x t r a c t i o n i v 广西大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和相 关知识产权属广西大学所有，本人保证不以其它单位为第署名单位发表或使用本论文 的研究内容。除己注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究成果，也不包含 本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮助的个人和集 体，均已在论文中明确说明并致谢。 论文作者签名： 冯乏臣2 0 口7 年占月j ；日 学位论文使用授权说明 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本： 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 口即时发布 口解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 论文作者签名：8 志臣 导师签名：寺；耄旁厶 巧降月，产日 广西大掣嘎士掌位论文地榆鲴随敏活性物质的研究 1 1 地榆简介 第一章绪论 地榆( s a n g u i s o r b ao f f i c i n a l i s ) ，是蔷薇科( r o s a c e a e ) 地榆属( s a n g u i s o r b al ) 多年生草本植物，分布于北温带，在我国主要分布在东北、西北、华北、华南及广西“1 。 地榆属全世界约有3 5 种，而据报道在我国有7 个种和6 个变种，其中地榆s a n g u f s o r b a o f f i c l n a l l s 在全国分布最广嘲。地榆根是一种中草药材，在本草纲目中已有记载， 因其根中含地榆皂甙，能凉血止血、收敛止泻、解毒敛疮，常用于便血、痔血、血痢、 崩漏、水火烫伤、痈肿疮毒。1 ，所以说地榆是一种极具开发价值和潜力的野生植物资源。 研究表明地榆含鞣质约为1 7 ，三萜皂甙2 o - - 4 o ，已分离出的有地榆甙i 、i i ( z i y u g l y c o s i d e i ，i i ) 、地榆皂甙a 、b 、e ( s a n g u i s o r b i na ，b ，e ) 和槲皮素，熊 果酸等物质。 1 2 地榆的国内外研究状况 目前，国内对地榆的研究主要限制在临床试验效果的验证上，在国外分子水平的研 究也有了一定的深度，但主要集中在其抑菌、抗氧化等研究上。地榆对伤寒杆菌、脑膜 炎球菌、福氏痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌及肺炎双球菌等有抑制作用。地榆的乙醇提取 液，在试管内对大肠杆菌、枯草杆菌及金黄色葡萄球菌有抑制作用，其中所含鞣质有抗 霉作用“3 。地榆中的鞣质、三萜皂苷等成分可以抑制体内亚硝胺生成，对抗巴豆油诱发 的小鼠耳部肿胀以及0 ：。，0 h 两种活性氧有明显清除作用。傅乃武等研究证明：小鼠 口服地榆鞣质2 0 m g k 9 1 可明显抑制抗氧基比林( a p ) 合并n a n 晚引起的急性肝损伤，地榆 鞣质能明显抑制0 2 一的产生、抗h 2 0 2 诱发的溶血以及清除羟自由基”。a nr e n b o 等人通 过体内自由基抑制实验，发现地榆提取物可以有效清除i ) p p l - i 自由基，并分离出四种单 体物质”1 。此外，地榆的乙醇提取物可以有效的清除乙酰胆碱酯酶，抑制率达到7 8 ( 1 m g m 1 1 ) ，人体产生的乙酰胆碱酯酶是分解神经末端传达物质的酶，现代医学认为它的存 ! 查兰竺主竺竺塑查苎竺塾兰苎苎竺丝墨望竺墨 在与老年痴呆症发病有关埘脚。 上述材料表明地榆在许多功能方面已经有了很深入的研究，但在很长一段时间内， 未涉及到地榆抗过敏特性的研究。在国外，最近s h i n ，t a e y o n g 通过p c a 和c o m p o u n d 4 8 8 0 引发的过敏动物实验模型，验证地榆根的租提物抑制组胺介质的释放和t n f a 的 产生，而t n f - a 为细胞过敏介质产生的诱导因子之一，证明地榆具有良好治疗即时型过 敏的效果恻“”。i m a o k a k ( 1 9 8 3 ) 等人报道了地榆的提取物能够显著抑制l g e 类抗体， 表明了地榆的提取物对l g e 类抗体产生的过敏性疾病有疗效作用，但对1 9 6 类抗体无影 响。l e ej 对可水解鞣质抑制c a 2 + 激活透明质酸酶的活性进行构效分析，2 7 种可水解鞣 质中没食子酸鞣质1 2 3 g - 四没食子酰葡萄糖抑制透明质酸酶的活性最强n 1 1 。p a r kl ( j 通过小鼠的被动皮肤测试及由c o m p o u n d4 8 8 0 和c a 2 + 引发的过敏测试，表明了地榆提 取物对肥大细胞有抑制作用，其主要成分为5 0 一a d ( 3 一c 一羟甲基) 呋喃来苏糖基 一b d 一( 2 一羟甲基) 阿拉伯呋喃糖的双糖“4 。这些研究都表明了地榆中确实存在抗 过敏作用组分。因此，在国内外对天然抗过敏植物的研究基础上，如何对地榆的抗过敏 活性物质进行分离，对其中的有效活性成分做纯度和结构上的鉴定，并对地榆中的多酚 类物质是否具有抗过敏作用做出检验成为当前研究的重点。 1 3 过敏性疾病 1 3 1 过敏性疾病的现状 随着物质生活水平的提高，环境社会因素的影响，过敏性疾病越来越多，过敏性疾 病的发病率也较高，国内外的流行病学资料表明，约有三分之一以上的人在一生中曾罹 患过过敏性疾病。过敏性疾病可严重地影响患者的生活质量，影响患者的工作和学习， 也会因此造成巨大的经济损失。比如近年来金属饰物过敏、宠物过敏、坚果等食物过敏 的发病率明显升高，很显然这与生活水平的提高有着密切关系。此外，某些过敏性疾病 尚有“流行性”的特点，过敏原的播散可在同一时段造成群体发病，如有些国家的花粉 症患病率可达1 0 以上。在这些过敏反应中尤其i 型过敏反应的过敏患者激增速率最快， 据统计过敏患者已占世界入口的4 0 ，2 0 以上的美国人都曾受到过敏性疾病的困扰； 日本厚生省过敏综合研究报告显示，3 5 的d , j l 和2 2 的成人都曾患过不同程度的花 曼查兰! 主竺苎丝查 苎竺塾苎苎兰竺丝竺竺! 墨 粉症、过敏性皮炎、哮喘、鼻炎等过敏性疾病；在我国，过敏反应的发病率约占1 0 ， 且成逐年上升的趋势。由此可见，过敏症己属于多发性常见病。虽然过敏反应性疾病不 像癌症和心血管疾病那样对人类健康造成最直接的威胁，但它会给人类带来长期的困 扰，引起多种并发症，甚至可能危及生命“”。 目前，世界各国治疗过敏反应的药物基本都是根据脱敏、抑制机理，抗过敏药按其 作用不同一般可分为五大类：化学介质释放抑制剂，此类药物依其化学性质不同又可 分为酸性抗过敏药及碱性抗过敏药；过敏介质拮抗剂，依不同的过敏介质又可分为白 三烯拮抗剂、血小板活化因子( p h f ) 拮抗剂及抗组织胺药；糖皮质激素类；支气 管扩张剂；钙通道阻断剂“。目前l f 每床上使用的上述五类抗过敏药，毒副作用都非常 大。随着人们生活水平的提高，无毒无害天然植物越来越受到人们的青睐，但纯天然的 抗过敏药少之又少，分离提纯天然植物中的抗过敏有效成分，研究其理化性质和作用机 理，代替毒副作用较大的西药已成为各国学者研究的热点。 1 3 2 过敏性机理和治疗概况 过敏反应又称超敏反应或变态反应，是指机体受同一抗原物质再次刺激后产生的一 种异常或病理性免疫反应。根据过敏反应的发生机制和临床特点，将其分为即时型和迟 延型2 类，前者接触过敏原1h 之内，就会出现过敏症状，而后者摄取后大约经过1 2 h 以后才出现过敏症状，有时长达2 4 4 8h 。其中i 型过敏反应是速发型过敏过反应的 代表，主要包括呼吸道过敏反应、消化道过敏反应、皮肤过敏反应以及过敏性休克等。 它的发病机理主要为：当过敏原接触人体的免疫系统时，b 淋巴间素诱发分泌制造i g e 的浆细胞，i g e 被释放出来后，粘附在肥大细胞或嗜碱性自血球的表面，当第二次接触 到同一过敏原时，过敏原就与此两种细胞表面的i g e 结合串联，这个现象促使细胞释放 出大量的颗粒，颗粒破裂后排出许多可引起生理反应的物质，如：组织胺、迟缓舒张素、 肝素、前列腺素、血小板活化素，及其它血球趋化素、蛋白质分解酶等，这些活性介质， 引起平滑肌收缩痉挛、毛细血管扩张、通透性增加、黏膜分泌物增加、炎症细胞渗出， 形成过敏症候群，包括：皮肤红肿、痒、眼睛轻度结膜炎、鼻塞、呼吸困难等。由于这 些活性物质的作用部位和强度不同，所引起的病变性质和临床经验表现也就不同。作用 于皮肤，引起寻麻疹；作用于上呼吸道则引发过敏性鼻炎；作用于下呼吸道则引发支气 管哮喘“”。 ! 查兰! 主竺苎竺查苎丝苎苎竺兰竺丝竺竺! 墨 对过敏反应主要的治疗方法包括特异性治疗和非特异性治疗两种，特异性治疗又可 分为预防和治疗两个方面“”，预防指尽早找到过敏原，避免过敏原与机体发生接触，减 少发生过敏反应的机率，这是一种针对病因的根本性防治措施，但是，这必须对过敏原 要有充足的了解，并且掌握大量的资料，这些都与致病原分布范围广，且可通过空气传 播的特点相悖，为预防的实施带来巨大困难。特异性免疫治疗即采用免疫学方法阻止变 态反应的发生，包括提高机体对过敏原的耐受能力，降低机体的反应性，即特异性脱 敏治疗( s e p e c i f i cd e s e n s i t i z a t i o n ) ，它是专门针对i 型变态反应的一种疗法。具体实 施为了解了导致患者发生变态反应的过敏原后，将过敏原配制成各种不同浓度的提取 液，给患者注射或通过其它途径让患者反复接触，剂量由小到大，浓度由低到高，使病 人对此过敏原的耐受性提高。特异阻断变态反应发生的环节，包括细胞因子免疫治疗、 抗i g e 抗体治疗等，是治疗i 型变态反应较为有发展前景的方法“1 。 非特异性治疗主要是指药物治疗。根据抗过敏药物作用于变态反应的不同环节，将 这些药物分为抗组织胺药、过敏反应介质阻释剂( 也称肥大细胞膜稳定剂) 、糖皮质激 素类等“。现在流行的主要药物种类包括抗组胺类药：盐酸异丙嗪、盐酸苯海拉明、氯 苯那敏、阿司咪唑等；过敏活性物质阻释剂：色苷酸二钠、富马酸酮替芬、曲尼司特等： 它们的作机理主要是针对i 型变态反应的发生和发展过程，切断或干扰某个环节，防止 或减轻i 型变态反应的发生m 1 。但是临床实践表明，西药在治疗过敏性疾病时存在着作 用环节单一、难根治、不良反应较多、价格昂贵等弊端。 随着中药研究成为全世界科研工作的热点，利用中药制剂治疗过敏性疾病也有了一 定程度的研究。美国霍普金斯大学i 临床过敏研究中心就曾对中草药复方抗过敏进行研 究，发现中药复方制剂对多项免疫指标有显著的降低作用，这些指标覆盖了i g e 介导的 即时型过敏反应的各个主要环节油3 。中国的中医药以促进机体自身调节功能的恢复， 从整体上改善系统的异常为主要特点，这在治疗上拥有了很大的优势，从传统中药的主 剂入手，分离提纯天然植物中的抗过敏有效成分，将成为抗过敏研究的一个新的热点方 法。 1 3 3 抗过敏活性的研究方法 抗过敏活性的研究方法可分为体内实验和体外实验，而目前较为通用的实验模型主 要为透明质酸酶抑制率实验，b 一己糖胺酶的抑制，肥大细胞释放组胺实验等。这些实 广西大掌硕士掌位论文地榆封随敏活性物质的司愧 验模型的原理主要是针对的是速发型i 型变态反应，主要测试i 型变态反应的参与因 素，如i g e 抗体、肥大细胞、嗜碱粒细胞、组胺、白细胞三烯等。 1 透明质酸酶体外抑制试验嘲： 透明质酸酶( l a a s e ) 是透明质酸( 姒) 的特异性裂解酶，h a 在人体发育和调控过 程中如细胞粘附、器官形成、创伤愈合、肿瘤发生和血管形成起主要的抑制作用，抑制 h a a s e 的活性可使h a 不被分解，维持正常的生理功能。实验证明透明质酸酶参与了i 型变态反应，透酸质酸酶抑制率之间存在一定的正相关性，目关采用的实验方法多为 e 1 s o n - m o r g a n 改良的方法。 2 b 一己糖胺酶的抑制州： 8 一己糖胺酶是是一种细胞内酶，为体内致敏因子之一。采用生物化小鼠d n pi g e 抗体与抗生物素蛋白的复合体刺激嗜碱细胞性白血病( r e l 一2 h 3 ) 细胞，测试从细胞中 游离的b 一己糖胺酶的抑制率来评价抗过敏活性。 3 肥大细胞释放组胺实验。”1 ： 在体内产生炎症、过敏时，与肥大细胞中组胺作为化学传递物质的释放关系密切。 因此，通过测定组胺的浓度，可测定抗过敏的效果。采用c o m p o u n d4 5 8 0 诱导鼠离体 肥大细胞释放组胺，通过供给抗过敏的活性成分，抑制游离组胺的释放。用h p l c 法测 定游离组胺含量。 4 酶联免疫吸附试验( e l i s a ) 嘲嘲： i g e 抗体是i 型变态反应的重要物质，测定其含量，可用于诊断和预测过敏状态。 酶与抗体或抗原结合后，酶活性也不受影响，在相应酶底物作用下会产生有色的反应来 检测各种免疫球蛋白的含量。 5 毛细血管通透性试验。”： 皮内注射过敏介质引起皮肤局部毛细血管通透性增加，同时静脉给予伊文思蓝，用 。直径测量法或比色测定法，根据染料渗透量判断毛细血管通透性大小。 此外，还有同种大鼠被动皮肤试验迟、发型超敏反应( d t h ) 、过敏性休克试验法、 离体动物试验法、放免疫分析法等试验方法。对于上述研究方法，透明质酸酶抑制率实 验是应用较为广泛的一种体外实验方法，它具有方法快捷，结果较准确等优点。k a k e g a w a 等报道各种影响肥大细胞释放组胺的药物能调节透明质酸酶的活性，透明质酸酶活性抑 制和肥大细胞释放组胺抑制活性之间有好的相关性”1 。y 0 0 等也报道了透明质酸酶参与 组织发炎过程，是i 型过敏反应的参与者，在过敏反应的第三阶段参与反应导致肥大细 5 ! 查竺塑主兰竺笙查竺竺苎苎苎蔓竺丝墨竺竺苎 胞脱颗粒。”。因此透明质酸酶体外抑制试验可以做为简单的生化方法来评价样品的抗过 敏性能。y u m i em a e d a 等对茶提取物的抗过敏作用研究中，采用透明质酸酶体外抑制试 验做评价方法。k a o r ih o s h i n o 等采用了三种体外测试方法，对1 0 种蔬菜提取物的抗 过敏功能进行评价，其中就有透明质酸酶体外抑制试验1 。由于透明质酸酶体外模型简 单易行，所以这种生物实验法作为研究抗过敏作用的一个指标被广泛地采用，但由于影 响透明质酸酶活性的因素较多，易出现有效活性成分漏筛或假阳性，在研究中应结合其 他实验模型进行综合评价。 1 4 天然产物的提取分离及鉴定方法 1 4 1 天髂产物的提取方法” 天然有效成分的提取方法主要包括溶剂法、水蒸气蒸馏法、升华法及超l 临界萃取法 等，在这些方法中应用最为广泛的为溶剂提取法。 溶剂提取法是根据天然产物中各种成分在溶剂中的溶解性质，选用对活性成分溶解 度大，对不需要溶出成分溶解度小的溶剂，从而将有效成分从药材组织内溶解出来的方 法。天然产物的结构千差万别，分予结构中极性基团的多少及取代位置决定了其在不同 溶剂中的溶解性。有机物一般具有相似相溶特性，即极性化合物易溶于极性溶剂，非极 性化合物易溶于非极性溶剂，同类分子或官能团相似的彼此互溶，常用溶剂的极性强弱 顺序可表示如下：石油醚( 低沸点一高沸点) 四氯化碳 二氯乙烷 苯 二氯甲烷 氯仿 乙醚 乙酸乙酪 丙酮 乙醇 6 0 的组分选出，发现它们都具有很好的清除氧自由 基的作用，如图3 3 所示。这些现象在一定程度上吻合了过敏产生过程有自由基参加的 作用机制，可以预测地榆抗过敏特性可能是通过有效清除氧自由基，有效阻断致敏物质 的释放，从而去除过敏症状。 3 4 结果与讨论 总之，地榆是很好的氧自由基清除剂，粗提物( o 4 m g m l l ) 的羟基自由基、过氧 化氢及超氧阴离子自由基清除率分别为5 4 、2 0 和2 4 。经大孔树脂纯化后清除效果又 得到了进一步的提升，大孔树脂4 0 洗脱部分的样品( o 4 m g m l - 1 ) 羟基自由基、过氧 化氢及超氧阴离子自由基清除率分别达到了9 8 、7 3 和4 5 ，几乎达到与原花青素标准 品相同的清除效果，属于强氧自由基清除组分。地榆的自由基清除作用与透明质酸酶抑 制作用在提取，分离的过程中都呈相应的增加，对应较强的抗过敏组分，也相应具有一 定的强度的抗氧化作用，也就是说地榆提取物的透明质酸酶抑制率与氧自由基清除率之 间具有一定的正相相关性，这可能与其分子结构中的存在大量的羟基或某些羟基的特定 位置有关。可以预测地榆抗过敏机制与其具有较强的氧自由基清除作用有关，这将对地 榆抗过敏作用的机制研究上提供帮助 广西大掌司e 士掌位崔吁地榆崮u 雹敏活性物质的研究 第四章地榆抗过敏活性成分的纯化 有效成分的分离纯化即是根据有效成分的具体性质，通过物理、化学的方法将其从 众多无效成分中分离，获得单一组分的过程。现在分离纯化的方法多种多样，包括萃取 法，沉淀法、盐析法、色谱法，渗透法等。本章通过超滤膜，聚酰胺，凝胶l h 一2 0 对 有效成分进行分离，得到透明质酸酶抑制率最强的单体组分。 超滤法是以选择性透过膜为分离介质，在外界压力作用下，使小分子透过膜，而 大分子如蛋白质、多糖等则不能透过膜，从而达到分离、提纯的目的。该方法优点是能 保留有效成分，操作方便，能耗低，分离效率高，无二次污染，可在常温下进行操作， 适用于热敏性物质，是一种高效、节能、无污染的新型分离技术。超滤膜的孔径通常在 3 r i m - 3 0 0 h m 之间，选用不同孔径超滤膜，可以将相对分子质量在几百到几十万之间的 物质同时进行分离。超滤膜的工作压力为0 2 m p a 加4 m p a ，常用的膜材料为聚丙烯腈、 聚醚酮、聚砜，聚酰胺嘲”“。 聚酰胺吸附色谱法，聚酰胺( p o l i a m i d e ) 吸附属于氢键吸附，是一种用途十分广 泛的分离方法，极性物质与非极性物质均可以使用，特别适于酚类、醌类、黄酮类的物 质。聚酰胺为高分子聚合物质，不溶于水、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿、丙酮等常用有机 溶剂，对碱特别的稳定，对酸尤其是无机酸稳定性差，可溶于浓盐酸、冰醋酸及甲酸。 通过分子中的酰胺羰基与酚类、黄酮类化合物的酚羟基，或酰胺键上的游离胺基与醌类、 脂肪羧基上的羰基形成氢键缔合而产生吸附。聚酰胺与酚类或醌类等化合物形成氢键缔 合的能力在水中最强，在含水醇中则随着醇的浓度增高而相应减弱，在高浓度醇或其它 有机溶剂则几乎不缔合。聚酰胺对一般酚类、黄酮类化合物的吸附是可逆的，分离效果 好，加以吸附量又大，广泛应于酚类、黄酮类化合物的制备分离蚴旧1 。， 凝胶色谱法是一种新发展的分离分析技术，使用的固定相是凝胶，这是具有许多间 隙的网状结构的固体，有分子筛的性质。当被分离物质的分子大小不同时，它们能够进 入到凝胶内部的能力也不同。最常用的亲水凝胶是交链葡聚糖凝胶，是由葡聚糖( 右旋 糖酐) 和甘油基通过醚桥( 一o c h 2 c h o h c h 2 一o 一) 相交联而成的多孔性网状结构。 在交联葡糖分子引入一个基团增大亲脂性，成为疏水性凝胶，如在s e p h a d e xg 2 5 上引 人羟丙基基团成醚键的结合状态：r 一0 h 、r - o - c h c h c h o h ，即成为s e p h a d e xl h 一2 0 ，从 2 r ! 查竺! 主竺竺丝查 兰竺苎苎苎兰竺竺墨竺! 墨 而使它不仅具有亲水性能吸水，而且膨胀，这就扩大了它的应用范围，适用于难溶于水 的亲脂性成分及水溶性成分的分离8 ”m ”1 。 本章研究首先利用膜分隔不同分子量的组分，再经聚酰胺吸附分离，最后经过 s e p h a d e xl h 一2 0 葡聚糖凝胶对抗过敏成分做精细分离，经高效液相色谱法做相应分离 组分纯度的检测和验证。 4 1 材料、试剂和设备 4 1 1 材料： 样品g 聚酰胺( 8 0 1 0 0 目) 凝胶l h - 2 0 4 t 2 实验药品、试剂 无水乙醇( a r ) 丙酮( a r ) 氨水( a r ) 甲醇( a r ) 甲醇( h p l c 级) 乙腈( h p l c 级) 无水碳酸钠( a r ) 透明质酸钾 透明质酸酶 对一二甲氨基苯甲醛( a r ) 实验用水为超纯水 4 1 3 实验设鲁 膜实验机 h e p 一5 0 恒流泵 大孔树脂4 0 乙醇洗脱浓缩后样品 浙江台州市路桥四甲生化塑料厂 a m e r s h a mb i o s c i e n c e s 公司 洛阳市化学试剂厂 洛阳市化学试剂厂 广东爱廉化学试剂有限公司 广东光华化学厂有限公司 天津四友化学试剂厂 天津四友化学试剂厂 洛阳市化学试剂厂 s i g m a 公司 s i g m a 公司 上海试剂二厂 吉林金赛科技有限公司 北京慧德易科技有限公司 地榆聿嗵敏活性物质的研究 中压层析柱 常压层析柱 h d - 3 型紫外检测器 b s z - 1 0 0 自动部分收集器 x w t s 小型记录仪 高效液相色谱仪 浙江大学n 2 0 0 0 色谱处理软件 4 2 实验方法 4 2 。l 膜实验确定有效成分的分子量组成 美国m i l l i p o r e 公司 上海华美实验仪器厂 上海泸西分析仪器厂 上海泸西分析仪器厂 上海自动化仪器厂 美国p e r k n e l m e r 公司 浙江智达软件有限公司 将大孔树脂分离后，透明质酸酶抑制率最强组分，即样品g 重新溶解在水中，过滤 ，保留过滤液，弃去滤渣，过滤液依次过m = l o k i hh = 5 k d ；m = i k d 的中空纤维超滤膜分级 分离，得到溶液a ( m i o k d ) ，溶液b ( i o k d m 5 k d ) ，溶液c ( 5 k d m i k d ) ，溶液d ( m i k d ) 各溶液经真空浓缩，冷冻干燥后得样品g a 、样品g b 、样品g c 、样品g d ，测定透明质酸酶 抑制率。 4 2 2 聚酰胺分离抗过敏成分 将色谱柱( 3 0 c m x 2 2 c m ) 垂直夹在铁架台上，若柱底没有玻璃砂芯，可稍加一点玻 璃毛，以防填料漏出。关闭柱塞( 不要涂油脂) ，加蒸馏水约至色谱柱一半高。将5 0 9 层析 用聚酰胺( 粒度8 0 1 0 0 目) 倒在烧杯中，加蒸馏水5 0 m l ，轻轻转摇拌和均匀( 不要用搅棒 搅动，防止颗粒太细) ，再打开柱塞使柱内水不断流出的同时，把烧杯内的聚酰胺缓缓加 入。边加边用套有橡皮管的玻璃棒轻轻敲打色谱柱，使填料装填均匀，无气泡。当色谱柱 顶部水下降到距聚酰胺层高约i 5 厘米时，关闭柱塞。 将浓缩后的膜分离样品g c1 9 溶于少量水中，添加到分离柱中，依次用水，3 0 乙 醇，7 0 乙醇，7 0 乙醇( p h = 8 0 ，氨水调) ，7 0 乙醇( p h = 9 0 ，氨水调) 洗脱，收集洗脱峰，浓 缩、冷冻干燥得到五个不同洗脱样品，分别定义为样品g c 一1 ，g c 一2 ，g c 一3 ，g c 一4 ，g c 一5 ， 分别进行透明质酸酶抑制实验。 广西大掌司e 士掌位戗? 文 地榆审u 宅敏活性物质的研究 4 2 3 凝腔s o p b a d e xu f - 2 0 分离抗过敏有效成分 4 2 3 1 凝胶的溶胀 s e p h a d e xl h - 2 0 在使用之前必须进行溶胀，在溶胀的过程中，要尽量避免过分搅 拌，否则会破坏球形胶粒，且要避免使用磁力搅拌器。在室温下，将凝胶溶胀于层析 溶剂中至少三小时，溶胀后凝胶体积的大小决定于所使用的溶剂系统。溶胀凝胶体积沉 淀之后占总体积的7 5 ，上层溶剂占2 5 。将溶胀后的凝胶根据装柱要求均匀倒入柱 内，在保证胶粒不变形的前提下，应在尽可能高的压力下装柱，反压不要超过1 5 b a r 。 溶胀体积：由于s e p h a d e xl h _ 2 0 的溶胀体积依赖于溶剂，所以对于不同直径的柱可 根据比例增加或减少旧柱体积以便计算出新体积。 4 2 3 2 凝胶柱分离的参数 柱直径：r = 2 2 c m ；柱长：l = 4 0 c m ；柱体积：v = 1 5 1 9 c m 3 ；流速：l m l m i n l 4 2 3 3 样品在s e p h a d e xl h - 2 0 凝胶柱甲醇体系的分离 称取聚酰胺分离后透明质酸酶抑制率最强组分样品0 5 9 ，用少量甲醇溶解，过滤， 弃去残渣。将溶液全部转移到s e p h a d e xl h 一2 0 凝胶柱，用甲醇洗脱，在2 8 0 h m 处记录各 洗脱液的吸收值，收集波峰溶液。 4 2 3 4 样品在s e p h a d e xl h - 2 0 凝胶柱乙醇体系的分离 称取聚酰胺分离后透明质酸酶抑制率最强组分样品0 5 9 ，用少量乙醇溶解，过滤， 溶液全部转移到s e p h a d e xl h 一2 0 凝胶柱，用乙醇洗脱，在2 8 0 n t o 处记录各洗脱液的吸 光值，收集波峰溶液。 4 2 3 5 样品在s e p h a d e xl h - 2 0 凝胶柱丙酮、乙醇体系的分离 称取聚酰胺分离后透明质酸酶抑制率最强组分样品0 5 9 ，用少量水溶解，溶液全 部转移到s e p h a d e xl h - 2 0 凝胶柱，先用丙酮洗脱，再用纯乙醇进行洗脱，在2 8 0 h m 处记 录各洗脱液的吸收值，收集波峰溶液，浓缩、干燥分别得到样品i ，。 4 z 4 高效渍相色谱的分析 4 2 4 1 色谱条件： 色谱柱：s p h e r i - 5o d sc 1 8 ( 2 5 0 砌4 6 r a m , 5 pm ) ；流动相：a 乙腈，b 水，c 甲醇，本实验选用三种不同比例洗脱剂，分别为a ：b = 8 0 ：2 0 ；a ：b = 2 0 ：8 0 。, 6 ； b ：c = 8 0 ：2 0 ；流速1 0m l m i n 一；进样体积1 0 0 uh 柱温：2 5 c ：检测波长2 8 0 h m 。 - 3 l ! 查竺壁竺苎笙查兰丝苎兰箜兰竺丝墨竺! 墨 4 2 4 2 样品测定 称取凝胶纯化后透明质酸酶抑制率最强的样品，用超纯水将样品溶解，经o 4 5i im 微孔滤膜过滤后，进入高效液相色谱仪进行测定，记录相应色谱峰。 4 3 结果与分析 4 3 1 膜分离地榆抗过敏有效成分 墓 壹 兰 暑 誊 毫 ： 星 罢 王 g g bg c s a m p l e s ( 2 m g m l 1 ) g d 图4 - l ：膜分离不同组分的抑制率和回收率 f i g u r e4 - 1 ：i n h i b i t i o na c t i v i t yo f h y a l u r o n i d a s ea n dr e c o v e i yp e r c e n to fs a m p l e ss e p a r a t e dw i t h h y p e r f i l t r a t i o nm e m b r a n e 对地榆4 0 乙醇大孔树脂洗脱组分，即样品g ，按分子量m = i o k d 、m = s k d ，m = i k d 进 行超滤膜截留分离，共得到四个组分，分别为样品g a ，g b ，g c ，g d ，进行透明质酸酶 抑制率的测定。结果如图4 - 1 所示：经过不同分子量的过滤截留，透明质酸酶抑制率得 到了进一步的提高，样品g c 的透明质酸酶抑制率为最高，达到了8 4 ( 2 m g m l 。1 ) ，属于 强抗过敏性组分，其分子量主要集中在1 k d 一5 k d 之间，可为进一步提纯分离提供参考。 地榆剖嗵铖活性物曩 的研究 4 3 2 聚酰胺对地榆抗过敏有效成分的分膏 将经膜分离后透明酸酶抑制最强的组分，即样品g c ，溶解、加入到聚酰胺柱上， 按多酚类物质在聚酰胺上吸附能力的大小进行洗脱，洗脱剂选为水，3 0 9 6 乙醇，7 0 乙 醇，7 0 7 , 醇( p h = 8 0 ，氨水调) ，7 0 7 , 醇( p h = 9 0 ，氨水调) ，流速l m l r a i n - 1 ，2 8 5 n m 处记录 吸光值，分离色谱图如图4 2 所示。 e c o n 一 q 2 5 z o 1 5 1 o o 5 o o o5 01 0 0 1 5 0 t u b en u m b e r 图4 2 ：样品c , c 的聚酰胺洗脱曲线 f i g4 - 2 ：e l u t i o nc u t - r eo f s a m p l eg c o i ip o l i a m i d ec o l u m n 从图4 2 可以看出，地榆过膜后的样品经聚酰胺吸附，不同极性溶剂洗脱后，样品 按在聚酰胺中吸附能力的不同，得到了进一步的分离。对1 5 组分洗脱液收集，浓缩 干燥后得到样品g c - 1 ，g c - 2 ，g c - 3 ，g c - 4 ，g c 一5 ，进行透明质酸酶抑制实验。各部分 的抑制率及回收率如图4 3 所示。 g - 西大掌司e 士掌位论文 地