（发酵工程专业论文）SARSCoV+M蛋白编码基因的克隆及其在粟酒裂殖酵母中的表达.pdf

摘要摘要s a r s 冠状病毒( s a r s - c o v ) 感染引起严重急性呼吸综合症( s a r s ) 。2 0 0 3年冬春之际，s a r s 在我国以及世界上多个国家和地区爆发流行，对人类健康、经济发展和社会稳定造成了严重的危害。世界卫生组织曾发出警告：s a r s 是进入2 1 世纪，严重威胁人类健康的疾病，是继艾滋病后，第二个能引起全球流行的新发传染病，这受到全世界广泛的关注，世界各国专业人士认为研制s a r s 疫苗是预防和控制s a r s 的关键。s a r s c o v 是一种单股正链r n a 病毒，长约2 9 ，7 2 7 个核苷酸，在r e p 基因下游有四个主要的开放阅读框，编码s 、e 、m 和n 这四个所有冠状病毒都具有的结构蛋白。m 蛋白是s a r s c o v 的一种重要的结构蛋白，在已知的冠状病毒的结构蛋白中它的含量是最丰富的，最主要的是它能引起宿主产生中和抗体。另外，m 蛋白和病毒的出芽和装配有关。m 蛋白含有高度保守的糖基化序列，而且它的糖基化可能与病毒和宿主的相互作用有关。由于m 蛋白在冠状病毒的生命周期中具有重要作用，而且它有免疫原性，这使它成为抗s a r s 药物研究、疫苗研发和煎清学诊断方法的确立过程中非常有吸引力的靶标。本研究利用基因重组技术，将s a r s - c o v m 蛋白编码基因通过裂殖酵母附加型载体在裂殖酵母t c p l 中表达，构建了胞内表达s a r s c o vm 蛋白的基因工程菌。首先设计特异性的引物利用r t - p c r 技术，以s a r s c o v 总r n a 为模板体外扩增出s a r s - c o vm 蛋白编码基因。然后就将扩增得到的目的片段连接p m d l 8 t 载体进行测序。将测序结果进行序列分析，与g e n e b a n k 中的s a r s c o vm 序列进行比较，发现此编码基因的序列与s a r s c o y 很多菌株的m 基因几乎是1 0 0 同源。设计带有k o z a k 序列的引物对验证测序正确的p m d l 8 - t m 进行扩增得到目的基因，选择带有标记的表达载体，将目的基因t o p o 克隆进表达载体的克隆位点，使其融合于载体中的v 5 多肽和6 x h i s 多肽的上游，可利用它们进行产物的分离、纯化和检测。经过p c r 鉴定后，构建得到重组酵母表达载体。将重组表达载体p n m t l m 用电转化法转化裂殖酵母t c p l ，重组载体含有a r m ，因而能在酵母中自主复制。在含有硫胺素的亮氨酸营养缺陷型平板e m m上筛选重组转化子，通过菌落p c r 法进行初步鉴定。然后将初步筛选出来的重组子提取酵母质粒并通过p c r 的方法进行鉴定。最终筛选得到含有重组质粒p n m t l m 的酵母转化予。对重组酵母进行特性研究，发现重组酵母的质粒稳定性很高；根据宿主菌和重组菌在不同生长时期培养液中的细胞密度( o d 值) 绘制它们的生长曲线图，华南理i _ 大学工学硕士学位论文分析两者生长规律，结果表明两者并无太大差别。说明外源基因的导入对宿主酵母的生长无明显干扰。将重组菌液体摇瓶培养并去硫胺诱导表达外源蛋白，经诱导1 6 h 左右后离心收集菌体，玻珠法破壁提取蛋白后进行s d s p a g e 分析，再通过w e s t e r nb l o t 进一步鉴定，结果确定了重组菌培养液能够表达s a r s c o vm 蛋白。本研究建立的裂殖酵母表达系统能够有效的表达下游标记v 5 和6 h i s 多肽的重组s a r s c o vm 蛋白，为s a r s 疫苗研究提供了实验基础。关键词：s a r s c o ym 基因；p o m b e 蛋白表达l i垒呈! ! 坠曼三a b s t r a c tt h eo u t b r e a ko fs e v e r ea c u t er e s p i r a t o r ys y n d r o m e ( s a r s ) i ns o m ec o u n t r i e sa n dr e g i o n sc a u s e ds a r sc o r o n a v i r u s ( s a r s c o v ) d u r i n gt h es p r i n go f2 0 0 3h a db r o u g h tg r e a ta t t e n t i o nw o r l d w i d e t h ew h oh a v ew a r n e dt h a ts a r si st h es e c o n di n f e c t i o u sd i s e a s et h a tc a l lr e s u l ti nt h eg l o b a lp l a g u es i m i l a rw i t ht h a to fa i d si nt h e2lt hc e n t u r y ，w h i c ht h e r e f o r ea t t r a c t e dt h eg r e a ta t t e n t i o ni n t e r n a t i o n a l l y i th a sb e e na g r e e dt h a tt h ek e yt op r e v e n ta n dc o n t r o lt h i sd i s e a s ei st od e v e l o pe f f e c t i v es a r sv a c c i n e t h eg e n o m eo fs a r s c o vi sas i n g l e s t r a n d e d ，p o s i t i v e s e n s ep o l y a d e n y l a t e dr n am o l e c u l eo fa p p r o x i m a t e l y2 9 ，7 2 7n u c l e o t i d e s t h e r ea r ef o u ro p e nr e a d i n gf r a m e s ( o r f ) d o w n s t r e a mo ft h a ta r ep r e d i c t e dt oe n c o d et h ef o u rs t r u c t u r a lp r o t e i n ss ，e ，ma n dn ，w h i c ha r ec o m m o nt oa l lk n o w nc o r o n a v i r u s t h emp r o t e i ni sa l li m p o r t a n ts t r u c t u r a lp r o t e i no ft h ec o r o n a v i r u s i nt h ec a s e so fo t h e rk n o w nc o r o n a v i r u s e s ，i ti st h em o s ta b u n d a n ta m o n gt h es t r u c t u r a lp r o t e i n sa n dc a ni n d u c ea n t i b o d y - d e p e n d e n tc o m p l e m e n t - m e d i a t e dv i r u sn e u t r a l i z a t i o n i na d d i t i o n ，t h emp r o t e i ni sa l s oi n v o l v e di nt h ea s s e m b l ya n db u d d i n go fv i r i o n st o g e t h e rw i t ht h eep r o t e i n t h emp r o t e i nc o n t a i n sh i g h l yc o n s e r v e dg l y c o s y l a t e ds e q u e n c e s ，a n di t sg l y c o s y l a t i o nm a yb er e l a t e dt ot h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nv i r u sa n dh o s t t h ei m p o r t a n tr o l eo ft h emp r o t e i ni nt h el i f ec y c l eo fc o r o n a v i r u s e sa n di n d u c i n gi m m u n i t ym a k ei ta na t t r a c t i v et a r g e tf o ra n t i s a r sd r u gr e s e a r c h ，v a c c i n ed e v e l o p m e n ta n dt h ee s t a b l i s h m e n to fas e r o l o g i c a ld e t e c t i o na s s a y h e r e ，w er e p o r tt h ee x p r e s s i o no fr e c o m b i n a n tmp r o t e i ni np p a s t o r i sa n dw h i c hr e t a i ni t sa n t i g e n i c i t y t h i ss t u d ye s t a b l i s h e dt h ep r o c e s st oc o n s t r u c tar e c o m b i n a n te n g i n e e r i n gy e a s ts t r a i nw i t hm o l e c u l a rc l o n i n gt e c h n i q u e p c rp r i m e r sw e r ed e s i g n e dt oa m p l i f ys a r s - c o vmg e n ew i t hr t - p c rf r o ms a r s - c o vt o t a lr n ai nv i t r o ，f o l l o w i n gar o u t i n es e q u e n c i n ga s s a yt oi d e n t i f yi t sn u c l e i ca c i ds e q u e n c e t h e nt h es e q u e n c ew a sa n a l y z e da n dc o m p a r e dw i t ht h ed a t af r o mg e n e b a n k ，t h er e s u l td e m o n s t r a t e dt h a tt h es e q u e n c ew a s10 0 h o m o l o g o u sw i t hm o s ts t r a i no fs a r s - c o va n dw eh a v ei s o l a t e dt h ed e s i g n a t e ds a r s c o vmc o l o n y p c rp r i m e r sw i t hk o z a ks e q u e n c ew a sd e s i g n e dt oa m p l i f yi n t e r e s t i n gg e n e1 1 1华南理工大学工学硕士学位论文f r o mp m d i8 - t - mt h a th a v eb e e np r o v e dc o r r e c t l y h a v i n gc h o s e na ne x p r e s s i o nv e c t o r ，w ea p p l yt o p et e c h n o l o g yt oc l o n et h es a r s - c o vmg e n ei n t oi t sc l o n i n gs i t et h a tl o c a t ei nt h eu p s t r e a mo fv 5a n d6 h i s ，s ow ec a ne a s i l ys e p a r a t e ，p u r i f ya n di d e n t i f yt h ee x p r e s s e dp r o t e i no fi n t e r e s t s a f t e rv a l i d a t i o nb yp c r ，t h ec o r r e c to r i e n t a t i o no ft h er e c o m b i n a n te x p r e s s i o nv e c t o rw a sr e c o n f i r m e d t h r o u g ht h et i p - a n d - r u nt r a n s f o r m a t i o n ，t h er e c o m b i n a n tp l a s m i di si n t r o d u c e dt ot h eh o s tf i s s i o ny e a s tt c p l t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dc a na u t o n o m o u s l yr e p l i c a t ei nt h ey e a s th o s tw i t ha r s l t h ep o s i t i v er e c o m b i n a n t sg r o wo nt h es e l e c t i n ge m mp l a t et h a tc o n t a i nt h i a m i nb u tw i t h o u tl e u c i n e p r i m a r yi d e n t i f i c a t i o nw a sc o n d u c t e dw i t hc o l o n yp c ra n ds o m ec a n d i d a t ec o l o n i e sw e r ei s o l m e df o rt h ec o n s e q u e n ts e l e c t i o n p l a s m i dw a se x t r a c t e df r o mt h e s ec o l o n i e sa n di d e n t i f i e db yp c r r e c o m b i n a n ty e a s ts t r a i n sc o n t a i n i n gt h ee x p r e s s i o nv e c t o rw e r ei d e n t i f i e d t h ep l a s m i dd e m o n s t r a t e dt h eh e r e d i t a r ys t a b i l i t yi nt h eh o s ta c c o r d i n gt oo u rs t u d y t h eg r o w t hc u r v eo ft h er e c o m b i n a n ty e a s ts t r a i nw a sc o m p a r e dw i t ht h a to ft h ew i l d t y p ey e a s ts t r a i n t h es i m i l a r i t yo ft h eg r o w t hc u r v e si n d i c a t e dt h a tt h ei n t r o d u c e de x p r e s s i o nv e c t o rd o e sn o ti n t e r f e r ew i t ht h eg r o w t ho ft h eh o s t w ec h o o s et h es t r a i na n dr e m o v et h i a m i nt oi n d u c et h ep r o d u c t i o no fs a r s c o vmp r o t e i nw i t he m m ，w h e nt h eo p t i c a ld e n s i t yo ft h ec u l t u r em e d i u mr e a c h e so d 6 0 0 = 1 0 a f t e ri n d u c t i o na b o u t16h o u r s ，y e a s tc e l l sw e r ec o l l e c t e db yc e n t r i f u g a t i o n ，a n dt h e nl y s e dw i t ha c i d - w a s h e dg l a s sb e a d s t h el y s a t ew a sc o l l e c t e da f t e rt h ec e l l sc o m p l e t e l yl y s e d t h ec o n s e q u e n te x p e r i m e n tr e s u l t so fs d s p a g ea n dw e s t e r n b l o td e m o n s t r a t e dt h a tt h er e c o m b i n a n ty e a s ts t r a i n sa r ec a p a b l eo fe x p r e s s i n gt h es a r s - c o vmp r o t e i n w i t hf u r t h e rm o d i f i c a t i o n ，t h er e c o m b i n a n ts t r a i nc o u l db eu s e di nf u t u r ep r a c t i c a la p p l i c a t i o n s & p o m b ee x p r e s s i o ns y s t e me s t a b l i s h e di nt h er e s e a r c hc a l le x p r e s st h er e c o m b i n a n tp r o t e i ns a r s c o vmp r o t e i nc - t a g g e db yv 5a n d6 h i s w h i c ha r et h eb a s i sf o rf u t u r ed e v e l o p m e n to fs a r sv a c c i n e k e y w o r d s ：s a r s c o v ；mg e n e ；p o m b e ；p r o t e i ne x p r e s s i o n茎苎塑兰塑查英文缩写词表一兰查垩三盔兰三兰堡主堂丝笙苎英文缩写英文全称中文全称m wm o l e c u l a rw e i g h t分子量o do p t i c a ld e n s i t y光密度值p b sp h o s p h a t e b u f f e r e ds a l i n ep b s 缓冲液p c rp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n聚合酶链式反应p e gp o l y e t h y l e n eg l y c o l聚乙二醇p hp o w e ro f h y d r o g e n酸碱值r p mr o t o rp e rm i n u t e转速分钟s d ss a i u md a e c y ls u l p h a t e十二烷基磺酸钠p a g ep o l y a e r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s聚丙烯酰胺凝胶电泳s e cs e c o n d秒钟t b st r i s * b u f f e r e ds a l i n et r i s 缓冲液t r i st r i s ( h y d r o x y m e t h y l )三( 羟甲基) 氨基甲烷n m t lt h en om e s s a g ei nt h i a m i n e硫胺存在下无信号vv o l t电压tt h i a m i n硫胺( 维生素b 1 )e m me d i n b u r g h s m i n i m a lm e d i u m爱丁堡裂殖酵母基本培养基y p dy e a s te x t r a c t p e p t o n e d e x t r o s e酵母提取物蛋白胨葡萄糖( 酵母培养基)i i华南理工大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：未卫秘日期：扣。厂年6 月严日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华南理工大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密口，在j 解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密日。( 请在以上相应方框内打“4 ”)作者签名：导师签名：日期：沙噼6 月严目日期：二。巴暨年d 7 月眵日第一章绪论第一章绪论2 0 0 2 年1 1 月在我国广东省流行一种“非典型肺炎”，在短短数月内，许多国家和地区亦发生类似疾病，它是由s a r s 冠状病毒( s a r s c o v ) 引起的严重急性呼吸系统综合症( s a r s ) ，进入2 0 0 4 年后，尽管从总体上得到了较好的控制，但仍有散发病例的报道，s a r s 依然对人类健康、经济发展和社会稳定存在着巨大的潜在性威胁和破坏作用。世界卫生组织曾发出警告：s a r s 是进入2 1 世纪，严重威胁人类健康的疾病，是继艾滋病后，第二个能引起全球流行的新发传染病，这受到全世界广泛的关注，世界各国专业人士认为研制s a r s 疫苗是预防和控制s a r s 的关键。1 1s a r s - c o v 简介1 1 1s a r s - c o v 的病毒学分类冠状病毒既包括一些能引起人类疾病的病毒，也包括一些引起其他哺乳动物和禽类的病毒，这些病毒在致病性上有一定的动物种属特异性。它主要包括三个群，第1 、2 群为哺乳动物冠状病毒，第3 群为禽类冠状病毒【1 1 。人冠状病毒是导图1 1s a r s c o v 分类学上所处位置【2 】f i gl 一1t h ep o s i t i o no fs a r s c o va c c o r d i n gt ot a x o n o m y华南理工大学工学硕士学位论文致人类呼吸系统感染的主要病原体之一，有两个血清型( h c o v - 2 2 9 e ，h c o v o c 4 3 )普通感冒有2 0 是由冠状病毒引起，它也是成人慢性气管炎急性加重的重要病因之一。s a r s 冠状病毒( s a r s - c o v ) ，在分类学上属于有壳病毒目( n i d o v i r a l e s ) 、冠状病毒科( c o r o n a v i r i d a e ) 、冠状病毒属( c o r o n a v i r u s ) 病毒口l 。s a r s c o v 作为一种新发现的冠状病毒，在缺乏系统的血清学分析的情况下，确定其具体的分类学地位主要依赖于对其基因组序列和编码蛋白的序列同源性分析与系统进化分析来确定。它实际上是一种新型的冠状病毒，其基因组构成上与冠状病毒有相似性，而遗传学分析和序列对比表明s a r s c o v 与其它己知的冠状病毒同源性不高，相对而言，其与牛冠状病毒以及鼠肝炎病毒的同源性最高，而与人类冠状病毒同源性较低，表明s a r s c o v 可能为一种非人源性病毒。1 1 2s a r s - c o v 的形态特征和相关冠状病毒受体s a r s c o v 是一种新型的冠状病毒，它的结构如下图1 2 所示。它的病毒颗粒呈球状，但具有多形性，有包膜，病毒直径为8 0 2 2 0 n m ，核衣壳里螺旋对称，基因组为非节段、单股正链的r n a 。在冠状病毒成熟的病毒颗粒中没有病毒复制、转录所需的病毒r n a 聚合酶存在，r n a 聚合酶是在病毒侵入宿主细胞之后才合图1 - 2s a r s c o v 模式图【8 lf i g1 2t h ep a t t e r no fs a r s - c o v2第一章绪论成的，只是在病毒的扩增阶段，保留在宿主细胞内行使功能，并不参与病毒颗粒的组装。另外冠状病毒基因组r n a 本身就包括有5 c a p 结构和3 。p o l y 尾巴，因此基因组r n a 本身就可以发挥m r n a 的功能，参与病毒蛋白质的合成。冠状病毒包膜上有3 种糖蛋白：s 蛋白、e 蛋白和m 蛋白，呈花瓣状突起，在病毒内部还存在核农壳蛋白，即n 蛋白 4 1 。人群对该病毒的感染普遍缺乏免疫保护，且进一步的研究表明，由于该病毒感染主要以显形感染方式传播，故尽管患者在康复后可在体内形成抗体保护，但本次的s a r s 流行并未能在人群中形成普遍的免疫保护屏障，人群仍然处于易感状态。冠状病毒的受体决定了感染宿主范围，一些相关冠状病毒受体与感染宿主对于s a r s - c o v 的研究是有重大借鉴意义的。表1 1 归纳了不同的细胞受体所对应的宿主。冠状病毒进入宿主细胞后，直接以病毒基因组r n a 为模板，合成病毒r n a 聚合酶，再利用该酶以不连续转录的机制完成负链亚基因组r n a 的合成、各结构蛋白m r n a 的合成，以及病毒基因组r n a 复制。在其初次转录过程中，通过r n a 聚合酶和一些转录因子，识别具有特定保守序列a a a c g a a c 的转录调控序列( t s r ) 起始，一次性转录得到一个成熟亚基因组m r n a 的全部组成部分并进一步翻译得到s 、e 、m 和n 四种结构蛋白。表1 1 冠状病毒细胞受体决定宿主范围4 】t a b l e1 - 1t h ec e l l u l a rr e c e p t o ro f c o r o n a v i r u sd e c i d et h eh o s ts a r s - c o v 在进入人体之后，直接侵犯体内的免疫系统，患者血中淋巴细胞及白细胞计数减少，其中c d 3 + 、c d 4 + 、c d 8 + t 淋巴细胞数量下降明显，且与疾病的严重程度存在一定的相关关系。感染过程中，脾及淋巴结内淋巴组织会出现病理损伤，并进一步发生坏死，导致机体免疫机能低下。3华南理工大学工学硕士学位论文1 1 3s a r s - c o v 基因组学特点2 0 0 3 年4 月1 2 日，加拿大温哥华m i c h a e ls m i t h 基因组科学中心及温尼伯国家微生物学实验室首先完成了s a r s 冠状病毒t o r 2 株的全基因组测序，病毒基因组含有2 9 7 5 1 个碱基，g e n b a n k 登录号：a y 2 7 4 1 1 9 ：4 月1 4 日美国c d c 公布了s a r s 冠状病毒u r b a n i 株的全基因组序列，病毒基因组含有2 9 7 2 7 个碱基胪，6 l ，g e n b a n k 登录号为a y 2 7 8 7 4 1 ：4 月1 6 日，中国军事医学科学院微生物流行病研究所和中国科学院北京基因组研究所公布了从不同地区来源、不同标本中分离的4 株新型冠状病毒的测序结果，病毒基因组分别含有2 9 7 2 5 、2 9 7 4 5 、2 9 7 5 7 和2 9 7 4 0个碱基，在g e n b a n k 的登录号分别为：a y 2 7 8 4 8 8 ( b j 0 1 ) 、a y 2 7 8 4 8 7 ( b j 0 2 ) 、a y 2 7 8 4 9 0 ( b j 0 3 ) 和a y 2 7 8 4 8 9 ( g z 0 1 ，后来改为g d 0 1 ) 。这是世界上三个不同研究组最早分别独立对各自分离的s a r s 冠状病毒株完成的全基因组序列测定【7j 。s a r s c o v 为单股正链r n a 病毒，其全基因组约为3 0 ，0 0 0 个核苷酸，这在所有_ j - - w - m i * - - w * - m i p w 一一t ，聃h 一t - 图1 + 3s a r s c o v 的基因组结构图【8 】f i g 1 - 3t h eg e n o m i cs t r u c t u r eo fs a r s - c o vr n a 病毒中是最长的。它的基因组结构与其它冠状病毒类似，已知有1 3 1 5 个开放阅读框，从5 到3 端依次为：5 - o r f l a o r f l b s x 卜x 2 e m x 3 x 4 x 5 n 3 ，两端各有一段非翻译序列。o r fl “l b 编码病毒r n a 聚合酶( r e p ) ，占整个基因组全长的2 3 ，负责病毒的转录和复制。r e p 的下游的4 个o r f ，分别编码s ( s p i k ep r o t e i n ) 、e ( e n v e l o p ep r o t e i n ) 、m ( m e m b r a n ep r o t e i n ) 和n ( n u e l e o c a p s i dp r o t e i n )四种主要的结构蛋白。4第一章绪论1 1 4s a r s c o v 蛋白组学特点s a r s - c o v 基因组主要编码s 蛋白、e 蛋白、m 蛋白和n 蛋白等结构蛋白和p o l 、h e l 、3 c l p r o 、p l p p r o 等非结构蛋白。除了上述结构蛋白以外，在s 和e之间( x 1 ，x 2 ) 以及m 和n 之间( x 3 ，x 4 ，x 5 ) ，还存在一些编码非结构蛋白的序列，其产物在不同冠状病毒之间的差异明显，其功能尚不明确，可能和病毒的复制有关。s 蛋白为大的i 型膜糖蛋白，一般由1 4 0 0 1 8 0 0 个氨基酸组成，含有重要的病毒中和表位，是典型的穿膜蛋白，在n 端有疏水性的信号肽，c 端有疏水性的穿膜部分。其与宿主细胞受体结合，可引起细胞融合，通过依赖p h 的内吞作用介导病毒侵入。能刺激机体产生中和抗体和细胞介导的细胞毒作用。在s 蛋白介导病毒的包膜与宿主细胞膜融合后，接着病毒的基因组r n a 释放到感染细胞的胞浆内p j 。n 蛋白为一种磷酸化蛋白，是冠状病毒的主要结构蛋白之一。在冠状病毒颗粒中，n 蛋白处于病毒粒子的核心部分，与r n a 相互作用形成螺旋状的核衣壳。在冠状病毒的生活周期中，n 蛋白具有多种功能：它与基因组r n a 结合形成核衣壳结构，然后再与m 蛋白相互作用构成病毒的核心；与位于基因组前导r n a 相结合，在病毒的复制、亚基因组转录和翻译中发挥着重要作用f 1 0 】。e 蛋白是s a r s 冠状病毒最小的结构蛋白，仅7 6 个氨基酸。e 蛋白的1 2 。3 4 位存在跨膜区，c 末端和一个4 6 个氨基酸的疏水区位于病毒包膜内，其功能与病毒包膜的形成及核衣壳的装配有关。3 c l p r o 在所有冠状病毒中是比较保守的，在s a r s c o v 中它催化h i s 3 2 8 1和c y s 3 3 8 5 的水解。s a r s - c o vo r f l a 的产物在氨基酸残基1 6 3 2 1 8 4 7 位仅含一个p l p p r o 结构域。推测s a r s c o v 核糖体移码的滑脱序列u u u a a a c 在13 3 9 2 n t - 1 3 3 9 8 n t ，位于o r f l a 和1 b 交叠的假节结构的上游。大多数核糖体遇到滑脱序列时可以翻译它并沿转录单元继续翻译直至终止密码，而有些核糖体识别这些序列时由于一个核苷酸出现滑脱现象可使读框发生移位。假结的出现可暂停滑脱序列上游的翻译，增加下游读框的蛋白表达，这样产生的多聚蛋白会自动催化成熟为病毒蛋白酶( p l p p r o 和3 c l p r o ) 、r n a 聚合酶( p o l ) 、r n a 螺旋酶( h e l )等。s a r s c o vs 蛋白的氨基酸序列与其他冠状病毒s 蛋白之间同源性很低，只有2 0 - 2 7 。s a r s c o v 的s 蛋自由于缺少2 型和3 型冠状病毒碱性氨基酸残基的裂解部位，因而不能裂解成s 1 和s 2 亚单位。s a r s c o vs 蛋白可能有2 3 个n - 糖基化位点，n - 末端有一个短的由疏水性氨基酸残基组成的i 型信号序列，在翻译并通过内质网运输时可能被去除；c 末端由非常保守的一个跨膜结构域和一个富含半胱氨酸残基的细胞质束组成，推测在第8 8 4 9 9 9 位有1 个含1 1 6 个氨基5华南理工大学工学硕士学位论文酸残基的“两性区域，介导细胞和病毒的膜融合。包膜蛋白e 含有一个疏水结构域( 第1 2 3 7 位氨基酸) 和一个半胱氨酸富含区。膜蛋白m 的n 末端含有3 个疏水跨膜结构域，在n 末端附近有一个n g t ，推测在第4 位是n 糖基化的。核衣壳蛋白n 是含4 2 2 个氨基酸残基的碱性蛋白( 其他冠状病毒为3 7 7 个4 5 4 个氨基酸残基) ，蛋白中部有7 个连续的疏水性残基。所有冠状病毒的n 蛋白n 末端都存在保守的f y y l g t g p 序列，僵各种冠状病毒在n 蛋白其他区域的氨基酸序列同源性较低j 。1 1 5s a r s - c o vm 蛋白简介m 蛋白为基质蛋白，是一种由一个短的n 端、3 个连续的跨膜区和一个位于病毒粒子内部的c 端结构域组成的l i l 型糖蛋白。m 蛋白在冠状病毒包膜的组装、病毒核心的形成等过程中均发挥着重要作用，其中参与包膜形成是m 蛋白最主要的功能【1 2 l 。尽管不同病毒的m 蛋自在序列上变化很大，但在蛋白整体的化学性质上则存在很大的保守性，其一般特征是3 个疏水域以及伴随交叉出现的亲水域，c 端( m 蛋白的一半左右) 大部分为两性的氨基酸残基，但其末端为亲水氨基酸，病毒被膜的装配实验表明，任何在一维结构上( 腔内域、跨膜簇、两性分子区以及c图1 4 公认的m 蛋白的作用及在病毒体上的位置f i g l 一4p u t a t i v ef u n c t i o no f mp r o t e i na n di t sp o s i t i o ni ns a r s - c o v端区1 的变化都会影响m 蛋白整合到被膜颗粒中，也就是说m 蛋白的所有结构域对于装配都是非常重要的，换句话说m 蛋白的这些保守性表明其刚性结构对其功能是必须的；m 蛋白的c 端区位于病毒内部，在感染的细胞中，这个区域可能是通6第一章绪论过与核壳体的相互作用而表现出其重要性；目前，m 蛋白与核壳体的作用已被观察到。比较s a r s 和其它几种冠状病毒c 端的二级结构，发现它们之间的相似性远高于其序列间的相似性，尤其是s a r s 和m h v ，此二者的c 端二级结构几乎相同，这似乎暗示着二者以类似的方式与n 进行相互作用，或者进行病毒粒子的组装。利用s i g n a l p 分析，可以看出此蛋白可能含有一个s i g n a la n c h o r ，切点位于3 9 4 0 之阀f n n ) ，或3 9 4 0 之间( h m m ) 。利用t m h m m 分析，可以看出此蛋白存在3 个跨膜区( 1 5 3 7 ，5 0 7 2 ，7 7 9 9 ) 。利用p s o r t 分析：此蛋白含有s i g n a la n c h o r ，位于3 9 4 0 之间；含有3 个跨膜区，位于2 l - 3 7 ，5 0 - 6 6 ，7 9 9 5 之间；膜拓扑结构分析表明该蛋白属于第3 类膜蛋白，即整合膜蛋白，且c 端位于病毒内部：在亚细胞定位上此蛋白有8 9 的可能性是属于分泌途径蛋白( 内质网，g o l g i 体，溶酶体，质膜等) 。利用h m m e r - p f a m 分析：2 - 2 2 1 区与冠状病毒m 蛋白相似。利用t i g r f a m和c o g h m m 分析：无匹配。利用多序列比对程序c l u s t a l x 比较2 6 种冠状病毒的蛋白m ：t 0 7 1 1 6 为一1 0 a a 的保守区：【s ，t 】【w ，m ，f w s ，a i f ，w n p e t ，s ，i ，v 1 f n ，k ，s ，d 】；此部分对应的二级结构主要为c o i l 。1 。2s a r s 疫苗研制背景及可能性1 2 1s a r s 疫苗研究的背景和必要性s a r s 冠状病毒疫苗是预防s a r s 流行最有效的一条途径。传统和现代疫苗制备方法主要包括灭活或减毒病毒疫苗、亚单位疫苗、基因工程疫苗和核酸疫苗等。尽管灭活或减毒的病毒疫苗，因为携带了所有的病毒抗原，从理论上讲应该是最为有效的一类疫苗，但该类疫苗在制备上难度大、生产条件要求高，在使用方面存在一定的风险。核酸疫苗和基因疫苗就不存在这方面的危险，因为这两种疫苗都不与病毒的病原体相接触，因此利用现在已取得的关于s a r s 病毒基因组和生物学特性的研究成果，尽快开展基因工程疫苗和核酸疫苗割备研究，以及开展相关候选疫苗的联合应用研究将是一个切实可行的途径。据报道灭活疫苗的研制工作进展顺利，病毒能大量培养；病毒灭活的有效性已得到初步证实，灭活的病毒悬液在细胞培养上盲传三代，证明病毒已被彻底灭活，灭活病毒按种猴子未被感染并产生了抗体。由复旦大学、广州医学院和香港大学联合成立的攻关课题组启动了鼻腔免疫灭活疫苗的研究项目，在细胞培养中初步证实灭活病毒有干扰或阻断活病毒入侵的作用。他们设想灭活病毒进入人体后会占领细胞受体，当活病毒再次侵入时已无相应细胞受体位置可占领，形成干扰和阻断活病毒的入侵。核酸疫苗的研究在2 0 0 3 年5 月已经过了小动物试验阶段，7华南理工大学工学硕士学位论文或注射小白鼠，或注射大白鼠，有的已检测到抗体。5 月2 6 日晚，武汉大学田波院士带领的课题组完成了抗s a r s 病毒侵入细胞的多肽药物的抑制实验，这种多肽药物可以阻断s a r s 病毒侵入动物细胞，具有预防和治疗两种功效，并且定量测出了这种多肽药物作用的浓度：在1 0 亿分之几克的低浓度下即可阻止s a r s 病毒进入细胞。据田波院士介绍，这种多肽药物还需通过药检、小动物试验、非人灵长类动物试验、临床试验才能投入生产。2 0 0 3 年1 1 月2 3 日，国家食品药品监督管理局官员对外宣布：s a r s 灭活疫苗已在动物身上实验成功，有望年底进入临床试验阶段。北京科兴生物制品有限公司与中国医学科学院动物研究所，以及中国疾病预防控制中心病毒所共同完成了s a r s 疫苗的临床研究。2 0 0 3 年1 1 月2 8 同中国医学基金会新药发展基金管委会成功研制了通过了动物实验的s a r s 疫苗针剂，进入了国家食品药品监督管理局的快速审批通道。香港中文大学医学院2 0 0 3 年1 2 月1 8 日公布，该院利用基因合成技术，有效制造预防严重急性呼吸道痖候群( s a r s ) 的疫苗，预计最快两年时间可研制成功。医学专家经过数月的研究发现，以蚕虫和大肠杆菌成功研制对抗s a r s 病毒的蛋白，再透过基因合成技术而提炼疫苗。目前在动物身上试验成效显著，但离进入临床阶段还有较大的距离。利用这种方法制造的s a r s 病毒蛋白，毋须利用灭活病毒制造病毒蛋白，大大减少在实验室内的感染机会，也可减低研究成本。由于s a r s 病毒的特殊性，很多相关问题尚在研究中，研制疫苗过程中存在的共性问题有待研究解决。1 2 2 核酸疫苗虽然一些灭活或减毒疫苗非常有效，但其仍有引起感染的可能性，因此，对于危险性很大的传染病，如爱滋病、s a r s 等，人们不会轻易尝试使用灭活或减毒疫苗。对于这类疾病，发展核酸疫苗、抗原表位亚单位疫苗等尤为重要。1 2 2 1 核酸疫苗发现及研究现状核酸疫苗又称基因疫苗，是将编码某种抗原蛋白外源基因( d n a 或r n a ) 与真核表达质粒重组后，利用某种方法直接导入动物细胞内，使带有目的基因的表达载体转化到体内，并通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生针对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗的目的。1 9 9 0 年w o l f f 等意外发现，小鼠肌细胞经注射未加任何化学试剂的质粒d n a后，外源基因在宿主内获得了高效表达。1 9 9 2 年t a n g 等f l3 】将表达生长激素的基因质粒d n a 导入小鼠表皮细胞，结果能检测到抗生长激素抗体。同年r e b i n o v i c h等1 将编码某种特定抗原的基因片段和载体质粒构建的重组质粒命名为核酸疫8第一章绪论苗。1 9 9 3 年u l m e r 等1 】发现，将编码甲型流感病毒核蛋白的重组载体肌注小鼠，可以使小鼠有效免受另一亚型流感病毒的攻击。这些研究表明，直接给动物接种编码抗原的基因，同样可诱导宿主细胞对抗原产生免疫应答，使机体获得对该抗原的免疫力。这一新技术的出现，为新型疫苗的开发研制开辟了一条崭新的途径，为人们发展新疫茁提供了新的概念和思路。近年来，核酸疫苗的应用研究取得了可喜进展。许多实验证明了核酸疫苗的有效性，所针对的病原