（环境科学专业论文）玉米、黄芪、西兰花的硒生物营养强化初步研究.pdf

中国科学技术大学学位论文原创性声明 本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。除已特 别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任何他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一 同j 作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了明确的说明。 作者签名： 签字日期： 中国科学技术大学学位论文授权使用声明 作为申请学位的条件之一，学位论文著作权拥有者授权中国科学技术大学拥有学位论 文的部分使用权，即：学校有权按有关规定向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文编入中国学位论文全文数据库等有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人提交的电子 文档的内容雨i 纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 口公开口保密(年) 作者签名： 导师签名： 签字日期： 签字日期： 摘要 捅要 硒是人体必需的微量元素之一，具有抗氧化、延缓衰老、提高免疫力、降低 癌症发病率等作用，对人体健康具有重要意义。本课题选取玉米、黄芪、西兰花 等主要农作物，进行人工硒生物营养强化，通过对强化过程中和强化后的玉米、 黄芪、西兰花样品中总硒和硒氨基酸形态及其分布进行定量分析，以期全面了解 硒在人工硒生物营养强化农作物中分布、转化规律，为富硒农产品的开发提供有 益的参考。此外，本研究还尝试对富硒酵母中的硒蛋白进行提取，探索富硒产品 中的硒蛋白提取的最优条件，为富硒农产品的深加工提供参考。本研究的主要结 果如下： 1 恩施地区的天然高硒玉米硒含量可高达4 8 7m 眺g ，其中的硒氨基酸形态几 乎全部是s e m e t ，占总硒的7 0 左右。玉米在纳米硒肥施硒量为1 2g m 2 的人 工强化下，硒累积可达到1 2 7m 眺g ，其硒形态和恩施天然区的组成基本相 同； 2 应用大田栽培黄芪的方式，考察不同施硒浓度对黄芪总硒及硒形态的影响。 黄芪根中硒代氨基酸和占总硒的5 0 以上，其中s e m e t 和s e m e c y s 是主要 的硒代氨基酸存在形式。实验中，当黄芪在施硒量为2 7 0g m 2 时，根部可累 积总硒达7 2 5m g k g 。当施硒量在5 4 1 3 5e , m 2 之间时，黄芪根中s e c y s 2 和 s e m e c y s 含量变化不大，具体在1 3 5g m 2 时，s e m e c y s 占总硒的1 8 ，s e c y s z 4 。而s e m e t 总硒值由2 1 增大到4 4 ，显著增加。当施硒量在1 3 5 2 7g m 2 范围内时，总硒和三种硒代氨基酸都是随着施硒量的增大而成正比增加的。 黄芪茎中各氨基酸的含量变化不明显； 3 人工硒生物营养强化培育富硒西兰花，其花在施硒量6g m 2 的强化条件下， 可累积硒达到5 0 0m g k g ，大大超过一般富硒农作物。硒形态分析得出西兰花 中硒是以有机硒为主，主要是s e m e c y s 和s e m e t 两种硒代氨基酸。当其在 施硒量1 2g m 2 条件下时，三种硒代氨基酸含量最高，s e m e t 含量占总硒的 3 4 ，s e m e c y s 占总硒的2 2 ，s e c y s 2 只有4 ： 4 通过对富硒酵母中含硒蛋白提取方法的探索得到最佳条件为在o 1 0 1 5m o l l 的k o h 碱性溶液中提取富硒酵母中硒蛋白。并且通过此方法提取的富硒酵 母中的硒蛋白主要是以s e m e t 的形式结合在蛋白中，水解后的有机硒占提取 总硒的7 0 左右。 关键字：硒生物营养强化；玉米；黄芪；西兰花：硒形态分桁；硒代氨基酸 摘要 h a b s t r a c t a b s t r a c t s e l e n i u m ( s e ) i so n eo ft h ee s s e n t i a lt r a c ee l e m e n t si nh u m a nb o d yf o rh e a l t hw i t h i t sf u n c t i o n si np r e v e n t i n go x i d i z a t i o n ，d e l a y i n g a g i n g ，e n h a n c i n gi m m u n i t ya n d r e d u c i n gc a n c e ro c c u r r e n c e i nt h ep r e s e n ts t u d y ，a r t i f i c i a lb i o f o r t i f i c a t i o n e x p e r i m e n t sw e r ec o n d u c t e do n s e l e c t e dp l a n t ss u c ha st o m , a s t r a g a l u sa n db r o c c o l i i no r d e rt ou n d e r s t a n df u l l yt h e r u l e sg o v e m i n gt h es es p e c i a t i o nd i s t r i b u t i o n si nb i o f o r t i f i e d c r o p sa n dp r o v i d e h e l p f u li m p l i c a t i o n s f o r d e v e l o p m e n to fs e e n r i c h e da g r i c u l t u r a lp r o d u c t s ，t h e c o n t e n t so ft o t a ls ea n ds e - a m i n oa c i d sw e r ed e t e r m i n e di nt h es e l e c t e dp l a n t s i n a d d i t i o n ，s e c o n t a i n i n gp r o t e i n sw e r ee x t r a c t e df r o mt h es e e n r i c h e dy e a s tt oe x p l o r e t h eo p t i m a lc o n d i t i o n sf o rs e - c o n t a i n i n gp r o t e i n se x t r a c t i o n t h i sc o n d i t i o n sc o u l d p r o v i d ei m p l i c a t i o n sf o rd e e pp r o c e s s i n go fs e e n r i c h e da g r i c u l t u r a lp r o d u c t s t h e m a i nr e s u l t so f l i ss t u d yw e r es u m m a r i z e db e l o w ： 1 t h et o t a ls ec o n t e n ti nn a t u r a ls e e n r i c h e dt o mo fe n s h iw a s u pt o4 8 7m g k g ， w h i c hw a sd o m i n a t e db y s e m e t ，a c c o u n t i n g a b o u t7 0 o ft h et o t a ls e m e a n w h i l e ，t h et o t a ls ec o n t e n ti nb i o f o r t i f i e dc o r nc o u l dr e a c ha sh i 吐a s1 2 7 m g k ga f t e rf e e d i n gw i t hi2g m 2n a n o s ef e r t i l i z e r h o w e v e r ，t h e r ew a sn o s i g n i f i c a n td i f f e r e n c ei ns es p e c i a t i o nd i s t r i b u t i o n sb e t w e e nt h e m ； 2 f i e l d s c a l ee x p e r i m e n t sw e r ea d o p t e dt oe s t i m a t et h es e a c c u m u l a t i n ga b i l i t yo f a s t r a g a l u s t h er a t i oo fo r g a n i cs e l e n o a m i n oa c i d sw a sa b o u t5 0 a n dt h em a i n s p e c i e sw e r es e m e ta n ds e m e c y s i nt h ee x p e r i m e n t s ，w h e ns ec o n c e n t r a t i o n w a s2 7 0g m s ，a s t r a g a l u sr o o tc o u l da c c u m u l a t et o t a ls e l e n i u mu pt o7 2 5m e g k g w h e nt h es e l e n i u mc o n t e n t sw a s5 4 - 13 5g m 2 ，n os i g n i f i c a n tc h a n g e sw e r e o b s e r v e df o rt h ec o n t e n t so fs e c y s 2a n ds e m e c y si na s t r a g a l u sr o o t s f o r e x a m p l e ，w h e ns ec o n c e n t r a t i o n , w a s13 5g m 2 ，s e m e c y sa c c o u n t e df o ra b o u t 18 o ft h et o t a ls e ，w h i l es e c y s 2a c c o u t sf o r4 h o w e v e r , s e m e ti n c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y , t h er a t i ow a sf r o m21 t o4 4 w h e nt h es e l e n i u mc o n t e n tw a s 13 5 2 7 0e c m ，b o t ht o t a ls ea n de o c ho ft h et h r e ek i i l d so fs e l e n o a 础l oa c i d s i n c r e a s e dp r o p o r t i o n a l l y n o n eo ft h e mi nt h es t e mc h a n g e ds i g n i f i c a n t l yi n t e r m so f i t sr a t i o ； 3 b yf e e d i n gs ec o n t e n tw i t h6 0e g m 2 ，t h es e e n r i c h e db r o c c o l if l o w e r sc o m d a c c u m u l a t es ec o n t e n tu pt o5 0 0m 罟肚g o fw h i c h ，s e m e c y sa n ds e m e t d o m i n a t e d m o r e o v e r ，t h ec o n t e n t so fs e l e n o a m i n oa d d sw e r eh i g h e s tw h e n i i i a b s 虹a c t f e e d i n gs ec o n t e n tw i t h12 0g m s a m o n gt h e m ，s e m e tw a s3 4 ，s e m e c y s 2 2 ，a n ds e c y s 24 o ft o t a ls e ； 4 t h eb e s tc o n d i t i o nt oe x t r a c ts ep r o t e i ni ny e a s tw a su n d e r0 1 - 0 15m o l lk o h a l k a l i n es o l u t i o ne n v i r o n m e n t u n d e rt h i sc o n d i f i o n ，t h ea n a l y s i so fs p e c i a t i o n d i s t r i b u t i o n sr e v e a l e dt h a tt h em a i ns ew a ss e m e t i naf o r mc o m b i n e dw i t h p r o t e i n t h ee n z y m eh y d r o l y s i ss h o w e dt h a tt h eo r g a n i cs ea c c o u n t e df o rn e a r l y 7 0 o ft h et o t a le x t r a c t e ds e k e y w o r d s ：b i o - f o r t i f i c a t i o n ；c o r n ；a s t r a g a l u s ；b r o c c o l i ；s es p e c i a t i o n s ；s e l e n o a m i n o a c i d s i v 目录 目录 第1 章绪论1 i 1 硒的概述1 1 1 1 硒的生理功能1 1 1 2 硒的形态2 1 1 3 含硒蛋白的提取方法4 1 2 中国膳食硒现状5 1 3 硒的生物营养强化6 1 3 1 硒生物营养强化的概念6 1 3 2 硒生物营养强化的途径7 1 4 影响硒生物营养强化的因素7 1 ，5 硒生物营养强化的展望9 第2 章选题背景及意义，研究内容与方法1 1 2 1 选题背景及意义1 1 2 2 研究内容与方法1 l 2 2 1 研究内容。11 2 2 2 研究方法1 2 第3 章玉米的硒生物营养强化过程及硒形态分析1 7 3 1 供试材料1 7 3 2 研究方法1 7 3 2 1 样品预处理17 3 2 2 测定方法1 8 3 3 结果与分析1 8 3 4 小结与展望1 9 第4 章黄芪的硒生物营养强化过程及硒形态分析2 1 4 1 供试材料的栽培与施肥方案2 1 4 2 材料与方法2 2 4 2 1 样品采集2 2 4 2 2 测定方法2 2 v 目录 4 3 结果与分析2 2 4 3 1 黄芪的硒强化效果。2 2 4 3 2 硒强化黄芪根、茎的硒形态分析2 3 4 4 讨论。2 7 第5 章西兰花的硒生物营养强化过程及硒形态分析2 9 5 1 供试材料的栽培与处理2 9 5 。2 材料与方法3 0 5 2 1 采集方法和样品预处理3 0 5 2 2 测定方法3 0 5 3 结果与分析3 0 5 3 1 西兰花硒强化效果3 0 5 3 。2 西兰花不同组织的硒形态分析3 2 5 3 3 西兰花硒积累与转化特征3 7 5 4 小结与展望3 8 第6 章富硒酵母中含硒蛋白的提取3 9 6 1 材料与方法3 9 6 1 1 材料3 9 6 1 2 实验溶液的配置一3 9 6 1 。3 实验方法3 9 6 2 结果与分析4 0 6 2 1b r a d f o r d s 法测定提取液中蛋白质的浓度4 0 6 2 1 不同溶剂下总硒提取率的测定4 1 6 2 2 硒形态的测定4 3 6 3 讨论4 4 第7 章结论4 5 参考文献：4 7 致谢5 3 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果5 3 v i 第1 章绪论 1 1 硒的概述 第1 章绪论 硒作为一种元素是1 8 1 8 年瑞典化学家b e r z e l i u s 首次发现的，常态下是以亚 硒酸盐或硒酸盐形式存在。长期以来，人们都认为硒是一种毒性很大的元素，直 至1 9 5 7 年s c h w a z r 从实验上证实当硒以低浓度存在时，有助于防止肝坏死，并 能促使人和动物的生长，由此才将其列为一种生命必需的微量元素。1 9 7 3 年 r o t r u c k 等发现硒是抗氧化物酶和谷胱甘肽过氧化物酶( g s h p x ) 必要的组成成 分，在防癌抗癌、清除自由基、抗膜质过氧化、防止衰老等方面的作用都得到证 实( r o t r u c k1 9 7 3 ；王芳，2 0 0 4 ；王金塔，2 0 1 0 ) 。同年，世界卫生组织宣布硒是 人体和动物生命活动中必需的微量元素。硒在农业生产、人畜健康和环境保护中 的重要性已越来越受到关注。目前，各学科科研工作者正在对硒的生理功能、药 理作用、硒与人体健康及硒形态分析等方面进行更加广泛深入的研究。 1 1 1 硒的生理功能 ( 1 ) 对人和动物的作用 硒是动物和人体必需的微量元素之一，对人体健康起着非常重要的作用。它 能提高动物和人体的免疫力、保护肝脏、视神经等，而且能预防关节炎、克山病、 大骨节病、糖尿病、心脑血管疾病、肝病、心脏病、白内障等重大疾病。硒还是 一种强大的抗氧化剂，美国的s h a m b e r g c r 等人首先提出硒有抗癌作用。它能清除 自由基，抗氧化防衰老，与维生素e 协同作用被称为抗氧化清除自由基的“黄金 搭档”，被誉为“生命的火种 。硒能加速致癌物质的代谢、促进d n a 损伤修复、 降低癌症发病率，是“抗癌之王”( 张素芳，2 0 0 4 ) 。预防医学研究表明，癌症的 死亡率与地区主食物中的含硒量呈显著负相关的( 陈以水，2 0 0 2 ；高楠，2 0 0 3 ) 。 ( 2 ) 对植物的生理作用和影响 一定浓度的硒酸盐溶液有利于提高植物种子的发芽率，并且喷施硒溶液能提 高蔬菜中的蛋白质、氨基酸含量，增大植物根际活力和谷胱甘肽过氧化物酶的活 性，增加植物体内叶绿素的合成。此外，硒对植物重金属胁迫有一定的拮抗效果， 可对植物的重金属中毒有一定的缓冲作用( 王芳，2 0 0 4 ；杨柳，2 0 1 1 ；l e m l y1 9 9 7 ； w i l b e r1 9 8 0 ) 。 第1 章绪论 1 1 2 硒的形态 在自然界中，硒可分为硒元素、无机硒和有机硒三种存在形态。在环境中， 硒主要以单质硒、亚硒酸盐、硒酸盐和有机硒等形态存在。在生物体内，硒主要 以多糖硒、蛋白硒和核酸硒等有机硒形态存在。有机硒包括硒代蛋氨酸、硒代半 胱氨酸和硒甲基半胱氨酸等小分子氨基酸和以大分子物质存在的如硒蛋白，硒多 糖，硒核酸等。表1 1 所示的是植物中常见的含硒化合物( 果秀敏，2 0 0 3 ；管凌 飞，2 0 0 7 ) 。 表1 1 植物中常见的含硒化合物 t a b l e1 1s e - c o m p o u n d si np l a n t s 1 硒代半胱氨酸( s e c y s ) 是人体的第2 1 种氨基酸，有自己的转运密码子u g a 。 它是多种酶辅基的必需成分。硒代半胱氨酸在人和动物体内特异性地参与硒蛋白 合成。 2 硒代蛋氨酸( s e m e t ) 是淀粉类植物如水稻、玉米、小麦等粮食作物中的主 要硒形态，也是人们日常膳食中的硒的主要形态，是提高植物组织的硒水平和提 高含硒蛋白酶活性的理想物质，能够预防肿瘤。与硒代半胱氨酸特异性参入含硒 蛋白不同，硒代蛋氨酸在体内能够代替蛋氨酸非特异性地结合进人体和动物蛋白 生成含硒蛋白，作为人体和动物的贮备蛋白在组织中累积。 3 硒甲基半胱氨酸( s e m e c y s ) 及其衍生物属于甲基硒类化合物，对肿瘤的 抑制作用最好，推测可能是由于能直接转化成具有抗肿瘤活性的甲基硒醇所致。 硒甲基半胱氨酸不能参与到动物和人体的蛋白中，因此补充其后，硒在人体和动 物组织中累积少，代谢快，能够有效避免组织因过度累积硒中毒的危险，提高了 安全性。 2 第1 章绪论 硒代氨基酸小分子物质再构成生物体内的大分子物质硒蛋白。硒多糖，硒核 酸是硒和多糖和核酸等物质的结合构成的。下面简单对几种含硒生物大分子物质 进行介绍： ( 1 ) 硒蛋白 目前，普遍认为蛋白硒复合物是硒在机体内的主要存在形态和功能形式。由 硒代氨基酸构成的硒蛋白是生物体内重要的含硒物质，许多硒的生物学功能必须 通过参与体内功能蛋白的合成才能够实现( 黄峙2 0 0 1 ；梁润梅2 0 0 4 ) 。硒在蛋白 质中有2 种存在状态，一种为共价结合，是含有硒代半胱氨酸的蛋白质，由m r n a 上的三联密码子u g a 编码硒半胱氨酸( s e c y s ) 参与，少量也含有硒代甲硫氨酸。 目前已发现了2 5 种硒蛋白，如谷胱甘肽过氧化物酶( g p x ) ，硫氧还蛋白还原酶 ( t r ) 、甲状腺脱碘酶( 5 - d i ) 、硒蛋白p ( s e l p ) 、硒蛋白w ( s e l w ) 等。另一 种为非共价结合，是含硒蛋白。在不做区分的情况下，硒蛋白可指两种蛋白总称 ( c r a c k2 0 0 1 ：b e h n e2 0 0 1 ) 。 姚敏对灵芝硒形态的研究发现：硒蛋白占总硒的7 3 6 7 7 4 ，是富硒灵芝中 主要的赋存形态( 姚敏，1 9 9 7 ) 。铁梅和黄峙分别对酵母和螺旋藻进行了硒形态 分析，指出在酵母和螺旋藻体内，有机硒也都是主要以蛋白质形态存在( 铁梅， 2 0 0 6 ；黄峙，2 0 0 1 ) 。 ( 2 ) 硒多糖 它是硒与多糖结合而成的有机大分子物质，兼有多糖和硒的双重活性。其生 物活性普遍比单一的多糖和硒高，比较有利于机体的吸收和利用，且具有抗金属 中毒、抗氧化、抗癌细胞和病毒的作用。目前已成功获得了酵母硒多糖、灵芝硒 多糖、大蒜硒多糖、香菇硒多糖、螺旋藻硒多糖和黑木耳硒多糖等合成或天然多 糖硒。 ( 3 ) 硒核酸 大量的研究报道表明，生物界中普遍存在着硒核酸。左银虎阐述了植物中有 硒与r n a 结合态的存在，并指出植物中与硒结合的r n a 全是转移核糖核酸( 左 银虎，2 0 0 8 ) 。胡文军等在对金针菇富硒研究中，发现有机硒中存在0 0 1 的核酸 硒( 胡文军，1 9 9 7 ) 。 无机硒很难被动物和人体直接吸收利用，有较大的毒性，且不易被吸收，不 适合人和动物安全使用。动物毒性试验表明，无机硒如亚硒酸钠，大鼠经口半致 死量为7m g k g ，而有机硒，如蛋氨酸的半致死量为3 0 4 0m g k g 。硒的利用研究 第1 章绪论 表明，机体可以通过肠壁的主动运输吸收利用有机硒，有机态的硒比无机态硒具 有更高的生物效价。和其它的元素( 如铁) 不同，人体对于来源于植物性食物中 的硒比对来源于动物性食物中的硒利用更好( 管凌飞，2 0 0 7 ) 。当动物和人长期 食用含硒量低的植物等食物时，就会造成硒营养不良，而导致多种疾患。相反， 若长期食用硒含量过高的食物则会造成硒中毒。无机硒具有致毒性，而有机硒具 有毒性低和副作用小等优点，在生物体内能够更好的发挥硒的功能。因此，开发 毒性低、吸收好、生物活性高、环境污染小的有机硒已成为硒研究的热点。 1 1 3 含硒蛋白的提取方法 本论文所指的含硒蛋白是包括非共价和共价两种方式结合硒代氨基酸的硒蛋 白的总称。蛋白质根据在不同溶齐, j e p 的溶解情况，可分为盐溶、水溶、碱溶、醇 溶蛋白等。蛋白质在稀盐和缓冲的水溶液中稳定性好、溶解度大，是提取蛋白质 最常用的溶剂，通常用量是提取量体积的5 倍左右。提取时为了利于蛋白质的溶 解，应该均匀的搅拌溶液。 蛋白的提取和以下几个因素有关。 ( 1 ) 温度 一方面，大多数的蛋白质，其溶解度随着温度的升高而增大。因此，温度高 利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活。因此， 基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温( 5 以下) 操作。 ( 2 ) p h 值 蛋白质是具有等电点的两性电解质，因此，提取液的p h 值应选择在偏离等 电点两侧的p h 范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质 可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化。一般来说，碱性蛋白 质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。 ( 3 ) 盐浓度 稀浓度可促进蛋白质的溶解，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白 质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点。在提取液中加入少量n a c l 等中 性盐，一般以0 。1 5m o l i 旅度为宜。缓冲液常采用0 0 2 0 0 5m o l l 磷酸盐和碳酸盐 等渗盐溶液。 综合可知，影响植物中含硒蛋白提取效率的主要因素有：提取过程中的温 度、p h 值、选用缓冲体系的种类、提取液的性质、植物的种类以及植物中存在 4 第1 章绪论 的含硒化合物的种类等( 向天勇，2 0 0 4 ；唐巧玉，2 0 0 3 ；沈莲清，2 0 0 7 ) 。 同时，富硒植物样品在进行硒形态分析之前，样品的前处理对测量结果的准 确性和完全性起着非常关键的作用。在蛋白酶酶解和提取过程中，为了加大提取 率，常利用超声波的方法将硒化合物从植物体中提取出来。 1 2 中国膳食硒现状 硒元素是生命活动的必要元素，硒在地壳中的相对丰度是0 0 5 0 0 9m g k g ， 我国的硒资源自然分布不均匀，呈明显的地带分布( 如图1 1 所示) ( 杨光圻，1 9 8 9 ) 。 尽管我国湖北恩施有“世界硒都”之称，陕西紫阳也是一个富硒区，但是我国存 在一个从东北黑龙江省一直延伸到西南云南省的低硒带，其土壤都缺硒，占我国 国土面积的7 2 。硒营养不良的情况在我国普遍存在，江浙沪长江三角洲地区是 属于严重缺硒地区。黑龙江、内蒙古、甘肃、青海、四川等严重缺硒地区有克山 病、大骨节病发生，一些癌症高发区( 如江苏启东市) 更是属低硒区。以土壤为 基础的食物链不能为人们提供足量的硒摄入：我国成人的平均日硒摄入量仅有3 9 岭，低于中国营养学会的推荐值5 0 2 5 0g g ( 杨光圻，1 9 9 2 ) 。不仅是我国的大部 分地区，全世界的大多数地区都存在不同程度的硒缺乏，是全世界广泛存在的问 题。w h o 公布的资料表明，全球有4 0 多个国家属于低硒或缺硒地区，这对人体 健康不利。 渊鬻缺硒 图1 1 中国硒资源分布 第1 章绪论 f i g 1 1s e l e n i u mr e s o u r c e sd i s t r i b u t i o ni nc h i n a 因为自然界无机态的硒很难直接为人所吸收利用，只有被植物或者动物转化 为有机态的硒才有应用价值，所以我们需要通过利用富硒生物产品满足日常自身 的硒营养需要。富硒生物产品是人体补充硒元素、增强对各种疾病抵抗力的有效 途径( 刘培杏，2 0 1 0 ；张奇志，2 0 0 9 ) 。 硒的生物营养强化 地壳中的硒通过火山运动、大气和雨水的风化、淋浴作用，进入土壤、大气、 水等环境，然后通过生物作用构成自然界主要的硒循环生态链。人和动物所摄入 的硒，都是直接地或间接来源于植物。这就是说，人体硒水平由所食用的植物性 或动物性食物的含硒量决定( h a m i l ，1 9 6 3 ；陈铭，1 9 9 6 ) 。因此，植物是人和动 物摄入硒的主要硒源，在这一循环中古有十分重要的地位，是硒生态链上不可缺 少的关键环节。 1 3 1 硒生物营养强化的概念 生物营养强化被定义为通过最佳的传统育种措施和现代生物技术来发展高 微量营养的主食作物。生物营养强化为提高人群的营养水平提供了一种新的方 法，既可以通过传统的育种或者基因工程来增加人群主食作物中的微量营养水 平，也可以通过施肥( 施入土壤、浸泡种子或者喷于叶面) 进行农业产品的生物 营养强化，这样可在不改变农作物基因组成的情况下增加农作物的微量元素营养 水平。 简单的说硒的营养强化理念是使谷物、中药。蔬菜及其他农产品在其植物组 织中最大限度地吸收和积累功能性形态的硒。 农牧业中硒营养普遍不足，环境中可利用的有效硒在不断减少，并且农作物 产量还必须要增加满足人口的增长，因此大范围的人畜摄入硒不足的局面还会逐 步加剧。 植物在硒自然生态循环链中的地位和在人类和动物体内有重要作用，因此， 加强植物对硒的吸收转化和硒积累机制的研究，对于充分开发利用宝贵的硒资 源，长期科学地补充硒营养元素，具有重要的现实意义( h a m i l1 9 6 3 ；吴永尧， 1 9 9 7 ；苏伟，2 0 0 4 ) 。 第1 章绪论 1 3 2 硒生物营养强化的途径 开发利用硒资源，研发富硒产品，具有重要的经济价值，更对增强人体体质， 保护健康有益。有如下一些方法： ( 1 ) 微生物富集法：对象主要是富硒酵母和富硒真菌。富硒酵母是将酵母菌 放入无机硒( 亚硒酸钠) 的培养基中培养而制得。它具有比亚硒酸钠更高的生物 活性和更高的食用安全性，生物利用率高，能有效地提高人体血硒水平，可作为 富硒保健食品。中科院高能物理研究所研制的硒含量在1 0 0 0m g 像g 以上的硒酵 母，有机硒含量在8 0 以上，蛋白质含量5 5 8 。富硒真菌主要是富硒食用菌， 生产方法是在食用菌栽培基料中加入亚硒酸钠等无机硒添加剂。如湖北恩施农科 所生产的富硒蘑菇，硒含量为7 0m g k g ，有机硒含量占9 9 4 0 。9 9 5 2 ( 宁婵娟， 2 0 0 9 ) 。 ( 2 ) 植物转化法：硒在土壤中普遍存在但是分布很不均匀。植物体内中的硒 含量取决于土壤中有效硒的水平。所以，其硒含量可以通过硒强化肥料的应用来 提高。植物不仅可以通过其根系吸收硒，叶对硒也有一定的吸收。试验证明，在 缺硒和低硒的土壤中栽培作物，通过士施硒肥、叶面喷施硒溶液和浸种都可增加 作物体的硒营养，都是提高其硒含量的有效措施( 杨柳，2 0 1 1 ) 。 许多研究表明：在缺硒地区，通过施硒提高饲料及粮食作物的硒含量，也是 防治人和动物硒缺乏的有效措施。其中芬兰的田间试验数据提供了很好的实例： 鉴于农业耕地中的硒含量低下，芬兰政府于1 9 8 4 年施用了硒强化肥料来提高牧草 和粮食硒含量，并且效果显著。 总结富硒食品的开发与生产主要有以下途径：利用天然富硒地区的土壤生产 富硒食品；利用有些对硒超级累的植物富硒的特点在其生长期通过叶片施肥或根 际施肥的形式喷洒硒盐化合物，经生物转化使其食用器官内富含硒元素；饲料中 添加亚硒酸钠或有机硒等生产富硒动物产品；利用微生物富集法生产高硒产品。 1 4 影响硒生物营养强化的因素 研究发现，在硒生物营养强化进行下的作物，其对土壤中硒的吸收与很多因 素相关。包括：植物的类型、土壤中的硒含量、耕作土的质地、p h 值、水分含 量、土壤的氧化还原电位、盐度等因素。下面简要的介绍下相关的主要因素： ( 1 ) 植物的类型 第1 章绪论 植物对土壤中硒的吸收量，首先取决于植物对硒的吸收能力。植物将无机硒 转化为有机硒的能力因种类不同而有所差异。国内外对植物的含硒量进行的大量 分析调查显示：所有植物，无论生长在哪种土壤之上，通常都含有硒，但硒含量 却有很大差异。如我国黑龙江缺硒地区产的玉米，硒含量仅有0 0 0 2 9m g k g ，而 产于湖北恩施高硒区的玉米，硒含量却可高达3 9 7 0 9m g k g 。像玉米等其他非聚 硒植物即使栽培在高硒土壤上，含硒量一般不超过5 0m g k g 。还有的含硒量更高 的植物( 如聚硒能力强的黄芪属) ，其有的种类可达几千m g k g ，而有的种仅能聚 硒几至十几m g k g ( 吴永尧，1 9 9 7 ) 。 根据植物生长在高硒土壤上时，其体内积累硒的量级别不同，有人提出以 植物含硒量高出其生长土壤的硒含量1 0 倍以上，3 1 0 倍和3 倍以下作为划分植物 对硒累积效果高低的标准。还有一种划分法是r o s e n l d 提出的，他将植物分成三 类：i 含硒量 1 0 0 0m g k g 的始级指示植物( 如紫云英属) ；i i 含硒量5 0 1 0 0 0 m g k g 的次级吸收植物( 如紫苑属、扁萼花属) ；i i i 含硒量 5 0m g k g 的非聚硒 植物( 禾本科和多数栽培作物均属此类) 。导致植物吸收硒能力差异的原因尚不 清楚，目前普遍认为种属是主要因素。 在富硒土壤上进行的研究总结发现：十字花科植物( 萝卜、甘蓝油菜) 和豆 科植物( 大豆、花生、黄芪、紫云英、苜蓿) 比禾本科( 小麦、大麦、燕麦) ， 菊科( 雏菊、莴苣) 植物能耐更高浓度的硒。 ( 2 ) 硒的存在形式和土壤类型是影响植物吸收硒的重要因素。 研究发现，植物吸收硒和硒的存在状态有关：元素硒可溶性好，植物对其容 易吸收但它的有效性很小；植物对亚硒酸盐( s e 4 + ) 的吸收不需要能量，但s e 4 + 在中性至酸性的土壤中，易与铁形成水溶性低的氧化物或水合氧化物而沉淀下 来。随着土壤酸性的增大，粘粒成份增加，s e 4 + 越难被植物体吸收；植物吸收硒 酸盐( s e 6 + ) 需要能量。但其若在碱性土壤中，则不容易被铁的氧化物固定；以 s e 2 。结合的有机硒，若结合于富啡酸中，其对植物是有效的，而与胡敏酸结合则 不能被植物吸收。 ( 3 ) 硫、磷等元素也会影响植物对硒的吸收。 施和平等对番茄吸收硒的研究表明，硫饥饿能促进番茄对硒的吸收和运输； 刘元英等对大豆吸收硒和硫的研究显示，当硒是在低浓度范围0 0 2 5m g l 时， 6 0m g l 的硫含量会对硒的吸收有协助作用，但在硒浓度较高下时，硫和硒则会 表现出相互的拮抗效应( 赵成义，2 0 0 4 ) 。 第1 章绪论 1 5 硒生物营养强化的展望 芬兰自1 9 8 4 年以来已通过施用含硒肥的方法提高了食物链中牧草和粮食的 硒含量。经过2 0 多年的努力，人均吸收量从当时的3 0 嵋增长到现在接近9 0 肛g ， 各类恶性疾病的发病率下降了7 0 左右。在中国低硒地区也通过向作物叶面喷硒 肥预防地方病。 生物营养强化不能对谷物产量产生明显的负面影响。硒肥过多会造成作物减 产，品质下降，而且长期施用硒肥也可能造成地下水污染。未来的研究还应包括 对土壤和植株适量使用硒肥，预防过量硒进入环境产生的潜在危害。因此筛选硒 积累能力高，在低硒土壤上生长的作物品种，提高土壤中硒和硒肥的生物利用率， 对于人体健康和生态环境可持续发展具有重要意义，其可以有效地提高食物链中 硒的水平，同时避免大量施用硒肥而造成的环境后果( 张艳玲，2 0 0 2 ) 。 此外，需要考虑的问题还包括足够的生物有效性，消费者的接受程度和成本 高低等。关于植物营养强化方面的研究，还有很多待探求和揭示的问题。 原书空白页 不缺内容 第2 章选题背景及意义，研究内容与方法 第2 章选题背景及意义，研究内容与方法 2 1 选题背景及意义 我国有2 2 个省市，其中约2 3 的地区都缺硒。在这些低硒区，农作物在生 长过程中无法从土壤中获取充足的硒，从而形成食物链的普遍缺硒状态。研究显 示中国人均同摄入硒的总量约为3 5 陷，显著低于世界卫生组织( w h o ) 推荐的 硒日摄入量5 0 2 0 0l a g ，这些低硒区域生活的人们需要补充硒的摄入。可是天然 食品中的硒含量一般都比较低，仅靠天然食品补硒难以从根本上改善缺硒状况， 因此，需要开发有效的补硒产品，提高人群的健康状况，对富硒食品或产品的需 求成为迫切的需要。总之，开发生物富硒产品对人群健康具有重要的意义。 从2 0 世纪7 0 年代开始，国内就有人进行了某些产品的富硒开发工作，如富 硒茶叶、富硒螺旋藻、富硒大蒜、富硒酵母、富硒中草药等，但大部分的富硒培 养研究工作仅涉及产品中总硒、有机态和无机态总量的测定，很少对具体的硒形 态进行定性和定量的研究。我国目前仍处在从硒的初级生物资源开发转向开发有 机硒形态的富硒保健食品的研究工作的开发阶段。 在生物营养强化概念中，我们希望能找到合适的硒化学形态用于抑制癌症的 天然富硒农产品。玉米、黄芪、西兰花三种作物分别作为谷物、中药材和蔬菜的 代表，不仅有很高的营养价值，并且都具有一定的富集硒的能力。对这三类作物 的硒累积有很多资料，但是关于它们在野外大田实验中的生长和对硒营养元素吸 收利用的具体的强化效果没有相关报道。本课题的研究目的在于探讨不同施肥浓 度条件下，玉米、黄芪、西兰花三种作物的硒形态分布情况。研究大田中硒肥强 化的效果，探索最佳的施肥条件，以期对今后的大田实验起指导作用，为富硒产 品的开发提供依据。 2 2 研究内容与方法 2 2 1 研究内容 不同的植物种类以及同一植物的不同组织中，硒的化学形态都不同，而人体 对硒的吸收和代谢与它在富硒产品中的化学形态密切相关，因此对富硒产品中硒 的形态进行分离后的定性定量分析鉴定，不仅是对产品进行的质量控制，还是评 价其营养、药理学性能的重要依据。 第2 章选题背景及意义，研究内容与方法 具体的实验方案简要归纳是将在不同施肥条件下，野外大田中生产培育出的 硒强化下的玉米、黄芪和西兰花的样品经过相应的预处理之后，测量各样品其中 不同组织部位的总硒含量和硒代氨基酸形态。根据得到的数据结果对样品进行系 统分析，进而判断在不同施肥浓度下，植株中硒累积的规律，以及在何种施肥浓 度强化条件下的总硒及有机硒累积的效果更佳，为以后的施肥提供指导。 2 2 2 研究方法 1 。大田培育作物 栽培管理程序包括选地，整地，施肥，播种，中耕除草，灌水，收割等。植 物生长是多种因子作用的结果，生长期间要为作物提供生长所必需的各种营养物 质，生长期要及时除草松土，使作物免受害虫危害，保证水肥条件良好，为作物 的生长创造良好的环境。 相比实验室盆栽实验，野外的大田实验具有更好的反应施肥作用的真实性， 因为盆栽时土壤的质量由于量少严格控制，一般会比大田的更好，而根系生长的 范围却不如大田的广阔，因此测得出的一系列数据也会有出入。另外野外的气候 也是复杂多变的，盆裁实验由于在室内不受自然季节气候影响得出的实验数据只 是模拟的，不足以完全用来替代真实情况。 2 总硒的测定方法及步骤 称取适量样品于锥形瓶中，用浓硝酸和高氯酸的混合酸( 4 ：1 ，v ) 进行消 解。步骤如下：样品加入混合酸后在室温下过夜，之后电热板上1 0 0 0 c 加热小 时，1 2 0 0 c 两小时，1 8 0 0 c 一小时，然后在2 1 0o c 时赶酸，直至冒高氯酸的白 烟。再加入5m l 浓盐酸将s e 6 + 还原3 小时成s e 4 + ，最后定容至2 5m l ，上机待 测。用原子荧光仪a f s 9 2 3 0 ( 吉天，北京) 测总硒含量。仪器条件：电流8 0m a ， 负高压2 7 0v ，雾化器高8m i l l ，载气速度4 0 0m l m i n ，屏蔽气8 0 0m l m i n ，应 用峰面积模式。每批样品都需用空白和标准物质( g b w0 7 6 0 3 g s v - 2 ) 判断数 据准确性( 严小平，2 0 0 9 ；雷绍荣，2 0 0 9 ；管文文，2 0 1 1 ) 。 3 硒形态的测定方法及步骤 硒形态的检测分析比传统的检测硒总量复杂，因为大多数天然食品或自然环 境中硒及有机硒含量比较低，在前处理的过程中硒非常容易挥发和转化。为了克 服这些困难，近些年来，科技工作者从前处理方法的改进、新仪器检测技术的联