（发酵工程专业论文）啤酒中自由基与抗氧化力初步研究.pdf

摘要 摘要 本论文建立了d p p h 分光法测定啤酒抗的氧化力，测定条件为：除气并用去离子水 稀释2 0 倍的啤酒，吸取2 m l 移入装有2 m l o 1m m o l ，l d p p h 乙醇溶液的具塞试管中 混匀，o 冰水浴静置3 0m i i l ，于5 1 7n m 处测吸光度，计算自由基清除率。利用该方法 可以有效地评价啤酒的抗氧化力。 利用d p p h 分光法考察酿造过程，发现随糖化的进行，持续高温促使麦汁的d p p h 清除率下降，从糖化初期的9 3 降至糖化结束8 7 1 7 ，下降6 2 7 ；煮沸时的高温使 得抗氧化物质进一步减少6 0 ；发酵时酵母代谢旺盛，产生了具有抗氧化能力的物质， 在发酵1 d 后清除率有明显的上升，发酵结束有所下降。 利用电子自旋共振( e l e c t r 咖s p i nr e s o n a n c e ，e s r ) 法测定啤酒及酿造过程的自由基， 发现成品啤酒中的典型自由基是o h ，它的产生依赖于氧气与啤酒中某些物质的反应， 随老化程度加深，自由基含量上升。而在酿造时，糖化麦汁经煮沸后自由基含量上升很 多，经发酵后回落，但过滤后明显上升。糖化麦汁中发现了一种国外未报道过的新型自 由基，暂命名为f r l 。f r l 与o h 之间存在反应链上的关系。氧气对糖化阶段自由基 的形成有极大的推动作用。 本论文基于对成品啤酒老化过程的研究，证明u c h i d a 等人提出的迟滞时间并不能代 表啤酒的抗氧化力，也不能很好表示啤酒的老化程度；提出s i ( s t a b i l i t yi n d e x ) 系数， 该值能很好反应啤酒的风味稳定性，新鲜啤酒s i 2 0 0 ，轻微老化啤酒s i 介于2 0 0 1 2 0 ， 一般老化s i 介于1 2 0 5 0 ，严重老化s i 2 0 0 ，f r e s h ；2 0 0 一1 2 0 ，s l i 曲t s t a i i n g ；1 2 0 一5 0 ，s t a l i n g ； 5 0 ，e x t r e m es t a l i n g a s p e c u l a t i o no nc a t e g o r i e so fa n t i o x i d a n t si nb e e r ：c a t e g o r y ia n di ih a v et h ee f f e c t m a i n l yo nl a gt i m e ，g e n e r a t i o ns p e e do ff r e er a d i c a lr e s p e c t i v e l y ，w h i l et y p i c a lm a t e r i a l sa r e s 0 2a n dp o l y p h e n o l s b o t hc a t e g o r yia n di ie f f e c tt h ed p p h s c a v e n 百n gr a t i o k e yw o r d s ：n a v o rs t a b i l “y ，f r e er a d i c a l ，a n t i o x i d a t i v ec a p a c i ty ，d p p h ， o h e l e c t r o ns p i nr e s o n a n c e ( e s r ) l i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名：日期：文彩年；月砑日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：导师签名： 日期：山卯年月刮日 第一章绪论 1 绪论 1 1 研究背景 1 1 1 啤酒风味老化 1 1 1 1 啤酒风味老化过程描述 瓶装啤酒进入市场后，在贮存过程中形成的一些产物会影响它原有的新鲜风味，使 啤酒的风味发生缓慢但明显的恶化。这些不利于啤酒风味的物质被认为是来自于啤酒贮 存过程中的各种氧化过程，一般被称为“氧化风味”( o x i d i z e dn a v o r ) 或“老化风味”( s t a l i n g f l a v o r l 。产生这些不利于啤酒风味的物质的过程，称之为啤酒的“老化”。啤酒的风味稳 定性也就是指啤酒的风味保鲜期，风味稳定性越好，保鲜越就越长，啤酒的抗老化能力 也就相应地越强。如何延缓这类风味物质的产生是当今酿造业面i 临的最大挑战之一，因 为消费者判定啤酒质量好坏与否的一个很重要的因素就是风味【l 】。 m e i l g a r r d l 2 j 用图例说明了一个高氧气含量瓶装啤酒的老化过程，如图1 1 所示。老 化的第一个标志是总的风味强度有所下降，然后风味强度随着老化风味的发展而有所增 加。在3 3 下贮存，四周后开始检测到纸板味，八至十二周后达到最大值，接着会出现 甜味、木头味、涩味和羽毛味，后者一般在六至九个月的货架期后达到最大值。 啤酒的老化味会出现许多类型，如硫化味、霉味、雪梨味、酚味，此外双乙酰等不 好的风味物质在老化过程中也能被检测出来。在老化过程的早期经常用“失去新鲜味” 来描述啤酒风味的变化。c l a p p e n o n 和d a l g l i e s h 【3 1 发现甜味的增加与焦糖味的发展是一 致的。啤酒的老化同时也表现为尖锐的后苦味和品尝上的收敛性。随着贮存时间与温度 的增加，啤酒中愉快的后苦味会降低，而不愉快的后苦味会增加【4 j 。后苦味随着贮存温 度的升高而会变得愈发明显。 人们认识到，在贮存过程中，不同的风味是由风味化合物成份的改变所引起的。在 老化过程的一定时间内，反应中的任何一个可能对风味起决定作用的物质，由于它们在 贮存过程中发生不断的变化，因此其老化或氧化风味的典型特征不易被描述。同时许多 风味物质之间存在一个动态平衡，这要比一个或几个重要的物质对整体风味的影响更 大。在国际啤酒风味术语中，通常用“纸板味”、“皮革味”、“醋粟味”和“霉烂味”来 描述瓶装啤酒老化或氧化风味【5 j 。“纸板味”是用于描述啤酒老化的初始阶段中面包味、 纸板味的基本术语：“皮革味”则代表老化的后期阶段，经常与“木头味”相联；“醋粟 味”则是描述被黑醋粟污染后风味的术语，有时候，土臭味、霉味、烂蔬菜味和硫化味 也常用“醋粟味”来表示。 1 1 1 2 啤酒风味老化的研究及其评价方法 目前对老化风味形成机理认识还不深入，一般认为包括以下几点【6 】：( 1 ) 高温影响； ( 2 ) 类脂降解作用：( 3 ) 自由基反应；( 4 ) 与异 辜草酮有关的反应；( 5 ) 醇醛缩合；( 6 ) 自然抗 氧化的保护影响。 江南火学硕士学位论文 质 量 等 级 风 味 强 度 04 81 21 6 3 3 。c 贮存时间( 周) 图1 1 高氧气含量的瓶装啤酒的老化过程 由于缺乏对老化机理的精细研究，酿造工作者无法建立起一套有效完整的评价体系， 以下几种方法在现阶段应用或研究比较多： ( 1 ) 感官品评法虽然能直接描述啤酒的风味，但只能定性分析，结果受主客观影响较 大； ( 2 ) 1 1 3 a 法是目前国内啤酒厂广泛采用的啤酒老化程度测定方法，最初是由k o h n 和 l i v e r s e d g e 提出用于食品和生物材料中脂类氧化的检测和定量，后经g r i 2 s b v 和p a l a m a n d 改进用于啤酒羰基类化合物分析。主要利用啤酒中的不饱和脂肪酸的降解产物丙二醛 ( m a l o n d i a l d e h y d e ) 与乙酸化的硫代巴比妥酸反应形成生色团，颜色越深说明啤酒的老化 程度越严重，但t b a 测定但是在前期的研究中发现该反应的特异性存在一定的争议【7 1 ： ( 3 ) j a 法与气相质谱法( g c m s ) 联用，并将其与感观评定结合起来进行比较， g c m s 虽可保证结果的准确性，但过于繁琐费时： ( 4 ) 1 9 9 8 年，y u a nj i a np i n g 等人提出关于5 - 羟甲基糠醛法( 5 一h m f ) 作为啤酒老化的指 示剂之一，并建立了高效液相色谱法，2 0 0 3 年燕京啤酒林智平1 8 1 等人对该方法进行了改 进，但在实际应用中存在梯度洗脱时间不合理、分离度差等缺点。 总而言之，并没有种方法得到完全认同，作者认为在啤酒这个含有超过8 0 0 多种 化合物的复杂体系中，仅依靠一类或一种老化相关物质的定量分析方法，很难从整体层 面上真正反映出整体风味的变化。 1 1 2 啤酒自由基研究进展 由于啤酒的风味老化过程其实就是各物质缓慢的氧化过程，因此，氧气在啤酒中所 起的作用无疑是十分巨大的。但有研究表明【9 j ，瓶装啤酒中分子氧并没有直接参与氧化 过程。v a ng h e l u w e 等人1 1 0 】在不同空气含量的啤酒中添加亚硫酸盐和异v c 钠盐，结果 发现这些抗氧剂并没有按化学计量关系与分子氧发生反应，对氧的吸收作用也小于预期 值，说明氧可能以某种活跃的形式参与了啤酒中的氧化还原反应，这使研究者将兴趣转 2 第一章绪论 移到了氧的活性形式活性氧( 即过氧化物和氧自由基，如图1 2 ) 。 3 0 2 ；兰= 兰呀；兰= 兰0 2 2 。 氧趁氧化物过氧化蝴 n u 肛撼擂 h 0 2 一 舻 h 2 0 2 兰o h 过氧化氢 羟基 图1 2 氧气与活性氧的关系 在此先简要介绍一下自由基的概念及其化学性质。 一般来讲，稳定的化合物，其电子都是成对存在的。自由基是含有未成对电子的原 子、原于团或分子。自由基通常用“”表示，如甲基自由基c h 3 、羟基自由基o h 。 自由基的产生分为以下三种情况：辐射分解，热解，单电子氧化还原。通常自由基 表现出极活泼的化学性质，存留时间非常短，制备和分离极为困难，即使采用特殊方法， 也很难进行直接检测。但也有少数几种自由基相当稳定，由于本身化学结构使自由基处 于较为隐蔽的地方而不易于反应，如图1 3 列出的几种自由基。 qr 6 弋j u 三苯甲基 d p p h 图1 3 几种自由基的结构式 o t e m p o 自由基最重要的化学特性是倾向于进行链反应。因为自由每有一个未成对电子，它 们与只具有成对电子的分子进行反应一定会产生另一个自由基，这样，自由基一分子反 应就会形成连锁反应，反应中不应该有自由基的净消失。将起始的自由基引入到含有反 应物或反应混合物的体系中去，然后这些反应物受起始自由基的进攻、生成新的自由基， 即形成反应链。链反应可大致分为聚合反应和非聚合反应两大类，聚合反应中，一个引 发的自由基加到烯烃分子上又产生新的自内基，此新自由基再加成到另一烯烃分子上， 依次类推；非聚合链式反应，自由基在反应物之间传递，又称作“链转移”。 由于测定手段的问题，很长一段时间里研究人员无法了解有关自由基的产生情况， 的彤叽 瞵，q =_l h h 物川i 靴单 朱 c 江南大学硕士学位论文 因为首先绝大部分自由基都是极不稳定的，存在寿命只有几秒，如羟基自由基的寿命大 约为1 0 。6 秒；其次，即使成功获得并保存了自由基，也会在e s r 仪操作条件下因无法 得到超低温保存而立即衰减，测不到自由基信号。直至自旋捕集技术( s p i nt r a p p i n g t e c h n o l o g y ) 的出现，研究者才能从真e 意义上测定短寿命自由基，如氧自由基。这种方 法的原理是利用自旋捕集剂( s p i nt r a p p i n gr e g e n t ) 与自由基反应生成相对稳定的自旋加合 物，通过测定该加合物来表征原自由基。 r + 自旋捕集剂一自旋加合物 自旋捕集剂是一类不饱和的抗磁性物质，通常为氮酮和亚硝基化合物，现在已经合 成上百种自旋捕集剂，最常用的有t n b ( n i t r o s o t e n _ b u t a n e ) ， d m p o ( 5 ，5 一d i m e t h y l - 1 一p y h o l i n e 一1 - o x i d e ) ，p b n ( p h e n y l t e r t b u t y n i t r o n e ) 。p b n 是较常用 的氧自由基捕集剂，结构及反应方程式如图1 4 所示。 o h c h 。 l 。 = = _ e c h 3+ o h + h ij 。 o 亡h 3 。t 。 2 - 者；叔丁基硝酮( p b n ) 8 h 26 3 1 g8 n 1 36 一1 6o o 超精细分裂常数 图1 4p b n 捕集o h 的反应式 相对不活泼的分子氧被啤酒中某些成分还原成为“活性氧”，在啤酒氧化过程中起重 要作用。成品啤酒中发生的氧化还原反应大部分是非酶反应，通过类黑色素、多酚、过 氧化物等中间物质及f e “、c u + 形成一条氧化还原耦合链( 如图1 5 ) 。图中a 为耦合链的 起始物，如v c 等，b 、c 、d 、e 为具有氧化还原能力的底物，x 为最后氧化产物。氧 还原态钒他惫还燎卷 a 、i ，b 1 y c 、， 。人。人。人 氧化态还取志氧化态 迁娘崽铽化态迁原志还原卷 哪厂d ，“。v ，7y “ 一啦。：人。人。人：八。 v址原态帆化态午 【化奄 八( 过钒化阶段) 。、o ， 轧化志 一风味明显改变 图1 5啤酒中的氧化还原耦合链反应 在反应链中起了关键性作用，但并不是分子氧而是活性氧，这也解释了为什么瓶颈空气 4 r r l 第一章绪论 含量往往不与老化味成线形相关关系。 在氧化阶段，与v c 类似的物质( 以a h 2 表示) 能以还原催化剂的氧化形式将催化剂转 化为还原态，如a h 2 被c u 2 + 催化氧化的方式为： a h 弋厂2 c u 2 + 、，h 2 0 2 ii a 一7 、- 2 c u + 2 h + 、0 2 此后氧的还原有两条途径： a 单电子机制：0 2 + h + + 1 e 一0 0 h b 双电子机制：0 2 + 2 h + + 2 e h 2 0 2 ，以b 途径为主。 在过氧化阶段( 耦合氧化阶段) ，分解h 2 0 2 ，主要由f e n t o n 反应引起： 弓i 发 f e 2 + + h 2 0 2 ，f e 3 + + o h + o h 增长 o h + h 2 0 2 一h 2 0 + h 0 2 h 0 2 + h 2 0 2 + 0 h + 0 2 + h 2 0 该反应会给啤酒引入很多自由基，对风味有不利影响。 1 9 8 8 年k a n e d a 等人【1 1 】首次采用以p b n ( 2 苯叔丁基硝酮) 为捕集剂的e s r 法测定啤 酒中自由基，认为根据加成物e s r 谱可初步认定羟自由基是啤酒中最主要的自由基， 并可能是因过渡态离子( f e “、c u + ) 催化h 2 0 2 而产生，进一步在啤酒中添加不同浓度h 2 0 2 后发现羟自由基在啤酒氧化过程中起了重要作用。之后该研究小组又采用荧光法和e s r 法研究巴氏灭菌及贮存过程中啤酒的氧化程度1 2 。4 1 ，发现灭菌易于产生自由基并参与啤 酒的氧化，该过程所选温度与时间均影响自由基生成量，巴氏消毒单位与自由基荧光强 度之间成正相关，2 0p u 相当于室温贮存一周。 1 9 9 6 年u c h i d a 等人开始研究【1 5 l 发现高温过程、发酵和过滤是产生自由基最多的三 个阶段。初步认为( 1 ) 温度影响啤酒自由基的生成量，无论是在灭菌阶段还是贮存阶段； ( 2 ) 发酵过程中各种因素如酵母接种量，接种时间、前期溶解氧、发酵方式等，都会影响 自由基的生成量：( 3 ) 提出以迟滞时间( 1 a gt i m e ) 为指标评价啤酒抗氧化力和老化程度 【1 6 i 。 1 9 9 8 年，m o g e n sl 【1 7 】研究了不同捕集剂，包括d m p 0 ，p b n ，m n p ，捕集啤酒自 由基后形成的e s r 谱，丰富了研究素材。 目前啤酒自由基方面的研究处于初始阶段，国内尚未开始，国外i ( a n e d a 和u c h i d a 是最具代表性的研究者，他们的结果都表明，自由基在啤酒氧化过程中起者举足轻重的 作用，当单一物质( 群) 评价啤酒整体风味老化存在困难的时候，自由基可能是一个揭示 啤酒老化的很好的突破口，因为自由基活性很高，促使很多原本反应活性不高的物质发 生反应，促使老化物质的形成，啤酒中的自由基反应构成网状结构涵盖了大部分老化反 应。 1 1 3 啤酒抗氧化力方面的研究进展 最初关于抗氧化力的研究重心放在多酚物质上，o w a d e s 和j a k o v a c ( 1 8 j 对啤酒中的多 江南大学硕士学位论文 酚在啤酒氧化过程中可能有的作用进行了研究，把同位素”o 注入瓶装啤酒的瓶颈空气 中，有6 5 的多酚分子整合了”o ，而进入异蓰草酮和挥发性羰基化合物中的1 8 0 分别 为5 和3 5 。由此可以说明，多酚与啤酒中的氧化反应有关。但是也有报道认为【1 9 】， 一些多酚在啤酒中是作为抗氧化剂存在。总的说来，大分子的多酚是啤酒中老化物质或 老化物质的前驱物质，对啤酒的风味稳定性有着一定的负面影响；而小分子的多酚，由 于它们具有一定的还原性，因此对于延长啤酒的保鲜期是有益的物质。 s h i e l 【i 时a k i i2 0 l 以t r a p ( t o t a lr e a c t i v e a n t i o x i d a l l tp o t e n t i a l ) 法研究了糖化过程中 搅拌桨速和空气对麦汁总抗氧化力的影响，并以这些麦汁为原料进行发酵，对发酵后的 啤酒进行风味稳定性考察，发现隔氧条件下低速搅拌制得的麦汁最好。 m o g e n sl 1 2 1 l 指出多酚，如阿魏酸、香豆酸、儿茶素、花色素，以及类黑精、含s 化合物等都有抗氧化能力，是啤酒的潜在抗氧化剂，它们很大一部分由麦芽和酒花带入， 另一部分来自发酵阶段酵母的代谢。 1 2 立题依据及意义 本研究通过对啤酒中自由基和抗氧化力的研究，揭示啤酒在风味劣化的过程中自由 基含量和抗氧化力的变化，分别建立适用于测定啤酒自由基的电子自旋共振法和测定抗 氧化力的方法：同时探索一个具有实际可操作性的评价风味稳定性的新指标；在学术意 义上，由于对啤酒中自由基的研究在世界范围内刚兴起不久，国内尚无其它研究者涉足， 本论文在自由基方面的探索将丰富该研究领域，为更清晰了解啤酒老化的精细机理奠定 基础。 1 3 本论文的主要研究内容 目前已知啤酒含有8 0 0 多种有机和无机化合物，这个复杂的体系中的一些物质形成 了啤酒特有的主体风味，而另一些物质又通过一系列物理化学反应来改变这种风味，使 得啤酒的风味处在不断的变化中，并最终导致风味老化。 所以风味老化是整体协同作用的结果，仅用一种或一类物质来评价就会出现以偏概 全的现象。老化又是一个动态过程，可以认为是氧化与抗氧化之间的斗争过程。而自由 基和抗氧化力分别是氧化的推动力和抵抗力。 鉴于以上考虑，本研究将不在从化合物层面上对老化进行研究，转而从自由基和抗 氧化力着手，将两者结合，有利于从正反两方面分析啤酒的老化过程。 本论文研究任务： 1 建立方法：建立适于测定啤酒自由基的e s r 法和抗氧化力的d p p h 分光光度法。 2 利用e s r 法考察啤酒酿造过程和贮存过程，研究自由基的种类和变化情况，确定自 由基在啤酒中变化的基本规律及其影响因素。 3 利用d p p h 法考察啤酒酿造过程和贮存过程，确定啤酒酿造过程的抗氧化力变化和 影响因素，优化部分工艺条件，考察成品啤酒贮存过程的抗氧化力变化，结合其它 方法或指标，拟合新指标评价啤酒风味稳定性。 第二章d p p h 分光法的建立 2d p p h 分光法的建立 2 1 引言 对于啤酒中的氧化还原体系而言，氧化剂与抗氧化物质之间的平衡不断变化， 最终导致啤酒的风味老化。虽然啤酒老化的精细机理尚不十分清楚，但有一点可以 肯定，即啤酒本身所含的抗氧化物质对风味稳定性有极大影响1 6 ，2 2 1 。 由于抗氧化物质众多，单个抗氧化剂无法代表总抗氧化能力，各抗氧化剂对抗 氧化作用的总和也并不能代表他们在啤酒体系内的相互协同作用。利用物质对自由 基的清除率来表征其抗氧化作用是现在普遍采用的方法，目前常用的有以下4 种方 法：a b t s 法、d p p h 法、d m p d 法和t r a p 法，前三者利用基质对自由基的清除能 力来评价其抗氧化能力，后者基于测定基质对铁离子的还原能力1 2 。其中a b t s 法 和础法曾被用于评价啤酒总抗氧化能力，t r a p 法较a b t s 法严格，但耗时较长， 前两种测定方法均需通过f e n t o n 反应建立一个存在自由基( 主要是羟基自由基) 或铁 离子的反应环境，这给之后评价清除效果的准确性造成了较大的影响。d p p h 法是 最近研究中使用比较多的方法，二苯代苦味酰肼自由基( 1 ，1 d i p h e n y l 一2 p i c r y l h y d r a z y l ，简称d p p h ) 是一种较稳定的自由基，在有机溶剂中呈紫色，并于 3 3 0 n m 、5 1 7 n m 处有强吸收。有自由基清除剂存在时，d p p h 自由基的单电子被分配 而使其颜色变浅，在最大吸收波长处吸光度变小，利用分光光度法可以检测自由基 清除情况，从而评价样品的抗氧化能力。该能力用清除率表示，清除率越大，抗氧 化能力越强【2 “。 本章主要目标是建立利用d p p h 清除率来表示啤酒抗氧化能力的分光光度法， 再用电子自旋共振法考证该方法的有效性。 2 2 材料与方法 2 2 1 主要试剂 啤酒：市售商品啤酒 d p p h ( 纯度9 0 ) ：东京工业株式会社 无水乙醇、抗坏血酸、醋酸钠均为分析纯，上海国药试剂集团 2 2 2 主要仪器 e m x 一1 0 1 2 型电子自旋共振仪：德国b r u l ( e r 公司 u v 2 1 0 0 型分光光度计：上海合利仪器有限公司 s h z 一2 2 恒温水浴锅：江苏省太仓市医疗器械厂 2 2 3 测定方法 2 2 3 1 分光法测定d p p h 清除率 d p p h 溶液配制：准确称取2 0m gd p p h ，用无水乙醇溶解并定容至2 5 0 m l 。 测定：将2m l 待测液及2m ld p p h 溶液置于一具塞试管中，混匀，0 放置 江南大学硕士学位论文 3 0 m i n ，以无水乙醇为空白于5 1 7 n m 测其吸光度a ；，并以下式计算清除率： 清除率：【1 一竺盟】1 0 0 a c 式中：& ：2 m l 无水乙醇加2 m l d p p h 溶液的吸光度 a ： 2m l 待测液加2m l d p p h 溶液的吸光度 a i ：2 m l 待测液加2 m l 无水乙醇的吸光度 2 2 3 2e s r 法测定d p p h 清除率 0 1 m o l l 醋酸盐缓冲液与乙醇以1 ：2 体积比混合，加入d p p h ，使其终浓度为 1 8 6 1 0 4 m o l l ；此d p p h 溶液与除气啤酒按1 4 ：1 的体积比反应，于0 静置1 0 m i n ， 进行e s r 测定。e s r 测定的原理是利用电子自旋共振仪为自由基单电子提供一个 能级跃迁的环境，通过测定由电子跃迁引起能量变化的大小来表示自由基信号强 弱，从而反映含量的多少。 e s r 测定条件：中心磁场，3 4 7 5 0 0 g ；微波功率，2 0 m w ；微波频率，9 7 g h z ； 调制频率，1 0 0 k h z ：调制幅度，o 5 0 g ；温度，室温；扫描时间：8 5 s 。 清除率计算：清除率：旦出。1 0 0 月。 式中：h o ：d p p h 溶液在测定条件下的峰高( 信号强度) h i ：加入啤酒后d p p h 溶液在测定条件下的峰高( 信号强度) 2 3 结果与讨论 2 3 1 反应体系的确定 2 3 1 1 最大吸收波长的确定 按方法1 3 操作，配制一定浓度的d p p h 乙醇溶液，于不同波长处测定吸光度， 结果如图2 1 所示。 l4 1 2 1 型08 采 罾o6 04 o 2 0 2 0 03 0 04 0 05 0 06 0 07 0 0 波长n m 倒2 1d p p h 在不同波长下的吸光度曲线 l2 l o8 型 絮o6 聋 一 04 02 0 0 0 0 5 0 1 o1 5 d p p h 溶液浓度m m 0 1 几 图2 2d p p h 在5 1 7 n m 处的吸光度标准曲线 由图2 一l 可知，d p p h 乙醇溶液分别在3 3 0 n m 、5 1 7 n m 波长处有最大i 殁光度f 曲 线i ) ，添加了一定量抗坏血酸( 曲线l i ) 后两个吸收峰的吸光度均有所降低，但由于 在5 1 7 n m 处的降低幅度更为明显，与文献报道一致【2 5 础】，选用可见光5 1 7 n m 处的 第二章d p p h 分光法的建立 吸收值来表示d p p h 含量的变化。 2 3 1 2 d p p h 浓度标准曲线 配制不同浓度的d p p h 乙醇溶液，在5 1 7 n m 处测定吸光度，结果如图2 2 所示。 由图2 2 可知，在1 o 1 0 一1 0 1 0 4 m o l l 的浓度范围内d p p h 乙醇溶液与吸光 值之间呈线性相关，回归方程式为y = 1 0 4 6 8 x + 0 0 0 3 ，r 2 = 0 9 9 9 7 。即可采用比色 分析手段，通过溶液颜色变化来量化抗氧化剂对d p p h 的清除作用。结合成本考虑， 选定d p p h 乙醇溶液的终浓度为5 o 1 0 m o l 几。 2 3 1 3 样品稀释率的确定 由于啤酒老化过程中势必消耗抗氧化物质，即对同一本底啤酒而言，老化程度 高的啤酒所含抗氧化物质应当少于新鲜啤酒，所以考察不同啤酒的老化程度与 d p p h 清除率之间的线性，作为反应条件的选取标准。 实验中发现，啤酒对d p p h 具有极强的清除作用，几乎在加入样品的同时d p p h 溶液紫红色消失：但反应液变浑浊，甚至有沉淀出现。通过稀释，调节啤酒在反应 体系中的量，可以解决上述问题。 对取分别经强制老化f 6 0 1 0 、2 、4 、6 d 的啤酒1 o o 、0 5 0 、0 3 3 、0 2 5 、o 2 0m l ， 用去离子水稀释并定容至1 0m l ，稀释倍数分别为1 0 、2 0 、3 0 、4 0 、5 0 倍。按2 2 3 1 法测定清除率，结果如图2 3 所示。 9 0 薄 篮 蜒 oz468 强制老化时间d + 稀释l o 倍一稀释2 0 倍+ 稀释3 0 倍 + 稀释4 0 倍一稀释5 0 倍 图2 3 稀释率对自由基清除率的影响 随着酒液稀释率的增加，不同老化程度的啤酒与自由基清除率之间的相关性有 下降的趋势，其一分别为0 9 9 2 3 、o 9 9 3 9 、o 9 5 2 0 、0 9 4 8 8 和o 8 4 2 9 ，而稀释倍数 为2 0 时，啤酒的老化时间与对d p p h 自由基的清除率之间的相关性最大：随稀释 倍数增大，系统误差也随之被放大，因而高稀释度时的相关性较差：若稀释倍数过 小，则可能出现底物过剩的情况。 最终确定体系配比为：除气啤酒稀释2 0 倍后取2m l 与2m l o 1m m o l l d p p h 乙醇溶液加入同一具塞试管。 2 3 1 4 反应温度及反应时间的确定 一 阳 驰帅m 0 江南大学硕：e 学位论文 对大部分反应而言，温度是一个影响非常大的参数。取强制老化0 、2 、4 d 的啤 酒，稀释后按2 2 3 1 方法于0 、2 0 、4 0 下分别反应1 5 m i n ( 图2 - 4 ) 和3 0 m i n ( 图2 5 ) 。 r _ - 1- 8 5 鼍8 0 薹7 5 7 0 6 5 6 0 5 5 j 0 0lz3 4b o12345 强制老化时间d 强制老化时间d 一0 c 一2 0 一4 0 一0 一2 0 r 一4 0 图2 4 反应温度的影响( 1 5 m i n )图2 5 反应温度的影响( 3 0 m i n ) 在相同反应时间下，反应温度越高d p p h 清除率越高，但不同老化程度啤酒间 的差异不如低反应温度下明显：对于相同反应温度的样品，延长反应时间，也会加 大d p p h 清除率，这种增加效果对反应温度低的样品来说更明显。这是因为高反应 温度促使反应速率加大，反应能较快达到终点，而此时较低温度下的反应尚不完全。 从区别老化程度的角度讲，低温长时对本反应有利，与老化程度的线性相关性 也说明这一点f 表2 1 ) 。 表2 1 不同反应条件下清除率与老化群度间的线性相关性 初步确定反应温度和反应时间分别为：0 ，3 0 m i n 。 2 3 1 5 反应显色体系的稳定性 有报道称d p p h 自由基暴露在空气中能稳定存在3 0 m i n ，因此d p p h 自由基是 一种比较稳定的自由基，但我们仍需考虑是否在反应时间内存在自身衰减的问题。 将d p p h 乙醇溶液置于o 空气下，测定其吸光度a c ，结果见表2 2 所示，d p p h 乙醇溶液的吸光值在3 0 m i n 内保持不变，表明该显色体系在反应时间内稳定。 表2 2 时间对d p p h 乙醇溶液吸光度的影响 2 3 1 6d p p h 自由基清除率与啤酒抗氧化能力的关系 通过上述实验，确定了d p p h 分光法的具体操作为：除气啤酒稀释2 0 倍，吸 取2m l 移入装有2m l 0 1m m o i l d p p h 乙醇溶液的具塞试管中混匀，o 静最3 0 m i n ，于5 1 7n m 处测吸光度。 帅 帅踮加陆弱舳 _j6醑堑娶 第二章d p p h 分光法的建立 取同一批次啤酒6 瓶，按上法操作，测定其d p p h 清除率( 图2 6 ) 。啤酒6 0 强制老化0 西d ，取出后迅速冷却，测定其清除率如图2 7 所示。 123456 编号 9 4 9 2 9 0 羹8 8 蓬8 6 8 4 8 2 8 0 强制老化时问d 图2 6 同批次啤酒的d p p h 清除率图2 7 老化时间与自由基清除率的关系 同一批次啤酒的d p p h 清除率基本相近，说明该值具有一定的稳定性：随着老 化时间的延长，啤酒抗氧化物质的减少，啤酒的自由基清除率均不断下降，同时两 者之间有较高的线性相关性( 其r 2 为0 9 9 6 3 ) ，表明利用d p p h 清除率可以很好地表 示啤酒的抗氧化能力。 2 3 2 分光法与电子自旋共振法的对照 c 0 n t r 0 2 d o d 哂妒 r t t i 一1 r r t 1 3 3 5 03 4 0 0 3 4 5 0 3 5 0 03 5 5 03 6 0 0 磁场g 图2 8 添加啤酒前后d p p h 溶液的e s r 谱 电子自旋共振( e s r ) 法是唯一可以直接定量测定自由基的方法，本实验通过对 d p p h 溶液的e s r 测定，来考察添加啤酒前后d p p h 自由基含量的变化，以便更清 晰地看出啤酒所含的抗氧化物质对d p p h 自由基的清除效果。 5；阳如m 0 江南大学颁：l 。学位论文 图2 8 显示了添加啤酒前后d p p h 自由基的e s r 谱，由上而下依次为：未加啤 酒、添加老化4 d 、2 d 、0 d 啤酒后的d p p h 溶液。d p p h 自由基的e s r 谱是典型的 五线谱，中心磁场3 4 7 5 g ，以中间谱线的峰高代表信号强弱即自由基含量多少。上 述4 个样品的峰高分别为：1 1 2 8 0 、5 8 6 0 、6 7 2 0 、7 2 8 0 ，按2 2 3 2 计算得老化0 、2 、 4 d 的啤酒对d p p h 清除率分别为4 8 0 5 、4 0 4 3 、3 5 4 6 。d p p h 自由基信号强 度( 峰高) 在添加啤酒后有明显减弱，说明d p p h 自由基被啤酒( 所含的抗氧化物质) 清除；越新鲜的啤酒的清除效果越好，随老化程度的加剧，自由基清除效果减弱； 意味着在啤酒发生老化的同时，部分抗氧化物质被消耗用于抵抗老化进度。 将对应的同一批次啤酒强制老化o 4 d ，再用分光法测定d p p h 清除率，对比 e s r 法和分光法的结果如图2 9 所示。 6 0r _ 一 羹篡= 二 蓬3 。：。j 。 幽2 9 两种方法测定d p p h 清除率的对比 通过对比可以发现两种方法测得的清除率变化趋势相同，均随老化程度的上升 而下降，证明分光法颜色变化的根源的确在于啤酒对d p p h 自由基的清除。当然 e s r 法的灵敏度优于分光法，所以曲线下降幅度不同，但考虑到分光法操作简便， 使用仪器少，测定快速，因而比e s r 法相具有更高的实用性。 2 4 本章小结 2 4 _ 1 确定啤酒对d p p h 清除率的测定条件为：除气并用去离子水稀释2 0 倍的啤 酒，吸取2m l 移入装有2m l 0 1m m o l l d p p h 乙醇溶液的具塞试管中混 匀，0 冰水浴静置3 0 m i n ，于5 1 7 n m 处测吸光度，计算自由基清除率。 2 4 2 随着啤酒老化程度的增加，啤酒对d p p h 自由基的清除率不断下降，且两 者之间表现出较高的线性相关性，r 2 一o 9 9 6 8 ，利用该方法可以有效地评 价啤酒的抗氧化能力。 2 4 3 利用分光法测定啤酒对d p p h 清除率的结果与电子自旋共振法测定结果的 变化趋势一致，说明分光法具有一定的准确性；虽然在检测的灵敏度上稍 次于后者，但该法操作简单，使用仪器少，测定快速，有较高的实用价值。 第三章生产原料与工艺条件对啤酒中自由基及抗氧化力的影响 3 生产原料与工艺条件对啤酒中自由基及抗氧化力的影响 3 1 引言 目前认为啤酒老化风味形成机理包括以下几点：( 1 ) 高温影响：( 2 ) 类酯降解作用； ( 3 ) 自由基反应；( 4 ) 与异萑草酮有关的反应；( 5 ) 醇醛缩合；( 6 ) 自然抗氧化的保护影 响。这些反应分布于麦芽的干燥、麦汁的糖化、过滤及煮沸过程、啤酒的发酵以及 成品啤酒的灌装和巴氏杀菌的过程中，也就是说，啤酒生产过程的每一步都会或多 或少地产生一些老化物质，再加上原料对啤酒的风味及风味稳定性也有一定的影 响，可以认为，啤酒酿造的全过程，从原料的选择开始，到糖化、发酵工艺的确定， 无一不对啤酒的品质和风味稳定性有巨大的影响。 虽然国外的研究者已对啤酒风味稳定性这个课题上进行了多年研究，也有文献 报道了麦汁糖化过程中部分老化物质的形成途径，但迄今为止，尚无研究者从啤酒 生产全过程的角度出发，系统、全面地考察自由基和抗氧化力在啤酒生产过程中的 变化及影响。 本章将对啤酒的原料和生产过程( 主要是糖化、煮沸、发酵、过滤、巴氏灭菌) 中涉及的自由基的种类、数量和变化情况进行研究，分析其对啤酒( 麦汁1 的影响， 对风味稳定性造成的影响；利用d p p h 分光法考察上述酿造过程，并着重分析过滤 阶段硅藻土的种类、铁含量、过滤时间、过滤前添加抗氧化剂等方面。 3 2 材料与方法 3 2 1 主要试剂与材料 啤酒：自酿，市售 麦芽，大麦：江苏三得利食品有限公司 2 一苯叔丁基硝酮( p b n ，纯度9 8 ) ：s i g m a 公司 d p p h ( 纯度9 0 ) ：东京工业株式会社 其它试剂( 无水乙醇、维生素c 等) 均为分析纯。 3 2 2 主要仪器 电子自旋共振仪，u v 2 1 0 0 型分光光度计，s h z 2 2 恒温水浴锅：同2 2 2 e b c 磨：d u u w 2 2 0 5 0 型，德国b u h l e r - m i a g 公司 协定糖化仪：杭州博日科技有限公司 磁力搅拌器：上海县曹行无线电元件厂 3 2 3 测定方法 3 2 3 1 麦汁( 啤酒) 中自由基的测定 将0 5 m l 除气麦汁( 啤酒) 装入离心管，外覆铝箔避光，加入p b n 溶液1 0 l ， 使其终浓度达到2 5 5 m o l l ，混匀；置于6 0 水浴中，促使自由基产生，此过程称 为培育，定时取样测定。p b n 溶液配制：4 5 1 9 8gp b n l ，溶剂为5 0 乙醇水( v ：v ) 。 江南大学硕士学位论文 e s r 测定条件：中心磁场，3 4 7 5 0 0 g ；微波功率，2 0m w ；微波频率，9 7 g h z 调制频率，1 0 0 l ( h z ；调制幅度，1 0 0 g ；温度，室温；扫描时间，1 6 7 7 7 2 s 。 3 - 2 3 2d p p h 清除率的测定：同2 2 3 2 3 2 3 3 糖化曲线：如图3 1 所示。 1 0 0 l o o 9 0 8 0 p 售7 0 三 6 0 5 0 4 0 o2 55 07 51 0 01 2 51 5 0 图3 1 糖化工艺曲线 3 2 3 ，4t b a 值测定【2 9 】 5 m l 啤酒在1 0 0 0 0 r m i n 下离心1 0 m i n 后，弃去沉淀物，加入2 m l 含0 3 3 硫 代巴比妥酸的5 0 乙酸溶液，混匀后于6 0 水浴中精确加热6 0 m i n ，速冷。以5 m l 离心后的啤酒加2 m l 蒸馏水为空白，5 3 0 n m 下吸光度即为t b a 值。 3 2 3 5 固体样品自由基的测定 取一定量样品置于e s r 仪谐振腔，e s r 测定条件：中心磁场，3 4 7 6 0 0 g ；微波 功率，3 9 8 5 m w ；微波频率，9 7 g h z ；调制频率，1 0 0 k h z ：调制幅度，2 0 0 g ；温 度，室温；扫描时间，8 3 8 8 6 s 。 3 2 3 6 铁离子测定：干法消化后用原子吸收法测定。 3 2 3 7 模拟过滤 在5 0m l 经脱脂棉过滤的啤酒中加入一定量硅藻土，磁力搅拌2 0m i n ，静置4 0 m i n ，滤纸过滤除去硅藻土，滤液待用。 3 2 3 8 色度测定【2 9 】 3 - 3 结果与讨论 3 3 1 酿造过程抗氧化力变化 利用d p p h 分光法考察了整个酿造过程的抗氧化力变化( 麦汁统一折算成1 1 。 p ) ，如图3 2 所示，横坐标1 6 分别代表糖化开始、糖化结束、煮沸开始、煮沸 结束、发酵1 天、发酵结束。 在酿造过程中可以发现，随糖化的进行，持续高温促使麦汁的d p p h 清除率下 降，从糖化初期的9 3 降至糖化结束8 7 1 7 ，下降6 2 7 ；煮沸时的高温使得抗 1 4 第三章生产原料与工艺条件对啤酒中自由基及抗氧化力的蟛响 氧化物质进一步减少6 o ；发酵时酵母代谢旺盛，产生了具有抗氧化能力的物质 如s 0 2 等，在发酵1 d 后清除率有明显的上升，发酵结束有所下降。 9 4 9 2 芝9 0 * 蟹 安8 8 8 6 8 4 图3 2 酿造过程抗氧化力变化 9 4 9 2 芝9 0 辞 篮 蜒8 8 8 6 8 4 9 4 9 3 j 芝 9 3 耋9 25 9 2 9 l5 9 l 圈3 3 糖化过程抗氧化力变化 l2345 o2 4 4 8 磊蒜舻1 6 8 2 0 9 2 3 3 图3 _ 4 煮沸过程抗氧化力变化圈3 5 发酵阶段抗氧化力变化 图3 3 为糖化过程，横坐标1 5 分别代表并醪，6 3 保温，7 0 保温，7 0 保 温，过滤5 个阶段，麦汁按1 1 。p 计算，整个糖化过程抗氧化力一直呈下降趋势； 图3 4 为煮沸过程，亦按1 1 。p 麦汁计算，从煮沸开始至结束历时8 0 m i n ，间隔2 0 m j n 取样( 横坐标1 5 分别代表煮沸o 、2 0 、4 0 、6 0 、8 0m i n ) ，发现在煮沸的过程中 d p p h 清除率一直下降，在5 0 m i n 时添加酒花的一组麦汁的d p p h 清除率有大幅回 升，说明酒花中的抗氧化物质能很大程度上提高麦汁的抗氧化能力；图3 5 显示发 酵过程的变化情况，定时取样测定，发酵液的整体清除率高于麦汁，发酵第1 天上 升迅速，中期保持平稳，后期略有下降。 3 3 2 酿造过程中的典型自由基 利用自旋捕集技术可以延长短寿命自由基的存在时间，以便进行e s r 测定，其 原理是利用自旋捕集剂( s p i nt t a p p i n gr e g e n t ) 与自由基反应生成相对稳定的自旋加合 物，通过测定该加合物来表征原自由基。本论文采用的自由基捕集剂是2 苯叔丁基 硝酮( p h e n y l t e n - b u t y n i t r o n e ，简称p b n ) 。自由基含量多少表现在波谱上即为信号强 江南火学硕士