（细胞生物学专业论文）神经组织发育中ipo13蛋白的分布研究.pdf

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蛋白可能 在神经系统发育方面具有一定的作用。我们用制备的抗i p 0 1 3 的多克隆抗体针对 各不同发育时期以及成体的神经组织进行免疫染色，观察i p 0 1 3 蛋白在发育期间 在神经组织细胞内的分布变化，寻找其规律，弄清其分布是否受发育过程的调控 本研究发现i p 0 1 3 蛋白在神经组织细胞内的分布随胚胎的发育过程逐渐由 细胞质向细胞核转移。在胚胎发育后期以及成体时，i p 0 1 3 蛋白主要集中在细胞 核。 在胚胎发育早期，神经上皮细胞不断分裂增殖，分化为成神经细胞。后期成 神经细胞迁移、分化为各种类型的神经元细胞。i p 0 1 3 的分布变化是与神经组织 发育成熟时间大体并行的，随着神经组织在胚胎发育后期进一步分化、成熟， i p o l 3 蛋白逐渐由细胞质向细胞核转移。从实验中我们得出初步结论是：i p 0 1 3 的分布受发育过程的调控，i p 0 1 3 在神经组织中的功能可能随发育时期的不同而 有所改变。 关键词：i p 0 1 3 抗体；核质转运；神经发育 a b s t r a c t n u l c e o c y t o p l a s m i ct r a n s p o r to f m a c r o m o l e c u l e si sm e d i a t e db ys o l u b l et r a n s p o r t r e c e p t o r s ，n a m e l yi m p o r t i nps u p c r f a m i l yp r o t e i n s r e c e n t l y , s o m em e m b e r so ft h i s s u p e r f a n l i l y a r cs h o w nt of u n c t i o ni nd e v e l o p m e n t i nt h es t u d yo fm o l e c u l a r m e c h a n i s m so fl u n go r g a n o g e n e s i s ，an o v e li m p o r t i nbh o m o l o g ，i m p o r t i n l 3 ( n , 0 1 3 ) w a si s o l a t e d i p 0 13h a sb e e ni d e n t i f i e dt ob et h eo n l yb i - d i r e c t i o n a lt r a n s p o r t e ri nt h i s f a m i l yi nm a m m a l m o s to fi t si s o l a t e dc a r g o e sa r er e l a t e dt od e v e l o p m e n t , s u g g e s t i n g i t sr o l e si nd e v e l o p m e n t t os t u d yi p 0 1 3 ，w ee x p r e s s e da n dp u r i f i e df u l l l e n g t hi p 0 1 3a n dp r o d u c e da n a n t i - i p o13p o l y c l o n a la n t i b o d y t i l i sa n t i b o d yw s sp u r i f i e da n di t ss p e c i f i c i t yw a s p r o v e d b yu s i n gt h i sa n t i b o d y , w ef o u n dt h ed i s t r i b u t i o no fi p 0 1 3i sd i f f e r e n ti n n e u r a lt i s s u e sa td i f f e r e n td e v e l o p m e n t a ls t a g e s i nt h ee a r l ys t a g e , m o s ti p o13 l o c a l i z e si nt h ec y t o p l a s mb u ta tt h el a t es t a g ea n di na d u l t si p 0 1 3i sm a i n l yi nt h e n u c l e u si nn e r v ec e l l s a tt h ee a r l ys t a g eo fd e v e l o p m e n t , n e u r o e p i t h e l i u i ap r o l i f e r a t ec o n t i n u o u s l y a t t h el a t e rs t a g e ，n e u r o e p h i t h e l i u i ad i f f e r e n t i a t ei n t ot h en e u r o b l a s tc e l l s w ec o n c l u d e t h a tt h ed i s t r i b u t i o no fi p 0 1 3i nn e r v ec e l l si sr e g u l a t e dd e v e l o p m e n t a l l ya n di p 0 1 3 m a yp l a y d i f f e r e n t r o l e s i nn e u r a l d e v e l o p m e n tb yc h a i l g m g i t ss u b e e l l u l a r d i s t r i b u t i o n k e y w o r d s ：i p o13a n t i b o d y ；n u c l e o c y t o p l a s m i ct r a n s p o r t ；n e u r a ld e v e l o p m e n t 2 前言 1 前言 1 1 大分子物质核质转运的基本过程 1 1 1 引言 由于真核细胞的基因复制、转录与蛋白质的表达翻译在细胞内分区进行， 蛋白质及核酸等生物大分子跨核膜转运成为细胞中最重要的生物学功能之一。 核转运的独特之处在于它包括核输入和核输出，已知很多蛋白能在核质中持续 穿梭，而其它细胞器的转运很大程度上是单向的。 蛋白必须通过有序的转移才能保证细胞的正常。一般而言，真核细胞中的 分子量小于4 0 6 0k d a 的分子可以通过核孔复合体( n u c l e a rp o r ec o m p l e x ，r e c ) 水溶性通道以被动扩散的方式进出细胞核【，而分子量大于4 0 - - 6 0 k d a 的生物 大分子只能以主动运输的方式进行穿过核孔复合体n p c ( n u c l e a rp o r ec o m p l e x ) 【2 】，这一过程主要是由i m p o r t i np 家族的蛋白质成员负责完成的【3 1 1 4 5 1 1 6 。 核质转运过程中主要包含三类大分子：转运物、接头分子和转运载体。一 些转运物通过直接结合到核输入或核输出转运载体而转运，如大多i m p o r t i nb 家族成员可以与底物结合而将底物转运出核或入核【刀阎；另外一些需要一个或 多个接头分子介导形成转运物转运载体复合物，如作为i m pp l 需要i m p o r t i na 作为其接头蛋白，负责识别并结合具有经典核定位信号的底物【9 】，r n a 解旋酶 a ( r n a h e l i c a s e a ，r h a ) 也是依赖经典的i m p o r t i no a m p o r t i np 途径转运入核， r h a 的n l s 序列与i m p o r t i n 结合，然后与i m p o r t i nd 结合一起转运入核【埘。目 前实验表明单独的i m p o r t i na 自身不能和n p c 相互作用，而是作为一种接头分 子( a d a p t e r ) 结合到i m p o r t i np 上，i m p o t t i np 作为载体分子( c a r d 哪实现转位核孔 复合体【1 1 】【1 2 1 。一旦形成该复合物，这些转运复合物以一定方向通过核孔复合体。 随后转运复合物在另一侧解离，转运载体和接头分子通过n p c 实现再循环， 从而进一步完成其它转运过程【1 3 1 【1 4 1 。 1 1 2 i r e p o r t i l lb 家族的结构特点与功能 i m p o n i i l _ 1 3 k a r y o p h e r i n 家族成员，一类真核生物中广泛分布的核质转运受体 蛋白【1 5 1 。该家族也称为k a 巧0 p h 甜璐，负责核输入的为i l n p o r t i l l s ，负责核输出的 为e x p o r t i n s 。至今只发现两个成员具有双向转运功能【1 6 1 1 7 1 ，即酵母的 前言 k a p l 4 2 m s n 5 和哺乳动物的i m p o r t i n1 3 ( i p 0 1 3 ) 。 迄今为止，在酵母中发现有1 4 个i m p o r t i n1 3 成员，哺乳动物和人类细胞在 中发现有2 0 个i m p o r t i nd 成员【1 8 1 。这些家族成员在功能上保守，在蛋白质序列 上具有较低的相似性；分子量大约在9 5 1 4 5k d a z 间；结构上都具有保守的n 端r a n 结合结构域( i b n o nd o m a i n ) 和c 端多个( 2 0 ) h e a tr e p e a t s 结构域 ( s w i s s p r o t 数据库) 【1 9 】【2 0 】【2 l l 【2 2 1 。r a n 结合结构域的异质性( h e t e r o g e n e i t y ) 突出，在 整个超家族中，和r a n 结合结构域的序列相似性大约只有1 0 ，在和r a n 结合 的核心基序中没有发现不变残基的存在 2 3 1 ；h e a t ( h u n t i n g t i n ，e l o n g a t i o nf a c t o r 3 ，t h er e g u l a t o r ya s u b u n i to fp r o t e i np h o s p h a t a s e2 aa n dt o r l ) 是由连续重复的 3 7 - 4 6 个氨基酸组成的一种螺旋形棒状结构单元。而h e a tr e p e a t s 由多个这样的 单元叠加形成具有延展性的超螺旋，可以通过构象改变为相互作用的蛋白质提 供丰富的结合位点【2 4 1 。通过这种特殊的结构，i m p o r t i np 家族成员可以使用c 端 结合底物( c a 唱o ) 或接头蛋白( a d 印t o r ) f 2 5 】，n 端结合黜m g t p 【2 6 】，中部结合核孔 蛋 刍( n u p s ) 1 2 7 1 ，从而将底物带入或带出细胞核。通过对i m p o r t i np 的晶体结构分 析，人们发现它的h e a tr e p e a t s 超螺旋结构域可以伸展或收缩，改变各种构象 以配合结构不同的底物( 图1 1 ) 【2 8 】【2 9 1 。 a圈 图1 1 i m p o r t i np 1 结构图 f i g1 1t h es t r u c t u r eo fi m p o r t i np l a ：i m pp l 的h e a tr e p e a t s 超螺旋结构可以伸缩或延展，以采用不同位点分别与r a n g t p ， i m p o d t i nq 的i b b ( i m p o r t i npb i n d i n g ) 结构域，核孔蛋白的f x f g 重复序列结合。b - i m pp 1 结合r a n g t p 后构象发生变化。 4 资料来源：w e i sk ，c e l l ，2 0 0 3 大多数i m p o r t i np 家族成员可以直接转运转运物，即直接识别底物的核定 位信号( n u c l e a rl o c a t i o ns i g n a l ，n l s ) 或出核信号( n u l e a re x p o r ts i g n a l ，n e s ) 并 与底物结合，而有些i m p o r t i nb 家族成员需要通过接头蛋白转运转运物，最著 名的接头蛋白是i m p o r t i na ，分子量为5 5 k d ，它能和典型的n l s 序列相结合。 i m p o r t i na 的n 末端是和i m p o r t i ni j 相互作用的所必需的，它是由4 0 个高度碱性 氨基酸残基组成的i b b 结构域，i b b 结构域的2 4 到5 l 之间的残基折叠成一个 a 螺旋结构，当r a n g t p 结合到i m p o r t i np 后引起i m p o r t i np 的构象改变，破坏了 i m pd l 与i b b 的紧密结合，导致i m p o r t i na 被释放。除t i m p o r t i na 作为其接头蛋 白，i m p o r t i nb 能结合其它转运物如t a t 和r c v 。这些转运物蛋白有富含精氨酸 的基序，能形成i b b 样甜螺旋 3 0 1 。i m p o r t i np 的其它接头分子包括：能结合到 m 3 g 帽化的us n - r n a 的s n u r p o r t i n 3 1 1 ，能结合至t j r p a 的蛙蛋l 刍x r i p a 3 2 1 1 3 3 1 ， 能介导组蛋白h l 核输入的i m p o r t i n7 刚。结构的延展性与接头蛋白的多样性， 使得一个i m p o r t i np 核转运受体可以拥有广泛的底物类型，这样就协调了少数受 体与大量底物之间的矛盾【3 5 3 6 1 1 3 7 3 9 l ，并且同种底物可由不同i m p o r t i np 成员转 运出核或入核，避免了单一受体带来的局限性 3 9 4 0 1 1 4 1 1 。 1 1 3 核质转运受体介导的蛋白质入核与出核机制 作为核质转运受体的i m p o r t i nd 家族成员负责细胞内大多数的蛋白质和 r n a 的出核或入核的运输。 蛋白质大分子的入核转运首先发生在细胞质中。细胞核输入受体在胞质内 识别底物的核定位信号( n l s ) ，并与之结合形成二聚体，携带底物穿过核孔复 合体进入细胞核内，在核内r a n g t p 的作用下，“核输入受体底物 二聚体发 生解聚，底物被释放在核内，而“核输入受体r a n g t p 一复合物通过n p c 重返 细胞质，并在胞质内r a n g t p 水解为r a n g d p ，使得核输入受体在胞质中被释 放，开始新一轮的入核转运f 9 】【4 2 】( 图2 ) 。 细胞核内生物大分子的出核转运则由核输出受体来执行。在核内核输出受 体与r a n g t p 结合之后才能识别并结合具有出核信号0 q e s ) 的相应底物。“核输 出受体底物r a n g t p 三聚体穿越n p c 到达胞质侧，在胞质内r a n g t p 发生 5 前言 水解，导致三聚体解聚，从而底物被释放到细胞质内【9 】【4 2 】( 图1 2 ) 。 i 。? “r i a “n 1 ( ：。p i 5 f 。h 。”r 。a k n 嚣( i p li h -i - h 址h h p l 毒兰。一j ，墼睾 e l 印- _ ；r 削l 矿“饼 巾，_r 图1 2 细胞核质转运示意图 f i g1 2s c h e m eo fn u c l e o c y t o p l a s m i ct r a n s p o r tm e d i a t e db yt r a n s p o r t i n 资料来源：g o r l i c h t h ee g b oz1 9 9 8 。 1 1 4 核质转运的调控对发育的影响 目前已在脯乳动物细胞中分离到2 0 个不同的细胞核质转移受体蛋白质。 虽然目前对核转运的基本机制已经有所了解，但对于核质转运在多细胞器官发 育中的具体功能还不甚明了。近年来逐渐开始有研究报道核质转运受体蛋白参 与了胚胎发育过程。k u m a r 等人发现将i m p o r t i nd 蛋白突变成无功能后会导致 果蝇幼虫的成虫芽( i m a g i n a ld i s c s ) 的眼细胞中蛋白质的核输入和m r n a 输出 功能丧失，从而引起果蝇成虫眼发育异常或完全缺失1 4 3 1 。z h a n g 等人也描述了 i m p o r t i na 2 同源蛋白质o t x l 在脑皮层神经细胞中起着重要的核质转运功能 4 4 1 。 研究发现在果蝇( d r o s o p h i l a ) 中，有7 种i m p o r t i n 蛋白在精子形成过程中表 达【4 引。其中i m p o r t i na 2 功能的缺失会阻止精子形成，导致出现有缺陷的精子， 造成雄性不孕【4 5 】【删【4 7 1 。而这种由于i m p o r t i na 2 的缺失导致的不孕症又可以因 为重新恢复i m p o r t i na 2 的活性，或者表达i m p o r t i na l 或i m p o r t i na 3 蛋白而痊 愈，说明这三种蛋白在功能上功能上具有一定的相关性。在线虫( ce l e g a n s ) 6 中，i m p o r t i n - a l ，砣，们相继在生殖细胞中表达【耜】。r n a i 实验也发现i m p o r t i n 以蛋白在卵母细胞发育过程中对调节减数分裂i 期的进程具有一定的作用嗍。 这些研究都说明了核质转运受体蛋白在胚胎发育发挥不可或缺的作用，它们的 缺失会直接导致胚胎发育的异常。 1 2 i m p o r t j n1 3 ( i p 0 1 3 ) 的结构与功能 1 2 - 1i p 0 1 3 的发现和特性 为了研究肺器官发育的分子机理，加拿大m c g i l l 大学k a p l a n 实验室使用差 异显示技术在发育的大白鼠胚胎肺中寻找糖皮质激素诱导的基因。提取大鼠的 胚胎肺和成年肺组织的m r n a ，以成年肺的e d n a 作为 d r i v e r 进行差异删减杂 交来分离出胚胎肺特异的e d n a 得到一个高度保守并具有与人类或啮齿动物 的8 个表达序列标签( e s t ，e x p r e s s e ds e q u e n c et a g ) 非常同源的的克隆，将其作 为模板进行e d n a 的5 ，3 端快速扩增和s p i c e ( 快速扩增e d n a 末端的聚合酶 链式反应) 得到长度为3 6 k be d n ai p 0 1 3 ( 1 a t eg e s t a t i o nl u n g2 1 9 1 2 ，i p 0 1 3 ， k a p l 3 ) ( g e n b a n k , a f l l 0 1 9 5 ) 编码9 6 3 个氨基酸的蛋白质【4 9 】。i p 0 1 3 定位在染色 体l p 3 3 3 4 2 上。通过b l a s t 检索工具在网上数据搜索与i p 0 1 3 序列的同源蛋白， 发现i p 0 1 3 属于k a p i m p j 3 家族成员，并且与之序列同源性最高的是t r n s r , 即 人类的t r a n s p o r t i n3 蛋白，与人类的及酿酒酵母的m t r l 0 蛋白同源性次之。不仅 序列相似，i p 0 1 3 蛋白的其他特性也与i m p o r t i np 家族成员相同，如：i p 0 1 3 分 子量为1 0 8k d ，i m p o r t i nb 家族成员分子量为9 5 1 2 5 k d ；i p o l 3 的等电点p i 是5 3 ， 而i m p o r t i n1 3p i 是5 5 4 ；以及i p o l 3 的二级结构也很类似于i m p o r t i nb 【4 9 】，i p 0 1 3 蛋白在n 段具有一个r a n 结合结构域，还有多个h e a tr e p e a t s ，图1 3 表示由 i m p o r t i n1 3 2 的结构为参考模拟出i p o l 3 的蛋白结构示意图。 7 前言 k a p - j 2 i 3 2 i n 4 。 n 5 6 图1 3i p 0 1 3 的蛋白质结构以同源蛋白成员i m p o r t i np 2 的结构为参考描述 i p o l 3 的结构模型( 其中的数字为h e a t 重复序列的数量) f i g1 3p r e d i c t e ds t r u c t u r eo fi p 0 1 3 ah o m o l o g y - b a s e dm o d e l o fi p o l 3o nt h e t e m p l a t es t r u c t u r eo fk a p - p 2w a sg e n e r a t e di ns w i s s - m o d e l 资料来源：z h a n ge ta l 。a m j r e s p i r c e l lm 0 1 b i 0 1 2 0 0 0 。 2 0 0 1 年人的同源i p o l 3 蛋白被克隆，此蛋白的氨基酸组成与鼠源i p o l 3 的相似性达到9 8 以上。其开放阅读框编码1 0 8 k d 蛋白质【1 7 1 。 2 0 0 6 年t a n a k a 实验室通过分析比较老鼠胚胎的胚泡和原始生殖细胞基因 的差异表达，发现一编码部分i p o l 3 基因片段的c d n a 克隆子1 5 叫。用其作为探 针对各组织样本进行n o r t h e r n 杂交，除了检测到全长3 4 k b 的i p 0 1 3 基因以外， 还发现在成体老鼠的睾丸中有一长度为1 6 k b 的i p o l 3 的r n a 转录本。这个 转录本包括了i p o l 3 基因的第7 到第2 0 个外显予，可以编码了l p 0 1 3 的c 端 片段，并且发现其只在成年老鼠的睾丸中有表达【5 1 】。i p o l 3 的短转录所表达的 蛋白缺少全长i p o l 3 蛋白的n 端部分，即r a n 结合区域。而r a n 结合区域是 i p 0 1 3 结合和释放底物的重要元件，所以推测截短i p o l 3 与全长i p o l 3 具有不 同的功能。截短i p o l 3 有可能作为全长i p 0 1 3 蛋白运输以及释放底物的一个负 调节子【引j 。 田 1 2 2i p 0 1 3 介导的核质转运 i p 0 1 3 作为i m p o r t i np 家族成员，转运蛋白质进出细胞核是其重要的生物学功 能。关于i p 0 1 3 的转运底物的报道近年来不断涌现，i p 0 1 3 的转运特性也逐渐为 人所知，有文献报道p a x 6 由町o p h e 血p 家族成员l ；己a p l 3 ( i p o l 3 ) 转运入核i s ：z ) 。 p a x 基因是一个编码转录因子的发育控制基因的超家族，也是一类进化上高度 保守的基因家族，普遍存在于从果蝇到人类的各种动物体内，基因家族成员都 含包括1 2 8 个氨基酸的成对结构域，并通过这个结构使蛋白与d n a 结合。有文献 报道在酵母双杂交中p a x 6 被认为是i p o l 3 的识别底物。体外g s tp u l ld o w n 和体 内的免疫共沉淀都验证了p 强6 和i p 0 1 3 之间的直接相互作用，洋地黄皂苷通透 细胞膜试验证明了p a x 6 是依赖r a n 由i p 0 1 3 转运入核。i p 0 1 3 通过n l s 识别p a x 6 ， 这个n l s 存在于包含同源结构域的8 0 个氨基酸残基中。当这个同源序列的两端 ( a a 2 0 8 2 1 4 和觚2 6 1 - 2 6 7 ) 缺失后i p 0 1 3 和p a x 6 之间的作用力减弱。成对同源家 族有2 0 多个成员，所有成员都包含类似于p a x 6 的n l s ，因此都有能被i p o l 3 转 运入核。实验也证明了同一家族成员p a x 3 ，c r x 都能被i p 0 1 3 识别并被其转运入核 5 2 1 o 已有文献相继报道i p 0 1 3 是s u m o 1 s e n t r i n 连接酶u b c 9 的入核转运受 体，除此之外i p 0 1 3 也是m g n ( 果蝇胚胎发育重要蛋白n l a g on a s h i 的人类同源 蛋白) 和r b m 8 ( m g n 和m r n a 之间的桥接蛋白) 的入核转运受体，并且i p 0 1 3 与r b m 8 - m g n 二聚体中的r b m 8 直接作用，而且还发现p o l 3 是转录起始因 子e i f l a 的核输出受体【1 7 1 1 5 。u b c 9 和r b m 8 都不含经典的入核序列( n l s ) ， r b m 8 序列中含有两段富含带电荷的氨基酸基序，但它们相距1 0 0 个氨基酸， 所以无法形成经典n l s 序列。推测这些氨基酸序列的三维结构可能形成类似 于n l s 的序列，或者这些蛋白可能结合于i p 0 1 3 的不同位点上【1 7 1 还有人报道i p 0 1 3 可以介导转录激活因子n f y 的二个亚基n f y b 与 n f y c 形成的二聚体转运入核。n f y 由n f - a ，n f - y b 和n f y c 组成的异源 三聚体，n f a 可以直接结合i m p o r t i np 而被转运入核，而n f y b 和n f y c 都 不能以单体的形式进行核输入，只有通过其保守的组蛋白折叠结构域( h e m ) 形 成二聚体，才能被i p 0 1 3 识别并转运入核。这是由于单体的n f y b 或n f y c 的h f m 结构域都不具有n l s 的信号功能，核定位信号只出现在二个相互作用 的h f m 结构域中，因此i p 0 1 3 只能结合n f y b n f y c 二聚体并介导其入核 9 1 5 3 】。 最近，t a o 等通过g s tp u l l d o w n 和c o i p 发现了口0 1 3 与g r ( 糖皮质激素 受体) 相互作用酬，同时还发现i p 0 1 3s i r n a s 抑n r a 0 1 3 的表达，直接导致g r 蛋白质不能在糖皮质激素诱导下，进入细胞核，影响g r 的正常生物学功能。 他们发现将g r 的n l s 突变后( 将5 1 3 5 1 5 氨基酸中的赖氨酸用天冬酰氨替换) ， g r 不能与i m p o r t i nq 结合【5 5 】【5 6 1 ，但依然能与i p 0 1 3 相互作用。 因此目前已报道的i p o1 3 入核底物有：s u m o 1 连接酶h u b c 9 、r n a 结 合模体蛋白r b m 8 和m g n 复合物【1 7 l 【5 、调控发育因子p a x 3 、p a x 6 5 2 1 ，转录 激活因子n f y b n f y c 二聚体【5 3 1 ，糖皮质激素受体g r 5 4 1 ，出核底物有：翻 译起动因子e l f l a t l 7 1 。 1 2 3i p 0 1 3 在生殖和发育中的功能 y a s u k a 实验室体外培养处于发育第1 5 5 天的胎卵巢三天后( 相当与体内 发育的第1 8 5 天) ，转染i p 0 1 3s i r n a ，发现本处于不同减数分裂时期的卵母 细胞有大半集中减数分裂的粗线期中期，而进入减数分裂粗线期晚期的卵母细 胞相对未转染i p 0 1 3s i r n a 以及非特异的s i r n a 的对照组减少了近乎一半， 说明i p 0 1 3 对调节生殖细胞减数分裂i 期粗线期的进程具有一定的作用【5 。 m g n 是果蝇m a g on a s h i 蛋白的人类同源蛋白，是i p 0 1 3 的入核底物之一 【1 7 】。而m a g o n a s h i 蛋白与生殖细胞的形成有密切关系，它涉及卵母细胞的 两极分化过程，轴形成过程以及o s k a rm r n a 的定位( 母源基因o s k a r 的m r n a 在卵母细胞后端特异性的累积将决定胚胎时期腹部的形成与生殖细胞的产生) 5 7 1 5 8 】【5 9 】。通过对处于不同生殖发育阶段的小鼠睾丸的精母细胞的u b c 9 以及 i p 0 1 3 的染色分析，以及在g c l 细胞中对外源表达u b c 9 和i p 0 1 3 进行共定 位检测，y a s u k a 实验室发现i p 0 1 3 在生殖细胞中可以介导u b c 9 的入核转运 【5 l 】。通过利用s i r n a 技术降低卵母细胞的i p 0 1 3 的表达，可以抑制近2 5 u b c 9 的入核【5 1 1 。老鼠胚胎u b c 9 的缺失会导致胚泡中大量染色体浓缩以及难以分 离，这与它对染色体动力调节功能一致。或许i p 0 1 3 通过调节u b c 9 、m g n 或者其他一些在生殖细胞中具有重要功能的分子底物的核质转运，从而控制生 殖细胞发育过程。 z h a n g 等通过n o r t h e m 分析证实i p 0 13 在大鼠胚胎肺中特异表达，在假腺期 1 0 ( 胚胎期1 4 1 6 天) 表达量最高，这与调控胚胎肺发育信号传导的关键因子的 转录一致，并且由糖皮质激素诱导，在上皮细胞中表达量多于间叶细胞。图1 4 表示i p o l 3 在人类胚胎器官中的表达，从1 6 周的不同胚胎器官中提取出同样量 的r n a ( 2 0 m g ) ，以2 4 k b 的i p 0 1 3d n a 作为探针进行杂交检测m 0 1 3 基因的表达 水平。图1 4 中显示胚胎肺，脑和心脏组织里有高水平的i p 0 1 3 的表达，肠和肾 脏也有少量表达，这表明i p 0 1 3 在肺，脑，心脏发育过程起着重要作用 4 9 1 。 莹：薹； 图1 4i p 0 1 3 在人类胚胎不同器官中的表达 f i g1 4e x p r e s s i o no fi p 0 1 3i nh u m a n f e t a lo r g a n s 资料来源：z h a n ge ta l ，a 儿j r e s p i r c e l lm 0 1 b i o l ，2 0 0 0 。 t a o 等还报道了i p 0 1 3 作为i m p o r t i np 家族蛋白的功能，并且在胚胎肺中 具有受分化调控的核质穿梭的特性。在共聚焦显微镜下，用荧光漂白丢失和荧 光漂白后恢复的方法，发现i p 0 1 3 蛋白质是在细胞核与细胞质之间穿梭转移蛋 白质。并且，在第2 l 天大鼠胚胎肺细胞中，i p 0 1 3 蛋白质进入细胞核的速度明 显比第1 8 天的细胞慢。i p 0 1 3 蛋白质在第1 8 天大白鼠胚胎细胞中比在第2 1 天的细胞中显得更活跃些。说明i p 0 1 3 蛋白质的功能可能受发育时期的调节 6 0 1o 在已被证明与i p 0 1 3 相互作用的底物中，许多都与发育有关。p a x 6 被认为 是眼形态发生的关键性分子开关【6 1 1 ，p a x 3 是神经形成和肌原性胚胎形成的调节 因子【6 2 】，c r x 则与感光受体分化和发育有关6 3 1 。而n f y 所介导的转录对高等 真核细胞的细胞增殖和发育能力起十分重要的作用，老鼠n f y 的缺失会造成 早期胚胎致死删。g r 是介导肺发生和成熟的重要调节子，g c g r 信号转导 蛩暑毒强 国露薹葛# 篁器叠 途径介导了肺发育的多个方面。种种研究表明i p 0 1 3 作为一核质转运受体是精 确控制发育调节底物的亚细胞定位所必须的蛋白，在发育过程中具有重要功 能。 综上所述，i p 0 1 3 主要具有以下几个特性：( 1 ) 同时具有转运大分子入核 与出核的功能，作为入核转运受体的i p 0 1 3 与经典i m p o r t i np 一样受到麟t p 的调节。而作为出核转运受体的i p 0 1 3 却与经典e x p o r t i n 调节途径不同，它不仅 受到r a n g t p 的调节，还受到i p 0 1 3 入核转运底物的调节。这种调节方式使得 i p o l 3 的底物在核质运输时最大限度的节约生物能，但也使得出核转运底物的 数量受到入核底物转运的限制；( 2 ) 越来越多与细胞发育和生理功能密切相关 的重要蛋白质被发现由i p 0 1 3 直接转运入核或出核，并且i p 0 1 3 与底物的结合不 一定通过经典的n l s ；( 3 ) 同时i p 0 1 3 的表达受到糖皮质激素和机体发育期的 双重调控，是目前所知的唯一一个受到双重表达调控的核质转运受体。但是关 于它的其他生物学功能还不是很清楚，因此关于i p 0 1 3 还有很多谜团需要我们 开展大量的工作进行进一步研究。 1 3 本课题研究的目的和意义 研究报道在肺发育早期，细胞内i p 0 1 3 蛋白质进入细胞核的速度明显快于 肺发育后期细胞，说明i p 0 1 3 蛋白质在细胞中的分布直接与其功能有关。但由 于这是外源蛋白质，并不能精确反映内源i p 0 1 3 蛋白质的生物学功能。先前的 研究发现i p 0 1 3 蛋白在人和鼠的胎脑中有很强的表达，所以有可能i p 0 1 3 蛋白 在神经系统发育发面具有一定的作用。因此，在本研究里，我们用抗i p 0 1 3 的 抗体，主要研究内源i p 0 1 3 蛋白质在不同发育时期神经组织中的分布及其分布 的变化。这对我们了解内源i p 0 1 3 的生物学功能及其在组织发育中的作用十分 重要，帮助我们了解i p 0 1 3 分布变化规律及弄清其分布是否受胚胎发育过程的 调控。为了获得抗体，我们首先构建融合表达载体p g e x 4 t 2 i p 0 1 3 。将构建好 的表达载体转化大肠杆菌并诱导表达，把表达的i p o l 3 蛋白纯化后做抗原，免 疫兔子得到多克隆抗体。以得到的抗体通过免疫荧光染色，发现i p 0 1 3 在人癌 细胞h e l a ，大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞p c i 2 ，人胚肾细胞2 9 3 t 中，均为核质分 布。通过对不同发育时期以及成年小鼠的神经组织免疫染色，发现i p 0 1 3 蛋白 在神经组织细胞中的分布随发育的成熟逐渐由细胞质向细胞核中转移，在发育 前言 后期主要集中在细胞核内。同时，我们也免疫染色成年正常人的眼角膜，发现 其i p 0 1 3 蛋白的分布与成年老鼠一致，主要集中在细胞核内。由此可见，i p 0 1 3 蛋白在神经组织细胞中的分布是受到发育时期的调节的，这说明i p 0 1 3 蛋白在 神经组织中的功能在不同发育时期有所不同。 1 3 材料与方法 材料与方法 2 1 实验材料 2 1 1 抗体列表 表4 抗体列表 抗体来源 r a b b i ta n t i h a s a n t ac r u z ，s c 8 0 5 r a b b i ta n t i i p o13 兔血清，本实验室 r a b b i ta n t i g s t 兔血清，本实验室 h r p 标记的二抗a m e r s h a m ，n a 9 3 4 v f i t c 标记山羊抗兔i g ( 3 北京中杉金桥，z f 0 3 1 1 2 1 2 细胞列表 表5 细胞列表 细胞名称细胞类型来源 h e l a人宫颈癌细胞 武汉大学典型物保存中心 2 9 3 t人胚胎肾细胞 p c i 2大鼠神经细胞 d r p r e s l e y , m c g i l lu n i v 2 1 3 组织列表 组织来源 小鼠胚胎组织d r b r i a n b a i ，c a s e w e s t e r n 成年小鼠脑组织 r e s e r v eu n i v e r s i t y 人烧伤旁视网膜组织刘祖国教授，厦门大学医学院 2 1 4 药品和试剂列表 表6 药品和试剂列表 1 4 材料与方法 a p r o t i n i n ，l e u p e p t i n ，p e p e s t a t i n ， a e b s f 、b e s t a t i n 、b 6 4 ( 蛋白酶抑制 美国s i g m a 公司 剂) d a p i 美国k p l 公司 d e m 匣m e d i u m 美国g i b c o 公司 d n a 分子量标准 t a k a r a ( 大连宝生物) e c l 试剂盒美国a m e r s h a m 公司 l i p o f e c t a m i n e 1 m2 0 0 0 美国l n v i t r o g e n 公司 l u m i n a l 美国s i g m a 公司 p - c o u m a d ca c i d 美国s i g m a 公司 p m s f 上海s a n g o n 公司 p r o t e i nm a r k e r 美国a m e r s h a m 公司 p v d f 膜 美国m i l l i p o r e 公司 x 射线胶片k o d a k 中国厦门 限制性内切酶及其缓冲液 t a k a r a ( 大连宝生物) 胶回收试剂盒美国p r o m e g a 公司 胎牛血清，小牛血清 美国h y c l o n e 青霉素钠上海s a n g o n 公司 链霉素钠 上海s a n g o n 公司 卡那霉素 上海s a n g o n 公司 其他化学试剂华美( s i n o - a m e r i c a ) 和s a n g o n 公司 2 2 分子克隆： 2 2 1 质粒提取和转化 2 2 1 1 质粒试剂配制( s d s 碱裂解制备质粒法) ： 碱裂解溶液i ( 5 0 0 m 1 ) g l u c o s e 5 0m m o l l 0 0 5x1 9 8 17x 0 5 = 4 9 5 4 9 t r i s - c l2 5m m o l l0 0 2 5 x1 2 1 1 4 x 0 5 = 1 5 1 4 9 e d t a - n a 21 0m m o l l 0 0 1 3 7 2 2 4x 0 5 = 1 8 6 1 2 9 1 5 材料与方法 碱裂解液 n a o h0 2 n s d s l ( m v )用前取贮存液0 4 nn a o h ：2 s d s = 1 ：1 稀释 得到工作液 碱裂解i i i 1 0 0 m l 醋酸钾 5m o l l6 0 0 m l5x9 8 1 4x 0 1 = 4 9 0 7 9 冰醋酸 1 1 5 m l h 2 0 2 8 5 m l 配成溶液中k + 浓度为3 m