（环境科学专业论文）奶牛粪便纤维素酶解糖化工艺研究.pdf

两南大学硕十学位论文 a b s t r a c t o p t i m i z i n gp r e t r e a t m e n ta n de n z y m a t i c s a c c h a r i f i c a t i o no f d a i r ym a n u r e c a n d i d a t e ：l i n gj u a n s u p e r v i s o r ：v i c ep r o f l ij i n g p r o f w e is h i q i a n g a bs t r a c t r e l a t i v et ot h ef i r s tg e n e r a t i o nb i o l o g yf u e l ，s u c ha sc o ma n db e a n ，t h es t r a wa n do t h e rp l a n t f i b r e sw e r ei d e n t i f i e da st h es e c o n db i o l o g yf u e l a n dt h em o s ta d v a n t a g ei sa v o i e dt h er i s k ，w h i c hi s g r a pg r a i nf r o mh u m a na n dg r a pl a n d f r o mg r a i n t h i sr e s e a r c hc h o i c et h es p e c i a lf i b r e m a t e n a l s - 也i r yr n a n u r e t h a t sn o to n l ye x p e n d e dt h es c a p eo ft h ec h o i c e o ft h ef i b r e m a t e r i a l s ，b u ta l s oc h a n g ew a s t et ow e a l t h m e a n t i m e ，i ta l s op r o v i d e dan e ww a yt od e v e l o pb i o l o g y f u e l i t si m p o r t a n tf o rs u s t a i n a b l ed e v e l o p m e n t t h i sr e s e a r c hi n c l u d et h r e ep a r t ：f i r s t ，i n v e s t i g a t i o n o fl i v e s t o c km a n u r e sp o l l u t i o n s e c o n d ，p r e t r e a t m e n ta n dz y m o s i sas u c c e s so fr e s e a r c h l a s t ，b e n e f i t a n a l y i s i so fd a i r ym a n u r ee t h a n 0 1 r e c e n t l y , b r e e d i n gm a d eab i gp r o g r e s s ，e v e nt ob eap i l l a ri n d u s t r i e si ns o m ep l a c e h o w e v e r , t h e p u l l u t i o no fl i v e s t o c km a n u r ef r o mb a dt ow o r s e t h e r ei sal o to fi n d i g e s t e do r g a n i cm a r e r si n l i v e s t o c km a n u r e ，w h i c hw i l le n d a n g e r e dt h ea i r 、w a t e r 、s o i la n db i o l o g y a c t u a l l y , t h es c a l eo f i n t e n s i v ea q u a c u l t u r eh a sg r o w na n da n i m a lf e e dt e n d st ob es t a n d a r e d ，s ol i v e s t o c km a n u r ec o n t a i n s p l e n t yo fc e l l u l o s i cm a t e r i a l s i fc h a n g et h i sm a t e r i a l st oe t h a n o l ，n o to n l yt h eu s eo ft h ew a s t e ， c r e a t i n gv a l u e ，b u ta l s or e d u c e dt h el i v e s t o c ka n dp o u l t r ym a n u r eo nt h ee n v i r o n m e n tp o l l u t i o n i n t h i sp a p e r , b a s e do np o l l u t i o ne c o l o g yt h e o r y , s e l e c t e dt or e p r e s e n tc o m p a r i s o no ft h ec h a r a c t e r i s t i c s o fi n t e n s i v el i v e s t o c kf a r m i n gm a n l l r e t o wd u n ga sc e l l u l o s i cm a t e r i a l s i tw a sf o u n dt h a tt h ep r e t r e a t m e n tm e t h o d s t e m p e r a t u r e 、t i m e 、c o n c e n t r a t i o na n ds u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o nw e r em o r ei m p o r t a n tt ot h ea c i dp r e t r e a t m e n tt h a na l k a l ip r e t r e a t m e n t t h er e s u l t so f o r t h o g o n a le x p e r i m e n tc o n c l u d e dc a ( o h ) 2i sn o ts u i t a b l ea sap r e t r e a t m e n tr e a g e n t ；t h eo p t i m i z e d c o n d i t i o nw e r e2 h c i 、2 5 h 、t e m p e r a t u r e1 2 5 c 、s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n4 5 9 l - 1 t h er e s u l t so fe t h a n o lf e r m e n t a t i o no nt h ec e l l u l o s i ch y d r o l y s a t es h o w e dt h a tt h eo p t i m i z e d c o n d i t i o nw e r et e m p e r a u t r e5 5 c 、e n z y m ed o s a g e o 1 m g g 、s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n1 5 9 l 1 、p h 4 8 t h r o u g ha n a l y s i sb e n e f i to fs o c i e t y 、e c o n o m ya n de n v i r o n m e n t ，i tc o n c l u d e dt h a td a i r ym a n u r e a saf i b e rr a wm a t e r i a lf o re t h a n o ln o to n l yb r o a d e n st h et r a d i t i o n a ls c o p eo ft h er a wm a t e r i a l sa n di n a c c o r d a n c ew i t ht h ed e v e l o p m e n to ft h ec o n c e p to fc i r c u l a re c o n o m y k e yw o r d ：d a i r ym a nu r e , c e l l u l o s i cm a t e r i a l s ，p r e t r e a t m e n t ，z y m o l y s i s 独创性声明 学位论文题目：奶牛粪便纤维素酶解糖化工艺研究 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了 特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同仁 在文中作了明确说明并表示衷心感谢。 学位论文作者：敖硝签字日期：争却# y - 月功咱 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借闺。本人授权西南大学研究生院( 筹) 可以将学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止)。 学位论文作者签名：歹囊哂导师签名：砖艺多 签字日期：b 川年 月彳日 签字日期： 2 1 pd 7 年z 月z 日 西南人学硕士学位论文第1 幸绪论 1 1 畜禽粪便概述 第一章绪论 畜禽粪便是畜禽排泄物的总称，它是其他形态生物质( 主要是粮食、农 作物秸秆和牧草等) 的转化形式，包括畜禽排出的粪便、尿及其与楚草的混 合物。它属于生物质能，具有可再生性、广泛分布性和总量丰富等特点。 1 1 1 畜禽粪便的排放量及污染现状 近年来，随着我国经济的发展和人民生活水平的提高，畜禽产品需求量不断 增加。特别是全国各大中城市和主要产区“菜篮子工程”的相继实施，使畜禽养殖业 得到了迅猛发展，生产规模不断扩大，集约化和商品化程度越来越高。然而，大 多规模化养殖场为了运输方便、供应及时、减少成本，选择在大中城市郊区和人 口稠密地区建场，使畜禽养殖特点由过去的分散经营、饲养头数少、主要分布在 农区转变为现在的集中经营、饲养头数多、分布在城市郊区或新城区。畜禽养殖 特点的变化，务农劳力的转移和肥料施用由有机肥为主转变为化肥占主导地位， 加之畜禽粪便的长期均衡产出与农业生产的季节性用肥不相一致，使得大量畜禽 粪便和养殖污水不能被农田所消纳，导致畜禽粪便由宝变为废弃物，特别是畜禽 粪便含水量大、恶臭，带来处理、运输、施用极不方便，更加剧了畜禽粪便直接 还田的难度，绝大多数粪污水没有得到及时处理和利用，直接排入或径流流入江 河湖泊，导致水体的严重污染，也制约了畜禽业的进一步发展【1 】。统计资料表明， 2 0 0 3 年我国畜禽粪便产生量约为3 1 9 0 亿t ，远超过当年工业固体废弃物1 0 o o 亿t 的总量，畜禽粪便中的总氮量为1 3 9 4 6 0 万t ，总磷量为3 7 8 5 0 万t 【。各类畜禽中 产生量最大的是猪和牛粪便，两者占年全部畜禽粪尿总量的9 0 以上【3 】。据估算， 我国畜禽粪便主要污染物c o d 、b o d 、n i l 4 n 、t p 、t n 的流失量分别为7 2 8 2 6 、 4 9 8 8 3 、1 3 2 2 0 、4 1 9 5 、3 4 5 5 0 万t 年，其中c o d 的流失量已接近全国工业废水 中c o d 的排放总量( 7 6 8 3 7 万t 年) ，总氮和总磷的流失量超过化肥的流失量【4 1 。 据估算，到2 0 1 0 年，全国畜禽粪便的排放量将达4 5 亿t 。调查还发现，全国9 0 以上的规模化养殖场没有经过环境影响评价，9 0 的规模化养殖场缺乏必要的污染 致力设施【5 】。畜禽粪便污染已成为重要水源地及江、河、湖泊污染和富营养化的主 要原因。 1 1 2 畜禽粪便的危害 1 1 2 1 污染空气 两南大学硕十学何论文第1 章绪论 畜禽养殖过程会产生大量的恶臭气体，还有来自粪污在堆放过程中有机物的 腐败分解产物，包括甲烷、有机酸、氨、醇类等2 0 0 多种有毒有害成分【酬。如果不 及时处理，排放到大气中就会污染空气，使空气中含氧量下降，使动物及人群的 免疫力下降，呼吸道疾病频发【7 1 。而且，有的畜禽养殖场离居民生活区较近，由于 恶臭污染问题，也会导致养殖场与周围群众关系十分紧张，甚至引发社会矛盾博j 。 1 1 2 2 污染水体 粪便和冲洗粪便废水中含有氮、磷及粪渣等有害物质，排放到河流水域，引 发大面积水域富营养化，使得蓝藻等有毒有害藻类大量繁殖。另外，水域大面积 的污染是生物多样性急剧减少，有的河流鱼虾绝迹【9 1 。畜禽粪便过量施用，残留土 壤中的n ，p 等物质渗入地下水，将导致地下水中n 0 2 、n 、n 0 3 浓度的升高，人 若长期或大量饮用，可能诱发癌症【6 】。 1 1 2 3 污染土壤 畜禽粪便中含有大量的钠盐和钾盐，如果直接用于农田，过量的钠和钾通过反 聚作用而造成某些土壤的唯恐减少，使土壤的通透性降低，破坏土壤结构，危害 植物【6 】。 1 1 2 4 传播病菌 畜禽粪便中的污染物中含有大量的病原微生物、寄生虫卵以及孽生的蚊蝇， 会使环境中病原种类增多，病原菌和寄生虫大量繁殖，造成人、畜传染病的蔓延， 尤其使人畜共患病时，会导致疫情发生，给人畜带来灾难性危害【10 1 。畜禽粪尿及 废水中的病毒、致病菌及寄生虫卵等即危害畜禽养殖场本身，又对人类的健康造 成威胁。 综上所述，畜禽粪便给人类带来的不利影响已经不容忽视，如不及时处理， 则会造成水源、空气、土壤的污染以及传染性疾病的流行。 1 1 3 畜禽粪便的利用现状及存在的问题 近年来，将畜禽粪便无害化和资源化，最大限度地满足环境的可接受性和经 济上的可行性，成为人们追求的目标，随之产生了许多畜禽粪便的处理方法，如 肥料化、饲料化、生产沼气等。这些治理方法在一定程度上解决了畜禽粪便对环 境污染的问题，但是在具体的处理技术上仍然存在一定的问题。 1 1 3 1 利用畜禽粪便生产有机肥 畜禽粪便中含有大量有机质、氮磷及各种中、微量元素，养分齐全，适量使 用可改良土壤，提高农产品品质，但其总养分含量偏低，单一使用不能满足作物 2 西南大学硕十学位论文第1 章绪论 生长需求。若利用有机肥和有机无机复混肥制备技术，能生产优质有机肥和商品 化有机复合肥。目前处理技术主要有：土地还原法、生物处理法【l i 】和高温堆肥法 【1 2 】 o 土地还原法虽然简单易行，但畜禽粪便当中含有的有害病菌和虫卵没有除去， 再施用过程中很容易对农作物产生不良影响。 高温堆肥法是将畜禽粪便与秸秆等辅料混合，堆高l m 左右，定期翻动补氧， 利用微生物生长使畜禽粪便发醉、脱臭。这种模式的优点是：生产工艺简单，投 资少，成本低：而主要问题在于：生产能力小，劳动强度大，受外界气候条件影 响大，产品商品率低。 微生物处理法能比较彻底的分解畜禽粪便，但受温度的限制比较大。在处理 过程中，原料的收集、运输贮存、加工都极易造成对环境的二次污染，目前我国 环保力度日益增强，应尽量减少二次污染。 1 1 3 2 利用畜禽粪便生产饲料 对发展中国家来说，粪便作饲料仍是主要出路。粪便资源饲料化，是畜禽粪便 综合利用的重要途径。由于畜禽粪便是有害物的潜在来源，含有病原微生物、化 学农药残留等，因此要将畜禽粪便经过无害化处理后方能作为饲料使用。带有潜 在病原菌的畜禽粪便经过高温、膨化等处理后，可杀死全部的病原微生物和寄生 虫。常用的处理技术有干燥法和生物分解f l l 】。 干燥法中自然干燥成本较低，节省能源，但缺点是效率低，湿营养成分损失较 为严重，而且对环境的污染较为严重。人工干燥可以达到消毒、杀灭细菌、消除 臭味的效果，但是养分损失较大，成本较高。 生物分解是利用优良品种的蝇蛆、蚯蚓和蜗牛等低等动物分解畜禽粪便( 尤其 是牛的粪便) ，达到既提供动物蛋白质又能处理畜禽粪便的目的。此法比较经济、 生态效益显著。但是一次投入成本过大，周期过长，不适合中小型养殖场。 1 1 3 3 利用畜禽粪便生产沼气 沼气工程被看作集约化畜禽养殖场是否进行环境污染治理的重要标志。目前 常用的沼气厌氧发酵法适于处理集约化畜禽养殖场采用水冲式清粪工艺的液态畜 禽粪尿，经厌氧发酵后产生沼气。沼气是一种清洁无污染的燃料。沼气池废渣及 沼液可做肥料加以利用。但沼气工程一次性投资高，日常运行维护费用高，经济 效益差，资金回收困难，北方地区冬季需采取保温措施才能维持正常运行【l3 1 。除 此之外，沼气处理存在会增加污染物数量、经济上不合算、会加重养殖场本身的 污染以及沼气技术本身不完善等弊病，限制了沼气化的大面积推广【1 4 】。因而，沼 气工艺作为大中型畜禽养殖场的唯一处理模式是不合适的，也是不科学、不经济 曲南人学硕士学何论文第1 章绪论 的。 上述处理方法在一定程度上缓解了全国畜禽粪便污染的严重性，但是，到目 前为止，全国畜禽粪便的污染仍然没有得到有效的控制，在“一控双达标”工作初见 成效以后，我国的主要污染由工业污染悄悄向农村面源污染转移，规模化畜禽养殖 业造成的面源污染及对江河造成的水质污染正上升为新的环境问题。因此，急需 探索一条新路来控制畜禽养殖业造成的面源污染。 1 2 纤维素乙醇化概述 1 2 1 纤维质原料的化学组成 术蕊磊r i i 维j ；孽 嚣r 7 v 甓一j 、l l ! r 一r 一 由 ， 瓣 电 j ： ， j 瞄髓卜裘 2 图1 2 1 木质纤维素结构示意图【1 5 】 f i 9 1 2 1t h es t r u c t u r eo f l i g n o c e l l o s e 纤维质原料构成，其中主要是纤维素、半纤维素和木质素等成分 1 5 , 1 6 】。 纤维素分子是由葡萄糖苷通过b l ，4 糖苷键联接起来的链状聚合体。纤维素具 ( c 6 i - 1 1 2 0 5 ) n h 2 0 的结构式，其分子量、聚合度根据种类及测定方法的不同有较大 的差别。植物纤维素结构复杂，基本上是由原纤维构成的微纤维束集合而成。原 纤维是由1 5 - 4 0 根有结晶部和非结晶部构成的纤维分子长链。纤维素的结晶部分 是由纤维素分子进行非常整齐规则地折叠排列而成的。在结晶部分里，葡萄糖分 子的羟基或在分子内部或与分子外部的氢离子相结合，没有游离的羟基存在，所 以纤维素分子具有牢固的结晶构造，酶分子及水分子难以侵入到内部中。因此， 纤维素的结晶部分比非结晶部分难分解得多【l 。7 1 。 半纤维素是植物纤维原料的另一主要组分，半纤维素是一大类结构不同的多 4 西南大学硕十学位论文第1 章绪论 聚糖的统称。在许多情况下，半纤维素分子不是由一个单一的糖苷聚合而成，而 是由2 6 个不同的糖苷组成。在细胞壁中，它位于许多纤维素之间，好象是一种 充填在纤维素框架中的填充料。半纤维素与纤维素不同，它很容易被水解。但是 由于半纤维素和纤维素交杂在一起，所以只有当纤维素也被水解时，半纤维素才 可能全部水解。 木质素是植物界中仅次于纤维素的最丰富和最重要的有机高聚物。木质素是 一类由苯丙烷单元通过醚键和碳碳键连接的复杂无定型物。它和半纤维素一起作 为细胞间质填充在细胞壁的微细纤维之间，加固木化组织的细胞壁：它也存在于细 胞间层，把相邻的细胞粘结在一起。木质素和半纤维素形成牢固的结合层，紧紧 地包围着纤维素，阻碍酶与纤维素的接触。 因此，要提高糖化速度，必须除去木质素、半纤维素的结合层，使纤维素的 孔隙增大，提高纤维素与酶接触的有效比表面积，从而提高糖化速度。 1 2 2 利用纤维素发酵生产乙醇的发展及现状 以纤维废料为原料生产酒精的研究近年来异常活跃【1 8 】。往汽油添加酒精作为 燃料始于第一次世界大战，到1 9 2 1 年德国的混合酒精生产量己达到2 1 0 0 0 吨，但 五十年代初期由于大量便宜石油的出现而停止了生产【1 9 】。七十年代中期发生石油 危机以来，人们又开始关注生物酒精燃料，使其发展得到了大大的加强。美国能 源部1 9 7 9 年以1 5 亿美元的预算用于生物质能的生产研究，在中西部设置了四个 实验厂，用纤维素废物生产燃料酒精【2 0 】。1 9 8 0 年2 月，由美国能源部和国家科学 基金会在纽约主持召开了“燃料和化学物发酵生物学展望”学术讨论会，会议报告中 阐述了纤维素资源的开发利用和生产乙醇的问题【2 。1 9 9 9 年1 2 月，美国能源部 再一次颁布了关于实施“生物质转化酒精”项目的计划。2 0 0 9 年2 月2 5 日，美国低 碳能源生物技术供应商麦斯卡玛公司( m a s c o m a ) 宣布，其位于纽约州罗马市的示 范工厂已经开始生产纤维素乙醇，“美国纤维素乙醇技术的一只脚已经迈进了商业 化的门槛”。日前又有全球最大的工业酶制剂生产企业丹麦诺维信公司宣布，一座 专门生产用于生物乙醇所需酶制剂的工厂动工，“该工厂将是全球首个纤维素酶工 厂，利用它的产品有望在未来几年使大规模生产第二代燃料乙醇成为现实”。 日本通产省从1 9 8 0 年起制定了生物质燃料化的七年研究开发计划，并设置了 生物质研究委员会。经费预算总额为2 6 0 亿日元，其中技术开发费用达1 2 4 亿日 元【2 2 】。日本工业技术研究院微生物工业研究所从1 9 7 9 年起，开始进行稻草、废木 材能源化的研究，目的是降低成本、进行工业化生产，至今酒精发酵技术已基本 完善。日前，日本科研人员开发出以竹子为原料生产纤维素乙醇的新技术。这一 新技术可以使葡萄糖的转化率从过去的2 提高到7 5 ，从而使每升用竹子为原料 两南大学硕十学位论文第1 章绪论 生产的乙醇成本降至1 0 0 日元左右。综上所述，在国外，以纤维质为原料生产酒 精逐步走向一个技术成熟的阶段【2 3 j 。 我国对纤维素乙醇的发展也很支持。根据国务院对外公布的可再生能源中 长期发展规划，到2 0 1 0 年，增加非粮原料燃料乙醇年利用量2 0 0 万吨，生物柴 油年利用量达到2 0 万吨。到2 0 2 0 年，生物燃料乙醇年利用量达到1 0 0 0 万吨。为 了实现规划提出的任务，国家在2 0 2 0 年前将投资2 万亿元，并且政府将采取 五大措施力保规划任务的实现，包括采取强制性市场份额、优惠电价和费用 分摊、资金支持和税收优惠、建立产业服务体系等政策和措施，积极支持可再生 能源的技术研发与利用。国内企业近年来纷纷上马了纤维素乙醇项目。目前，河 南天冠集团已投入了1 亿多元在生产纤维素乙醇项目上。吉林九新实业集团2 0 0 6 年申报建设3 0 0 0 吨年的玉米秸秆生产纤维乙醇示范性工厂。2 0 0 9 年1 月1 5 日， 中粮集团与丹麦诺维信公司、中国石化集团签订了技术合作框架协议，三方将在 中国- 合作开发从谷物秸秆生产纤维素生物乙醇的商业化规模工艺，并将纤维素乙 醇推向国内外市场。 1 2 3 纤维素乙醇化发酵工艺研究 利用木素纤维素生产乙醇，主要经历三道工艺：预处理、糖化和发酵，另外 需要一些额外的工序，如脱毒处理和生产水解酶类等( b o t h a s te ta 1 ，1 9 9 9 ) 。图1 2 2 是美国可再生能源国家试验室开发的以植物纤维素为原料，转化为乙醇的主要工 艺流程【2 4 1 。 纤维 图1 2 2 植物纤维素类生物质转化为乙醇的主要工艺过程 f i g1 2 ，2t h ef l o w c h a r tf o rt h ec o n v e r s i o no fc e l l u l o s et oe t h a n o l 6 乙醇 电力 热能 两南大学硕十学位论文第1 章绪论 1 2 3 1 木质纤维素的预处理技术 植物纤维素的酶水解( 糖化) 的效率受植物纤维素的可及度、结晶度、木质 素和半纤维素的含量及与纤维素结合方式的影响( t s a oa n dc h i a n g ，1 9 8 3 ) 。木质纤 维素的结构较复杂。细胞壁中的半纤维素和木质素通过共价键联结成网络结构， 纤维素镶嵌其中。 植物纤维素原料的预处理的目的就是打破纤维素分子的结晶结构和保护层， 使材料变得蓬松，易于被纤维素酶作用。未经预处理的原料，其水解率低于理论 值的2 0 ，而经预处理后的水解率可达理论值的9 0 以a 2 1 眩】。植物纤维原料预处理 的方法很多，包括物理法、化学法、生物法以及以上几种方法的联合作用，各种 预处理的具体方法如表1 2 1 【2 5 2 7 1 。 表1 2 1 常见的纤维素原料预处理方法 t a b l e1 2 1t h eu s u a lp r e t r e a t m e n to fc e l l u l o s i cm a t e r i a l s ( 1 ) 物理法 包括球磨、压缩球磨、爆破粉碎、冷冻粉碎、声波、电子射线等均可使纤维 素粉化、软化，但这些方法存在作用不明显、预处理的成本高、且设备成本高、 条件苛刻等缺点。另外，微粉碎处理是用球磨或碾磨将纤维素类物质粉碎，促进 糖化。同时，经过粉碎的纤维素粉末没有澎润性，体积小，可以提高基质浓度， 得到高浓度的糖化液。但这种粉碎法耗能大，也并不适合所有材料的处理。蒸汽 爆碎预处理：蒸汽爆碎预处理是近年来发展起来的一种新的预处理方法，用高温 高压下的饱和水蒸气使木质素的x 一丙烯乙醚及部分的b 一丙烯乙醚裂开，破坏木 质素、半纤维素结合层，然后突然将压力降至常压，这样纤维素的空隙增大。蒸 汽爆碎预处理工艺的费用较低，效果明显，但因为此处理过程中木质素未被除去， 较高的基质浓度也只能得到低浓度的糖液。 ( 2 ) 化学法 包括无机酸( 硫酸、盐酸、乙酸等) 、碱( 氢氧化钠、碱性过氧化氢、氨水 等) 、有机溶剂( 甲醇、乙醇、丁醇、苯等) 处理原料等方法，可以将纤维素、半 纤维素和木质素吸胀并破坏其结晶性，使天然纤维素溶解并降解，从而增加其可 消化性，但存在弊端。如无机酸、碱必须高浓度，处理后纤维素和半纤维素损失 7 两南大学硕十学付论文第1 章绪论 大( 回收率仅5 0 ) ，试剂回收、中和和洗涤困难；强酸和强碱对设备的要求高， 造成设备成本有机溶剂腐蚀性和毒性大，环境污染严重；形成产物多种多样( 如 纤维糊精、纤维二糖、葡萄糖、葡聚糖等) ，产品回收率低。次氯酸钠、臭氧等试 剂进行预处理以及溶胀预处理和溶剂预处理等方法，可以使纤维素溶解脱去木质 素；其中以氢氧化钠和稀酸预处理研究的较多。碱预处理操作简便，设备要求低， 氢氧化钠可以使分子间酯键皂化，脱去木质素，促进膨胀，是一种膨胀剂，对提 高原料的可降解性效果非常好，但氢氧化钠的耗量较大，在碱处理过程中还有部 分半纤维素被损失，所以不太适于大规模的生产。 ( 3 ) 物理化学法 蒸汽爆裂( 自动水解) 蒸汽爆裂是木质纤维素原料预处理较常用的方法【2 8 l 。蒸 汽爆裂法是用高压饱和蒸汽处理生物质原料，然后突然减压，使原料爆裂降解。 主要工艺：用水蒸汽加热原料至1 6 0 - - - 2 6 0 c ( 0 6 9 4 8 3m p a ) ，作用时间为几 秒或几分钟，然后减压至大气压。由于高温引起半纤维素降解，木质素转化，使 纤维素溶解性增加。蒸汽爆破法预处理后木质纤维素的酶法水解效率可达9 0 。 蒸汽爆裂法的优点是能耗低，可以间歇也可以连续操作。主要适合硬木原料 和农作物秸秆。但蒸汽爆裂操作涉及高压装备，投资成本较高。连续蒸汽爆裂的 处理量较间歇式蒸汽爆裂法有增加，但是装置更复杂，投资成本大为增加。 氨纤维爆裂( a m m o n i af i b e re x p l o s i o n ，a s e x ) 法是将木质纤维素原料在高温和 高压下用液氨处理，然后突然减压，造成纤维素晶体的爆裂。典型的a f e x 工艺 中，处理温度在9 0 - - - 9 5 ，维持时间2 0 3 0m i n ，每千克固体原料用1 2 埏氨【2 9 1 。 氨纤维爆裂装备与蒸汽爆裂装备基本相同，另外需要氨的压缩回收装置，因此投 资成本也很高。 c 0 2 爆裂原理与水蒸汽爆裂原理相似，在处理过程中部分c 0 2 以碳酸形式存在， 增加木质纤维素原料的水解率。主要工艺：用4 k g c 0 2 处理每公斤木质纤维素原料， 在5 6 2m p a 压力处理后减压爆裂处理，其效果比蒸汽爆裂法和氨纤维爆破法差， 更缺乏经济竞争力【3 0 】。 ( 4 ) 生物法 生物法是采用降解木质素的微生物如白腐真菌、褐腐真菌、软腐真菌和其他 细菌等在培养过程中可以产生分解木质素的酶类，从而可以专一性地降解木质素， 提高纤维素和半纤维素的酶解糖化率。它具有作用条件温和，专一性强，不存在 环境污染，处理成本低等优点。但是，目前存在木质素降解微生物种类少，木质 素分解酶类的酶活力低，作用周期长等需要进一步研究关键性技术问题。 ( 5 ) 其他预处理方法 文献报道还有臭氧处理 3 l 】、有机溶剂处理【3 2 】、氧化处理【3 3 1 等木质纤维预处理 两南大学硕七学位论文第1 章绪论 方法，但这些方法都因缺乏竞争力而很少被应用。 1 2 3 2 纤维素的水解 经过预处理的纤维素通常经酸水解或酶水解来糖化。 ( 1 ) 酸水解 常用的无机酸有盐酸和硫酸。无机酸催化纤维素分解的机理是：酸在水中解离 并产生氢离子，当纤维素链上的b 1 ，4 葡萄糖苷键和水合氢离子接触时，后者将一 个氢离子交给d 1 ，4 葡萄糖苷键上的氧，使这个氧变得不稳定，当氧键断裂时，与 水反应生成两个羟基，并重新放出氢离子，后者可再次参与催化水解反应。在一 定的酸浓度范围内，纤维素水解反应的速度与酸的浓度呈正比。温度增加酸水解 反应的速度也会加快，一般认为，温度增加1 0 c ，水解速度提高1 2 倍( 3 4 】。 纤维素在浓酸中的水解是均相水解。是纤维素晶体结构在酸中润胀或溶解后， 通过形成酸的复合物，再水解成低聚糖和葡萄糖： 纤维素一酸复合物一低聚糖一葡萄糖 在浓的无机酸，如4 1 4 2 h c l ，6 5 7 0 h 2 s 0 4 或8 0 , - 8 5 h 3 p 0 4 溶液中可进 行纤维素水解。l e e 等用7 2 h 2 s 0 4 在3 0 下水解纤维素后，再于1 0 0 或1 2 0 c 下蒸汽加压，得到了不完全解聚的多糖和部分单糖【3 5 】。葡萄糖的回聚是纤维素水 解的逆过程，水解溶液中单糖和酸的浓度越大，回聚程度越大。葡萄糖回聚后可 以生成二糖或三聚糖。因此为了提高葡萄糖的得率，在水解末期，必须将溶液稀 释和加热，使回聚的低聚糖再行水解。 稀酸水解属多相水解，水解发生于固相纤维素和稀酸溶液之间。在高温高压 一下，稀酸可将纤维素完全水解成葡萄糖： 纤维素一水解纤维素一可溶性多糖一葡萄糖 酸水解法工艺的特点是酸易于收回，反应温度低，但糖化率较低，一般为5 0 左右，而且水解过程中会生成对发酵有害的副产品，另外设备腐蚀问题也是该工 艺的重要缺陷，操作安全性较低，投资也高。 ( 2 ) 酶水解 应用酶催化可以高效水解木质纤维素，生成单糖。 纤维素酶是一种很复杂的酶，是由几种酶共同作用下降解纤维素的。酶降解 纤维素至少需要三种酶协同作用：( 1 ) 内切葡聚糖酶( e g ，e n d o 1 ，4 d 一葡聚糖水解 酶，或e c 3 2 1 4 ) ，攻击纤维素纤维的低结晶区，产生游离的链末端基；( 2 ) 夕t - 协 葡聚糖酶，常称纤维二糖水解酶( c b h ，l ，4 - p d 葡聚糖纤维二糖水解酶，或 e c 3 2 1 9 1 ) ，通过从游离的链末端脱除纤维二糖单元来进一步降解纤维素分子：( 3 ) 葡萄糖苷酶( e c3 2 1 2 1 ) ，水解纤维二糖产生葡萄糖。纤维二糖和葡萄糖对于 9 两南人学硕士学付论文第1 章绪论 曼皇! 曼! 曼曼! ! ! 曼! ! ! ! 皇! 皇曼曼曼曼曼曼曼曼! ! ! ! ! 曼! ! ! ! 曼曼曼曼i i 一一 i 皇曼曼曼! 舅曼曼曼曼曼! 曼皇皇 纤维素酶的催化作用具有强烈的反馈抑制作用【3 6 】。 与酸水解法相比，酶水解工艺的优点在于：反应条件温和( 5 0 c ，p h4 8 ) ， 能耗低，水解副产物少，糖化得率高，不产生有害发酵物质以及不使用有毒和腐 蚀性的化学物质，可以和发酵过程相耦合，不发生副反应。细菌、真菌及动物都 可以产生可以水解木质纤维素原料的纤维素酶。所以近年来，利用生物酶法降解 纤维素已受至l 上世界各国科技人员的高度重视。 1 2 3 3 纤维素的酒精发酵 利用微生物发酵纤维素生产酒精的工艺大致可分为三大类： ( 1 ) 纤维素直接发酵法 该法特点是利用纤维素分解菌直接发酵纤维素生产酒精，即以纤维素为原料 进行直接发酵，不需酸解或酶解前处理过程。这种工艺方法设备简单，发酵周期 短，纤维素分解率也较高，成木低廉，但酒精产率不高，易产生有机酸等副产物。 利用混合菌直接发酵，可部分解决问题。v i l j i o e n 在1 9 2 6 年分离出一株嫌气性纤 维素分解菌，命名为热纤梭菌，该菌能发酵纤维素、纤维二糖、葡萄糖、果糖和 甘露醇，主要发酵产物为醋酸、乙醇和乳酸。把该菌与热硫化氢菌( c t h e r m o h y d r o s u l f r i c u m ) 混合培养，可以提高乙醇醋酸比值1 0 倍以上，乙醇生成量 显著提高。 ( 2 ) 间接发酵法 该法的特点是用纤维素酶将纤维素分解，收集酶解液作为酵母发酵的基质生 产酒精。g h o s e 等【3 7 】将甘蔗渣粉碎和氢氧化钠处理后，用里氏木霉( q m 9 4 1 4 ) 生 产的纤维素酶进行糖化，用糖化液培养酿酒酵母生产酒精。分批发酵的结果是：酒 精浓度9 7 ( w ) ，生产率为1 6 克升小时。连续发酵的结果是：酒精生产率可 达3 2 0 克升小时。m i l k e 和r o s e n b l u t h 用磨细并热处理过的废纸作为底物，其浓 度为1 1 5 。加入纤维素酶水解4 0 h 左右，水解糖化液培养酵母，废纸的乙醇得率 为3 7 。该法在工艺上分两步进行，糖化液要分离收集，能量比值往往大于1 ，因 此，近年来，有关报道己不多见。 ( 3 ) 同步糖化发酵法( s i m u l t a n e o u s s a c c h a r i f i c a t i o n a n df e r m e n t a t i o n ) 简称 s s f 。即纤维素的酶水解过程和糖的酒精发酵过程在同一容器内同时进行。这种方 法的优点在于酶水解产物葡萄糖不断的被发酵成酒精，从而解除了葡萄糖对纤维 素酶的反馈抑制，有利于酶水解反应的进行，从而提高了糖化和发酵效率；在工艺 上采用一步发酵法，简化了工艺，减少了设备投资，生产中能耗降低，因此同步 糖化发酵越来越受到人们的重视。自t a k g e 于1 9 7 7 年报道了用s s f 法转化纤维素 生成酒精的研究结果以来，己有大量这方面的研究报告【3 8 4 2 1 ，取得了较大的进展。 1 0 两南大学硕十学位论文第1 章绪论 同步糖化发酵法的优点是显而易见的，但同时也有三个明显的制约因素：一是 木糖的抑制作用，二是糖化和发酵的最适温度不协调一致，三是酒精的抑制作用。 1 3 畜禽粪便乙醇化的研究概况 目前，有关畜禽粪便中纤维质水解研究在国外只有少量报道【43 4 4 1 ，丽国内仅 本研究小组进行了初步探索f 4 5 ，4 6 1 。究其根本，主要是因为，第一，饲料中的绝大 部分易于被动物消化系统中纤维素酶接触的纤维质都己被预先消化掉了【4 7 】。第二， 畜禽粪便中氮含量高达0 9 0 以上，即使通过不同的方式预处理后，氮含量仍然高 达0 1 3 - - - 0 8 1 ，远高于其它大部分纤维质材料( 麦秸含0 4 0 ，云杉木含0 2 0 ) 1 4 8 1 。而蛋白质水解产生的氨和氨基酸在高温的酸性环境中会与产生的糖发生反应， 并最终导致还原糖产量大幅降低【4 4 ，4 9 1 。另外，规模化养殖场大量使用的兽药和饲 料添加剂，大部分会以原药和代谢产物的形式残留在粪便中，也会影响微生物的 正常生命活动，降低纤维素降解菌与发酵菌株的效率。因而，这些复杂的特点使 得畜禽粪便乙醇化过程变得比其它木质纤维素类物质乙醇化过程更加复杂。已有 的秸杆类纤维质乙醇化工艺技术还不能完全适用于畜禽粪便的乙醇化过程。 1 4 本课题的研究意义和内容 1 4 1 课题研究的意义 世界石油储量持续告急，价格不断上涨，且由于化石燃料导致的日益严重的 环境问题，使我们不得不去寻找新的代替能源，近年来颇受青睐的生物质能源自 然成了新能源的“明星”，生物质能源当中又属生物乙醇最受瞩目，它具有许多独特 优点，近年来受到政府的很多政策支持，且最近纤维素乙醇制备技术的突破，伎 人们更加坚信它的发展前景非常美好。特别是在目前全球金融危机让人们对传统 能源越来越丧失信心的时候，各国都在争着纤维素乙醇的产业化，其原因、其目 的不言而喻。 相对于以玉米和大豆等粮食为原料的第一代生物燃料来说，以稻草、秸秆等 植物纤维为原料的纤维素乙醇被称为第二代生物燃料，其最大优势在于避免了“与 人争粮、与粮争地”的风险。纤维素是地球上最丰富的可再生资源，据测算年总产 量高达1 5 0 0 亿吨，蕴储着巨大的生物质能( 6 9 x 1 0 ”千卡) ，也是当前利用率最低 的资源，自然也成了各国新资源战略的重点，纤维素乙醇也因此被当作最佳液体 替代燃料并具有生态效益而成为工业生物技术的研究热点。目前，对可再生资源 生产燃料乙醇的研究主要集中在农业废弃物( 如秸秆、稻壳) 、林业废弃物( 如树 枝、木材边角料) 、水果渣( 如桔皮) 、生活垃圾等方面，只有少量关于奶牛场粪 便的研究报道 4 3 , 4 4 。而对畜禽粪便的研究主要集中堆肥化和沼气化方面的研究， 两南大学硕十学位论文第1 章绪论 曼皇! ! 曼舅曼曼曼! ! ! 曼曼曼! 舅曼曼曼! 曼曼! ! ! 曼皇! ! ! ! ! 曼曼曼曼! 皇! 曼! ! 曼! ! ! ! ! 曼! 鼍曼曼曼曼蔓曼曼曼鼍曼曼曼曼皇! ! 曼i 一一 i 苎曼曼曼 鉴于重庆市畜禽养殖污染排放量大，有机质含量高，污染严重，以及废物乙醇化 研究对基础知识的需要，本研究拟对畜禽粪便乙醇化进行详细的基础研究，以期 为重庆市乃至全国畜禽粪便污染的治理和废物乙醇化奠定基础数据和实验依据。 当今对纤维素乙醇的研究主要集中在原料、成本和工艺条件上。解决纤维素 乙醇原料和成本的根本出路，在于选取蕴含丰富纤维素资源，并且价格低廉的原 材料：工艺条件应放在原料的预处理和水解等工序的技术革新和改造上，及找到 最佳的处理条件，既能最大程度的提高得糖率，又能使产生的污染降到最低。本 课题正是针对以上几个方面进行考虑，对奶牛粪便纤维素酶解糖化工艺进行研究。 1 4 2 研究内容 利用奶牛粪便为原材料，对其中蕴含丰富的纤维质资源进行酶解糖化，首先 研究奶牛粪便的预处理，找出最佳预处理条件，然后研究经预处理过后奶牛粪便 的酶解糖化的工艺条件。 ( 1 ) 确定各因素对奶牛粪便的的预处理影响 通过单因素试验，得到预处理时间、酸碱浓度、温度和底物浓度对预处 理的影响。 ( 2 ) 奶牛粪便最佳预处理条件的确定 通过正交试验，得到对奶牛粪便预处理最佳工艺条件。 ( 3 ) 确定各因素对奶牛粪便酶水解的影响 通过单因素试验，得到酶解时间、酶用量、温度、p h 和底物浓度对酶 解过程的影响。 ( 4 ) 奶牛粪便最佳酶解条件研究 通过正交试验，得到对奶牛粪便酶解最佳工艺条件。 ( 5 ) 奶牛粪便转化发酵酒精的效益分析 从环境效益，经济效益和社会效益的角度，分析奶牛粪便转化发酵酒 精的可行性。 1 2 两南大学硕七学位论文第2 章奶牛粪便的预处理 第二章奶牛粪便的预处理 2 1 引言 木质纤维素为可再生生物质原料，采用酶解法以木质纤维素为原料制糖发酵 生产乙醇，必须对木质纤维进行预处理1 5 1 1 。因为木质纤维原料具有较大的结晶性， 预处理的目的是打破纤维素分子的结晶结构和保护层，使材料变得蓬松，易于被 纤维素酶作用。未经预处理的原料，其水解率低于理论值的2 0 ，而经预处理后 的水解率可达理论值的9 0 以上【5 2 】。目前，对木质纤维素原料的预处理方法主要 有物理法、化学法、物理化学法、生物法。预处理是利用木质生物资源生产乙醇 工艺中技术最不成熟、成本最高的一个环节【5 。因此本章从这个角度出发，采用 目前被认为是除去半纤维素较成熟而又有效的化学方法对奶牛粪便进行预处理， 观察各因素对预处理的影响，以还原糖量为衡量指标，最终选取节能，经济，效 果好的最佳预处理条件。本章中，选取比较有代表性的酸盐酸、硫酸；碱 氢氧化钠、碱石灰进行预处理，研究奶牛粪便的转化效果。考虑到成本和酸、碱 对设备的腐蚀以及生产的安全性，在酸碱处理中选用的是稀酸和稀碱。 2 2 材料与方法 2 2 1 试验材料 奶牛粪便：取自重庆市某奶牛场的鲜样，搅拌均匀后在冰箱内冷冻、密封保存， 备用。 2 2 2 试剂 丙三醇分析纯北京化工厂； 浓硫酸分析纯成都金山化学试剂