（发酵工程专业论文）13丙二醇产生菌的选育及其发酵研究.pdf

摘要 摘要 l ，3 丙二醇是目前国际上公认的六大石化新产品之一，其主要功能是作为合成聚酯、 聚醚和聚亚氨酯的单体。1 ，3 丙二醇的生产方法有化学合成法和微生物转化法。微生物 转化法生产l ，3 丙二醇具有显著的优点，成为当前的研究热点。 本研究以产l ，3 一丙二醇( 1 ，3 p d ) 克雷伯氏杆菌( k l e b s i e l l as p ) 为出发菌株，采 用紫外诱变，结合0 5 m g m l 亚硝基胍和超声波( 2 0 0 w ，5 0 k h z ， 2 0 m i n ) 复合诱变选 育获得一株1 ，3 一丙二醇高产突变株。在批次发酵中，该突变株产l ，3 一丙二醇能力提高 3 6 7 2 ，达2 3 3 l l 。变异株经1 0 次传代培养，发酵能力稳定。突变株副产物乙醇产量 降低，副产物乙酸产量略有增加。酶量未发现有明显变化，甘油脱水酶活性提高约2 1 ， l ，3 p d 氧化还原酶活性有所提高。 采用单因素实验初步优化k l e b s i e l l as p 突变株产l ，3 丙二醇发酵工艺，分别考察了 不同浓度的甘油、磷酸二氢钾、酵母膏等因素对k l e b s i e l l as p 突变株发酵的影响。通过 正交实验进一步优化了k l e b s i e l l as p 突变株发酵培养基，其适宜组成为：甘油6 0 l 、 磷酸二氢钾3 l 、酵母膏6g l 、七水硫酸镁1 l 。在摇瓶发酵中，l ，3 丙二醇的产 量达到2 7 0 3 l ，比优化前提高了约9 9 2 。 探讨了外源添加( v c 、g s h 、c y s 、d t t ) 还原剂对k l e b s i e l l as p 突变株合成1 ，3 一 丙二醇影响。添加0 3 5m m o l ld t t 、o 3 5m m o l lc y s 、0 4 5 m m o l lg s h ，1 ，3 - p d 的产 量分别能达到2 9 7 7g l 、2 9 3 2e d l 、2 9 8 7g l ，均高于参照2 7 0 1 l 。考察外源添加 v c 发酵过程变化，添加o 2 5m m o l l 的v c 对1 ，3 p d 的产量影响最大，达3 0 0 1g l 较对照提高1 1 1 1 ；v c 添加提高了副产物乙酸、乙醇浓度，添加o 2 5m m o l l 副产物 乙酸、乙醇分别较对照提高3 7 7 、3 3 5 ；添加v c 对菌体生长有抑制作用，单位菌 体产1 。3 p d 效率提高。 考察添加a t p 对k l e b s i e l l as p 突变株合成1 ，3 一p d 的影响。结果表明：添加a t p 对菌体生长有明显抑制作用，添加0 0 4e d l 的a t p 对菌体抑制作用最大，较对照降低了 2 6 5 。添加o 0 6g la t p1 , 3 p d 终浓度较参照提高1 1 2 6 ，达3 0 0 5g l 。添加a t p 提高单位细胞催化效率。添加a t p 促进副产物乙酸的合成，添加0 0 6g la t p ，发酵 结束，乙酸浓度较对照高8 7 。在发酵的不同阶段( o h 、4 h 、1 8 h ) ，分别向3 组摇瓶 添加相同浓度( o 0 6 l ) a t p ，4 h 添加a t p1 , 3 p d 终浓度最高，达3 0 1 3g l ，较对照 提高1 1 2 6 。0 h 添加a t p 的摇瓶1 ，3 p d o d 值最大，较对照提高2 5 8 4 。 关键词：1 , 3 丙二醇，甘油，诱变育种，发酵，辅助因子 a b s t r a e t a b s t r a c t l ，3 一p r o p a n e d i o li sa c k n o w l e d g e da so n eo fs i xn e wp e t r o c h e m i c a lp r o d u c t sc u r r e n t l yi n t h e w o r l d i t sm a i nf u n c t i o ni sa sa ni m p o r t a n tm o n o m e rt os y n t h e s i z ean e wt y p eo f p o l y e s t e r , p o l y e t h e r ，p o l y u r e t h a n e 1 ，3 一p r o p a n e d i o l i s p r o d u c e db y t w o w a y s ：c h e m i c a l s y n t h e s i sa n dm i c r o b i a lc o n v e r s i o n p r o d u c i n g1 , 3 - p r o p a n e d i o lb ym i c r o b i a l f e r m e n t a t i o n h a v em a n yo b v i o u sa d v a n t a g e sa n db e c o m et h ef o c u s e so fr e s e a r c h k l e b s i e l l a s p w a s u s e da st h e o r i g i n a l s t r a i nf o rf u r t h e rr e s e a r c h ah i g h 1 ，3 - p r o p a n e d i o l p r o d u c i n g s t r a i nw a so b t a i n e db yu va n d ( o 5 m g m l ) n t g u l t r a s o u n d ( 2 0 0 w ，5 0 k h z ，2 0 m i n ) i n d u c i n gm u t a g e n e s i s i nb a t c hf e r m e n t a t i o no fm u t a n t ，t h ep r o d u c t i o n o f1 ，3 - p r o p a n e d i o lw a si n c r e a s e dt o2 3 31g l ( b y3 6 7 2 ) t h em u t a n ts t r a i ns h o w e d g e n e t i cs t a b i l i t ya f t e r10g e n e r a t i o n s t h eb y p r o d u c t ，a c e t a t e ，w a si n c r e a s e d ，a n de t h a n o lw a s d e c r e a s e d ，r e s p e c t i v e l y t h ea m o u n to fe n z y m ew a sn o tf o u n dc h a n g e ds i g n i f i c a n t l y , b u tt h e a c t i v i t yo fg d h t r i s e sb y21 a n dt h ea c t i v i t yo fp d o ra l s or i s ei nac e r t a i ne x t e n t t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o nf o rk l e b s i e l l as p m u t a n tp r o d u c i n g1 , 3 - p r o p a n e d i o lw a s p r e l i m i n a r yo p t i m i z e db ys i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no fg l y c e r o l ，y e a s t e x t r a c t ，k h 2 p 0 4a n do t h e rf a c t o r si n f l u e n c i n gt h eg l y c e r o lc o n v e r s i n gt o1 , 3 一p r o p a n e d i o lw a s s t u d i e dr e s p e c t i v e l y af u r t h e rs t u d yo nt h ef e r m e n t a t i o nm e d i u mc o m p o s i t i o nw a sb y o r t h o g o n a lt e s t t h eo p t i m u mm e d i u mf o rm u t a n tw a sa sf o l l o w s ：g l y c e r o l6 0 9 l ，y e a s t e x t r a c t6 9 l ，k h 2 p 0 43 9 l 、m g s 0 4 7 h 2 0l g l i nf l a s kf e r m e n t a t i o n ，t h ep r o d u c t i o no f1 ，3 - p r o p a n e d i o lw a si n c r e a s e dt o2 7 0 3g l ( b y9 9 2 ) e f f e c t so n 1 3 - p r o p a n e d i o lp r o d u c t i o no f k l e b s i e l l a s p m u t a n tb y a d d i t i o no f r e d u c t a n t ( v c ，g s h ，c y s ，d t t ) w e r es t u d i e d t h ey i e l do f1 , 3 - p r o p a n e d i o lc a nr e a c h2 9 7 7g l ， 2 9 3 2 l ，2 9 8 7g lb ya d d i n g0 3 5m m o l ld t t ，0 3 5m m o l lc y s ，0 4 5 m m o l lg s h s i n g l e l y t h e yw e r ea l le x c e e d e dt h ev a l u eo fc o n t r o l ( 2 7 01g l ) t h ey i e l do f1 , 3 - p r o p a n e d i o l i s3 0 0 1g l ( r i s eb y1 1 11 ) b ya d d i n go 2 5m m o l lv c s t u d y i n go nt h ec o n c e n t r a t i o n v a r i a t i o no fs i d ep r o d u c t sb ya d d i n gv c ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ef i n a lc o n c e n t i o no fa c e t i c a c i d ，e t h a n o li si n c r e a s e db y3 7 7 ，3 3 5 a c c o r d i n g l y e x p e r i m e n t a lr e s u l t sa l s os h o w e d t h a ta d d i t i o no fv ch a da ni n h i b i t o r ye f f e c to nc e l lg r o w t h ，b u ti n c r e a s e dl ，3 - p r o p a n e d i o l p r o d u c t i o np e r c e l lc o n s i d e r a b l y e f f e c t so n1 3 一p r o p a n e d i o lp r o d u c t i o no fk l e b s i e l l as p b ya d d i t i o no fa t pw e r es t u d i e d t h er e s u l ts h o w e dt h a ta d d i t i o no fa t ph a da ni n h i b i t o r ye f f e c to nc e l lg r o w t h a d d i n g0 0 4 g la t ph a dar e m a r k a b l ei n h i b i t o r ye f f e c to nc e l lg r o w t h ，t h ev a l u eo fo d 6 0 0d e c r e a s e db y 2 6 5 t h ey i e l do f1 , 3 - p r o p a n e d i o li s3 0 0 5g l ( r i s eb y11 2 6 ) b ya d d i n go 0 6g la t p a d d i t i o no fa t pi n c r e a s e d1 , 3 - p r o p a n e d i o lp r o d u c t i o np e rc e l la n dt h ec o n v e r s i o no fs i d e p r o d u c ta c e t a t e c o m p a r i n gt ot h ec o n t r 0 1 t h ey i e l do fa c e t i ca c i dr i s e db y8 7 b ya d d i n g 0 0 6g la t p a d d i n go 0 6g la t pt of l a s k sa td i f f e r e n tf e r m e n t a t i o ns t a g e ( 0 h 、4 h 、ls h ) ，t h e h i g h e s ty i e l do f1 ，3 一p r o p a n e d i o li s3 0 13g l ( b y11 2 6 ) b ya d d i n g0 0 6g la t p a t4 h t h e v a l u eo f1 ，3 一p d o di sm a x i m u m ( r i s eb y2 5 8 4 ) b ya d d i n go 0 6g la t pa to h ，r e s p e c t i v e l y k e y w o r d s ：1 , 3 - p r o p a n e d i o l ，g l y c e r o l ，m u t a t i o nb r e e d i n g ，f e r m e n t a t i o n ，c o f a c t o r s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是誉人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机柏的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 签名： 垂堡 日 期：沙。8 年缃彬 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签 名：丝丕 导师签名： 日 期： 一粤 数亟釜 第一章绪论 第一章绪论 1 11 ，3 丙二醇理化性质 物理性质：1 ，3 丙二醇( 1 , 3 p r o p a n e d i o l ，1 , 3 p d ) 是一种无色无味透明的液体，相 对密度为1 0 5 3g c m 3 ，熔点2 7 ，沸点2 1 1 ，折射率( 2 0 ) 1 4 3 9 2 ，1 0 0 时饱 和蒸汽压为9 7 9p a ，闪点为8 0 。自燃温度为4 0 0 ，易溶于水、乙醇、醚类和甲酰胺， 微溶于氯仿和苯【l 】。与其它二元醇相比，1 ，3 丙二醇具有更高的沸点和更低的熔点。 化学性质：与1 ，2 丙二醇( 1 , 2 一p d ) 类似，高温下与羧酸缩合成酯，与异氰酸盐及 酸性氯化物生成聚氨酯。与1 ，2 丙二醇不同的是1 ，3 丙二醇只有两个端羟基有反应活性， 且反应活性相同。l ，3 丙二醇在酸性催化剂作用下，与醛或酮反应生成二氧杂环乙烷。 这是一种广泛应用的有机无机溶剂。在氧化铝催化下，1 ，3 丙二醇可生成为乙醇、丙二 酸等。1 3 一丙二醇最重要的性质就是与二酸反应生成聚酯和聚氨酯。 1 2l ，3 丙二醇功能和应用 l ，3 丙二醇是一种重要的化工原料。可直接用于防冻剂，是多种增塑剂、洗涤剂、 防腐剂和乳化剂的合成原料，也广泛应用于食品、化妆品和制药等行业【2 】。1 ，3 - 丙二醇 最主要的用途是合成新型聚酯p t t 的原料p j 。p t t 合成过程：1 ，3 一丙二醇( 1 ，3 一p d ) 和 对苯二甲酸( p t a ) 反应生成对苯二甲酸丙二醇酯，再经缩聚反应生成聚对苯二甲酸一l ，3 - 丙二醇酯( p t t ) 。因l ，3 丙二醇分子合适的碳链长度和对称的分子构形，p t t 兼具聚对 苯二甲酸乙二醇i 骆( p e t ) 和聚对苯二甲酸二醇酯( p b t ) 的优良特性。热塑性工程塑料方 面，p t t 既具有p e t 的物理性能，包括强度、韧性和耐热性，又具有p b t 的加工优势， 如熔体温度低、结晶快等，同时又保持聚酯的基本优点，即尺寸稳定性、电绝缘性和耐 化学品性。在合成纤维方面，p t t 不仅具有p b t 及尼龙纤维所特有的蓬松性和回弹性， 同时还具有p e t 及聚丙烯p p ) 优良的抗污及抗静电能力，另外，由于p t t 纤维全色范 围内染色无需载体，可以避免因使用某些染色载体对环境造成的危害，并且不需加染色 设备，可节省投资。众多的优点使得p t t 已被公认为2 1 世纪最具前途的合成聚酯材料 之一【4 】。据s h e l l 公司预测，到2 0 1 0 年，包括非纤维应用在内的全球p t t 需求量将 达到每年一百万吨p 1 。 因制备1 ，3 p d 的费用较高，曾影响了p t t 的发展。1 9 9 5 年后，壳牌公司、杜邦 公司研发的新技术已使1 ，3 p d 生产成本大幅下降，接近现有乙二醇的水平，推动了p t t 的发展。 1 31 ，3 丙二醇的生产及市场概况 受1 ，3 丙二醇产量有限的影响，长期以来它的售价一直偏高，1 9 9 1 年其价格为每公 斤3 6 美元，是乙二醇、1 ，2 丙二醇、1 ，4 丁二醇、2 ，3 丁二醇等其他二醇的十几倍以致 几十倍。到1 9 9 5 年，s h e l l 公司首先实现了p t t 的商品化并在g e i s m a r 建有一套年产4 0 0 0 吨l ，3 丙二醇的工业装置，另外d e g u s s a 公司也是世界上生产p t t 和l ，3 - 丙二醇的大公 江南大学硕+ 学位论文 司，具有年产5 万吨1 ，3 丙二醇的能力。随着产量的大幅度增加，其价格降为每公斤3 5 4 一 芙兀。 与s h e l l 公司和d e g u s s a 公司的化学法生产不同，尽管d u p o n t 公司早在1 9 9 8 年就 获得d e g u s s a 公司的生产技术，并己在德国和美国分别拥有2 2 万和1 2 万吨的年生产 能力，但其并不把化学法作为生产1 ，3 一丙二醇的主要方向，而倾向于用经济可行的微生 物发酵法进行生产：拟采用生物转化法生产l ，3 丙二醇，d u p o n t 公司正与世界第二大工 业酶生产商g e n e n c o r 国际有限公司以及世界领先的原料制造商t a t e & l y l ec i t r i c a c i d 公司( 擅长加工玉米、小麦或糖，并通过技术实现对这些原料的增值) 联合开发用基因 工程菌直接生产1 ，3 丙二醇实现大规模工业化生产技术。 根据美国咨询公司c o n d u x 的一项规划，近几年内p t t 年产将达到百万吨，1 ，3 丙二醇的需求量也会因此大大增加。近几年，1 ，3 。丙二醇产量将进一步提高，但价格变 化不会太大，至少不会低于每公斤2 美元【2 】【6 】【7 】嘲。 l ，3 丙二醇的市场目前主要由德国d e g u s s a 公司、美国d u p o n t 公司和荷兰s h e l l 公 司垄断，我国的1 ，3 丙二醇产量非常少，l ，3 丙二醇的生产技术水平、产品品种、产业 规模与世界跨国公司相比仍有一定的差距，特别是现有的1 ，3 一p d 的微生物发酵生产还 只能在试剂规模，大量工业用1 ，3 丙二醇仍需进口【7 】，因此，1 ，3 丙二醇在我国的开发前 景十分广阔。 1 41 , 3 丙二醇制备方法 1 ，3 丙二醇的生产方法有化学合成法和微生物转化法。目前已开发的具有工业应用 前景的生产方法主要有三种：s h e l l 公司的环氧乙烷羰基化法；d e g u s s a 公司的丙稀醛水 解法和h e n k e l 公司、d u p o n t 公司的微生物转化法【2 。3 】【8 - 1 。 1 4 1 环氧乙烷羰基化法 荷兰s h e l l 公司以环氧乙烷( 简称e o ) 作原料，经氢甲酰化反应得到3 羟基丙醛 ( 简称3 - h p a ) ，然后加氢得到1 ，3 p d ，其反应式如下： e o + c o + 2 h 2 1 ，3 一p d 此工艺的特点是技术难度大，装置投资高，但产品的质量和成本有竞争力。用e o 通过羰基合成反应制1 ，3 p d 有二步法和一步法，“e o 法工程化方面存在的困难是： ( 1 ) 高效催化剂的选择和改进：( 2 ) 反应压力较高，氢甲酰化反应压力在1 5 m p a 左右， 反应器结构相当复杂。 1 4 2 丙烯醛水合法 德国d e g u s s a 公司开发了以丙烯醛为原料生产1 ，3 一p d 的工业化路线，并申请了专 利。其主要生产步骤如下： ( 1 ) 丙烯醛水合得到3 - h p a - c h 2 = c h c h o + h 2 0 h o c h 2 c h 2 c h o ( 2 ) 3 h p a 催化加氢制得l ，3 p d ：h o c h 2 c h 2 c h o + h 2 - - ，h o c h 2 c h 2 c h 2 0 h 丙烯醛路线反应条件比较温和，技术难度也不大。但丙烯醛本身也是一种重要的有 2 第一章绪论 机中间体，而且属剧毒易燃易爆物品，难以储存和运输。 1 4 3 微生物转化法 微生物转化法通常分为两类：一是以德国h e n k e l 公司为代表的技术路线，用肠道细 菌在厌氧或微耗氧条件下直接将甘油歧化转化为1 ，3 一丙二醇；二是以美国d u p o n t 公司 和g e n e r c o r 公司为代表的技术路线，用基因工程菌直接将糖转化为l ，3 一丙二醇。与化学 合成法相比，它具有如下特点：1 、可以利用成本较低的可再生资源；2 、生产条件温和， 节约能源，不需贵重金属催化剂；3 、转化率高，选择性好，副产物少，易于分离纯化； 4 、环境友好等特点。 微生物转化法生产1 ，3 丙二醇目前尚处于实验室以及中试研究阶段，部分研究机构 已完成中试，即将进行工业化生产。微生物转化法生产1 ，3 丙二醇是以生物技术为特征 的“绿色工业 ，向传统石油化工提出了强有力的挑战，具有重要意义。 1 5 微生物发酵法生产1 , 3 丙二醇的研究进展 早在18 81 年，a u h u s tf r e u n d 就发现巴斯德梭菌( c l o s t r i d i u mp a s t e u r i a n u m ) 能代谢 甘油生成1 ，3 丙二醇。二十世纪六十年代，由于甘油过剩及l ，3 丙二醇的潜在用途，人 们致力于将甘油转化为1 ，3 丙二醇的研究，主要集中在酶学性质、代谢机理及培养工艺 的研究。近年来，由于1 ，3 丙二醇用于p t t 合成的巨大市场需求，重新激起了人们的研 究兴趣，以德国生物工程研究中心( g b f ) 和美国d u p o n t 公司为首的多家研究机构对 生物法制取1 ，3 丙二醇进行了研究。 目前生物法生产1 ，3 丙二醇主要有两条途径：一条途径是利用天然微生物将甘油转 化为l ，3 丙二醇，研究重点是如何提高产物浓度以及甘油转化率；另一条途径是利用基 因工程技术构建可以将甘油或其他廉价碳源如葡萄糖转化为1 ，3 丙二醇的基因工程菌。 国内生物法生产1 ，3 丙二醇的研究起步较晚，主要是利用肺炎克雷伯氏菌厌氧条件下将 甘油转化为l ，3 丙二醇，研究重点多集中于菌种筛选和发酵工艺优化方面。 1 5 1 生产茵种 1 ，3 丙二醇生产菌主要有肺炎克雷伯杆菌( k l e b s i e l l ap n e u m o n i a e ) 、弗氏柠檬菌 ( c i t r o b a c t e r f r e u d i i ) 、成团肠杆菌( e n t e r o b a c t e ra g g l o m e r a n s ) 、短乳杆菌( l a c t o b a c i l l u s b r e v i s ) 、布氏乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sb u c h n e r i ) 、丁酸梭状芽孢杆菌( c l o s t r i d i u mb u t y r i c u m ) 和巴斯德梭菌( c l o s t r i d i u m p a s t e u r i a n u m ) 等【4 , 1 2 , 1 3 】，它们只能利用甘油而不能由糖类等 廉价碳源直接产生l ，3 丙二醇。其中kp n e u m o n i a e 、c f r e u n d i i 和cb u t y r i c u m 具有较高的 底物转化率和生产强度，因而得到了较多关注。 甘油作为上述微生物发酵的唯一碳源和能源物质，经过微生物代谢后除产生目的产 物1 ，3 丙二醇外，还可能产生乙酸、乙醇、丁酸、2 ，3 丁二醇、乳酸、琥珀酸等副产品， 但副产物的量一般较少( 小于5 ) 1 3 j 。发酵的底物、目的产物及副产物都是微生物生 长的抑制剂。kp n e u m o n i a e 、cb u t y r i c u m 比cf r e u n d i i 具有较高的甘油耐受力，发酵 速度较快，kp n e u m o n i a e 与cf r e u n d i i 属于兼性菌，而cb u t y r i c u m 要求严格的厌氧条 3 江南大学硕士学位论文 件。虽然kp n e u m o n i a e 和c f r e u n d i i 是l ，3 丙二醇较好的生产菌种，但由于它们可能产 生的致病性，在培养过程中要有安全防护措施【l o l ，故在实际应用中受到一定限制。 1 5 21 , 3 丙二醇生物合成途径 1 ，3 - 丙二醇是一种典型的甘油发酵产物，并未发现其可由其他有机底物厌氧转化而 来。甘油作为唯一碳源和能源，它可以沿着氧化和还原途径发生歧化反应，氧化途径中 产物与糖类发酵产物一致，并产生供细胞生长所必需的a t p ，在某些产物形成的同时释 放还原力n a d h ；还原途径则消耗氧化途径中多余的还原力，生成1 ，3 丙二醇【1 4 】。在厌 氧条件下以甘油为底物转化生产1 ，3 丙二醇的生物合成途径如图1 1 所示【”】。 氧化途径主要包括以下步骤：( 1 ) 甘油经甘油脱氢酶( g d h ) 催化生成2 羟基丙酮 ( d h a ) ，此酶为厌氧酶，以n a d + 为辅酶；( 2 ) 2 一羟基丙酮在a t p 及2 一羟基丙酮激酶 的作用下，生成磷酸二羟丙酮( d h a p ) ；( 3 ) 磷酸二羟丙酮代谢生成丙酮酸，然后进一 步代谢生成乙酸、乙醇、乳酸等代谢副产物。氧化途径生成生物能量a t p 和还原力 n a d h ，并伴随有微生物细胞的生长。还原途径主要有两步酶反应：( 1 ) 甘油脱水酶 ( g d h t ) 在辅酶b 1 2 存在下将甘油转化为中间产物3 羟基丙醛( 3 - h p a ) ；但) 在 n a d h 存在下，3 羟基丙醛在1 ，3 一丙二醇氧化还原酶( p d o r ) 催化下生成1 ，3 丙二醇。 还原途径消耗氧化途径生成的过量n a d h ，使微生物细胞内的还原物质达到平衡。 图1 1 厌氧发酵甘油代谢途径 f i g 卜lt h em e t a b o l i s mp a t h w a yo fg l y c e r o li na n a e r o b i cf e r m e n t a t i o n 4 第一章绪论 1 5 31 , 3 丙二醇生物合成途径中的关键酶 1 5 3 1 甘油脱水酶的结构及性质 甘油脱水酶由三个亚基组成，在菌体内可形成六聚体结构q 2p 27 2 ，分子量大约1 9 0 k d t l 6 1 。三个亚基的编码基因均在菌体的d h a 调节子上。另外甘油脱水酶需要在辅酶b 1 2 的辅助下才能有效地进行催化，属于第1 i 类以b 1 2 作辅酶的生物催化剂。脱水酶的作 用主要是与辅酶b 1 2 有机结合后产生电子受体，从而将甘油或l ，2 丙二醇转化为相应的 醛【1 7 】。 在催化甘油的同时，脱水酶会出现甘油导致的自杀性失活现象。这主要是由于底物 甘油导致辅酶b 1 2 的c c o 键发生不可逆断裂，形成5 一脱氧腺苷和烷基钴氨素类似物 ( 即被修饰的辅酶) 1 8 - 1 9 。而烷基钴氨素与脱水酶紧密结合，致使脱水酶不可逆性失活。 t o r a y a 等【2 l 】研究表明，向甲苯处理后的kp n e u m o n i a e 和ko x y t a c a 细胞中加入 a t p 、m 9 2 + ( 或v i n 2 + ) 及辅酶b 1 2 时，失活的脱水酶都可以复活，进一步研究表明， 这是一个辅基交换过程，即将与之结合的被修饰的辅酶b 1 2 或维生素b 1 2 与自由态辅 酶b 1 2 进行交换，从而恢复脱水酶的催化活性。而且a t p 、m g + ( 或m n 2 + ) 及辅酶b 1 2 三者对于酶的复活都是必需的，缺一不可。甘油脱水酶复活机理模型的关键是复活因子 亲合形态的转变。e m p t a g e 等都认为是通过菌体能量状态( a t p a d p ) 的调节来实现的 2 1 - 2 2 】，因此菌体的能量状态对于维持脱水酶的活性至关重要。 1 5 3 2l ，3 丙二醇氧化还原酶 1 ，3 丙二醇氧化还原酶( 1 ，3 - p r o p a n e d i o lo x i d o r e d u c t a s e ，p d o r ，e c l 1 1 2 0 2 ) ，又称 l ，3 一丙二醇脱氢酶( 1 , 3 一p r o p a n e d i o ld e h y d r o g e n a s e ) ，是微生物中特有的一种酶。j o n h n s o n 等【2 3 】首次从kp n e u m o n i a e 中纯化得到l ，3 一丙二醇氧化还原酶，推断该酶为同型八聚体 或同型六聚体，亚基分子量为4 5 士3k d 。此酶对底物甘油和辅酶n a d + 都非常专一， 其活性可被二价阳离子的鳌合物强烈抑制，f e 2 + 、m n 2 + 可使其活性恢复。 d a n i e l 等【2 4 】纯化了来源于c f r e u n d i i 的1 ，3 丙二醇氧化还原酶，并推断该酶为八聚体， 分子量为3 3 1k d ；亚单位分子量为4 3 4k d 。以3 羟基丙醛和n a d h 为底物的k m 值分别 为1 4 0 m 和3 3 m 。该酶能被二价阳离子的鳌合物强烈抑制，c 0 2 + 、c a 2 + 、z n 2 + 对其活 性没有影响。m n 2 + 、f e 2 + 可使其恢复活性。f e 2 + 对其活性有显著影响。 1 6 发酵工艺开发与优化研究 1 6 1 茵种筛选 在菌种选育方面，由于存在底物抑制和产物抑制，为提高1 ，3 p d 的产物浓度和甘 油转化率，必须筛选耐受高底物浓度和产物浓度的菌种，人们通过自然筛选和诱变筛选 得到了许多优良菌种。如p a p a n i k o l a o u 2 5 】筛选到一株丁酸梭菌可以耐受高产物浓度 ( 8 0 9 l 。) 。h o m 猢【2 6 】筛选到一株c f r e u n d i i ，副产物只有乙酸，甘油到l ，3 p d 的 转化率达到o 6 5m o l m o l 。 江南大学硕士学位论文 1 6 2 培养基优化 修志龙吲等人对k p n e u m o n i a e 间歇发酵和连续发酵培养基中n a + 、k + 、n h 4 + 等进 行了优化。结果表明，n a + 对发酵过程关键酶具有抑制作用，而k + 和n h 4 + 具有激活作 用，采用k o h 调节p h 优于n a o h ，而采用无铵培养基氨水调节p h 的发酵，甘油 对1 ，3 p d 的的转化率和1 ，3 p d 的终浓度较高。z e n g t m 等认为维生素b 1 2 是甘油脱水 酶的辅酶，f e 2 + 对丙酮酸脱氢酶和1 ，3 丙二醇氧化还原酶有激活作用，二者是1 ，3 p d 发 酵培养基中的重要成分。h i l l l 】m i 【2 9 l 研究了生物素以及碳氮比对c 1 b u 缈i c u m 甘油到 1 ，3 p d 的转化率的影响，当生物素浓度为4 ug l ，甘油到1 ，3 一p d 的转化率为o 6 3 m o l m o l 。r e i m a n n 3 0 】研究发现c 1 b u t y r i c u m 发酵过程中铁离子i 艮i i i 有利于降低丁酸 的生成从而提高1 ，3 p d 的得率系数。 1 6 3 培养条件 p h 和温度是影响1 ，3 p d 合成的关键工艺条件。1 ，3 p d 发酵的最佳p h 接近中 性。c l b u 缈m u m 补料批式发酵的最佳p h 为7 o 【3 1 1 。c f r e u d i i 的适宜p h 范围为 6 5 8 5 。c l o s t r i d i u m 和k l e b s i e l l a 为6 5 8 0 。最近的研究表明，p h 是ea g g l o m e r a n s 中l ，3 p d 合成途径中酶活性的决定因素。在低p h 下，甘油脱水酶的相对活性高于 1 ，3 一p d 氧化还原酶，因此造成有毒代谢中间物3 h p a 的累积，提高p h 到8 0 可以 避免3 一h p a 累积使甘油完全转化【3 2 j 。发酵法生产1 ，3 p d 的合适温度范围为2 8 - - 3 7 。其中c 1 b u t y r w u m 的最佳温度为3 5 c ；基因工程菌的最佳温度为2 8 ，此时甘油 脱水酶的活性最高。 1 6 4 培养方式 补料批式发酵 补料批式发酵是最常用的培养方式，具有操作简单、对设备要求低等优点。在厌氧 培养过程中通过补加甘油和氮源，可以消除底物抑制，提高产物浓度和甘油转化率。较 常用的补加方式有间歇补加、恒速补加以及在线补加。s a i n t - a m a n s 等人【3 3 】用c 0 2 作为 控制参数以确保在丁酸梭菌v p i3 2 6 6 发酵过程中底物甘油处于稳定的微过量状态，发 酵液中浓度可达6 5g l ，生产强度为1 2 1g l h ，摩尔转化率为5 6 ，但这种方法只适 用于产生h 2 和c 0 2 的比值为定值或不产生h 2 的细菌。r e i m a n n 和b i e b l 【3 4 j 贝0 根据k o h 和底物甘油消耗的关系，通过p h 值来确保丁酸梭菌d s m5 4 3 1 产乙酸途径突变株发酵 液中稳定的微过量甘油浓度，结果1 ，3 丙二醇浓度达7 0 9 a ，生产强度达1 8 2 4 虮l l ， 且发酵时间大大缩短。刘海军等人( 2 0 0 1 ) 也通过将底物流加和p h 值调控相偶联的方法 有效的提高了1 。3 丙二醇的发酵终浓度和甘油摩尔转化率。 连续培养 连续培养生产强度较高，但产物浓度过低，给下游提取增加了困难。m e n z e l p 习以 o 1 h 以的稀释率连续培养足p 珊枷刀砌p ，1 ，3 p d 的浓度可达4 8 9 l ，摩尔转化率为0 6 3 m o l m o l 一，生产强度为4 8 9 l 1 h - 1 ，但此时要求甘油剩余5 0 9 l 一。当甘油过量很 少时，1 ，3 p d 浓度只有3 3g l ，转化率为0 4 6m o l m o l ，生产强度为3 3g l 。1 h 。 6 第一章绪论 微好氧发酵 氧对甘油发酵的影响尚不十分清楚，但是微好氧生产l ，3 一p d 似有可能【2 】。修志龙 等【3 6 】在微好氧条件下批式发酵的实验结果表明：1 ，3 p d 的终浓度和甘油到1 ，3 p d 转 化率接近在厌氧条件下的相应的值。然而在微好氧的情况下，发酵结束产生的乙醇要比 厌氧条件下产生的要少，微好氧批式发酵的时间比厌氧发酵明显要短，从而增加了 l ，3 p d 的生产强度。微好氧条件下补料分批发酵的单位体积的l ，3 p d 生产强度几乎是 厌氧条件下补料分批发酵的两倍，分别为1 5 7 9 l 。1 h d 和0 8 0g l 1 h 。 协同底物发酵 当以甘油为唯一碳源，1 ，3 p d 理论最大摩尔转化率为0 7 2 m o l m o l 。b i e b l t 3 7 】研 究了葡萄糖、1 ，2 一乙二醇、l ，2 丙二醇作为辅助底物对c i b u t y r i c u m 和c f r e u n d i i 发酵 甘油转化率的影响。发现葡萄糖作为辅助底物可以使甘油的转化率提高0 9 0 m o l m o l ， 而另外两个作为辅助底物转化率不但没有提高反而降低。a b b a d a n d a l o u s s i t 3 8 】利用葡萄 糖作为辅助底物得到了类似的结果。甘油对1 ，3 p d 的摩尔转化率 达到o 9 2 0 9 3 m o l m o l 。m a l a o u i t 3 9 】等人的研究结果表明，在甘油浓度给定的情况 下，逐步增加葡萄糖，使得碳源向还原途径转移，甘油到1 ，3 p d 的转化率0 6 3 m o ln n o l d 上升到0 8 9m o l m o l 。 细胞循环培养 为消除产物抑制，r e i m a n n 研究了c 1 b u 纱r w u m 细胞循环下的连续培养方式，通过 中空纤维膜分离发酵产物，而菌体循环回反应器，大大提高了1 ，3 一p d 的生产速率 4 0 l 。 1 7 产l ，3 丙二醇基因工程茵的研究 由于甘油和其他廉价碳源如葡萄糖相比，价格较高，增加发酵法成本。而自然界中 没有能够直接利用葡萄糖产生1 ，3 丙二醇的菌种，因此利用基因工程构建能将葡萄糖等 碳水化合物转化为1 ，3 丙二醇的菌种成为降低发酵成本重要手段，也是发酵法生产1 ，3 丙二醇热点。产1 ，3 丙二醇基因工程菌的构建策略主要有五条途径【4 ，见图1 2 。 图1 2 基因工程菌的构建策略 f i g 1 - 2t r a t e g i e so fg e n e t i cr e c o m b i n a n t si nl ，3 - p r o p a n e d i o l ( 1 ) 通过基因工程方法强化还原途径中限速酶( 如甘油脱水酶) 的表达以及阻断副 产物代谢途径，并多克隆表达编码激活因子的基因； ( 2 ) 将l ，3 丙二醇生产菌的d h a b 、d h a t 基因克隆到甘油生产菌中，以希望获得能将 葡萄糖转化为1 ，3 丙二醇的基因工程菌； 7 江南大学硕士学位论文 ( 3 ) 将甘油生产菌的d a r l 、僦基因克隆到l ，3 丙二醇生产菌中，以希望获得能 将葡萄糖转化为1 ，3 丙二醇的基因工程菌； ( 4 ) 将l ，3 丙二醇产生菌的d k a 调控子调控的基因克隆到大肠杆菌中，获得能转化甘 油为1 3 丙二醇的基因工程菌； ( 5 ) 将1 ，3 丙二醇生产菌的d h a b 、d h a t 基因和甘油生产菌的d a r l 、僦基因克隆 到e 疗中，获得能将葡萄糖转化为1 ，3 丙二醇的基因工程菌。 1 8 生物法合成1 , 3 丙二醇研究现状 目前，微生物法生产1 ，3 丙二醇主要有两大类：一是以德国国家生物技术中- i 二