（发酵工程专业论文）丁酸梭菌清液发酵工艺的研究.pdf

丁酸梭菌清液发酵工艺的研究 摘要 丁酸梭菌，又名酪酸梭菌，1 9 3 3 年由日本的宫入近治博士首先发现，是存在于 人和畜禽肠道的一种厌氧益生菌。丁酸梭菌作为微生态制剂，它能形成内生芽孢， 具有耐高温、耐酸、耐胆盐、耐部分抗生素等特性，在日本等国广泛应用于调理人 体肠胃的整肠药，能大幅降低肠炎的发病率，对菌群失调引起的腹泻，抗生素相关 肠炎，便秘等有良好疗效，且无任何毒副作用，此外丁酸梭菌作为饲料添加剂和兽 药，比非芽孢类活菌制剂有显著的优势。 丁酸梭菌不耐贮藏，需要进行包被或放置在低温下。高含量菌粉可以减少包被 成本和低温贮藏费用。为了获得高含量菌剂产品，本文采用了清液发酵策略。 首先采用单因素实验筛选出最适碳源为葡萄糖，氮源为胰蛋白胨、酵母浸粉和 牛肉浸膏。在此基础上，利用p l a c k e t t b u r m a n 设计对影响生物量的因素进行评价， 筛选出具有显著效应的葡萄糖、胰蛋白胨和酵母浸粉等三个重要因素。用最陡爬坡 路径逼近最大生物量区域后，利用响应面中心组合设计对显著因素进行优化，结果 表明葡萄糖、胰蛋白胨和酵母浸粉最佳浓度分别为3 4 ( w v ) ，4 o ( w v ) ，3 8 ( w v ) 。优化后培养基组分为：葡萄糖3 4 ( w v ) ，胰蛋白胨4 ( w v ) ，酵母浸粉3 8 ( w v ) ，牛肉浸膏1 5 ( w v ) ，可溶性淀粉o 1 ( w v ) ，n a c lo 5 ( w v ) ，乙酸钠o 3 ( w v ) ，半胱氨酸0 0 5 ( w v ) ，k 2 h p 0 4o 2 ( w v ) ，( n h 4 ) 2 s 0 4o 1 ( w v ) ，初始p h 为 7 1 。采用上述优化后的培养基，可使发酵液中的生物量提高到3 x 1 0 8c f u m l ，比优 化前的6 9 6 x 1 0 7 e f u m l 提高了4 3 倍，通过离心收集干燥后，每克干物质的菌数为 5 5 7 x 】0 l o c 如。 关键词：微生态制剂；丁酸梭菌；p l a c k e t t b u r m a n 设计；响应面法 丁酸梭菌清液发酵工艺的研究 a b s t r a c t c l o s t r i d i u mb u t y r i c u m ，19 3 3b yd r k i n g m i y a i r if i r s tf o u n di nh u m a na n da n i m a l e x i s t e n c ei na l la n a e r o b i ci n t e s t i n a lp r o b i o t i c s i tc a nf o r m a t i o ne n s p o r e ，a n dh a v es t r o n g a b i l i t yt or e s i s th i g ht e m p e r a t u r e s ，l o wp h ，b i l ec o n c e n t r a t i o n sa n ds o m ea n t i b i o t i c s c l o s t r i d i u mb u t y r i c u mi nj a p a na n do t h e rc o u n t r i e sa sw i d e s p r e a dh u m a ng a s t r o i n t e s t i n a l f u n c t i o n c o n d i t i o n i n g m e d i c i n a l d r u g u s e ， c a n s i g n i f i c a n t l y r e d u c et h e p s e u d o m e m b r a n o u s c o l i t i st h ei n c i d e n c eo f d y s b a c t e r i o s i s c a u s e d b yd i a r r h e a , a n t i b i o t i c a s s o c i a t e dc o l i t i s ，c o n s t i p a - t i o n ，e t c ，h a v eag o o de f f e c t ，a n dw i t h o u ta n ys i d e e f f e c t s i t sa p p l i c a t i o ni nf e e d sa n dv e t e r i n a r yd r u gh a sav e r yv a s tp r o s p e c tc o m p a r e dt o n o n - s p o r ef o r m a t i o np r o b i o t i c s i ti sh a r dt os t o r a g ec l o s t r i d i u mb u t y r i c u md i r e c t l y , b u ti se a s yt ob ec o a t e do rb e h o l du n d e rl o wt e m p e r a t u r e a n du s i n gt h ew a yo fc o a t i n ga n dl o wt e m p e r a t u r ew i t hh i 曲 c o n c e n t r a t i o ns t r a i n p o w d e rw a sm o r ee c o n o m i c a l s o i nt h i sp a p e r , ac l e a r e d f e r m e n t a t i o ns t r a t e g yw a st a k e nt oo b t a i nh i 曲一c o n t e n tp r o d u c t s i no r d e rt oe n h a n c et h eb i o m a s sp r o d u c t i o nb yc l o s t r i d i u mb u t y r i c u mb 1 ，t h i s e x p e r i m e n th a sc a r r i e do nt h eo p t i m i z a t i o nt oi t sc l e a n e df e r m e n t a t i o nm e d i u m i n i t i a l l y , t h em o s ts u i t a b l ec a r b o ng l u c o s e ，n i t r o g e ns o u r c et r y p o n e ，y e a s te x t r a c t ，a n db e e f e x t r a c tw e r es e l e c t e da c c o r d i n gt os i n g l ef a c t o r i a le x p e r i m e n tr e s p e c t i v e l y b a s e do nt h er e s u l t ，t w ol e v e lf a c t o r i a ld e s i g no fp l a c k e t t b u r m a nw a su s e dt oe v a l u a t e t h ei n f l u e n c ef a c t o r s i ts h o w st h a tt h r e ef a c t o r sp l a y e dt h ei m p o r t a n tr o l e si nt h em e d i u m ， i tw a sg l u c o s e ，t r y p o n ea n dy e a s te x t r a c t t h e nt h ep a t ho fs t e e p e s ta s c e n tw a su s e dt o a p p r o a c ht h eo p t i m a lr e g i o n t h eo p t i m a lc o m b i n e dc o n c e n t r a t i o nf o rm a x i m u mb i o m a s s p r o d u c t i o nw e r ef u r t h e ro p t i m i z e db yr e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g ya n dd e t e r m i n e da s f o l l o w s ：g l u c o s e3 4 ，t r y p o n e4 0 ，y e a s te x t r a c t3 8 t h eo p t i m a lc o n c e n t r a t i o n so f t h ev a r i a b l e sw e r ed e t e r m i n e da s ：g l u c o s e3 4 ( w v ) ，t r y p o n e4 ( w v ) ，y e a s te x t r a c t 3 8 ( w v ) , b e e fe x t r a c t1 5 ( w v ) ，s t a r c h0 1 ( w v ) ，n a c l0 5 ( w v ) ，c h a c o o n a 0 3 ( w v ) ，c y s0 0 5 ( w v ) ，k 2 h p 0 40 2 ( w v ) ，( n h 4 ) 2 s 0 40 1 ( w v ) ，o r i g i n a lp h 7 1 t h eo p t i m i z a t i o no fc u l t u r em e d i u mo fc l o s t r i d i u mb u t y r i c u mb1 ，t h eb i o m a s s p r o d u c t i o nw a si m p r o v e df r o m6 9 6 x10 7c f u m lt o3 x10 8c f u m l ，e n h a n c e d4 3f o l d s ， a n dt h en u m b e ro fe a c hg r a md r ym a t t e ri s5 5 7 10 l o c f u k e yw o r d sm i c r o b i o l o g i c a lp r o d u c t s ；c l o s t r i d i u mb u t y r i c u m ；p l a c k e t t - b u r m a n ； r e s p o n s es u r f a c e i i 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密移 如需保密，解密时间年月日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名：确象7 又 时间：如c 年6月歹 日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版 和电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段 保存、汇编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容，并授权中国科学技术信息研究所和北京万方数 据股份有限公司将本人学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并进行信 息服务( 包括但不限于汇编、复制、发行、信息网络传播等) ，同时本人保留在 其他媒体发表论文的权力。 注：保密学位论文( 即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保 密的论文) 在解密后适用于本授权书 学位论文作者签名：憾 锄签名：膨多呼 签名日期：二1 年6 月日签名日期：土1 年6 月 7 日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文丁酸梭菌清液发酵工艺的研究 1 前言 1 1 研究背景 自1 9 2 9 年弗莱明发现青霉素并随着用于临床以来，已经开发利用了百余种抗生 素，他们在感染性疾病的治疗上发挥了巨大的作屠，有效地保障了人类的生命和健 康，同时也积极推动了对畜牧养殖业的发展。随着科学认识的深入，人们在获得经 济效益的同时，也发现越来越多由使用抗生素带来的负面影响：导致动物肠胃正常 菌群失调( 石现瑞和高峰，2 0 0 0 ) 、药物残留、耐药菌株的产生( l e v y s b ，2 0 0 1 ) 、 动物机体抗病能力下降等问题已经引起人们的注意，尤其是动物肉、蛋、奶品质的 下降，直接威胁到人类的健康和安全。为此，能替代抗生素、抗菌药物而又无副作 用、无残留的新一代药物微生态制剂应运而生。微生态制剂是促生素、益生素、 生菌剂、益生菌、活菌制剂等的统称。对于微生态制剂的定义，到目前为止都还没 有定论。学术界最推崇和认可的是f u l l e r 的定义，即益生素为一种可通过改( f u l l e r , 1 9 8 9 ) 善肠道菌群平衡而对动物施加有利影响的活的微生物饲料添加剂。但随着微生 物技术的发展，这个概念又出现了其局限性。当前市场上销售的产品中，不少是包 含了那些有益微生物及其发酵产物的。因此，微生态制剂的概念还有待权威专家根 据微生态制剂的实际及未来发展趋势来重新定义。 1 2 微生态制剂的研究进展 1 2 1 微生态制剂的发展 可以说饲用微生态添加剂发展到目前，已经经历了三个阶段( 钟日聪和徐春厚， 2 0 0 7 ) ： 第一阶段是用活菌或活菌处理过的日粮喂养畜禽，此过程中，细菌的菌体通常 在饲料中被作为一种蛋白质源或日粮的改良剂使用。 第二阶段是随着饲料加工工艺及相关技术的发展而衍生的微生物工业副产品， 此过程是根据相关研究的成果用菌体提炼出来的作用针对性比较强的微生态产品。 第三阶段是利用微生物发酵后的菌体成分、代谢产物及变性培养基复合起来形 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 丁酸梭菌清液发酵工艺的研究 成饲料添加剂。这类产品粗蛋白含量并不高，不像第一阶段的活菌体，不能将其作 为一种蛋白质源使用。但是，其中含有大量细胞外代谢产物和经过充分发酵的已经 变性的培养基。这些物质对于动物胃肠道中的微生物而言是绝好的营养底物。因此， 其主要有效成分是其中的细胞外代谢产物及变性培养基而不是活菌数目。 这三个发展阶段没有时间的界限，所取得的成果目前都在广泛应用。 1 2 2 微生态制剂的菌种 各国规定允许使用的微生态制剂的菌种各有不同，1 9 8 9 年美国食品与药物管理 局( f d a ) 和美国饲料控制官员协会公布了可以使用的微生物菌种4 2 种；另外在欧 洲市场上销售的微生态制剂也不下5 0 种。我国农业部2 0 0 3 年公布允许使用的微生 态制剂菌种为1 5 种，分别是地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、粪肠球 菌、屎肠球菌、乳酸肠球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、乳酸乳杆菌、植物乳杆菌、 乳酸片球菌、戊糖片球菌、产朊假丝酵母、酿酒酵母、沼泽红假单胞菌( 李研东， 2 0 0 5 ) 。 目前用于微生物饲料添加剂的微生物主要有乳酸菌制剂、芽孢杆菌制剂和酵母 菌类等真菌制剂( 杜晋平，2 0 0 2 ) 。 1 2 3 微生态学的理论假说( 何明清，1 9 9 4 ) 1 2 3 1 生态平衡理论 生态平衡理论又称优势种群理论。微生态学认为，人体、动植物体表及体内寄 居着大量的正常微生物群。宿主、正常微生物群和外环境构成一个微生态系统。在 正常条件下，这个系统处于动态平衡状态。在微生态系统内微群落水平中，存在一 种或数种优势群对整个群落起着决定作用，而微种群内部中优势个体的丧失则会引 发微生态失调。在动物肠道系统微生态系中，厌氧菌占9 9 以上，兼性厌氧菌和好 氧菌不到1 。利用宿主体内的正常微生物优势菌群成员的益生菌，制成的微生态 制剂，可以补充或恢复失调的优势种群，使宿主体内恢复正常的微生态平衡，达到 防病治病的目的。 2 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 丁酸梭菌清液发酵工艺的研究 1 2 3 2 生物夺氧理论 根据正常微生物群的自然定植规律，人或动物出生时是无菌的，出生后不久就 被一系列微生物细菌定植了。厌氧菌在整个微生态系统中其数量上占据首位，并保 持着一定的生态平衡。多数病原微生物属于好氧菌或兼性厌氧菌，当动物肠道内微 生态平衡失调会造成局部氧分子浓度升高，有利于病原微生物的生长和繁殖。使用 微生态制剂可以培育好氧微生物，利用这些无毒、无害、非致病性微生物暂时在肠 道内定植，降低局部环境中氧分子浓度，氧化还原电位下降，抑制病原菌的生长， 恢复适合正常肠道优势菌生长的微环境，促进厌氧菌大量繁殖生长，从而达到预防 和治疗疾病的目的。 1 2 3 3 生物屏障理论 生物屏障理论又称生物拮抗理论，正常微生物群构成了机体的生物屏障和化学 屏障。生物屏障是指有秩序的定植于黏膜、皮肤等表面或细胞之间的正常微生物菌 群。化学屏障是指正常菌群的代谢产物，如乙酸、丙酸、乳酸、细菌素、抗生素及 其它的具有活性抑菌物质。这些屏障可以阻止外源菌的定植和生长，发挥生物拮抗 作用。 1 2 3 4 三流循环即能源流、物质流和基因流 能源运转是指正常微生物菌群内部与宿主保持着能源交换和运转的关系。物质 交换是指正常微生物菌群与宿主通过与宿主降解与合成进行物质交换。基因交换是 指在正常微生物之间有着广泛的基因交换，如耐受因子、产毒因子等。 微生态制剂作为非特异性免疫调节因子，促进吞噬能力和细胞产生抗体的能力， 抑制腐败微生物的过度生长，促进肠道内的有毒物质如氨、酚等的代谢，保证微生 态系统的能量流、物质流和基因流的正常运转。 3 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文丁酸梭菌清液发酵工艺的研究 1 2 4 微生态制剂的临床应用 1 2 4 1 在家禽饲养上的应用 对鸡使用微生态制剂后，可以提高鸡的生产性能、饲料转化率、提高免疫力、 降低死亡率等。 冷寒冰等选用3 日龄肉鸡1 4 0 0 0 只，随机分成2 组，实验组口服功能型微生态 制剂，空白对照组不饲喂任何微生态制剂，全程跟踪监测，结果表明，肉鸡在口服 功能型益生菌制剂后表现出生长加快，鸡群整齐度与均匀度有所改善，出栏平均重 提高9 5 ；肠道环境有所改善，饲料利用率提高，实验组比对照组料肉比降低2 1 6 ； 实验组鸡群可提前3 5 天出栏( 冷寒冰等，2 0 0 7 ) 。黄云海以饮水方法投喂微生态 制剂，结果表明，对照组在进雏后因肠炎死亡5 1 只；5 周龄时发生散发性传染性法 氏囊病，死亡4 8 只；6 周龄后该组鸡群转入正常。试验组进雏后，因肠炎死亡3 2 只；在4 周龄时鸡群中有部分发生传染性法氏囊病，死亡3 7 只；6 周龄后直至出 栏，该组鸡群均健壮活泼( 黄云海，2 0 0 7 ) 。余成瑶等对饲喂微生物饲料添加剂肉用 仔鸡的小肠黏膜做了扫描电镜研究，结果表明：实验组鸡小肠黏膜皱襞增多，绒毛 长度增长，黏膜陷窝加深，小肠吸收面积增大( 余成瑶，1 9 9 4 ) 。在其他的研究中也 表明饲喂益生菌可以使鸡小肠黏膜皱裂增多，绒毛长度增长黏膜陷窝加深。另外， 有很多试验报道，日粮中添加益生菌能提高肉仔鸡机体的免疫力，降低料重比，并 能提高产蛋鸡的产蛋率。张日俊等报道，用1 0 - - 2 o 的含芽孢菌、乳酸菌和酵母菌 等有益菌组成的活性微生物益生素饲喂肉仔鸡能明显提高饲料转化率和增重，同时 能显著刺激胸腺、脾和法氏囊的发育，增强机体免疫能力和抗病力。何明清等综述 中也指出，益生素可使蛋鸡产蛋重由2 7 4 9 9 枚上升为4 6 5 9 枚，上升了1 9 8 9 枚，产蛋率由4 4 3 提高到7 4 3 ，产蛋重与产蛋率明显优于其它对照组( 何明清和 倪学勤，2 0 0 2 ) 。韩进程等在罗曼蛋鸡的日粮中添加0 0 9 j j n 酶微生态制剂，结果实 验组蛋鸡产蛋率较对照组显著提高7 1 2 ( 韩进程等，1 9 9 8 ) 。日粮中添加y c 可提高 雏鸡日增重、饲料转化率、成活率，促进雏鸡生长；可提高雏鸡免疫器官指数和血 清免疫球蛋白，增强了雏鸡机体免疫力( 马明颖等，2 0 0 5 ) 。 4 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文丁酸梭菌清液发酵工艺的研究 1 2 4 2 在猪饲养上的应用 很多试验报道在猪的日粮或饮水中添加微生态制剂，可以提高猪的日增重，增 强其机体免疫力和饲料转化率，降低腹泻率和提高仔猪成活率。微生态制剂可以调 整仔猪肠道内环境，抑制或杀灭病原微生物，进而激活体内的免疫系统发挥功效， 提高仔猪抵御疾病以及安全度过断奶期的能力。 黄红卫将含乳酸菌、酵母菌等复合有益活菌的微生态制剂添加到断奶仔猪饲料 中，结果表明，仔猪料中添加微生态制剂的试验组比对照组平均日增重提高2 2 2 差异极显著( p o 0 1 ) ，试验组料肉比比对照组降低了1 6 8 ，差异极显著( p o 0 1 ) ， 采食量也增加了1 6 3 ( 黄红卫，2 0 0 7 ) 。b a i r d 和p o l l m a n 报道乳杆菌制剂能够提高 生长猪的日增重和饲料转化率( b a i r d d m ，1 9 7 7 ；p o l l m a n d se ta 1 ，1 9 8 0 ) 。g i l l 报道，用纯乳酸杆菌喂猪，仔猪日增重提高8 1 6 ，b a i r d 用混合乳酸杆菌喂猪，生 长育肥猪日增重提高8 1 4 ，饲料报酬提高5 1 8 。何明清等报道，微生物饲料添 加剂( 8 7 0 1 ) 可使生长育肥猪日增重提高1 5 ，饲料利用率提高1 0 1 3 。李春丽等 用含o 1 微生态制剂的自来水饲喂母猪及其所产哺乳仔猪，为期4 0 天，结果表明： 试验组的仔猪平均日增重提高8 3 3 ，发病率降低3 0 3 1 ，试验组母猪的免疫球蛋 白( i g a ) 浓度一直维持不变，对照组浓度下降了4 2 ( 李春丽等，2 0 0 5 ) 。邢宝松 等研究表明添加酵母培养物可以改善母猪的繁殖性能，尤其倾向于提高胎儿的营养 供应，且可以有效提高母猪分娩后的泌乳能力，从而提高哺乳仔猪的生长速度( 邢 宝松等，2 0 0 4 ) 。马曙生利用e m 发酵饲料培育断奶仔猪，实验表明仔猪腹泻率下降 6 5 6 ，死亡率下降6 8 ，日增重也显著提高( 马曙生，1 9 9 9 ) 。 1 243 在反刍动物饲养上的应用 反刍动物的消化主要在瘤胃进行，将适当比例的微生态制剂添加在牛的日粮中， 可以有效的减少腹泻疾病的发生、增强免疫力，促进犊牛瘤胃的发育、提早断奶， 提高产奶量。 徐晶等在益生素的应用中提出，加拿大研究人员于犊牛出生后当日便饲喂给乳 酸菌等混合发酵的初乳，结果犊牛日增重可达2 3 9 - - 2 4 8 9 ，而对照组仅为1 7 8 9 ( 徐晶 和金征宇，2 0 0 1 ) 。李义海在奶牛中应用微生态制剂，可使奶牛产奶量提高7 一1 0 ， 乳蛋白含量提高o 1 0 2 个单位，乳脂率提高o 1 一o 3 个单位。尹召华报道，在日 s 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文丁酸梭菌清液发酵工艺的研究 粮中添加益康x p 能提高乳产量及乳成分含量，增强牛的体质；减少肠道疾病的发 生；有助于产后的体况恢复，增强乳牛的繁殖性能( 尹召华和杨万玉，2 0 0 2 ) 。张扬 等用添加微生态制剂的饲料饲喂荷斯坦奶牛，结果表明，试验组比对照组平均日产 奶量提高了1 9 7 蚝，试验组试验后比试验前平均日产奶量提高1 9 3 k g ，等于每天增 收3 0 5 元( 张扬等，2 0 0 5 ) 。在羔羊的饲料中添加益生素有利于提高其生长速度，增 强免疫力。钞海峰研究表明：羔羊日粮中添加o 1 9 只天剂量的益生素时，羔羊的 生长速度及免疫功能均达到最佳状态( 钞海峰，2 0 0 4 ) 。任文军研究表明：添加益生 素的羔羊的成活率和断奶体重明显要高于未添加益生素的羔羊( 任文军，2 0 0 4 ) 。 1 2 4 4 在水产养殖上的应用 微生态制剂可以改善水质，抑制水产病原微生物的生产和繁殖、提高养殖对象 的抗病力。主要表现在可以利用水环境中过多的有机物合成菌体物质，从而降低环 境中氨氮、亚硝酸盐、硫化氢等有害有毒物质的含量，增加溶氧的含量，净化水产 动物生存环境。 微生态制剂中，主要是光合细菌可应用于水产养殖中，它除了能提高鱼类的抗 病能力，改善水体质量，诱导贝类附着变态的微生物；当作为饲料添加剂使用时， 可提供营养，提高饲料转化率，提高机体免疫力的同时还能改善肉的品质。d o u i l l e t 将细菌c a 2 作为饲料添加剂投喂太平洋牡蛎幼虫，促进了幼体的生长( d o u i l l e ta n d l a n g d o n ，1 9 9 4 ) 。王彦波等在对虾池中分别加入光合细菌、芽胞杆菌以及不同的微 生态制剂，待其生长繁殖后测定氨氮、亚硝酸盐、c o d 值和p h 值，发现制剂对 虾池水质具有明显的改善作用。方波等研究证明，微生态制剂可以明显净化盐碱地 养殖水环境，有效降低水环境中的氨氮、化学耗氧量和碱度，提高对虾养殖产量( 方 波等，2 0 0 5 ) 。刘克琳等研究了益生菌对鲤鱼免疫功能的影响，采用有益芽孢杆菌制 成微生物添加剂，对鲤鱼的生长和免疫功能进行了试验，试验鲤鱼苗分2 组，试验 组添加1 微生态制剂，经1 0 0 天饲喂试验，结果证明，益生菌生态制剂对鲤鱼有 促生长作用，试验组较对照组增质量提高1 1 8 ，饵料系数下降0 2 4 ；试验组免疫 器官胸腺和脾脏生长发育较对照组迅速且成熟快，电镜观察免疫器官内t 、b 淋巴 细胞较对照组成熟快、数量增多且产生抗体增多，免疫功能增强；试验组前肠黏膜 皱褶增多、隐窝加深、微绒毛长而密集，肠吸收面积增大，表明鲤鱼的消化功能增 强( 刘克琳和何明清，2 0 0 0 ) 。 6 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 丁酸梭菌清液发酵工艺的研究 1 3 丁酸梭菌研究进展 1 3 1 丁酸梭菌的来源、形态和生理特征 丁酸梭菌( c l o s t r i d i u mb u t y r i c u m ) ，即酪酸梭菌。1 9 3 3 年日本千叶医科大学医 学系k i n g im i y a i r i 博士从人的粪便中分离出丁酸梭菌( c l o s t r i d i u mb u t y r i c u m m a 瓜i ) ，随后发现其具有极强的整肠作用，可以抑制肠道中的致病菌，促进肠 道中有益菌如双歧杆菌和乳酸菌的生长。 丁酸梭菌属于硬壁菌门( f i r m i c u t e s ) 梭菌纲( c l o s t r i d i a ) 梭菌目( c l o s t r i d a l e s ) 梭菌科( c l o s t r i d i a c e a e ) 梭菌属( c l o s t r i d i u m ) 。它存在于土壤、人和动物肠道、干 酪及自然酸奶中。丁酸梭菌是一种直或弯曲的革兰氏阳性厌氧内生芽孢杆菌，后期 培养物可变为革兰氏阴性杆菌，菌体灰白色，呈煎蛋样，中间隆起( 赵建新等，2 0 0 2 ) ， 卵圆，单个或成对，短链，偶见长丝状菌体，周生鞭毛，具有运动性。菌体中常有 圆形或卵圆形的巨大芽孢，无孢子外壁和附属丝，形成芽孢后一端膨大呈鼓锤状， 或中部膨大呈梭状或纺锤状( 冉雪松等，2 0 0 7 ) 。丁酸梭菌在琼脂平板上形成白色或 奶油色的小规则圆形菌落，不水解明胶，不消化血清蛋白，能够发酵葡萄糖、蔗糖、 果糖、乳糖等碳水化合物产酸，一个显著的特征是产生淀粉酶，水解淀粉但不水解 纤维素。发酵产物主要有丁酸、乙酸、甲酸、丁醇、乙醇、氢气、二氧化碳、1 ，3 丙二醇；d n a 的g + c 含量( g c ) 为2 7 2 8 ( 杨桂平，1 9 9 8 ) 。 1 3 2 丁酸梭菌的生理功能及应用 1 3 2 1 丁酸梭菌对肠道菌群的作用 丁酸梭菌可以产生淀粉酶，水解淀粉和碳水化合物生成低聚糖，这些低聚糖更 容易被双歧杆菌和乳酸菌利用。 朱晓慧等通过体外培养证明，在双歧杆菌菌、嗜酸乳杆菌和粪链球菌的培养基 中加入1 3 比例的丁酸梭菌发酵提取物，液体培养2 4 小时，三种菌的活菌含量分别 比对照组提高了2 4 0 0 、4 2 5 7 和6 6 7 ( 朱晓慧等，2 0 0 0 ) 。另丁酸菌酪可增加肠 内酪酸、醋酸等短链脂肪酸生成量，可促进排便，抑制肠道内葡萄球菌、念珠菌、 克雷伯氏菌、变形杆菌、弯曲杆菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、痢疾志贺菌、伤寒沙门 7 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文丁酸梭菌清液发酵工艺的研究 氏菌、霍乱沙门菌、霍乱弧菌等有害和腐败菌的生长繁殖( 张树波等，2 0 0 2 ) 。 1 3 2 2 促进生长功能 丁酸梭菌体内存在着蛋白酶i 和蛋白酶i i 及脂肪酶，其能促进动物对脂肪和蛋 白质的消化吸收，丁酸梭菌还具有氨基酸载体的作用，能转运所有的氨基酸，但不 分解，所有这些都有利于促进动物生长。 李恕等将酪酸菌制剂用于水产类，结果鱼及特种水产类日增重率提高大约 1 5 - 4 0 ，杂食性鱼类可提高2 2 以上( 李恕和丛宁，1 9 9 8 ) 。 1 3 2 3 免疫调节功能 丁酸梭菌能激活免疫系统，促进免疫功能，维持机体的健康状况。当机体摄食 丁酸梭菌死菌体( 1 0 9 个克) 后，从小肠上皮细胞无菌取出派伊尔氏淋巴结细胞， 用e l i s a 法测定血清中免疫球蛋白i g a 含量，实验组( 6l x g m l ) 明显高于未摄食 菌体的对照组( 0 5l x g m l ) 。 1 3 2 4 提供营养元素 丁酸梭菌在发酵过程中能产生葡萄糖、麦芽糖等6 种糖，及维生素e 。这些物 质直接为动物提供营养元素，维生素e 能强化血管，增强抗病性，激活细胞，对机 体非常重要( 冉雪松等，2 0 0 7 ) 。 丁酸梭菌在体内能产生b 族维生素、维生素k 等，对机体具有保健作用。同时 其主要代谢产物丁酸是肠道上皮组织细胞再生和修复的主要营养物质。 1 3 3 丁酸梭菌的应用开发现状 1 9 9 9 年2 月由联合国粮农组织( f a o ) 和世界卫生组织( w h o ) 联合召开的第 5 2 次食品添加剂专家委员会强调指出酪酸梭菌是人的正常肠道菌 ( h t t p ：w w w w h o i n t p c s j e c f a s u m m a r y _ 5 2 p d f ) 。此后，人们广泛的关注和研究了酪 酸梭菌的形态特征、生理特点、生化特点及其商业应用。另外，n a r i t a 等人研究 了酪酸梭菌对重金属的抗性( n a r i t ae ta 1 ，2 0 0 0 ) ；酪酸梭菌的非共生固氮能力也 8 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文丁酸梭菌清液发酵工艺的研究 引起了人们的注意( p a r k e r a c ，1 9 5 4 ) 。 1 9 4 0 年，丁酸梭菌在日本实现了商业化生产并被应用于临床。最初它被用作整 肠剂，广泛用于肠道菌群失调，急慢性腹泻，肠易激综合症，抗生素相关性肠炎等 疾病的治疗，取得了显著疗效。此后，它先后被作为处方药、非处方药、兽药、饲 料添加剂、食品添加剂等广泛使用。在韩国，酪酸梭菌也已经被用于牛、猪及家禽 的饲料添加剂( h t t p ：l l w w w h a n d o n g v e t c o k r e n g l i s h p r o d u c ta p r o d u c ta0 7 a s p ) 。丁 酸梭菌能单独作为饲料添加剂使用，也能与乳酸菌、芽孢菌、双歧杆菌等益生菌复 配使用，能增强其功效( 张雪平等，2 0 0 1 ) 。 我国市场上进口药用丁酸梭菌产品主要是日本米雅利桑制药株式会社生产的米 雅b m 片剂( m ab mt a b l e t s ) ，治疗肠道菌群紊乱引起的肠炎、腹泻、消化 不良等，效果显著。2 0 0 4 年我国青岛东海药业有限公司的口服酪酸梭菌活菌胶囊的 新药证书( $ 2 0 0 4 0 0 8 4 ) 获得国家食品和药品监督管理局的批准。此外，山东科兴生 物制品有限公司生产的口服酪酸梭菌、双歧杆菌二联活菌剂( o r a lc l o s t r i d i u m b u t y r i c u ma n db i f i d o b a c t e r i u mc a p s u l e ，l i v e ) ，重庆泰平药业有限公司生产的酪酸 梭菌活菌胶囊( c l o s t r i d i u mb u t y r i c u mc a p s u l e ) 也纷纷上市。 在酪酸梭菌的研究开发和商业化的生产过程中，形成了许多专利。日本拥有的 酪酸梭菌相关专利比较多，中国、美国、法国、德国和英国等国家的知识产权机构 也都受理和批准了一些相关专利。酪酸梭菌相关专利涉及的应用相当广泛，除了酪 酸梭菌本身的分离培养、规模化生产等专利外，有利用其预防和治疗人类或动物疾 病方面的，例如治疗肠道疾病、肝脏疾病、癌症等；有利用其作为保健品的专利； 有利用其促进动物或植物生长方面的专利；还有利用其生产氢气等能源开发方面的 专利。可见，现在关于酪酸梭菌的研究正日益深入和广泛，其产品市场更是蓬勃发 展( 李雄彪等，2 0 0 8 ) 。 1 4 课题的立题依据和目的及意义 丁酸梭菌( c l o s t r i d i u mb u t y r i c u m ) 比普通的其它的益生菌( 女n - g l 杆菌、双歧杆菌 和肠球菌) 有更强的耐酸、耐胆汁特性，能更适应动物肠道环境，具有很大的应用 价值。近年来国内对丁酸梭菌的研究多集中在医学方面，饲料方面的研究也逐渐升 温。因此，对丁酸梭菌培养基的优化研究有其实际意义，但丁酸梭菌不耐贮藏，需 要进行包被或放置在低温下，所以高含量菌粉可以减少包被成本和低温贮藏费用。 9 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文丁酸梭菌清液发酵工艺的研究 目前用于丁酸梭菌发酵的主要氮源为大豆饼粉，因其不可溶，所以发酵后得到的是 菌粉实际上是菌体和发酵大豆饼粉后的混合物，不能得到高含量的菌体。基于上述 现状，本文采用清液发酵的策略，通过在大量碳源、氮源等培养基成分筛选的基础 上，运用数学统计中优化效果最为显著的响应面方法，在s a s 统计软件的帮助下， 得到适合工业化生产的清液发酵工艺，通过离心处理便可以得到大量纯净的菌体。 l o 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文丁酸梭菌清液发酵工艺的研究 2 实验材料和方法 2 1 实验材料 2 1 1 主要仪器设备 表2 1 仪器和设备 t a b l e 2 1t h ei n s t r u m e n t sa n de q u i p m e n t s 主要仪器厂家 电子精密天平 冰箱 相差显微镜 p h s 3 c 型精密酸度计 b c n 1 3 6 0 型生物洁净工作台 d h p 1 2 0 型恒温培养箱 b df a c s c a l i b u r 流式细胞仪 7 5 2 型紫外可见分光光度计 t d l 5 型离心机 t g l 1 6 c 型离心机 d h g 9 0 a 型烘箱 r 0 8 0 8 1 型灭菌锅 奥豪斯公司； s i e m e n s ： n i k o n 上海虹益仪器仪表有限公司； 北京东联哈尔仪器制造有限公司； 上海实验仪器厂有限公司； b db i o s c i e n c e s 上海第三分析仪器厂； 上海安亭科学仪器； 上海安亭科学仪器； 上海索谱仪器有限公司； 武汉市鸿雁医疗器械制造有限公司。 2 1 1 实验菌株 丁酸梭菌( c l o s t r i d i u mb u t y r i c u m ) b 1 ，由华中农业大学农业微生物学国家重点实验 室发酵工程室保藏，分离于湖北省劲牌酒业有限公司刘仁八镇基酒基地酒窖底泥 ( 谢树贵等，2 0 0 7 ) 。 2 1 2 培养基 ( 1 ) 种子培养基( 梭菌增殖培养基，简称r c m 培养基) ：酵母浸膏3g 、牛肉浸膏 1 1 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 丁酸梭菌清液发酵t 艺的研究 1 0g 、胰蛋白胨1 0g 、葡萄糖5g 、可溶性淀粉1g 、氯化钠5g 、三水合乙酸钠3g 、 半胱氨酸盐酸盐0 5g 、0 5 美蓝0 2m l 、蒸馏水1 0 0 0m l ；调节p h7 1 4 - 0 1 ，1 1 5 ， 2 0m i n 灭菌备用。( 陈天寿，1 9 9 5 ) ( 2 ) 初始发酵培养基：酵母浸膏3g 、葡萄糖5g 、可溶性淀粉1g 、氯化钠5g 、三 水合乙酸钠3g 、磷酸氢二钾2g 、硫酸铵1g 、半胱氨酸盐酸盐o 5g 、o 5 美蓝0 2 m l 、蒸馏水1 0 0 0 m l ；调节p h7 1 4 - 0 1 ，1 1 5 ，2 0 m i n 灭菌备用。 2 2 实验方法 由于丁酸梭菌属严格厌氧菌( h a m b l e t o na n dr i g b y ，1 9 7 0 ) ，在有氧条件下无法 生长，传统的培养方式多选用焦性没食子酸法( 夏淑兰，1 9 8 8 ) ，现在多采用厌氧工 作台或厌氧罐培养，但实验成本相对较高。本实验在培养方法和计数方式都做了相 对改进。 2 2 1 丁酸梭菌的发酵方法 取2 0 甘油管保藏的菌种2 0 0 “l 接种于装有9 m l r c m 培养基的试管中，3 7 条件下静态厌氧活化4 8h 。将活化好的菌种按1 ( v v ) 的接种量转接到灭过菌 的发酵培养基中( 培养基组成按设计中的所取的水平进行) 。3 7 。c 条件下静态厌氧培 养2 4h 3 6h 以达到最大生物量。 发酵培养基装于1 8 x 1 8 0 l i l l 的试管中，装液量为1 5m l ，加约2c n l 厚的液体 石蜡液封。培养基灭菌后若放置超过4h ，在使用前都需要沸水浴1 0m i n 驱氧，直 到美兰指示剂的蓝色褪去。 2 2 2 丁酸梭菌的计数方法 采用稀释平板计数法在厌氧条件下培养，不但工作量大而且实验成本较高，本 实验采用分光光度计比色法和流式细胞仪测定菌数相结合的方式，既定性又定量的 对发酵结果进行评定，方法快速且准确。 2 2 2 1 分光光度计比色法 将培养液于4 5 0 0r m i n 离心1 0m i n ，弃去上清，将沉淀用无菌水洗涤2 次，在 1 2 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 丁酸梭菌清液发酵工艺的研究 6 5 0n r r l 处测其吸光度值o d 6 5 0 ，采用此方法定性反应生物量的多少( 孔青，2 0 0 6 ) 。 2 2 2 2 流式细胞仪测定菌数 ( 1 ) 标准曲线的制作 将培养液于4 5 0 0r m i n 离心1 0m i n ，弃去上清，将沉淀用无菌水洗涤2 次，稀 释一定倍数使吸光度值落在o 2 0 8 范围内( 得到4 个样品) ，以蒸馏水校正零点， 在6 5 0 n m 处侧其吸光度值o d 6 5 0 。将上述4 个样品经流式细胞仪( b df a c s c a l i b 矗刑) 测定菌体浓度，并绘制菌体浓度( y ) 吸光度( x ) 标准曲线( 见图2 1 ) ，求出标准 直线方程y = 2 5 2 4 x 0 4 3 2 ，r 2 = o 9 9 8 。 为 一 x = o u 0 。4 o d 渤 圈2 1 菌体浓度标准曲线 f i g 2 1s t a n d a r dc u r v eo ft h et o t a lc e l ln u m b e r ( 2 ) 计算发酵液中的菌体浓度 将培养液于4 5 0 0r m i n 离心1 0m i n ，弃去上清，将沉淀用无菌水洗涤2 次，稀 释一定倍数使吸光度值落在o 2 一o 8 范围内，以蒸馏水校正零点，在6 5 0 n m 处侧其吸 光度值o d 6 5 0 。将吸光度值带入标准曲线得到稀释后的菌体浓度，再乘以稀释倍数 即得到发酵液的菌体浓度。 2 2 3 丁酸梭菌浓缩菌体的计数 将培养液于4 5 0 0r m i n 离心1 0m i n ，弃去上清，将沉淀用无菌水洗涤2 次并用 滤纸吸干水分，平均分为两份。将其中一份溶于蒸馏水测定吸光度带入菌体浓度标 准曲线计算出菌体浓度；另一份置于1 0 5 c 烘箱2 h 烘干，计算出干物质的含量。二 1 3 坫 ” 心 8 6 4 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 丁酸梭菌清液发酵工艺的研究 者相除便是每单位干物质含有的菌体浓度。 2 2 4 还原糖测定方法- 3 ，5 二硝基水杨酸法( d n s 法)( 蔡武城和厚 积，1 9 8 2 ) ( 1 ) 标准曲线的制备 精确吸取葡萄糖标准储备液0 2 m l 、0 4 m l 、0 6 m l 、o 8 m l 、1 0 m l 、1 2 m l 分 别置于比色管中，各管补蒸馏水至体积为2 0 m l 。按顺序向比色管中加入3 ，5 一二 硝基水杨酸溶液2 0 m