（制糖工程专业论文）重组骨唾液酸蛋白的表达、纯化及活性研究.pdf

摘要摘要骨唾液酸蛋白( b o n es i a l o p r o t e i n ，简称b s p ) 是细胞外基质中的一种酸性糖蛋自，其组织分布具有局限性，分布在矿化组织，包括骨、牙齿和钙化的软骨等，主要由成骨细胞、破骨细胞以及软骨细胞表达和分泌。骨唾液酸蛋白参与组织矿化，与多种骨代谢性疾病有关，而近年来的研究又发现b s p 与肿瘤的骨转移、动脉粥样硬化及血管增生有关。因而深入研究b s p 的生物活性，揭示其作用机制，可以更好地指导相关疾病的临床诊断和治疗。稳定地获得b s p 是深入研究b s p 的重要保证，获得b s p 的途径有2 条：一是从骨中提取b s p ，二是在表达系统中表达重组r b s p 。二者在b s p 的研究中都具有重要作用骨b s p 和r b s p 的对比研究有利于揭示b s p 的结构与功能的关系，以及翻译后加工修饰对蛋白功能的影响。本文对b s p 在毕赤酵母中的表达进行了探索研究。首先根据g e n b a n k 中人骨唾液酸蛋白基因( h b s p ) 序列设计基因特异性引物，应用r t p c r 技术从人股骨外膜组织的总r n a 中扩增出b s p 的c d n a ，克隆至p b l u e s c r i p t1 1r i 质粒中，构建了重组质粒p b h b s p ，为b s p 的表达研究打下基础。在获得h b s p 基础上，根据毕赤酵母分泌型表达质粒p p i c z a a 及h b s p 序列设计p c r 引物，以重组质粒p b h b s p 为模板进行p c r 扩增，p c r 产物与质粒p p i c z c t a重组，构建了分泌型融合表达r h b s p h i s 6 的质粒p p i c z a a h b s p ；重组质粒p p i c z t t a ，h b s p 经电转化到毕赤酵母g s l l5 宿主细胞中，通过对转化子的初筛和复筛，筛选出r h b s p 表达量较高的毕赤酵母工程细胞g s l l 5 p p i c z a a h b s p ，检测结果表明，重组表达质粒已整合至宿主染色体上，表现为对甲醇敏感的m u t s 表型。在摇瓶发酵条件的研究中，确定工程细胞g s l l 5 p p i c z a a h b s p 表达r h b s p 的最适发酵条件为；以b m g y 作为种子培养基，菌体密度a 6 0 0 达到9 时，重悬于1 1 5体积的b m m y 中开始诱导表达，此时细胞密度相当于a 6 0 0 达到4 5 ，甲醇诱导剂量为2 ( v v ) ，p h 值6 ，0 ，诱导4d ，r h b s p 产量达高峰期，最大表达量为0 2 5 5g l ，表达的r h b s p 约占发酵上清液总蛋白的8 0 。融合表达的r h b s p h i s 6 的c 端带有6 h i s 纯化标签，能与n i 2 + 特异性结合，应用固定化金属离子亲和层析( i m a c ) 法进行纯化研究，在适宜纯化条件下目的蛋白r h b s p 达到电泳纯，s e p h a d e xg 2 5 柱脱盐后，r h b s p 浓度为0 7 5m g m l ，总回收率为7 5 。研究发现目的蛋白在s d s p a g e 中分布于4 3 6 6k d 之间，具有明显的分子量不均一性，说明在毕赤酵母中表达的r h b s p 存在糖基化程度的多样性。尽管毕赤酵华南理工大学工学博士学位论文母表达系统和哺乳动物细胞存在不同的糖基化方式，但本文表达的r h b s p 具有良好的b s p 抗原活性及生物学活性，表现出促进血管生成、介导细胞粘附和抑制羟基磷灰石晶体生长的活性。本文首次进行了重组人骨唾液酸蛋白在毕赤酵母中的表达研究，实现了r h b s p的高效分泌表达，且表达产物易于纯化，为b s p 的获得提供了一条新途径，并研究了r h b s p 的生物活性，为b s p 免疫学和生物学的深入研究、探索其作为药物治疗靶子的可行性奠定了基础。关键词：骨唾液酸蛋白；毕赤酵母；基因表达；纯化；活性v 1 i ia b s t r a c ta b s t r a c tb o n es i a l o p r o t e i n ( b s p ) i sa l la c i dg l y c o p r o t e i ni ne x t r a c e l l u l a rm a t r i xa n dh i g h l yr e s t r i c t e dt om i n e r a l i z e dc o n n e c t i v et i s s u e s ，s u c ha sb o n e ，t e e t ha n dc a r t i l a g ec a l c i f i e d i ti se x p r e s s e da n ds e c r e t e dm a i n l yb yo s t e o b l a s t s ，o s t e o c l a s t sa n dc h o n d r o c y t e b s pi sr e l a t e dt ot i s s u em i n e r a l i z a t i o na n ds o m eb o n em e t a b o l i z i n gd i s e a s e c u r r e n t l y , b s ph a sb e e nf o u n dp l a y i n gar o l ei nt u m o u rm e t a s t a s i st ob o n e ，a r t e r i o s c l e r a s i sa n da n g i o g e n e s i s s os t u d i e so nb s pb i o a c t i v i t ya n dm e c h a n i s mc a np r o v i d eab e t t e rm e t h o df o rd i a g n o s i sa n dt r e a t m e n to f d i s e a s e sa s s o c i a t e dw i t hb s rb s pc a nb ep r o d u c e db yt w ow a y s ：e x t r a c t i o no fb s pf r o mb o n ea n de x p r e s s i o no fr e c o m b i n a n tb s p ( r b s p ) i nh e t e r o l o g o u sp r o t e i ne x p r e s s i o ns y s t e m b o t ho ft h e ma r ev e r yi m p o r t a n tt ot h er e s e a r c ho fb s ec o m p a r i s o nb e t w e e nb o n e - d e r i v e db s pa n dr b s pc a ng i v em o r ek n o w l e d g eo nr e l a t i o nb e t w e e np r i m a r ys t r u c t u r ea n df u n c t i o n s ，a n dp o s t t r a n s l a t i o n a lm o d i f i c a t i o ni n f l u e n c eo nf u n c t i o n s t h i sp a p e rr e p o r t e ds t u d i e so nb s pe x p r e s s i o ni np i c h i a p a s t o r i s f i r s t l y , g e n es p e c i f i cp r i m e r sw e r ed e s i g n e da c c o r d i n gt oh u m a nb o n es i a l o p r o t e i ng e n e ( h b s p ) s e q u e n c ei ng e n b a n k ，a n dt h e ni tw a su s e dt oa m p l i f yt h ee d n ab yr t - p c rf r o mt o t a lr n ao fh u m a nf e m u rp e r i o s t e u m t h ee d n aw a sc l o n e dt op b l u e s c r i p ti ir iv e c t o rt og e tt h er e c o m b i n a n tv e c t o r , p b - h b s p ，w h i c hw a sr e a d yf o rh b s pe x p r e s s i o n s e c o n d l y , h b s pw a sa m p l i f i e db yp c rw i t hp b h b s pa st e m p l a t ea n dp r i m e r sd e s i g n e da c c o r d i n gt op p i c z a av e c t o ra n dh b s pe d n as e q u e n c e r e c o m b i n a n tp p i c z l x a h b s p ，w h i c hc a l le x p r e s sa n ds e c r e t er h b s p h i s 6 ，w a sc o n s t r u c t e db yt h er e c o m b i n a t i o no fp c rp r o d u c ta n dv e c t o rp p i c z a a t h e n ，p p i c z a a h b s pw a st r a n s f o r m e dt opp a s t o r i sg s l l 5b ye l e c t r o p o r a t i o n ，a n dh i g he x p r e s s i v ea n ds e c r e t i v et r a n s f o r m a n t sg si15 p p i c z a a h b s pw e r es e l e c t e db yp r i m a r ys c r e e n i n ga n ds e c o n d a r ys c r e e n i n g i tw a st e s t i f i e dt h a tt h er e c o m b i n a n tv e c t o rh a di n t e g r a t e di n t ot h eh o s ts t r a i ng e n o m ea n dt h er e c o m b i n a n tpp a s t o r i ss t r a i nw a sm u t 5p h e n o t y p e ，w h i c hw a ss e n s i t i v et om e t h a n 0 1 t h i r d l y , t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fr h b s pw e r es t u d i e d c e l l sw e r eh a r v e s t e da ta 6 0 0 = 9a n dr e s u s p e n d e di nb m m yt oa 6 0 0 = 4 5 t h ee x p r e s s e dr h b s pr e a c h e dt h el a r g e s ta m o u n t0 2 2 5g la tp h 6 0 ，2 o ( v v ) m e t h a n o lo nt h e4 t hd a ya n dw a su pt o8 0 o f t o t a lp r o t e i ni nt h es u p e r n a t a n t t h er h b s pw i t hp o l y h i s t i d i n ef u s e dt oi t sc t e r m i n a l ，w h i c hc a nb i n dw i t hn i 2 +i x华南理工大学工学博士学位论文s p e c i a l l y , w a sp u r i f i e db yi m m o b i l i z e dm e t a li o na f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y ( i m a c )t h r o u g hn i ”一n t ac o l o u m t h ep u r i t yo ft h et a r g e tp r o t e i nw a si d e n t i f i e db ys d s p a g e t h ec o n c e n t r a t i o no fr h b s pw a s0 7 5m g m la f t e rd e i o n i z a t i o nb ys e p h a d e xg 一2 5 u n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s t h er e c o v e ro f r h b s pw a s7 5 f i n a l l y , t h er h b s pw a sd e t e c t e da sab r o a db a n db e t w e e n4 3 6 6k di ns d s 。p a g e s h o w i n go b v i o u sh e t e r o g e n e o u si nm o l e c u l a rw e i g h t ，w h i c hr e s u l t e df r o mh e t e r o g e n e o u sg l y c o s y l a t i o no fr h b s pe x p r e s s e di npp a s t o r i s a l t h o u g ht h en u m b e ra n dt y p eo fs u g a ru n i t sa d d e di npp d s t o r 话a r ed i f f e r e n tf r o mm a m m a l i a nc e l l s ，t h er h b s pe x p r e s s e dl npp a s w r 括h a sg o o db i o a c t i v i t y , s u c ha sa n t i g e n i c i t y , a n g i o g e n e s i s ，c e l la d h e s i o na n dh y d r o x y a p a t i t es e e dg r o w t hi n h i b i t i o n t h er e c o m b i n a n th u m a nb s pw a se x p r e s s e da n ds e c r e t e de f f i c i e n t l yi npp a s t o r , se x p r e s s i o ns y s t e mf o rt h ef i r s tt i m e ，a n dt h er h b s pc o u l db ep u r i f i e dc o n v e n i e n t l y t h i ss t u d yg a v ean e ww a yt op r o d u c er h b s pa n dd i ds o m ew o r ko nb i o a c t i v i t yo fn b s ew h i c hi ss i g n i f i c a n tn o to n l yf o rd e e p e rr e s e a r c ho ni m m u n o l o g ya n db i o l o g yo fb s p , b u ta l s of o rp r o v i d i n gab a s i sf o rb s pa sat a r g e ti nt h e r a p y k e yw o r d s ：b o n es i a l o p r o t e i n ，p i c h i ap a s t o r i s ，g e n ee x p r e s s i o n ，p u r i f i c a t i o n ，a c t i v i t yx华南理工大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：逄熬日期：妒；年多月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华南理工大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密口，在年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密囱。( 请在以上相应方框内打“”)作者签名：导师签名：日期：御岁年，月多日日期：缸。；年6 月7 日茹一习剧毒匿篷英文缩略词表aa ba m pa o xb s ab s pb s pc a mdd ，a s pd a bd d h 2 0d m s od n ag ，g l ye c me d t ae pe g 1 uf c sh h i shh ah b s ph e p e sh u v e ci m a ck b英文缩略词表a b s o r b a n c ea n t i b o d ya m p i c i l l i na l c o h o lo x i d a s eb o v i n es e r u ma l b u m i nb o n es i a l o p r o t e i nb o n es i a l o p r o t e i ng e n ec h o r i o a l l a n t o i cm e m b r a n ea s s a yd a ya s p a r t i ca c i ds - d i a m i n o b e n z i d i n et e t r a h y d r o n a t ed o u b l e d i s t i l l e dw a t e r( c h 3 ) 2 s od i m e t h y l s u l f o x i dd i t h y l r i b o n u c l e i ca c i dg l y c i n ee x t r a c e l l u l a rm a t r i xe t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i de p p e n d o r fg l u t a m i ca c i df e t a ic a l fs e r u mh i s t i d i n eh o u rh y d r o x y a p a t i t en 一2 一h y d r o x y e t h y l p i p e r a z i n e n 一2 一e t h a n e s u l f o n i ca c i dh u m a nu m b i l i c a lv e i ne n d o t h e l i a lc e l li m m o b i l i z e dm e t a li o na f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h yk i l o b a s e s吸光率抗体氨苄青霉素醇氧化酶基因牛血清白蛋白骨唾液酸蛋白骨唾液酸蛋白基因鸡胚尿囊绒膜试验天天冬氨酸联苯二胺双蒸水二甲基亚砜脱氧核糖核酸甘氨酸细胞外基质乙二胺四乙酸e p 管谷氨酸小牛血清组氨酸小时羟基磷灰石人骨唾液酸蛋白基因n - 2 一羟乙基哌嗪n 一2 乙磺酸人胚胎脐静脉内皮细胞固定化金属离子亲和层析千碱基数华南理工大学工学博士学位论文k dm c sm l nm u tn cn i n t ak i l d a l t o nm u l t i p l ec l o n i n gs i t e sm i n u t em e t h a n o lu t i l i z a t i o nn i t r o c e l l u l o s en i c k e l n i t r i l o t r i a c e t i ca c i dp f up y r o c o c c u s f u r i o s i sd n ap o l y m e r a s eo dp a g ep b sp c rp i p e sp m s fr ，a r gr b s pr g dr h a n gr h b s pr mr t p c rs d sst e m e dt r i su t ry n bo p t i c a ld e n s i t yp o l y a c r y l a m i n eg e le l e c t r o p h o r e s i sp h o s p h a t e b u f f e r e ds a l i n ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o np i p e r a z i n e n ，n 一b i s ( 2 一e t h a n e s u l f o n i ca c i d )p h e n y l m e t h y l s u l f o n y lf l u o r i d ea r g i n i n er e c o m b i n a n tb o n es i a l o p r o t e i na r g - - g l y - - a s pr e c o m b i n a n th u m a na n g i o g e n i nr e c o m b i n a n th u m a nb o n es i a l o p r o t e i nr o t o rp e rm i n u t er e v e r s et r a n s c r i p t a s ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o ns a i u md a e c y ls u l p h a t es e c o n ds e p h a c r y ls e p h a d e xn ，n ，n n 、一t e t r a m e t h y le t h y l e n ed i a m i n et r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n eu n t r a n s l a t e dr e g i o ny e a s tn i t r o g e nb a s e千道尔顿多克隆位点分钟甲醇利用( 表型)硝酸纤维素( 膜)n i 2 + 固定化的次氨基三乙酸层析介质由高温嗜热菌分离的高保真d n a 聚合酶光密度值聚丙烯酰胺凝胶电泳磷酸盐缓冲液聚合酶链式反应哌嗪一n n 一双( 2 一乙磺酸)苯甲基磺酰氯精氨酸重组骨唾液酸蛋白精一甘一天冬氨酸三肽重组人血管生长素重组人骨唾液酸蛋白转速分钟逆转录一聚合酶链式反应十二烷基磺酸钠秒钟聚丙烯酰胺葡聚糖葡聚糖凝胶n ，n ，n 、n 、四甲基乙二胺三( 羟甲基) 氨基甲烷非翻译区酵母基本氮源第一章绪论第一章绪论1 1 骨唾液酸蛋白的研究现状1 1 1 骨唾液酸蛋白的结构骨唾液酸蛋白( b s p ) 是1 9 7 2 年首次从牛骨中提取的一个大的糖基化、磷酸化和硫酸化蛋白质，属s i b l i n g ( s m a l li n t e g r i n b i n d i n gl _ i g a n d ，n - l i n k e dg l y c o p r o t e i n s l蛋白家族。b s p 富含唾液酸，唾液酸是神经氨酸的酰基化衍生物，在b s p 中为糖链末端的1 4 - 乙酰神经氨酸一。其平均分子量是7 0 8 0k d 核心蛋白部分约为3 3 - 3 4k d ，大约含5 0 的碳水化合物，既有0 一糖链也有n 一糖链，且糖链结构为复杂型。b s p 基因序列分析结果显示，它是由3 1 7 个氨基酸组成的分泌蛋白，包含一个1 6 个氨基酸的疏水信号序列，引导蛋白进入内质嚼并分泌到胞外m 。哺乳动物的b s p 具有高度保守区域“，人、猪、牛、鼠的b s p 同源性达8 6 ，如图1 1 所示，具有4 个n 糖基化位点和数个o 糖基化位点，含磷酸化和酪氨酸硫酸化位点，靠近n 端有2 3 个保守的聚谷氨酸序列，与结合羟基磷灰石晶体有关，靠近n 一端具有r g d ( 精一甘天( 门1 冬氨酸) 细胞粘附序列，能介导细胞的粘附和迁移，并发现b s p 细胞粘附作用不仅与r g d 三肽有关，也与其侧面的高度保守区域及e p r g d n y r 肽的三级结构有关”，。此外b s p 的细胞粘附活性可能也与其分子中的酪氨酸残基有关”。二级结构预测和疏水性分析显示b s p 的氨基酸序列拥有众多易形成“螺旋和一些口折叠的开放式弹性结构。在电子显微镜下可观察到b s p 呈小球形并连有丝状结构，推测球状部分是蛋白质缺乏聚糖的c 端结构，丝状结构是蛋白质高度糖基化的n 端结构m 。b s p 富含谷氨酸和天冬氨酸其等电点为3 9 m ，。成熟b s p 糖蛋白上的磷酸、硫酸和唾液酸基团使其负电荷明显增加，限制了常规蛋白染色技术( 如考马斯亮蓝和银染法) 对b s p 的检测和定量，且广泛存在的糖基化造成b s p 在s d s p a g e和色谱分析结果中的多样性。s d s p a g e 电泳中，在人胚胎肾细胞中表达的h i s 6 m y c b s p 呈现7 0 8 0k d 的一条宽带，非变性条件下纯化的骨b s p 在7 0k d处形成一清晰的条带，变性条件纯化的骨b s p 则呈现8 0k d 的带，其他不同来源的b s p 则处于5 5 8 2k d 的不同位置处，如牛b s p 分子量为5 7 3k d 。这些不同来源的b s p 的一级结构是非常相似的，它们分子量的不同很可能是由于翻译后加工修饰程度的不同造成的。兰童堡三奎兰三兰堡圭兰堡丝苎dm k t a l i l l s il g m a c a f s m kn f h r r v k a e ds e d n g v f k y rp r y f l y k h a 一5 0bm k t a l i l l s il g m a c a f s m kn f h r r k a e ds e e n g v f i 1 0 0g l ，湿重 4 0 0g l 。即使是胞内表达的蛋白，发酵罐培养物的蛋白产量也明显高于摇瓶培养。培养液的缓冲力必须与酵母密度相当，使环境的p h 不利于蛋白降解，充足通气，添加适量的蛋白胨或酪蛋白水解物，为外源蛋白的合成分泌提供氨基酸和能量。毕赤酵母发酵培养基由纯粹碳源( 甘油或甲醇) 、生物素、无机盐类、微量元素和水组成，不含组分未知的成分，不含可能带来热源和毒素的成分，因此毕赤酵母适合生产人用药物蛋白，但是也要看到，诱导外源蛋白表达的甲醇是有毒性的，必须彻底去除才能安全使用。毕赤酵母很容易从摇瓶培养过渡到高密度发酵培养，可采用补料分批发酵或连续发酵技术 7 7 - ，”。一般高密度发酵的方法是：首先在含甘油的培养基中培养工程菌积累生物量，但外源基因的表达被抑制，当培养基中的甘油被消耗完后，会有一个短暂的生长休止期，此时开始流加甘油至培养物中，使细胞限速生长；最后，流加甲醇或是甲醇与甘油的混合物，诱导外源基因的表达，同时监测培养液中外源蛋白浓度，至适当时机收获目的蛋白。毕赤酵母表达系统已经高效表达了多种外源基因，如：肿瘤坏死因子、破伤风毒素c 片段、蔗糖酶、人血清白蛋白、蛋白酶抑制因子等基因的表达产物都超过每升发酵液l g 的水平。其中肿瘤坏死因子和破伤风毒素c 片段每升发酵液可高达1 0 9 以上。而摇瓶发酵的p p a s t o r i s 表达外源蛋白质的水平明显地低于发酵罐的表达水平。相同的表达载体在相同的转化条件下获得的转化子表现出高低不同的表达效率，甚至相同拷贝数的转化子亦有明显的表达差异，为了筛选最佳的酵母表达菌，必须筛选大量转化予。用发酵罐时监测指标多，可以优化条件但工作量大，不能华南理工大学工学博士学位论文作为筛选技术。通常用摇瓶进行小规模的诱导表达，筛选出表达量最高者。1 2 3 外源蛋白的表达调控毕赤酵母表达载体上的醇氧化酶基因的启动子a o x i 高度调控外源蛋白的表达，外源基因在甲醇以外的碳源中处于非表达状态，醇氧化酶a o x ( a l c o h o lo x i d a s e )甲醇代谢途径的关键酶仅为甲醇喂养时的a o x 的2 ，而在培养液中加入甲醇后，外源基因才被诱导表达，此时醇氧化酶a o x 可达细胞可溶性蛋白的3 0 。a o x 的合成是在转录水平调控的。其基因启动子具有明显的调控功能，可用于调控外源基因的表达。此调控作用是由一般碳源抑制解抑制及碳源特殊诱导双重机制控制的。某些外源蛋白表达时对细胞产生毒性作用，而此种抑制机制可使菌体大量扩增后再进行外源蛋白的表达，有利于外源蛋白的高效表达。发酵开始时使酵母在甘油中快速生长，a o x 被抑制，外源蛋白不表达。然后用甲醇替换甘油后，外源蛋白被诱导表达，一般甲醇诱导后长达1 5 0 一2 0 0 小时外源蛋白的表达才能达到峰值1 7 9 ，。长时间的诱导表达，表达产物易降解、变性失活，表达产物或副产物可能对宿主造成潜在毒害作用。1 2 4 表达载体的整合与大肠杆菌不同，毕赤酵母转化后会发生复杂的载体与酵母染色体的整合。对于大肠杆菌而言，其载体上携带有自身复制原点可随染色体复制而复制，能够比较稳定地存在，但也存在质粒丢失的可能。而毕赤酵母的载体不含酵母复制原点，导入细胞内的重组表达载体必须与酵母染色体上的同源区发生重组，而一经整合，外源基因表达盒就能稳定存在，构建的工程菌十分稳定。表达载体上的a o x i 和h i s 位点都可以作为同源区参与整合。一般情况下这两个位点并无区别，但在极少数情况下，染色体突变的h i s 位点和表达盒h i s 4 基因位点之间发生基因交换时会导致表达盒的丢失，因此一般选择a o x l 位点整台。整合可分为单交换和双交换两种情况。单交换，即插入，是外源基因通过重组插入到酵母染色体上，染色体上a o x l 基因仍然保留，能正常代谢甲醇，转化子表型为甲醇耐受型( m u t + ) ，即在甲醇为唯一碳源的培养基中可正常生长。另一种双交换，即替换。是外源基因重组时替换了染色体上的a o x l 基因，这些转化子在甲醇为碳源的培养基中只能依赖较弱的a o x 2 基因生长】，生长缓慢，表现为甲醇敏感型( m u t ) 。毕赤酵母表达载体经过适当的限制酶切后，释放出两端分别为5 和3 a o x l序列的线性质粒，转化后，大约1 0 2 0 转化子发生基因置换，导致a o x l 基因缺失，被表达盒和标记基因取代】，表现为m u t 8 型。对于胞内表达的蛋白优先考1 4第一苹绪论虑用m u t 。型，因为低水平的醇氧化酶使表达的蛋白更易纯化1 8 2 。在高生物量的发酵中m u t + 在甲醇为碳源的培养基中生长更快，应该较之m u t 5 对于提高外源蛋白的产率更有效。但就报道的毕赤酵母表达的外源蛋白中，许多m u t 8 型获得了很高的表达量，甚至高于m u t + 型所表达的蛋白，在摇瓶培养时这种情况更多见【8 3 ，。同源重组时有时会产生多拷贝整合，可占转化子的1 1 0 。这是因为一个拷贝整合到染色体上以后，整合位点仍然存在，则另外的拷贝又可整合上去。一般情况下，外源基因整合的拷贝数越高，蛋白表达量越大，如在表达明胶、破伤风毒素c 片段、鼠表皮生长因子( m e g f ) t ”，时，多拷贝的表达量较高。但目前还不能确定基因拷贝数和蛋白表达量之间有必然的联系，因为在有些情况下，单一拷贝数已达到很高表达量，有意增加拷贝数并没有起到更好的效果m 】，有的反而使蛋白产量下降m 1 ，因此在筛选出商拷贝转化子并鉴定表达量的同时，也有必要以单拷贝转化子作为对照，比较二者的表达量。1 2 5 分泌蛋白的糖基化特征肽链中有两类糖基化位点，一是a s h x s e r t h r 三残基构成的n 糖基化位点，其中x 代表任意氨基酸，n 一糖链通过还原端的声型n 一乙酰氨基葡萄糖( g i c n a c )和该结构中a s n 侧链酰胺基上的氮原子相连。另一类o 糖基化位点主要是s e r 和t h r ，还有t y r 、羟赖氨酸和羟脯氨酸，这些残基侧链上的羟基氧原子可和多种单糖生成糖苷键，形成o 一糖链。重组蛋白的糖基化程度与其蛋自质分子中糖基化位点的多少直接相关，同时也与工程细胞类型、培养条件( 如培养基的组成) 、下游加工过程中降解等因素有关 8 6 1 。应该注意的是，并不是所有的a s h 和带羟基的残基都能作为糖基化的起始位点，被糖基化的残基附近的肽段应具有一定的序列和特定的立体结构。甚至在某个表达体系中重组的肽链某个位点被糖基化而在另一个表达体系中同样位点上却没有糖基化f 8 7 l 。n 一糖链是结构复杂而且多变的糖链，但它们都有共同的核心五糖结构( 2 个n 乙酰氨基葡萄糖和3 个甘露糖) 。在粗面内质网上先合成核心结构的前体寡糖，和蛋白质的新生肽链的合成是分别进行的。蛋白质的新生肽链在翻译的同时已经进入粗面内质网，肽链的n 端信号肽切除后，前体寡糖作为一个整体被转移到肽链的n 糖基化位点上，继续在内质网和高尔基体受不同的糖苷水解酶水解，进行后加工处理，然后再在不同的糖基转移酶催化下形成不同分支结构和取代糖基的成熟n 糖链i s 7 。n 糖链在粗糙内质网内成熟的同时，也在帮助肽链的折叠，如果肽链不能正确折叠，则糖链又能促进这些肽链的降解。o g a l n a c 糖链的生物合成中不存在前体寡糖，其合成过程是糖基逐个转移的过程。户p a s t o r i s 表达系统能分泌表达异源性蛋白产物，在分泌过程中进行糖基化、华南理工大学工学博士学位论文二硫键的形成以及正确的折叠等翻译后加工修饰。p p a s t o r i s 的分泌蛋白既有0 糖基化也有n - 糖基化，其n 糖基化位点为( a s n x s e r t h r ) 与哺乳类细胞的糖基化位点相同。为研究酵母n 一糖链的合成，用【23 h m a n ( 甘露糖) 标记酿酒酵母的糖蛋白，并凝胶过滤分析内切糖苷酶h 释放的产物，可以检测到m a n 8 - 1 4 g i c n a e 和m a n ，2 0 g l c n a c 两类产物。脉冲追踪标记和动力学研究表明，转移到蛋白上的前体寡糖g l c 3 m a n 9 g l c n a c 2 很侠被降解为m a n s g l c n a c 2 ，然后又逐渐延长形成大的寡糖链”。t r i m b l e 等研究了s a c c h a r o m y c e s s u c 2 转化酶在毕赤酵母中分泌表达的糖基化情况m l ，在s d s - p a g e 电泳分析中呈现一8 5 9 0k d 的分散条带，而在s a c c h a r o m y c e s 中表达的该蛋白呈现宽阔的1 0 0 1 5 0k d 的蛋白带。用口内切糖苷酶h 水解毕赤酵母表达的转化酶后，产生带有g i e n a c 的6 0k d 蛋白和寡糖链，对寡糖链的分析表明，m a n s 一9 g l c n a c 占7 5 ，m a n l 0 g l c n a c 占17 ，m a n if g i c n a c占8 ，糖链末端存在8 1 ，2 和8 一l ，6 糖苷键，不同于酿酒酵母的末端仅一1 ，3 糖苷键。目前，关于毕赤酵母中发生o 糖基化的机制和特异性的了解还比较少，但也有一些关于外源蛋自o 糖基化的研究报道。如入簇岛素样生长因子( i g f 1 ) f 9 8 i 、d 淀粉酶m ，、和人单链尿激酶纤溶酶原激活因子 9 2 j 。毕赤酵母的o 一糖链也是由单一的甘露糖组成，蛋白质一级结构中发生。一糖基化的氨基酸残基目前仍无定论。对于同一种蛋白，在不同的宿主中发生o 糖基化的位点可能不同，毕赤酵母中发生。一糖基化的特定的t h r 和s e r 位点未必是原宿主的o 糖基化位点，在其原宿主中无糖基化的蛋白在毕赤酵母中未必不发生糖基化。例如，人胰岛素样生长因子( i g f i ) 是非糖基化蛋白，而在毕赤酵母中表达后发现0 一链接的甘露糖占产物分子量的1 5 m 】。总之，s , c e r e v i s i a e 和p p a s t o r i s 的糖基化多为高甘露糖型n 糖链，然而它们的糖链长度有明显不同，啤酒酵母对外源蛋白发生过度糖基化，其糖链上常带有4 0 以上的甘露糖残基。且其糖链具有终端n 1 ，3 糖苷键使其抗原性明显增加-而毕赤酵母一般有8 1 4 个甘露糖残基，糖基化程度相对适中。因而在表达外源糖基化蛋白时，与酿酒酵母相比，毕赤酵母是一类更为理想的表达系统。但也应该看到，虽然毕赤酵母与哺乳类细胞的糖基化位点一致，但糖链特征不同，糖的成分较为简单，为高甘露糖型，无半乳糖和唾液酸。而哺乳动物不仅有高甘露糖型，更具有杂合型和复杂型糖链。1 3 金属蝥合亲和层析的应用金属螯合亲和层析，又称固定化金属离子亲和层析( i m m o b i l i z e dm e t a li o na f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y , i i m a c ) ，是近2 0 年来发展起来的一种新型分离技术，第一章绪论最早由p a r o t h 等人提出mj 。它具有高收率、高纯度、能保持生物大分子天然状态等优点，广泛用于生物大分子的分离纯化，特别是对含量较少的基因工程产品的一步纯化，更显示出优越性。该方法是利用蛋白质分子中的一些氨基酸，如组氨酸、色氨酸、赖氨酸等能和金属离子发生特殊的相互作用而对蛋白质进行分离。c u p 、n i 2 + 、z n ”、c o ”等能与分子表面具有h i s 的蛋白质结合】，重组蛋白c 端或n 端具有( h i s x ) 。和( h i s - x 3 一h i s ) 。类型结构有利于纯化，其中x 为任意氨基酸，即位置相近的多个h i s 就可提高蛋白与金属离子的亲和力。1 9 8 7 年，h o c h u l i将6 h i s 标签和i m a c 技术应用到重组蛋白的纯化中1 9 5 ，自此，该方法逐渐被广泛应用，目前真核细胞表达的重组蛋白中已有5 0 是以i m a c 法进行纯化的。蛋白质与金属的螯合是通过蛋白质表面的组氨酸等氨基酸上的给电子原子( 如n 原子等) 的孤对电子与金属离子的空杂化轨道结合形成的，而h + 也可以提供空轨道，会与金属离子同时竞争蛋白质表面上的孤对电子。因此，除了竞争性物质，如咪唑、组氨酸等能与金属离子发生竞争性结合，提高h + 浓度，即降低p h值，蛋白质也容易被洗脱下来。i m a c 法纯化过程如图1 5 所示，层析介质上具有金属螯合臂，与待纯化蛋白质溶液作用后，未结合的蛋白被淋洗下来，耳的蛋白与金属螯合，最后洗脱下目的蛋白，达到纯化的目的。目前已报道的重组骨唾液酸蛋白( r b s p ) 均是以带有聚组氨酸纯化标签的融合蛋白的形式表达，并以i m a c法进行纯化。懋吣rp m e t 3 时t - c m h 酬”8上a 曙落“谨间上燃t d e i u eb o u n dp r o t e i n图1 - 5 金属离子结合蛋白的i m a c 纯化示意图f i g 1 5i l l u s t r a t i o no fi m a cp r o c e d u r ef o rp u r l f y i n gam e t a li o nb i n d i n gp r o t e i n1 4 本课题的研究背景及研究意义细胞外基质( e x t r a c e l l u l a rm a t r i x ，e c m ) 曾被认为只是把细胞粘连在一起的连结上霉华南理工大学工学博士学位论文物和支持物，然而，近年来的研究表明细胞外基质不仅决定细胞的形态，还可控制细胞的生长、分化，调节细胞的运动。b s p 是骨细胞外基质中的重要蛋白1 9 e , 9 7 ，参与信号识别、细胞粘附和转移。b s p 与羟基磷灰石( h a ) 有很高的亲和力，在组织钙化中表现为双重调节作用，一方面h a 聚集形成晶核，另一方面它又能吸附于h a 晶体表面而表现出抑制h a 晶体生长的特性。b s p 可作为成骨细胞分化和生物矿化的指标”“m ”。b s p 上靠近c - 端有r g d 细胞识别序列，即精- 甘天( 门) 冬氨酸结构，通过与整合素家族中的a v p3 识别、介导细胞表面与细胞外基质的粘附作用，在骨细胞的分化、癌细胞的骨转移及血管生成中发挥重要作用。由于b s p 具有刺激血管生成、促进血管内壁增生的作用，因而也怀疑它与冠状动脉硬化、冠心瘸等心血管疾病有关。另外，血清b s p 浓度可反映破骨细胞活性和骨