（制糖工程专业论文）高纯低聚果糖分离纯化技术的研究.pdf

高纯低聚果糖分离纯化技术的研究 摘要 低聚果糖具有促进人体肠道内双歧杆菌生长的显著作用，并有保 护肝脏，提高机体免疫力等生理功能，广泛应用于食品和保健品行业。 但大规模生产的低聚果糖产品为多种组分的混合物，纯度不高限制了 公众对其生理功畿的认同感。由于技术条件限制，国内市场紧缺高纯 度的低聚糖产品，这使得纯化低聚果糖具有极其现实的意义。 本课题初步研究了对低聚果糖糖浆的脱色效果方法。结果表明 7 0 ，p h = 3 8 ，活性炭用量为1 4 ，脱色5 0 r a i n 时活性炭对低聚果 糖具有很好的脱色效果。新生态碳酸钙法用于低聚果糖脱色效果不理 相 ，二 o 同时研究了利用膜分离法将脱色后的低聚果糖进行两级纳滤和 一次反渗透，并将其分离为9 0 以上纯度和5 0 以上纯度的低聚果 糖产物i 和产物i i 以及葡萄糖和蔗糖的混合产物i i i 。产物i 虽然产率 并不高，但却为后续凝胶层析分离低聚果糖单一组分提供了原料来 源，同时也为b i o g e lp 一2 凝胶层析分离奠定了良好的分离基础。 利用聚丙烯酰胺凝胶p 2 ，当流速为0 1 2 m l m i n 一，1 2 0 x l c mi d ， 进样量为0 5 m l 时，以高纯度低聚果糖为原料初步得到蔗果三糖、蔗 果四糖以及蔗果五糖的单一组分，原料纯度越高，单一组分纯度也越 高。葡聚糖凝胶l h 2 0 在纯水作为流动相时分离低聚果糖单一组分 不理想。 运用k s 与c s 系列凝胶糖柱，以纯水为流动相，三柱串联方法 能够有效分离低聚果糖，本研究为低聚糖类物质提供了新型、环保节 能的分离方法。 关键词：低聚果糖活性炭纳滤分离纯化凝胶层析 s t u d yo ns e p a r a tl0 na n dp u rlf lc a t 10 nm e t h o do f g h - p u rit yf r u c t o o lig o s a c c h a rid e a b s t a r c t f r u c t o o l i g o s a c c h a r i d e ( f o s ) e x h i b i tas t i m u l a t i n ge f f e c to nt h e g r o w t ho ft h eb e n e f i c i a lb i f i d o b a c t e r i ai na n i m a li n t e s t i n e sa n dp r o t e c t l i v e r ，i m p r o v ei m m u n i t ye t c ，i t sc u r r e n t l yu s e di nt h es o c a l l e dh e a l t h f o o d sa n df e e d s t u f fa n ds oo n b e c a u s eo ft h es h o r to fh i g h p u r i t yf o s ， t i sv e r yu s e f u l lf o rp u r i f y i n gf o s h o w e v e r ，l a r g e - s c a l ep r o d u c t i o no f f o si sm i x t u r eo fm u l t i p l i c a t ec o m p o n e n t s ，i t sl o w p u r i t y ，r e s t r i c t st h e p u b l i c ss e n s eo fi d e n t i f i c a t i o nw i t ht h e i rp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n s d u et o t e c h n i c a lc o n s t r a i n t s ，h i g h g r a d ep r o d u c t so fo l i g o s a c c h a r i d e si ss h o r ti n t h ed o m e s t i cm a r k e t ，w h i c hm a k e sf o s p u r i f i c a t i o n i s e x t r e m e l y p r a c t i c a ls i g n i f i c a n c e t h i s e x p e r i m e n tp r e l i m i n a r ys t u d i e do nd e c o l o u r i z a t i o no ff o s s y r u p t h ee x p e r i m e n t ss h o wt h a tt h ed e c o l o u r i z a t i o ne f f e c tw a st h eb e s t w h e nt h ea m o u n to fa c t i v a t e dc a r b o ni s 1 4 p e r c e n t ，d e c o l o r i z a t i o n t e m p e r a t u r ei s7 0 ，p hi s 3 8a n db l e a c h i n gt i m ei s4 0m i n f r e s hl i m e c a r b o n a t ei sn o te f f e c t i v ef o rt h ed e c o l o u r i z a t i o no f f o s f o si sp u r i f i e db yn fa f t e rd e c o l o u r i z a t i o n i ti s p u r i f i e db yt w i c e n fp r o c e s sa n do n c er o ，t h e nw ec a ng e tt h r e ep r o d u c t s ：p r o d u c ti s p u r i t yi sa b o v e9 0 ，p r o d u c ti i sp u r i t yi sa b o v e9 0 ，p r o d u c ti i ii st h e i i i m i x t u r eo fs u c r o s ea n dg l u c o s e p r o d u c tii sn o th i g hy i e l d e d ，b u ti ti st h e r a wm a t e r i a lf o rt h es e p a r a t i o no ff o sa n di ti su s e f u lf o rt h es e p a r a t i o n w i t hb i o g e lp - 2 w ec a n g e t1 - k e s t o s e ，n y s t o s e a n df r u c t o f u r a n o s y l n y s t o s eb y s e p a r a t i o nw i t hb i o - g e lp - 2w h e nt h ef l o wr a t ei so 1 2 m l m i n q , c o l u m n l o n g t hi s1 2 0 x l c mi d ，i n j e c t i o nv o l u m ni s0 5 m l t h e yw i l lh a v eh i g h p u r i t yw h e nt h er a wm a t e r i a li sm o r ep u r e i t sn o n - i d e a lf o rs e p a r a t i o n w i t hs e p h a d e xl h - 2 0w h e nt h em o b i l ep h a s ei sw a t e r i t se f f e c t i v ef o rt h es e p a r a t i o nw i t hk s c ss e r i e ss u g a rc o l u m n w h e nt h em o b i l ep h a s ei sw a t e ra n dw i t ht h r e ec o n n e c t e dc o l u m n s t h i s m e t h o di sn e w ，a n di t sg o o df o re n v i r o n m e n t a lp r o t e c t i o n k e y w o r d s ：f r u c t o o l i g o s a c c h a r i d e ；a c t i v a t e dc a r b o n ；n a n o f i l t r a t i o n ； s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o n ；g e lf i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h y i v - 符号说明 意义 纯度为5 0 的低聚果糖 纯度为9 0 的低聚果糖 低聚果糖糖浆透光率 膜通量 透过液体积 纳滤时间 n 倍洗脱时的膜通量 葡萄糖与蔗糖分离度 蔗糖与蔗果三糖分离度 蔗果三糖与蔗果四糖分离度 蔗果四糖与蔗果五糖分离度 树脂理论塔板数 被分离组分保留时间 被分离组分半峰宽 被分离组分峰底宽 单位或量纲 m i c m - h m l m i n m l c m z h m l n m l n m l n 口丐 姆 姆 ： 地 群 阳 阳 丁 ， y ， 觑 m 舵 船 斛 壕 m 肜 广西大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得 的成果和相关知识产权属广西大学所有，本人保证不以其它单位为第一署名 单位发表或使用本论文的研究内容。除已注明部分外，论文中不包含其他人 已经发表过的研究成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对 本文的研究工作提供过重要帮助的个人和集体，均已在论文中明确说明并致 谢。 论文作者签名： 甙仓良 学位论文使用授权说明 川年a1 6 日 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本： 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 亿面时发布口解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 一：榭如弛矿协刁谢年二 | 月l 侈日 广西大学硕士学位论文 高纯砸订疑果糖分离纯化技术研究 第一章绪论弟一早三百t 匕 1 9 5 0 年，b a c o n t 与b l a n c h a r d 等1 1 】在研究酵母转化酶时，分别发现该酶除了具有水 解作用之外还具有糖基转移作用。用这种转化酶水解蔗糖时，除释放出葡萄糖和果糖外， 还生成一些低聚糖，其化学结构后来得到确定，被命名为蔗果三糖( k e s t o s e ) 族低聚糖， 即低聚果糖。1 9 5 2 年，w h a l l e y 等【1 】应用酵母转化酶作用于蔗糖，首次制得蔗果三糖。 天然蔗果三糖及其同形物，已在菊芋和芦笋、龙舌兰族、紫苑科、风铃草科和百合目等 植物中发现。此外，牛蒡( 3 6 ) 、洋葱( 2 8 ) 、大蒜( 1 0 ) 、黑麦( 0 7 ) 和香蕉 ( 0 3 ) 中也有少量存在。 经过多年来对低聚果糖的深入研究，人们发现低聚果糖具有许多优越的生理功能。 如：调节体内菌群平衡、降低血脂、促进矿物质的吸收和肠内有毒废物的排除、低热量、 防龋齿等，特别在调节体内菌群中对促进人体内有益菌双歧杆菌的增殖更具有明显的 功效【l 2 l 。 由于低聚果糖具有优越的生理功能，因此，随着生产技术的成熟，大规模生产低聚 果糖成为现实。1 9 8 2 年，日本明治制果株式会社首次实现低聚果糖的工业化生产，并投 放市场。低聚果糖的食用安全性在许多国家已得到政府的确认，1 9 9 2 年同本厚生省批准 低聚果糖为特定保健品，年产量达4 万吨，应用范围多达2 0 0 余种食品；在美国，食品 和药物管理局( f d a ) 已批准低聚果糖作为公认安全( g r a s ) 级食品配料用于食品、 饲料的生产。同时，日本和欧洲生产的低聚果糖在美国已被作为一种天然营养补充剂在 市场上销售；在欧洲，低聚果糖被作为控制胆固醇水平的功能性甜味剂而广泛应用于食 品产品中。在台湾，含低聚果糖的甜食、糕点、软饮料和饼干等在保健品市场很受欢迎。 在国内，低聚果糖近几年来已形成生产规模，并得到大力推广，在食品、保健品行业开 始应用，尤其在乳制品中广泛应用，许多国产奶粉都添加了低聚果糖，或用低聚果糖取 代低聚异麦芽糖，国内许多知名品牌的保健品也都添加有低聚果糖，可以说低聚果糖在 国内食品与保健品行业作为企业开发新产品和提高产品档次的应用已成为一种流行趋 势【3 - 8 1 。 广西大掌硕士掌位论文离纯低聚果梧分离纯化技术研究 1 1 低聚果糖的研究概述 1 1 1 低聚果糖的分子结构及存在方式 低聚果糖( f r u c t o o l i g o s a c c h a r i d e s ，简称f o s ) ，又称寡果糖，蔗果三糖族低聚糖或 蔗果低聚糖，是指在蔗糖分子的果糖残基上通过b ( 1 - 2 ) 糖苷键连接1 3 个果糖基而 成的蔗果三糖( 1 - k e s t o s e ；1 - k e s t o t r i o s e ；g f 2 ) 、蔗果四糖( n y s t o s e ；1 ，1 一k e s t o t e t r a o s e ；g f 3 ) 、 蔗果五糖( 1 - f r u c t o f u r a n o s y l n y s t o s e ；1 , 1 ，1 k e s t o p e n t a o s e ；g f 4 ) 及其混合物，其中葡萄 糖基与果糖基是以a ( 1 _ 2 ) 糖苷键连接，具体分子结构见图l 一1 。 固! 翻 i t i h c 0 瞄x 烈嗡薯， “ i 一 g ， 斟；洲i t t s x 2 e 1 3 ti t - 耋，屯 擎，| d 碡 裔 h o 1i 嫩占 i - i ( x t a d 7 划 t r - - 胤- 矿刊5 h ， 鼢 f 截x ： ，。 l 7h 0 7 1 、l”j i ；： 。 4 i ，： 飞澍一h 毯? 沁h 丫一j ，c h ，o h 、“r ，t ，h 图1 - 1 低聚果糖分子结构图 f i 9 1 1m o l e c u l a rs t “c t u r eo ff o s 低聚果糖最初是在植物中被发现的，它广泛存在于香蕉、洋葱、小麦、大麦、芦笋： 菊芋( 洋姜) 等，尤以耶路撒冷菊芋( 1 6 2 0 ) 、菊苣( 5 1 0 ) 、芦笋( 1 一2 0 ) 、韭菜( 2 - 5 ) 、大蒜( 3 6 ) 、婆罗门参( 4 1 1 ) 、洋葱( 2 一6 ) 、 牛蒡( 3 6 ) 、小麦( 1 4 ) 等为多。天然的和微生物酶法得到的低聚果糖几乎是 直链状，属于果糖和葡萄糖构成的直链杂低聚糖【1 。 1 1 2 低聚果糖的理化性质f 2 刁 ( 1 ) 甜度 纯度为5 5 - 6 5 的低聚果糖甜度约为蔗糖质量分数的6 0 ；纯度为9 6 低聚果 糖甜度约为蔗糖质量分数的3 0 ，且较蔗糖甜味清爽。 2 广西大芍h 页士掌位论文离纯低聚果糖分离纯化技术研究 ( 2 ) 粘度 在0 , - - 7 0 4 c 的范围内，低聚果糖的粘度同玉米蔗果糖浆相似，并随温度上升而降低。 ( 3 ) p h 值热稳定性 当环境p h 值为中性时低聚果糖在1 2 0 还非常稳定。在酸性条件( p h = 3 ) ，温度 达7 0 以后，极易分解，稳定性明显降低。 ( 4 ) 水分活性 低聚果糖的水分活性与蔗糖相似，低聚果糖略高。 ( 5 ) 其他加工特性 溶解性、耐高温性、抑制淀粉老化、非着色性、赋形性、耐碱性、保水性和稳定性 均较好，但非吸湿性较差。 1 1 3 低聚果糖的生理功能【1 - 1 0 , 2 8 , 3 0 】 ( 1 ) 调节体内菌群的平衡，防止腹泻和便秘 人体内细菌可分为有益菌、有害菌和中性菌三大类。一般来说，如果人体内有害菌 增多而有益菌减少，那么人就会觉得精神不好，甚至生病；如果人体内有害菌减少而有 益菌增多，那么人就会觉得精力充沛、精神爽朗。实验证明服用一定量的低聚果糖后， 人体内重要的有益菌群双歧杆菌数量会增多，有害菌如沙门氏菌、大肠杆菌等数量会 大大减少，其机理是低聚果糖服用后不能被唾液消化酶分解，直接通过胃和小肠到达大 肠，被大肠内的有益菌主要是双歧杆菌所利用，使双歧杆菌得到大量繁殖，同时产生有 机酸如醋酸、丙酸、丁酸和乳酸等。这些酸性物质可使肠内p h 值下降，从而抑制肠内沙 门氏菌等腐败菌的生长，改善肠道环境，减少肠内腐败物质的生长，促进肠道蠕动，通 过渗透压增加了粪便的水分，改变大便性状，有效地防止了便秘。这些特性起到调节肠 胃、整肠、排毒等作用。对于消化系统不良、长期便秘及其引起的内分泌不平衡有很好 的改善和消除效果。 ( 2 ) 降低胆固醇和血脂，是一种极好的膳食纤维素。 低聚果糖是一种水溶性膳食纤维，可以起到降低血清胆固醇和血脂的作用，其机理 是低聚果糖通过肠内细菌发酵，产生丙酸，阻碍胆固醇的合成，促使胆固醇向胆汁酸转 换，增加胆汁酸排出量，因而能降低血脂。同时双歧杆菌形成烟酸也同样抑制胆固醇的 吸收作用，从而改善脂质代谢。所以低聚果糖对于因血脂高而引起的一系列疾病如高血 压、心血管疾病等有很好的改善作用。 3 广西大掌硕士学位论文 高纯低聚果糖分离纯化技术研究 ( 3 ) 促进矿物质的吸收和肠内有毒废物的排除，并促进维生素的合成 服用低聚果糖能帮助人体对矿物质如钙、铁、镁等元素的吸收，并且促进体内毒素 的排除，其机理是低聚果糖在大肠内被细菌发酵而产生乳酸，乳酸可以溶解肠内的钙、 镁、铁等矿物质，促进人体对矿物质的吸收，还可以降低b 葡萄糖苷酶的活性，有利于 肠内吲哚、亚硝基胺等致癌有毒废物的排除。这已在人体试验和人粪便微生物的检测中 得到证实。服用低聚果糖3 周，粪便中有毒物和有害酶降低4 4 6 。f o s 还可以降低肝中 苯酚、甲苯酚、吲哚等腐败物质的含量。同时双歧杆菌在肠道内能自然合成维生素b 1 、 b 2 、b 6 、b 1 2 烟酸和叶酸，还能将乳制品中的乳糖部分转化为乳酸，解决了人们对乳煎 的耐受性问题。低聚果糖在这些方面的作用对于人体补钙、补血、补充b 族维生素、排 毒、防癌等有很好的帮助。 ( 4 ) 低热量难消化 低聚果糖很难被消化道中的酶分解，极难被人体吸收。据测定，其热值仅为 1 5 k c a l g - 1 ，而蔗糖热值为3 9 5 k c a l g - 1 ，因此摄入后，不会引起肥胖。 ( 5 ) 延长产品的货架期，改良产品性质 作为独特的低糖、低热值、难消化的甜味剂，添加于食品中，不仅可以改善产品的 口味，降低食品的热值，而且可以延长产品的货架期。如在减肥食品中添加低聚果糖， 可以极大降低产品热值；在低糖食品中低聚果糖，较难引起血糖升高；在酒类产品中添 加低聚果糖，可以防止酒中内溶物沉淀，改善透明度，提高酒的风味，使酒的口感更醇 厚、更清爽；在果味饮料和茶饮料中添加低聚果糖，可以使产品口味更细腻柔和、更清 爽；在焙烧食品中添加低聚果糖，可以增进产品的色泽，改进脆性，有利于膨化。 ( 6 ) 低龋齿性 低聚果糖不能被突变链球菌s t r e p t o c o c c u sm u t a n s 作为发酵底物来生成不溶性葡聚 糖，不提供口腔微生物沉积、产酸和腐蚀的场所( 牙垢) ，由它生成的乳酸数量为蔗糖 的5 0 以下。因此，低聚果糖是一种低腐蚀性、防龋齿的功能性甜味剂。 ( 7 ) 抗突变特性 乳酸菌可以结合在烹调中由于高温而生成的热突变产物；此外，乳酸菌也可降解黏 膜表面上的某些致癌物( 如n 亚硝基胺类) 。据报道，当f o s 以嚼用片的形式给健康人 服用4g 次( 1 天2 次) 后，发现肠道内双歧杆菌的数量增加，且可使参与毒性代谢的一 些酶的活性显著降低，如葡萄糖苷酸酶乙醇酸( g l u c u r o n i d a s e s g l y c o l i ca c i d ) 和羟化酶乙 醇( h y d r o x y l a s eg l y c o l i c a c i d ) ，表o f j f o s 具有预防或减少致癌物生成的潜能。 4 广西大掌硕士学位论文 高纯低聚果糖分离纯化技术研究 ( 8 ) 用于美容产品 作为美容因子添加于美容食品、护肤品中，可以增强产品美容、护肤作用。 ( 9 ) 与低聚异麦芽糖的对比 低聚异麦芽糖不具有减少有害菌的特性，它在肠内发酵时可被部分梭菌利用，而肠 内大部分梭菌属有害腐败菌，会引起人体消化道不适。可以说，低聚异麦芽糖既有利于 有益茵又有利于有害菌的增殖，而低聚果糖只有利于有益菌的增殖，同时可抑制有害菌 的繁殖。 低聚异麦芽糖能部分被人体消化酶( 如唾液淀粉酶、葡萄糖苷酶、葡萄氧化酶) 水 解，有2 5 转变为葡萄糖，且5 倍于葡萄糖的热量，比蔗糖热量高。属于可消化低聚糖， 而低聚果糖不能被人体消化酶水解。 要达到同样的双岐杆菌增殖效果，低聚果糖只需3 克人时，低聚异麦芽则需要1 4 克 人。 低聚果糖的口感比低聚异麦芽糖好。 1 1 4 低聚果糖的生产技术 ( 1 ) 微生物酶法制备低聚果糖 曹霞等【1 1 】用f 1 本曲霉( a s p e r g i l l u s j a p o n i c u s ，a j 5 6 ) 的b d 一果糖基转移酶进行转移 果糖基反应生成低聚果糖，该酶促反应的最适底物浓度为7 0 0 9 l - 1 ，最适时间为l h ，酶 浓度为5 ( v v ) 。酶反应的最适温度为5 0 5 5 。c ，最适p h 值为5 o 。低聚果糖占总糖的 最高含量达6 0 3 1 。底物浓度对产物得率的影响最大，其次是酶浓度和酶作用时间。 马莺等【1 2 】采用来源于米曲霉中的b d 呋哺果糖苷酶。米曲霉培养条件简单、培养基 的成本低，提取的b d 呋喃果糖苷酶是胞外酶，酶的提取、纯化较容易，低聚果糖的转 化率与黑曲霉中b d 呋喃果糖苷酶的转化率基本一致。酶反应的最佳条件为：反应温度 3 5 。c ，p h i 8 0 8 2 ，酶浓度2 7 i u 百1 ( 蔗糖) ，酶反应时间为8 h 。低聚果糖的最大转化 率为5 4 ，8 2 的蔗糖被转化。酶用量和p h 对生成糖产率的影响较大，而反应时间对生 成糖产率的影响次之，反应温度对生成糖产率的影响最小。 ( 2 ) 酶的固定化的研究 魏远安等i ”】利用深层发酵培养所得的液态酶，以壳聚糖为载体进行酶的固定化最适 宜条件的研究，选择了制备固定化酶最佳的戊二醛( 交联剂) 的浓度，交联温度和交联 p h 值。并比较了将液态酶和固定化酶用于从蔗糖直接合成蔗果低聚糖时的催化反应效 5 广西大学硕士掌位论文高纯低帮：果糖分离纯化技术研究 果，以及两者储存的稳定性。对其酶促反应的特性也进行了探讨。 用液态酶及以该批液态酶制得的固定化酶，在相同温度、时间的条件下进行催化反 应活性对比试验。二者蔗果低聚糖的生成量明显不同，固定化酶要比液体酶高。经固定 化酶反应后蔗糖转化率达9 0 以上，蔗果低聚糖含量达6 0 左右。 ( 3 ) 固定化增殖细胞发酵法生产低聚果糖 利用固定化增殖细胞发酵法，优点是可以连续反应，自动化程度高，操作简便。 江波等f 1 4 j 报道了固定化黑曲霉增殖细胞生产低聚果糖的研究。黑曲霉a s 0 0 2 3 菌株生产 的果糖转移酶为胞内酶，因而可使用固定化微生物细胞的方法。一般选择包埋法，然而 包埋黑曲霉菌丝体需破碎菌体，试验表明，在破碎时会造成酶的流失，或者酶活遭到破 坏，所以江波等采用用海藻酸钙包埋黑曲霉孢子，黑曲霉孢子经海藻酸钙包埋3 3 h 后得 到的固定化增殖细胞其酶活性达到最高，机械强度仍保持较高水平( 为起始时8 0 ) 。 最适p h 为5 o ，与游离酶相同，最适温度为5 5 ，比游离酶高5 ；有害离子对其影响较 小，其k m ( 以蔗糖为底物) 为8 2m m o l 。将固定化增殖细胞装入填充式反应柱，产品中 低聚果糖含量在5 0 5 5 ，操作一个月活性保持不变。比较琼脂、卡拉胶、海藻酸钙 及壳聚糖等相应的固定化颗粒的机械强度，包埋性能和热稳定性，认为海藻酸钙是最佳 的包埋材料，琼脂与卡拉胶次之，壳聚糖最差。 史锋等1 15 j 还研究了用固定化方法，连续化生产低聚果糖的最佳工艺参数。在 d 3 5 c m x 5 0 c m 的小型夹套层析柱上，最佳操作参数为p h 6 5 ，5 0 ，体积流量1 3 m l r a i n - 1 ； 扩大到d5 5 c m x l 0 0 c m 中型填充床反应器，则为p h6 5 ，5 0 ，体积流量6 0m l - m i n ； 在此条件下产品中低聚果糖质量分数达5 3 ，连续反应1 7 天低聚果糖质量分数保持在5 0 以上。 ( 4 ) 共固定化酶与细胞生产低聚果糖 由于酶法生产低聚果糖的同时生成了副产物葡萄糖，阻遏了蔗糖的进一步转化，因 而产品中含有相当量的葡萄糖和未作用的蔗糖。江波等【1 6 l 采用甄种固定化方法，在生产 低聚果糖的同时，将副产物葡萄糖异构化或氧化，从而解除了葡萄糖的抑制作用，制备 出高含量的低聚果糖。 方法一，利用戊二醛和丹宁将黑曲霉细胞与葡萄糖氧化酶交联后与海藻酸钠结合， 制成海藻酸钙共包埋颗粒，从而制得7 1 的低聚果糖； 方法二，又采用固定化黑曲霉增殖细胞与固定化葡萄糖异构酶协同作用方法，将5 0 蔗糖溶液通入柱式反应器连续生产，产物中低聚果糖和果糖含量分别为6 3 和1 6 。 6 广西大掌硕士掌位论文高纯低聚果糖分离纯1 匕技术研究 利用方法一可一次同时生产低聚果糖和去除葡萄糖。其缺点：一是将葡萄糖氧化成 葡萄糖酸与碱( c a c 0 3 ) 作用后去除，浪费了糖资源：反应过程需通氧，不利于柱式连续 生产。而选用方法二，经装柱连续生产一个多月，固定化颗粒活性保持稳定，因而是生 产高含量低聚果糖的一种新方法。 ( 5 ) 双酶法生产高含量低聚果糖 江波等【1 7 】利用果糖转移酶( f t a s e ) 转化蔗糖制备普通低聚果糖，然后再通过葡萄糖 氧化酶( g o d ) 与过氧化氢酶( c a t ) 的协同作用来消除普通低聚果糖中的葡萄糖。用 g o d 与c a t 协同作用，能完全消除低聚果糖产品中的葡萄糖，得：至1 j 8 6 9 2 的低聚果糖。 用单- - g o d 只能去除少量的葡萄糖，这是因为g o d 反应过程中积累的h 2 0 2 对g o d 有很 大的失活作用。由于过氧化氢对g o d 的阻碍作用，使得g o d 无法进一步作用于葡萄糖。 所以，欲得到更高纯度的低聚果糖，必须消除反应过程中的h 2 0 2 。 s a r o t e 等1 1 8 l 采用a s p e r g i l l u sn i g e ra t c c2 0 6 1 1 的f 1 呋喃果糖苷酶与葡萄糖氧化酶 ( e c1 1 3 4 ) 的混合酶系来制备低聚果糖。在2 l 的发酵罐中，控制温度为4 0 ，p h 5 5 ， 通风速率l v v m ，搅拌速率5 5 0 r r a i n ，最初蔗糖浓度为4 0 0 9 l 1 ，b 呋哺果糖苷酶与葡萄 糖氧化酶的用量分别为1 0 ，1 5 u g 1 蔗糖，培育3 2 h 。其收率( f o s g f ) 达到最大为0 9 2 9 ， g f 2 与g f 3 的产率分别为4 9 7 ，5 4 4 9 h 。葡萄糖氧化酶的用量有一最佳值，过多反而不 好【1 0 , 1 1 , 1 3 , 1 4 , 1 6 - 2 5 】。 1 1 5 高纯低聚果糖的纯化技术【1 9 - 2 7 】 低聚糖的分离纯化技术，有纳滤分离法、色谱分离法和微生物分离法( 发酵法) 。 前二种为当代国际先进的物理分离方法，后一种是利用某种酵母特性的传统生化分离方 法。 ( 1 ) 发酵法( 酵母法) 生产高纯度低聚果糖 发酵法生产高纯度低聚果糖是利用筛选得到具有较弱转化酶活性的酵母s k 2 0 0 3 ， 经培养后添加于总糖浓度为2 0 的低聚果糖中，经3 0 * ( 2 、2 5 0 r m i n 。1 反应2 4 h ，制得纯度 为8 0 2 4 的低聚果糖。由此可见，利用酵母法去除葡萄糖从而制备高纯度低聚果糖在工 业上完全可行。酵母通常都含有一定量的转化酶活性，它可将蔗糖水解为葡萄糖和果糖。 但是，由于低聚果糖也可被转化酶作用，因而筛选出低转化酶活性的酵母是该方法的关 键之一。在利用酵母代谢葡萄糖时，酵母产生的代谢副产物如微量的醇、醛，可能对低 聚果糖产品的风味产生不良影响，需在反应后脱味。在上述工作的基础上，进一步研究 7 商纯低聚果糖分离纯化技术研究 其反应条件，并在酵母作用后的糖液中加入果糖转移酶，作用于其中的蔗糖。在5 0 、 p h 5 5 条件下反应1 0 h ，f o s 质量分数可提高至8 5 。2 3 。由此可见，酶反应可以提高低聚 果糖的纯度，但提高幅度并不是很大，这是由于蔗糖含量较低，侵果糖转移酶的作用受 到限制【2 0 1 。 ( 2 ) 纳滤法生产高纯度低聚果糖 膜过滤工艺最初是被用于水的处理，随着膜工艺的改进和膜孔径控制技术的发展， 逐渐被引入到物质的分离纯化领域，并用于工业化的生产，取得良好的经济效益。河北 省维尔康制药有限公司与其它公司合作研究采用膜过滤设备，得到了含量约8 0 的低聚 果糖。 低聚果糖的纳滤分离，目的是去除相对分子量1 8 0 的葡萄糖、果糖和相对分子量3 4 2 的蔗糖，使低聚果糖质量分数总含量达9 5 。孙蔚榕等【1 9 】人采用二次分离：第一次分离 方法分离选用3 0 0 型膜组件，得到高纯度低聚果糖( f o s = 9 5 ) 产品。第二次分离选用 2 0 0 型膜组件，对透过液回收三糖及以上的糖，得到普通低聚果糖产品( f o s = 5 5 ) 。 二次分离结果合计使低聚果糖收得率和产品出率达到理想的经济效果。用低聚果糖浆进 行了5 批中试，中试规模低聚果糖2 0 0 k g d 1 成品糖浆( d s 7 5 ) 。低聚果糖平均f o s 总 含量= 9 5 。 低聚糖纳滤分离纯化与原糖浆本身糖分组成有很大关系，关键是原糖浆中二糖含量 的高低。低聚果糖中蔗糖含量高，产品纯度很难超过9 5 。因此纯度的提高要立足于改 进5 0 型低聚糖的质量( 糖分组成) ，改进酶转化技术，使蔗糖尽量转化为低聚果糖，使 之纯化倍数少而容易达到目标纯度。选择适宜的产品纯度也很重要。盲目增加纯化倍数， 要多几倍的运行费用，还会造成低聚糖有效成分的损失。5 0 型低聚糖中杂质如菌体、蛋 白质、脂肪、糊精、色素和盐等，可以通过活性炭吸附、硅藻土助滤和离子交换等予以 去除。也可采用微滤或超滤方式去除。这样纳滤分离才能顺利进行，且延长纳滤膜的使 用寿命。此外，最好能配套反渗透设备用于回收可消化性糖( 葡萄糖、果糖、蔗糖) 作 为商品售出。 ( 3 ) 层析法生产高纯度低聚果糖 层析法是选用某种特性吸附载体，利用吸附层析的原理，将5 5 的低聚果糖通过层 析而分离纯化，经吸附、水洗、解析、浓缩等过程，可得到9 5 以上的低聚果糖的浆和 粉，分离效果较好。但此工艺需要使用有机溶媒，生产成本较高，吸附载体受到限制， 远远高于菊苣低聚果糖价位，缺乏市场竞争能力【2 0 1 。 8 广西大学硕士学位论文高纯低聚果糖分离纯化技术研二 ( 4 ) 树脂流动床处理设备生产高纯度低聚果糖 用树脂流动床处理设备来纯化5 5 的低聚果糖，是近些年日本和韩国新研发出来的 方法，它的关键部分主要在设备设计和制造。采用设计合理的设备，纯化低聚果糖，纯 度可达9 5 以上，并且所有物料均可被充分利用，浪费极少。尽管设备投入较大，但可 以实现大规模连续化生产，操作更为简便实用且趋于洁净化生产【2 0 1 。 1 1 6 低聚果糖研究现状 低聚果糖是国际公认的益生元，有如上等诸多显著功效。现今社会抗生素泛滥，造 成很多负面影响，而低聚果糖的提高免疫力功能，可以降低抗生素的使用量。现今，一 些发达国家已将低聚果糖作为一种功能性食品成分应用于食品、医药、饲料等行业。目 前，我国低聚果糖生产尚处于初级阶段，大多是利用微生物发酵或酶法生产制得5 0 型低 聚果糖，而高纯度如9 0 型的低聚果糖由于分离纯化过程较为困难，一直较为紧缺。 目前世界上只有日本明治公司f f f l d a i c h i g a k a k u p h a r m ac e u t i c a l 公司拥有制取低聚 果糖单一组分的技术，而其他国家却未见报道，这就给丌发高品质功能性低聚果糖产品 及研究双歧杆菌对低聚果糖的代谢机理带来了很大障碍。 现今对9 0 型低聚果糖的报道文献中，绝大多数是用乙腈作为流动相，在高效液相制 备色谱上分离检测低聚果糖，此法消耗大量水和有毒试剂乙腈，不利于环保，且产量很 小；还有报道用专一性较强的果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶或酵母法消耗葡萄糖，以此 来达到提高低聚果糖含量的目的。但这些方法都会给低聚果糖产物中带来很多附属产 物，不利于纯化分离等后续工作。 1 2 本课题的立题背景和研究内容及研究意义 1 2 1 立题背景与研究意义 低聚果糖具有促进人体肠道内双歧杆菌生长的显著作用，并有保护肝脏，提高机体 免疫力等生理功能，广泛应用于食品药品饮料饲料产品，国内市场紧缺高纯度的低聚糖 产品，以其作为安全添加剂按1 0 倍剂量替代饲料中7 0 的抗生素为例( 第三届“国家8 6 3 计划成果与浙江民营企业对接活动 ) ，低聚果糖年需求量为2 0 万吨，按平均吨价1 0 万 元计算，产值达2 0 亿元，本研究成果推广应用后，能够提高我国畜产品和食品安全水平， 预期有良好市场前景。 低聚果糖对肠道内有益菌尤其是双歧杆菌有选择性增殖作用，被公认为是一种益生 o 广西大学硕士学位论文高纯低聚果糖分离纯化技术研究 元( p r e b i o t i c s ) 。虽然低聚果糖的生物活性很早已被证实，并作为一种功能性食品基料 已广泛应用于食品工业和饲料工业，但低聚果糖其单一聚合度组分的生物活性研究在国 内尚属空白，国外只有日本明治公司和d a i c h i g a k a k u p h a r m a c e u t i c a l 公司拥有其单组分分 离技术。这归因于低聚果糖单一组分之间除分子质量有微小差别外，其理化性质十分接 近，没有十分有效的手段将各单一组分制备分离。以蔗果三糖为例，s i g m a r 公司的标准 品标价为每克1 9 1 0 0 美元，因此开展单一组分生物活性的研究，对于开发高品质功能性 低聚果糖产品及研究双歧杆菌对低聚果糖的代谢机理具有重要的科学意义。同时，此课 题的完成可以极大促进提升糖业产品深加工及综合利用水平，为糖业产物链的延伸和新 产业群构建提供方法依据。 本课题采用膜分离及色谱制备技术耦合，在分离过程中均采用环保型工艺条件进行 分离纯化，具有较高的创新性和现实意义，同时分离低聚果糖单一组分在国内研究鲜见。 1 2 3 本课题研究的主要内容 ( 1 ) 预处理工艺条件研究 利用活性炭、新生态碳酸钙对5 0 型低聚果糖进行脱色，为纯化和分离进行预处理。 拟解决的关键问题为对各种脱色方法的优劣比较和技术参数确定。 ( 2 ) 膜纯化技术研究 利用超滤和纳滤膜等耦合技术对5 0 型低聚果糖进行纯化，拟解决的关键问题为膜 的选择，料液初始浓度，压力，洗脱倍数等膜过滤影响因素的确定。 ( 3 ) 色谱分离技术研究 利用柱层析法对纯化后的低聚果糖进行初步分离，拟解决的问题为初步确定固定 相、流动相、流速、柱长等。 利用半制备型高效液相，探索单一低聚果糖组分分离分析方法。以纯水为流动相对 纯化后的低聚果糖进行分离，拟解决的关键问题为色谱柱、流动相配比、柱温、柱长等 影响因素的确定。 1 0 广西大学硕士学位论文高纯低聚果糖分离纯化技术研究 第二章低聚果糖糖浆的脱色 酶固定法生产的5 0 型低聚果糖中有少量杂质如菌体、色素、盐和极少量的蛋白质、 脂肪、糊精等。可以通过活性炭吸附、硅藻土助滤和离子交换等予以去除；杂质中包括 的菌体、高价盐、高糖等，也可采用微滤或超滤方法去除。 在低聚果糖生产中，产品的分离纯化是一个重要的工序。其中脱色效果是影响产品 质量的一个关键因素。由于产品的下游分离纯化工作目前较少有人研究，以致于目前的 脱色方面普遍存在着脱色效率不高、低聚果糖损失较大等缺陷，严重伟i j 约了低聚果糖的+ 工业化进程，预处理对5 0 型低聚果糖深度分离纯化制备9 0 型低聚果糖有重要辅助作用 1 3 2 1 。 2 1 活性炭脱色法 低聚果糖糖浆的色泽即透明度的高低，直接影响其加工性能，探讨和选择低聚果糖 糖浆生产中最佳的脱色工艺参数，具有实际意义。 2 1 1 活性炭脱色原理【3 8 ，4 0 1 活性炭是一种由含碳材料制成的外观呈黑色，内部孔隙结构发达、比表面积大、吸 附能力强的一类微品质碳素材料。活性炭材料中有大量肉眼看不见的微孔，1g 活性炭材 料中微孔的总内表面积可高达7 0 0 2 3 0 0m 2 ，也就是说，在一个米粒大小的活性炭颗粒 中，微孔的内表面积相当于一个大客厅内墙面的大小。正是这些微孔使得活性炭能“捕 捉”各种有毒有害气体和杂质。 活性炭具有很强的“物理吸附”和“化学吸附”的作用，活性炭的主要作用是依靠它巨 大的表面积( 通过范德华力，即分子问作用力) ，可将某些有机化合物吸附而达到去除 效果，利用这个原理，我们就能有效地去除5 0 型低聚果糖浆中的菌类、色素等。 2 1 2 材料与方法 2 1 2 1 实验材料 低聚果糖糖浆、活性炭、0 1 m o l l 1 碳酸钠、0 1 m o l l 1 盐酸。 2 1 2 2 主要实验设备 p h s 2 5 型精密数显酸度计：上海伟业仪器厂； 离纯低聚果糖分离纯化技术研究 d f - 1 1 0 型电子分析天平：中国轻工业机械总公司常熟衡器工业公司； 6 0 1 0 紫外可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司； h h s y l l n i 型恒温水浴锅：北京市长风仪器仪表公司； j b 1 a 型恒温磁力搅拌器：上海精密科学仪器有限公司。 2 1 2 3 单因素实验方法 参考相关的技术资料和单因素实验结果，以低聚果糖糖浆的透光率作为衡量脱色工 艺优劣的指标，选取活性炭用量、p h 、脱色时间和脱色温度为考察因素，进行单因素实 验。 实验采用6 0 1 0 紫外。可见分光光度计，在4 2 0 n m 紫外光下测定低聚果糖溶液的透光 率。 ( 1 ) 活性炭用量对脱色效果的影响 取5 0 型低聚果糖糖浆1 0 0 9 ，加入3 0 0 m l 水，室温下测量稀释液锤度、透光率、p h 值、 温度，分装4 0 9 稀释液n 8 个小烧杯中，分别加入不同量的活性炭，磁力恒温搅拌4 0 m i n ， 滤纸过滤，室温下测量滤液锤度、透光率、p h 值、温度。 ( 2 ) 脱色时问对活性炭脱色效果的影响 根据( 1 ) 的实验结果，选择最优活性炭用量，改变搅拌时间，选择1 0 m i n 、2 0 m i n 、 3 0 m i n 、4 0 m i n 、5 0 m i n 五个水平，考察脱色时间对脱色效果的影响，实验其余步骤同( 1 ) 。 ( 3 ) 脱色温度对活性炭脱色效果的影响 根据( 1 ) 和( 2 ) 选择最优活性炭用量及搅拌时间，利用恒温水浴槽改变脱色温度， 选择3 0 、4 0 。c 、5 0 、6 0 、7 0 五个水平，考察脱色温度对脱色效果的影响，其余 步骤同( 1 ) 。 ( 4 ) 脱色p h 值对活性炭脱色效果的影响 根据( 1 ) 、( 2 ) 及( 3 ) 的实验结果，最优活性炭用量、搅拌时间，在室温下，利 用0 1 m o l u 1 h c l 溶液与o 1 m o l l 1 n a 2 c 0 3 溶液调节脱色p h 值，选择3 8 、4 2 、4 6 、5 o 、 5 4 、5 8 六个水平，考察脱色p h 值对脱色效果影响，其余步骤同( 1 ) 。 2 1 2 4 正交实验 根据单因素实验结果，选取合适的因素水平值，进行正交试验。取3 倍稀释的低聚 果糖糖浆水溶液，测定其p h 值，并用1 0 的碳酸钠溶液调整到试验方案所要求的相应的 p h 值，然后定量装入烧杯中，置于水浴锅内，待温度达到要求时，加人事先己称量好的 活性炭，搅拌，达到试验方案要求的反应时间后取出烧杯，用定性滤纸过滤，以蒸馏水 1 2 广西大学硕士学位论文高纯低聚果塘分离纯化技术研究 作为空白样于4 2 0 n m 波长下测定滤液锤度、透光率。 j 下交实验的结果采用极差分析法。极差分析法优点是对实验结果作少量计算就能直 接比较出最优的各因素水平组合结构，即最优的生产条件，不足之处就是不能判断实验 所得数据波动的原因，也不能判断各因素作用显著程度。 2 1 3