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提高酶解蔗渣生产单糖产率的研究 摘要 甘蔗渣是制糖工业的主要副产品。目前大部分的蔗渣没有得到充分 利用而被烧掉，既污染环境又造成能源的浪费。为提高其综合利用率， 结合当前生物能源蓬勃发展的趋势，本论文重点从预处理和酶解的角度 来研究不同预处理条件和酶解条件对单糖产率的影响，为进一步将其用 于生产燃料乙醇或其他产品提供基础。 本研究首先采用非木质造纸原料成分分析标准测定了蔗渣中各组分 的含量，其次通过单因素分析和响应面实验设计优化了用过氧化氢乙酸 系统去除木素的预处理条件和酶解反应条件，并进一步探索了预处理对 酶解的影响。 实验得到蔗渣最优预处理条件：用浓度为6 4 2 8 的h z o 。一h a c ，7 4 9 3 处理2 8 4 6 h ，此时木素的去除率可达9 5 。通过f t i r 和x 光衍射分析 得到预处理在去木素的同时也降低了纤维素的结晶度。同样的方法得到 的最优酶解条件：在控制反应体系的p h 为4 4 0 、加入1 2 5 m g m l 的纤维 素酶0 1 0 2 6 m l 时，在5 0 。c 条件下酶解3 6 。6 0 h ，此条件下的酶解得率可 达3 6 1 3 3 9 。离子色谱分析结果表明酶解液中葡萄糖和木糖的含量分别 为1 8 9 8 9 6 和6 0 1 。 研究结果表明，蔗渣可作为生产单糖的自然资源，将酶解所得单糖 用于进一步生产燃料乙醇和其他化学品有很深远的意义。 关键词：蔗渣过氧化氢乙酸酶解生物燃料 s t u d y o nt h ee n z y m a n ch y m 姗ch y d r o l y s i s o fb a g a s s et om o n o s a c c h a r i d e a b s t r a c r b a g a s s ei s am a j o rb y p r o d u c tf r o ms u g a rm a n u f a c t u r e c u r r e n t l y ，t h i s f i b r o u sr a wm a t e r i a lh a sn o tb e e nf u l l yu s e db u tb u r n tt or e c l a i mi t sp a r t i a l s o l a re n e r g y t h i sp r a c t i c ei sn e i t h e re n v i r o n m e n t a l l yb e n i g nn o re n e r g y e f f i c i e n c y i no r d e rt om a k ef u l lu s eo ft h i sn a t u r a lr e s o u r c e ，t h i sp a p e rh a s s t u d i e dt h ei n f l u e n c eo fp r e t r e a t m e n tc o n d i t i o n so nt h ee n z y m a t i ch y d r o l y s i s o fb a g a s s e r e s u l t so ft h i ss t u d yw i l le s t a b l i s hap l a t f o r mf o rt h ef u r t h e r g e n e r a t i o no f e t h a n o lf u e la n do t h e rc h e m i c a l sf r o mb a g a s s e t h e s t u d yb e g a n w i t ht h e c o m p o s i t i o nd e t e r m i n a t i o n 研b a g a s s e f o l l o w i n g t h es t a n d a r d p r o c e d u r ee m p l o y e db yp u l p i n gi n d u s t r i e s b y e m p l o y i n gr e s p o n s es u r f a c ed e s i g no fs i n g l ef a c t o ra n a l y s i s ，t h es t u d yt h e n c o n d u c t e das y s t e m a t i ci n v e s t i g a t i o no nt h eo p t i m a lc o n d i t i o n sf o rb a g a s s e p r e t r e a t m e n tu s i n gp e r o x i d e - a c e t i ca c i ds y s t e mi nt e r mo fl i g n i nr e m o v a l ，a n d t h eo p t i m a lc o n d i t i o n sf o re n z y m a t i ch y d r o l y s i s w i t ht h eo p t i m a lc o n d i t i o n s e s t a b l i s h e d ，t h es t u d yh a sf u r t h e re x p l o r e dt h ei n f l u e n c eo ft h et r e a t m e n to n e n z y m a t i ch y d r o l y s i s r e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h et r e a t m e n to fb a g a s s eu s i n g6 4 2 8 h 2 0 2 - h a c u n d e r7 4 9 3 。cf o r2 8 4 6 hc a nr e a c ho p t i m a lr e s u l t l i g n i nr e m o v a lu n d e rt h i s o p t i m a lc o n d i t i o ni s9 5 f h rs p e c t r o s c o p ya n dx r a yd i f f r a c t i o ns t u d i e s i n d i c a t e dt h a tt h ep r e t r e a t m e n th a sl e dt oad e c r e a s ei nc r y s t a l i n i t yo fc e l l u l o s e b e s i d e st h ee l i m i n a t i o no fl i g n i n s i m i l a r l y ，t h eb e s tr e s u l to fe n z y m a t i c h y d r o l y s i so fp r e t r e a t e db a g a s s ec a nb eo b t a i n e db yu s i n g0 1 0 2 6m l c e l l u l a s e ( t h ed e n s i t yi s1 2 5 m g m e ) i np h 4 4b u f f e rs o l u t i o nf o r3 6 6 hu n d e r 5 0 。c u n d e rt h eo p t i m a lc o n d i t i o n ，3 6 1 o r g a n i cm a t t e rc a nb ed i s s o l v e d i o nc h r o m a t o g r a p h yd a t ai n d i c a t e dt h a tt h ee n z y m o l y s i sf l u i dc o n t a i n e d 1 8 9 8 g l u c o s ea n d6 0 1 x y l o s e r e s u l t so ft h i s s t u d yt h u ss h o w e dt h a tb a g a s s ec o u l db eap o t e n t i a l n a t u r a lr e s o u r c ef o rt h ep r o d u c t i o no fm o n o s a c c h a r i d e ，w h i c hc o u l db ef u r t h e r u s e df o rt h eg e n e r a t i o no fe t h a n o lf u e la n do t h e rc h e m i c a ls t o c k s k e y ，w o r d s ：b a g a s s e ；h y d r o g e np e r o x i d e ；a c e t i ca c i d ；e n z y m a t i c h y d r o l y s i s ；e t h a n o lf u e l i i i 广西大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和 相关知识产权属广西大学所有，本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本 论文的研究内容。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究成果，也 不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮助的个 人和集体，均已在论文中明确说明并致谢。 论文作者签名：审军贺 学位论文使用授权说明 洳3 年6 月j 如 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本： 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 国蔷时发布口解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 论文作者签名：曙贺 导师签名：翻留最沙矿汐年石月日 广西大掌硕士掌位论文 援爿疆謦解蔗渣生产簟蓿产率的研究 1 1 蔗渣利用概述 第一章引言 蔗渣是甘蔗糖厂最大量的副产物，它是甘蔗经压榨或渗出处理后剩余的纤维残渣 m ，产率约为加工甘蔗量的2 4 - 2 7 ( 以5 0 9 6 水分计) 。我国一个中等规模的甘蔗糖厂， 若一个生产期加工1 0 万t 甘蔗，将生产湿蔗渣( 以5 0 9 6 水分计) 2 5 万t 左右，每个 糖厂都库存着大量的甘蔗渣，按每产1 吨糖就产生2 吨的甘蔗渣计算，目前我国甘蔗 年产量在8 5 0 0 万t 左右，也即甘蔗渣年产量约为2 2 0 0 力t 左右圆。 世界年产蔗渣量( 以5 0 9 6 水分计) 2 亿t 左右，数量相当大。这是一种丰富的资 源。因此，若能将其充分综合利用，将在实际应用中提高其经济效益。 1 1 1 蔗渣的组成 蔗渣的利用途径主要取决与蔗渣的组成。甘蔗渣的一般组成1 如下： 纤维素4 5 5 0 半纤维素2 2 - 3 0 木质素1 8 2 3 蔗蜡2 4 可溶性固溶物卜3 蔗渣的主要特点如下： 蔗渣以纤维素及半纤维素为主要成分，是木材制品的理想代用品。 蔗渣已经过破碎过程，纤维已初步散解，有利于综合利用。 蔗渣纤维组织中含有一定数量杂细胞，性质与木材不尽相同，对某些利用带 来不利影响，要加以处理。 蔗渣中含有少量糖分。 捷j 滔参解蘑渣生产簟稠| j 一率的研究 1 1 2 蔗渣综合利用概况 8 0 年代初，世界著名制糖专家陈其斌( 美籍华人) 博士来华讲学时介绍，世界上 蔗渣综合利用项目已达5 0 0 多项。目前具有工业生产规模的利用途径主要集中在如下 几个方面：燃料、制浆造纸、人造板、饲料、糠醛、木糖醇、羧甲基纤维素等h 1 。据 资料报道，以一吨甘蔗渣制成下列产品的经济效益对比为： 燃料 3 0 活性炭6 5甲烷 3 0c m c8 9 0 商品电 5 5 糠醇 1 0 6 糠醛 1 2 8木糖醇1 2 8 漂白纸浆1 5 0纤维板1 2 0新闻纸2 5 0碎粒板 1 0 0 书写纸2 5 0 1 1 2 1 燃料 干蔗渣成分绝大部分是可燃物质，干蔗渣的净热值相当于标准煤的3 3 。甘蔗制 糖生产过程要耗用大量蒸汽和电力，以蔗渣作锅炉的燃料历来是最广泛的利用途径。 在一些非产石油国家，为了减少对进口石油的依赖性，热电厂常以蔗渣、煤和糖蔗残 杂物( 蔗梢、蔗叶) 作燃料。 1 1 2 2 蔗渣纸浆造纸卜m 从干蔗渣组成来看，其含纤维素和半纤维素高达7 0 - 8 0 ，纤维也较细长，是造 纸的好原料。过去造纸主要以木材为原料。由于木材再生周期长，资源不断减少，因 此在使用蔗渣纤维素造纸在国民经济中具有重要意义。 糖厂生产的蔗渣纤维已经过充分破碎处理，利用蔗渣造纸可以减少纸浆造纸过程 的原料运输、收集、处理等工作量。因此蔗渣造纸是糖厂综合利用的一条较好的途径。 目前世界上利用蔗渣制浆造纸的产量已经超过2 0 0 万t ，我国利用蔗渣造纸的年 产量估计在1 0 万t 左右。用蔗渣生产的质的品种主要有：书写纸、印刷纸、打字纸、 包装纸、牛皮纸、纸模、卫生纸等。近年来，糖厂还生产掺有部分棉浆的吸水性较强 的餐巾纸和纸尿巾 1 1 2 3 蔗渣人造板8 h 1 0 1 蔗渣纤维在制糖预处理和压榨过程被充分破碎，使蔗渣成为较小的纤维粒子，大 部分可作为人造板的原料。 以蔗渣制人造板，近年在国内外都发展很快。常见的蔗渣人造板主要有碎粒版和 2 广西大d 昀炙士掌位论文提舞晴睡解蔗渣生产单捌 产率的研究 中密度纤维板。 1 1 2 4 蔗渣作饲料n 妇 蔗渣用作反刍动物的粗饲料，是由于蔗渣富含纤维素，与糖蜜、尿素等配合使用， 能使营养成分较全面和协调。 美国檀香山海洋研究所开发了以蔗渣为主要原料的虾饲料。蔗渣先经过裂解和膨 化处理，制成粉状物，再配以其他营养物，制成虾的配合饲料。其中，8 0 9 6 为经膨化 处理过的蔗渣：2 0 9 6 为以含甲壳质为主的廉价蛋白质、脂肪和矿物质等。配料混合后， 压制成小颗粒，适于水产化饲养。据介绍成本仅及一般商品饲料的4 0 ，生产成本1 0 0 美元t ，而进口饲料为3 0 0 4 5 0 美元t 1 1 2 5 以蔗渣为原料生产羧甲基纤维素。n 町 羧甲基纤维素是一种可溶性纤维素( 简称c m c ) 以蔗渣生产c m c 是高附加值产品， 经济效益甚好，这主要是c m c 用途广泛，在食品、石油钻井、纺织、肥皂、香料、医 药、农药、农肥、种子、装修等行业都有应用。 c m c 在食品中具有强化、增稠、增粘、稳定等功能，对人体具有减肥作用：由于 豆奶、椰汁、粒粒橙、冰淇淋等饮料中可改善其口感，并无毒副作用。 c m c 的国际市场价格约4 0 0 0 美元t ，而国内零售价为4 万元t ，国内生产的食品 用c m c 的售价为1 7 3 0 万元t 。 生产方法可采用纸浆半成品、经碱处理获纤维素，再与一氯乙酸反应，生产流程 如下： n a o h 氯乙酸 纤维素_ i 嚣一碱纤维素_ i 赢 c m c 一 洗涤一c m c _ ；嘉c m c 一包装 _ 成品 1 1 2 6 蔗渣生产糠醛和木糖醇5 m 6 蔗渣中的半纤维素的主要成分是多缩戊糖，分子式( c 5 h 6 0 4 ) 。，m 为聚合度，一般 m 值为1 5 0 左右。蔗渣中的多缩戊糖是由木糖和阿拉伯糖组成的。 以蔗渣为原料生产糠醛：蔗渣经水解，其中的多缩戊糖大部分解聚，成为戊 糖，脱水后获得糠醛。糠醛是一种重要的化工原料，可用于制造尼龙、合成橡胶、塑 料、农药等，也是石油提炼工业使用的选择性很好的溶剂。目前国外利用蔗渣生产糠 3 广西大掌硕士等唧立论文提j 蹭睡解蔗渣生产单籍产率的司阳奄 醛的大型厂有数家，多米尼加和墨西哥各有一家年产万吨糠醛的生产厂，另外还有数 间年产数千吨糠醛的厂。南非在这方面利用也取得了成功。国内目前只有江门甘蔗化 工厂以蔗渣为原料生产糠醛，年产量为2 0 0 0 t 。 以蔗渣为原料生产木糖醇：木糖醇的分子式为c 5 h 。：0 。生产方法是：将玉米 芯、棉籽壳、甘蔗渣等水解，经离子交换净化，脱色制的木糖液，再经加氢反应、离 子交换、蒸发浓缩、结晶、分离而得木糖醇。木糖醇具有与蔗糖相当的甜度，可作为 糖尿病人的甜味剂。由于木糖醇口感清爽可口，而且不会引起龋齿，可用于制口香糖 和牙膏，木糖醇用于医药和特殊食品，经济效益高。 1 2 本论文的选题背景和意义 随着经济和社会的发展，人类正面临着人口急剧增长、资源匮乏、能源短缺和环 境污染四大难题，能源和化学工业过分依赖石油，煤炭天然气为主的化石燃料。中国 除煤炭资源可以开采2 0 0 年外，石油仅可开采4 0 年，天然气可开采6 0 年。因此开发 可再生能源和新的化工原料已经刻不容缓。以化石燃料为原料的能源工业和化学工业 排放出大量的有害废弃物，引起了严重的环境污染；大量的城市垃圾含有大量的纤维 素，既污染环境又浪费资源；农村农业废弃物的燃烧污染了大气环境，环境问题也促 使我们寻找可持续发展的可再生资源及其清洁利用途径。生物质能一直是人类赖以生 存的重要能源，它是仅次于煤炭和天然气而居于世界能源消费总量第四位的能源引。 从长远利益来看，液体燃料短缺将是困扰人类发展的大问题，而如果经济步入了健康 的发展轨道，可再生能源的消耗最终会增长，从而逐步取代以前的燃料。地球上的生 物资源的年产量相当于目前所需能源的1 0 倍，但被作为能源利用的生物质资源还不 到1 ，所以生物质转化能源的技术很有发展前途。据估计，生物质能极有可能成为 未来可持续能源的组成部分n 酬例。到2 l 世纪中叶，采用新技术生产的各种生物质替 代燃料将占世界总能耗的4 0 以上。 中国是一个人口大国，又是一个经济迅速发展的国家。2 l 世纪将面临着经济增 长和环境保护的双重压力。因此，改变能源生产和消费方式，开发利用生物质能等可 再生清洁能源资源对简历可持续发展的能源系统，促进国民经济发展和环境保护具有 4 提离翻 解蔗渣生产革糖产率的习院 重大的意义。以木质纤维素为原料制备乙醇和生物质发酵制备沼气是生物质能源化利 用研究的最广泛的课题纯乙醇或汽油与乙醇的混合物都可作为汽车燃料嘲。燃料乙 醇放出有害气体比汽油少得多，温室气体c 0 2 的净排放量也很少，就燃料本身而言， 掺入1 0 - 1 5 的乙醇可使汽油燃烧的更完全，减少了c o 的排放量，乙醇作为汽油的 添加剂，安全替代原来的m t b e ( 甲基叔丁基醚) 的作用，而m t b e 有毒，易污染地下 水，在有些地区已被禁用。 目前比较成熟的生产乙醇的生物转化方法以甘蔗汁和玉米淀粉作为原料，虽然 以粮食为原料生产燃料乙醇工艺简单，但其原料成本高达总成本的4 0 1 ，产量的增 加也有一定限度。对美国来说，用于乙醇生产的玉米每增加2 5 0 万吨，玉米价格就要 上涨1 2 - 2 0 美元k g 。在中国，由于人口众多的特殊国情，能用于生产燃料乙醇的 粮食显得更有限。另外，研究表明，纤维素原料生长使用一个单位的能量，可得到近 5 5 个单位价值的乙醇。它比从谷物生产乙醇的效率甚至更高。纤维素乙醇排放主要 的温室气体二氧化碳比谷物基乙醇远远少得多。纤维素乙醇排放二氧化碳比一般的汽 油要少8 0 ，而谷物基乙醇仅少2 0 。因而以廉价且来源广泛的木质纤维素生产燃料 乙醇具有很大的发展前途。 木质纤维素制备乙醇的过程主要包括三个阶段。第一阶段是通过物理的、化学的 或酶技术将纤维素聚合物降解为单糖；第二阶段是微生物( 一般采用酵母) 将糖转化 为乙醇；第三阶段是通过蒸馏回收乙醇。其中，第一阶段最为重要。本论文进行的就 是第一阶段的研究，以广西最丰富的生物质资源、甘蔗糖厂的副产品一一甘蔗渣为原 料，先经过物理化学方法预处理，再进行酶解。旨在找到一种最优的预处理条件和酶 解条件，最大程度地提高单糖得率。 1 3 各国木质纤维原料生物转化燃料乙醇研究进展 1 3 1 主要原料 木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源，据估计木质纤维素原料占世界生物质 量( 1 0 0 亿 一5 0 0 亿t ) 的5 0 5 1 啕，这些丰富而廉价的自然资源可以来源于： 5 提力瞪善解蔗渣生产单s s - 产率的研究 农业废弃物，如麦草、玉米秸秆、玉米芯、大豆渣、甘蔗渣等； 工业废弃物，如制浆和造纸厂的纤维渣、锯末等； 林业废弃物； 城市废弃物，如废纸、包装纸等。 1 3 2 关键技术 预处理工艺：即通过各种方法，如气爆法、湿氧化法、稀酸法或几种方法的 组合，破坏秸秆中的纤维素、半纤维素与木质素的结构，使之松散，亦可使半纤维素 水解； 水解工艺：即通过酶法或酸法把上述物质中的纤维素、半纤维素水解成六碳 糖和五碳糖； 发酵工艺：选用特殊的共酵菌种对上述六碳糖和五碳糖进行发酵，生产酒精。 1 3 3 主要研究障碍 酶解成本过高； 缺乏经济可行的五碳糖发酵技术。 因此，技术路线的优化组合问题、生产过程中成本降低的问题以及提高产率等问 题，值得我们认真深入探讨、研究、解决。 1 3 4 各国研究进展 美国h 矧：1 9 9 9 年能源部计划到2 0 1 5 年把燃料乙醇的成本降低3 6 ，可以实现技 术和经济问题过关，实现工业化生产。美国用纤维素制乙醇的技术开发较早，酒精燃 料在美国的燃料市场上的份额已达到8 。第一家商业性转化纤维质为酒精的工厂b c i n t e r n a t i o n a l 成立于1 9 9 8 年，该厂以蔗渣和稻壳为原料，年产酒精2 0 x1 0 6 加仑。 除此之外，城市垃圾生产酒精的建厂计划亦在进行中。 6 提高酶解蔗渣生产簟糖产率的研究 加拿大：渥太华的生物技术公司i o g e n 是首家纤维质乙醇工业化公司，处于世界 领先地位。使用原料为麦秸( t g 可利用玉米秸秆及其他农作物废弃物为原料) ，采用的 技术是用稀酸结合蒸汽气爆预处理半纤维素，随后在含木质素和木糖的环境下用纤维 素酶水解纤维素；液固分离，固形部分( 木质素) 燃烧或资源利用，液体进行木糖和葡 萄糖联合发酵：发酵物蒸馏，蒸馏后残渣用于发电或产热。每周处理能力2 5t 麦秸， 年产3 2 万l 乙醇。该公司准备在加拿大或美国爱达荷州建设一个耗资3 5 亿美元的工 厂。s u n o p t a 公司采用稻草、玉米秸秆、草、树片、甘蔗渣等为原料生产各种生物转 化产品，如纤维质乙醇、纤维质丁醇、木糖醇和膳食纤维等。该公司在世界范围内的 纤维质原料转化乙醇技术上，处于领先地位，采用的技术是高压下连续气爆处理生物 质，原材料包括木片、甘蔗渣、各种谷物秸秆、废纸等，中试厂处理原料为5 0 0 k g h 。 此技术已经在意大利、美国、芬兰和法国等国应用。该公司拥有预处理系统所有权和 专利技术，同时也是世界上唯一能进行连续工业化生物质预处理装置的单位。 日本：由于国内粮食生产不足，故对以纤维素为主的生物质废物为原料生产燃料 乙醇的技术十分重视。日本国内有不少企业开展了利用废木屑生产燃料乙醇的技术开 发，其中以日本食粮公司发明的方法别具特色。该法先将废木材破碎为数毫米的碎片， 再用臭氧处理，然后放入自行开发的酵素，将木材中的纤维素和半纤维素加水分解为 葡萄糖、木糖，最后经酵母菌发酵生产乙醇。该项目已于2 0 0 3 年5 月投资5 亿日元建成 工试，目前日产乙醇2 5t 。试成后拟建2 0 0t d 商用装置，成本目标为2 5 同元l ，将 低于美国现有水平。 欧洲嘲：主要采用两种方法水解纤维素，一种是“稀酸水解 ，用稀硫酸或二氧 化硫做催化剂在2 0 0 下进行水解反应。如果采用浓酸水解，则反应可在较低温度下 进行，此时产率较高，副产物较少，存在的问题是在分离回收酸液时应尽量减少对环 境的污染。另一种是“酶水解”，原料经稀酸预处理后再酶解。目前，稀酸技术在反 流收缩床技术中的应用正在研究中。 我国 捌：目前我国有一些科研机构、大学和企业在这方面也开始了研发工作， 取得了一些进展，但是由于基础研究不够，生产成本过高，只有很少成果能投入实际 应用。 由此可见，木质纤维原料生物转化燃料乙醇技术还不够成熟，还有很大的研究发 展空间。上述各种关键技术和主要障碍也成了各国的研究重点。 7 g - 西大掌司e b 掌位论文 提奠n 謦解蔗渣生产单糖产率的研究 1 4 木质纤维原料组成及其水解方法 1 4 1 木质纤维原料的组成 木质纤维原料的主要化学组成妇见图1 - 1 所示 植物纤维 原料 竺爨差赞l 厂 堡查竺竺竺 主要成分l 一 一 黔子ib i - 量物质) il _ 1木素 少量组分 ( 低分子 量物质) 无机物 ( 灰分) 有机物 纤维素 半纤维素 有机溶剂 抽出物 图1 - 1 木质纤维原料的主要化学组成 f i g 1 1 m a i nc h e m i c a lc o m p o s i t i o no f w o o df i b e rr a wm a t e r i a l 在植物纤维原料中，最主要的化学成分是碳水化合物，其含量因原料的不同而异， 主要以纤维素和半纤维素的形式存在。此外，木素也是一种主要的高分子化合物口州矧。 1 4 1 1 纤维素 纤维素的结构式为( c 6 h 。0 5 ) 。h ：0 ，由吡喃式葡萄糖基由1 3 - 1 ，4 一糖苷键结合而成的 线性大分子化合物m 1 。纤维素分子中的羟基易于和分子内或相邻的纤维素分子上的含 氧基团之间形成氢键，这些氢键使很多纤维素分子共同组成结晶结构，并进而组成复 杂的微纤维、结晶区和无定形区等纤维素聚合物，进而构成纤维细胞壁的网状骨架。 维素分子中的b - 1 ，4 葡萄糖基含量即为纤维素分子的聚合度。蔗渣纤维素平均聚合 度约为1 0 0 0 左右汹3 ，其中大约3 0 - 1 0 0 个纤维素分子在氢键作用下，形成结晶的或 8 主t 矗汀睡解蔗渣生产簟糖产率的研究 类结晶的微纤丝。微纤丝的结晶部分是由纤维素分子整齐规则地折叠排列，在微纤丝 的结晶部分里，葡萄糖分子的羟基在分子内部或分子外部的氢离子相结合，没有游 离的羟基存在而具有牢固的结晶构造。因此，纤维素结晶部分比较难分解。只有破坏 纤维素结晶结构，纤维素酶才能有效地降解纤维素。 1 4 1 2 半纤维素 半纤维素在结构和组成上变化很大，是一类由多种糖基( 戊糖基、己糖基) 和糖 醛酸基所组成的无定形物质，并且分子中往往带有较短且高度分枝的支链。半纤维素 侧链糖基为戊糖基( 以木糖、阿拉伯糖基为主) 和已糖基( 葡萄糖基、甘露糖基、半 乳糖基、鼠李糖基) 啪1 。各种糖所占比例随原料而变化，一般木糖占一半以上。甘蔗 渣的半纤维素含量一般为2 7 6 8 一3 6 1 ，其中大约7 0 为木聚糖，3 0 为聚阿拉伯 糖。半纤维素组成复杂，其分解需要多种酶的作用。半纤维素的彻底降解需要木聚糖 酶、木糖苷酶、阿拉伯糖苷酶和葡萄糖醛酸酶，其分解产物主要是木糖、阿拉伯糖和 葡萄糖醛酸口力。半纤维素与纤维素不同，它很容易被水解。但是由于半纤维素和纤维 素交杂在一起，所以只有半纤维素也被水解时，纤维素才可能全部水解啪。 1 4 1 3 木素 木质素由苯丙烷结构单元通过醚键、碳一碳键联接而成的具有三度空间结构的芳 香族高聚体化合物，其分子式可简单表示为( c 6 h 0 2 ) 。分子质量为2 4 5 3 0k u ，高 低值分布较广。木质素由于分子大，没有易被水解的键，溶解性差，且含有各种稳定 的复杂的键型及重复的单元，微生物及其分解的胞外酶不易与之结合，对酶的水解 作用呈抗性，是微生物难以降解的芳香族化合物。蔗渣的木质素在甘蔗表皮组织部分 含量较多，约占1 9 一2 3 。蔗渣的木质素分子质量和聚合度低，降低了木质素的稳 定性，这是蔗渣容易蒸煮的原因之一。蔗渣以纤维素的结晶微纤丝为骨架，木质素和 半纤维素形成牢固结合层，包围着纤维素。蔗渣纤维素呈结晶化，木质素阻碍酶与纤 维素的接触，造成蔗渣酶水解的困难。因此，保持蔗渣的酶水解有效地进行，应当破 坏木质素和半纤维素的结合层，使纤维素的孔隙增大，提高纤维素与酶接触的有效比 表面积，从而提高糖化速度口。 1 4 1 4 甘蔗渣的主要组成及其化学结构嘲 蔗渣的组成化合物以纤维素、半纤维素、木质素为主，三者含量超过总质量的8 0 此外还有少量的粗蛋白，淀粉，糖醛酸和可溶性糖。各组分的化学结构见表卜l 9 提高酶解蔗爿曙毛产单糖产奉的研究 表1 - 1 主要组分的化学结构 t a b l e1 - 1m a i nc o m p o n e n tc h e m i c a lc o n s t i t u t i o n 1 4 2 木质纤维原料的水解方法 常用的水解方法是酸催化水解和酶水解h “。酸水解工艺发展相对成熟，包括浓酸 水解和稀酸水解。浓酸水解常用4 1 - 4 2 盐酸或6 5 - 7 0 9 6 硫酸或8 0 - 8 5 磷酸进行水解； 稀酸水解中酸浓度为0 3 - 3 0 9 6 ，温度在1 0 0 2 0 0 。然而，在酸水解过程中，使用了 大量的酸，氧化剂和敏化剂等化学试剂，水解条件较为苛刻，后续处理困难，且生成 很多副产物。这些副产物往往对后续发酵中菌体具有毒害作用。相对于酸水解来说， 酶水解过程反应条件温和，选择性强，专一性很强，可在低温常压下进行，副产物少， 糖得率高，无腐蚀，无环境污染，是一种清洁的生产工艺1 ，近年来成为纤维素催化 1 0 广西大掌硕士学位论文提高酶解蔗渣生产单糖产率的研究 水解研究的热点。 1 4 2 1 木质纤维酶基本性质 纤维素酶是一种多组分的复合酶h 2 1 ，一个完整的纤维素酶系，通常含有作用方式 不同而又能相互协同催化纤维素水解的三类酶n 羽吖删。这三种主要的酶组分是：内切 葡萄糖酶( e n d o - 1 ，4 1 3 - d - g l u c a n a s e ，e c 3 2 1 4 ，简称e g ) 、外切葡萄糖酶( e x o 一1 ，4 一 b o - - g l u c a n a s e ，e c 3 2 1 9 1 ) 又称纤维二糖水解酶( c b h ) 、一葡萄糖苷酶( b - g l u c o s i d a s e ，e c 3 2 1 2 1 ，简称b g ) 。此外，还有一些作用于半纤维素的补助酶，如 葡萄糖苷酸酶，木聚糖酶，半乳甘露聚糖酶等。 纤维素酶按底物特异性可将纤维素酶分成以下组分侧( 见表1 - 2 ) 表1 - 2 纤维素酶的多酶体系 t a b l e1 - 2 m u l t i - e n z y m es y s t e mo fc e l l u l a s e 组分 功能 外切o 一1 ，4 一葡聚糖酶作用于纤维素线状分子还原性末端，水解d - 1 ，4 一葡萄糖苷 ( c b h )键，产生纤维二糖 内切d 一1 ，4 一葡聚糖酶 作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机内切纤维素分子内 ( e g ) 的b 一1 ，4 一葡萄糖苷键，产生纤维寡糖、纤维二糖和葡萄糖 d - 1 ，4 一葡萄糖苷酶可水解纤维二耱、纤维寡糖及其他o 一葡萄糖苷， ( b g ) 产生葡萄糖 纤维二糖脱氢酶 以黄素腺嘌呤二核苷酸( f a d ) 和血红素( h e m e ) 为辅机。c d h ( c d h )有较广泛的底物范围，除纤维二糖外还可氧化纤维三糖、纤维 四糖、纤维五糖、乳糖及纤维素 纤维二糖醌氧化还原酶是种黄素蛋白，只含f a d ，c b q 不能还原细胞色素c ( c b q ) 磷酸化酶可使纤维二糖或纤维素磷酸化并最终高度代谢 纤维素酶小体由不同的纤维素酶按一定形式的复合体协同作用于纤维素 ( c e l l u l o s o m e ) 纤维素酶的分子结构分为：较大的核心为催化结构域( c a t a l y t i cd o m a i nc d ) 4 7 1 和较小的为纤维素结合结构域( c e l l u l o s e - b i n d i n gd o m a i nc b d ) 伽。 1 1 提囊订謦解蔗渣生产簟餐产奉的习陵 1 4 2 2 纤维素酶的水解机制 虽然已进行了大量研究，但对酶水解的详细机理了解仍然不是很清楚。纤维素的 降解，必须通过三类组分的协同作用n 州1 0 4 1 ，但是，对于纤维素酶各组分的作用方式， 许多研究者有不同的看法。目前普遍接受的酶解机制是内切一外切协同作用模型和外 切一外切协同作用模型侧。 内切一外切协同作用模型( 见图1 - 2 ) 不溶性纤维素了_ 嘉| 一- - 馈i 一 抑； 制! 图1 屯纤维素酶对纤维素的协同降解 f i g 1 。2 t h em o d e lo fc e l l u l o s eh y d r o l y s i sb yc e l l u l a s e 首先由内切酶作用于线性纤维素分子，在纤维素的无定型结构处剪断b - 1 ，4 连 接，产生还原末端以及可被外切酶作用的非还原端；随后外切酶( t r i c h o d e r m a 中为 c b h i 和c b h i i ) 在纤维素长链的非还原端剪下纤维二糖单元，同时为内切酶提供了更 多的结合位点；最后由b 一葡聚糖苷酶将纤维二糖单元转化为葡萄糖单体哑1 。纤维素 酶的活性，特别是c b h i ，受到纤维二糖的抑制，而b 一葡聚糖苷酶的剪切使纤维二糖 转化为葡萄糖，从而减小了这种抑制作用，使得水解过程继续进行。 外切- # b 切协同作用模型( 见图1 - 3 ) 汹1 此种作用模型是首先由外切型葡聚糖酶( c b h i 和c b hi i ) 水解不溶性纤维素，生成 可溶性的纤维糊精和纤维二糖，然后由内切型葡聚糖酶( e g i 和e gi i ) 作用于纤维糊 精，生成纤维二糖：再由c b 组分将纤维二糖分解成二个葡萄糖。 广西大粤页士掌位嵌譬提囊晴解蔗渣生产单糖产率的研究 c b hi 、 纤维素 纤维糊精1 五t _ i 五_ 斗纤笋糖 c b 图1 - 3 纤维素酶水解纤维素的可能途径 m g 1 - 3t h ep o s s i b l ep a t h w a yo fc e l l u l o s eh y d r o l y s i sb yc e l l u l o s e 这两种协同作用，仅在水解天然纤维素时发生，而水解羧甲基纤维素( c m c ， c a r b o x y m e t h yc e l l u l o s e ) 和羟乙基纤维素( h e c ，h y d r o x y le t h y lc e l l u l o s e ) 时 则不发生，纤维素内切酶和纤维素外切酶的酶解反应为多相反应，而1 3 一葡萄糖苷酶 水解纤维二糖的反应则属于均相反应。 蔗渣水解是不溶于水的纤维素和溶于水的纤维素酶决定了纤维素酶催化反应是 一个相异反应，通常只遵循图1 - 2 的协同作用模型进行水解。 1 4 2 3 纤维素酶水解作用的影响因素 纤维素的酶水解过程分为三个阶段：纤维素酶吸附到纤维素表面一纤维素在 酶组分的协同作用下水解产生可发酵糖类_ 酶脱吸附。底物、酶活性、水解条件， 如温度、p h 等都会影响纤维素酶水解作用剜删1 。 底物浓度 纤维素对纤维素酶的可及性是决定水解起始速率的关键因素嘲1 ，预处理的目的即 在于此。纤维素的可及性取决于纤维素的结晶度、聚合度，木素和半纤维素的机械障 碍以及原料的比表面积聆司。此外，木素和半纤维素都会对纤维素产生无效吸附作用嘲1 ， 有研究表明佑7 1 ，原料木素含量越低，纤维素的酶解率就越高。酶用量一定时，底物浓 度是影响酶水解的重要因素。在低的纤维素浓度下，增加其浓度可使水解速率上升， 增加酶水解糖得率，而高的纤维素浓度则会引起底物抑制，降低水解速率，其底物对 酶的抑制作用程度取决于纤维素含量与酶用量的比率油儿刚。由此可见，底物浓度是酶 解的关键，纤维素的预处理效果是提高底物浓度的关键，那么在预处理时尽可能降低 结晶度，聚合度，去除木素和半纤维素是研究的重点。 1 3 广西大掌硕士学位论文提矗n 睡解蔗渣生产单糖产率的研究 酶用量 在一定底物浓度范围内，随着酶用量的增加，酶解产量和速率都会增大刚嘲3 ，但 是成本也会随之增加，而纤维素分子能和酶分子结合的结合点数有限，当这些结合点 全被纤维素酶分子占据后，再增加纤维素酶用量，也不能增强酶解作用。因此实验研 究中也需探索合适的酶用量。 温度 环境温度对纤维素酶活性影响很大，酶水解的适宜温度是4 5 - 5 0 c 。 p h 值 纤维素的酶水解过程对p h 值的变化比较敏感，大多采用p h 4 8 。 反应时间 纤维素酶解周期较长，初期速度很快，2 4 h 后开始下降，4 8 h 后产糖量可达到总 产量的8 0 ，7 2 h 可酶解完全。 抑制剂和活化剂嘲 纤维素酶解反应产物纤维二糖和葡萄糖都会在一定程度上抑制其酶活，补充加入 b 一葡聚糖苷酶加速纤维二糖水解，同步发酵消耗葡萄糖等方法都可减少这种反馈抑 制作用魄1 ，但是本实验需要得到葡萄糖产物，这也是纤维素酶解单糖产率难于提高的 瓶颈。常用的抑制剂有： r 竞争性抑制剂：纤维二糖，葡萄糖和甲基纤维素 i i 天然的抑制剂：植物体内的某些酚，单宁，花色素 i 其他抑制剂：卤化物，重金属，去垢剂和染料 1 l 活化剂：m 9 2 + ，c o c l ：，c a 2 + 和中性盐类 1 4 2 4 纤维素酶水解的优缺点 由于酶作用具有专一性，纤维素酶水解只生成单一产物，故糖产率很高，且在酶 水解过程中基本上不添加化学药品，使提纯过程相对简单，同时也避免污染。此外， 酶水解所需设备简单，条件温和，具有能耗低的优点。但是一般所需时间较长m h 锄嘞1 。 1 4 2 5 提高纤维原料酶解效率和降低成本的途径 进一步开发经济、简便、高效的原料预处理技术； 选育纤维素酶高产菌株，或是采用基因工程技术构建高活力纤维素酶生产菌 株； 1 4 j - 西大掌硕士掌位论文提舞r 酶解蔗渣生产1 y t t t , 产率的研究 在酶水解过程中采用酶复合制剂，使各种不同性质的酶更好地协同作用； 在纤维原料酶水解过程中加入非离子表面活性剂，减少纤维素酶与纤维素之 间的不可逆结合和纤维素酶与木质素之间的非选择性吸附，从而提高纤维原料的酶解 效率； 将生成的糖从酶解系统通过超滤移出，或是采用同步糖化发酵及时利用生成 的可发酵糖，有效地消除产物抑制； 开发新型高效的生物反应器以适应同步糖化发酵、同步产酶与酶解等生物工 艺的需要。 1 5 木质纤维素原料的预处理 1 5 1 木质纤维素原料主要组分与预处理的关系 葡萄糖是微生物发酵的主要碳源，因此纤维素是木质纤维原料生物转化生产可发 酵糖的主要高分子碳水化合物。在预处理过程，应尽量避免纤维素的损失，以减少后 续发酵糖的分离和纯化成本。 半纤维素的存在会阻碍纤维素酶与纤维素的接触，从而降低纤维素的水解率。因 此只有半纤维素水解后，纤维素才能进一步完全水解。但半纤维素的阻碍作用要远小 于木素的阻碍作用。 一 木素是阻碍木质纤维原料酶催化水解的一个主要因素。木素的存在降低了纤维素 与酶的接触表面积，同时会造成纤维素酶的无效吸附，从而降低酶解效率。因此，预 处理最主要的目的就是要脱除木素。本论文以木素的含量作为预处理效果的评价指 标，并配合x 一光衍射实验验证结晶度的降低，并通过实验验证了预处理后木素含量 对酶解得率的影响。 1 5 2 预处理的目的和方法 由于自然界中的纤维素类物质结构很稳定，纤维素、半纤维素和木素问互相缠绕， 且纤维素本身存在晶体结构，会阻止酶接近纤维素表面，故生物质直接酶水解时效率 广西大掌硕士学位论文提高酶解蔗洼生产单糖产率的研究 很低，所以需要对原料进行预处理嘲，因此木质纤维素预处理的基本目的就是降低纤 维素的聚合度、结晶度，破坏木质素、半纤维素的结合层，脱去木质素，增加有效比表 面积，使纤维素的可及度增加m 1 ，从而提高酶解产率习。一般来讲，一个好的预处理工 艺应满足以下几个要求：提高糖的形成量或处理后酶催化水解中糖的形成量：没 有糖的降解和损失：没有会对后续发酵过程造成抑制的副产物产生：降低能耗和 成本。 。 对于木质纤维基质酶水解工艺中的预处理很早就有人研究，基本上可分为物理 法、物理一化学法、化学法以及生物法四大类嘲，其中，物理法包括机械粉碎、高温 分解和微波辐照，物理一化学法主要有汽爆、氨爆和c 0 2 爆破等，化学法根据所使用 的试剂分为无机酸、碱、有机酸和臭氧预处理，各种不同预处理方法的比较见表卜3 。 表i - 3 不同预处理方法的比较 t a b l e1 - 3c o m p a r i s o no fd i f f e r e n tp r e t r e a t m e n tm e t h o d 1 6 广西大学硕士掣啦论文提舞陌謦解蔗渣生产簟籍产率的句柏宅 本论文采用能较好的分离为纤维素、半纤维素和木质素不残留毒性、易回收的乙 酸阳门和无污染、脱木素效果较好的过氧化氢作预处理剂，既可以省去蔗渣处理前有机 溶剂抽提的步骤、实现工艺的简化，又降低成本、环保节能。 1 7 广西大掌硕士掌位论文 提力r 暑謦解蔗渣生产簟糖产率的习臼巴 2 1 实验材料与分析方法 2 1 1 实验材料 第二章蔗渣成分分析 弟一早 愿渔从万万1 ：l 蔗渣取自南宁糖业股份有限公司。原料自然风干后，经植物粉碎机粉碎，再筛分， 取4 0 - 6 0 目( 粒径范围为0 2 5 0 3 8 r a m ) 部分进行原料分析，小于8 0 目( 粒径 水分含量 灰分含量 苯醇抽出物含量 酸不溶木素含量 酸溶木素含量 综纤维素含量 由t a b l e2 一l 可知看出