（发酵工程专业论文）低产高级醇酿酒酵母菌株的选育.pdf

学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的 研究成果。除文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包括任何其他个人或集 体已经发表或撰写的成果内容。对本文研究做出重要贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名： 日期：年月日 专利权声明 本人郑重声明：所呈交的论文涉及的创造性发明的专利权及使用权完全归天 津科技大学所有。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名： 日期：年月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权天津科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密 1 ( 请在方框内打v ”) ，在年解密后适用本授权 书。 本学位论文属于 不保密圈( 请在方框内打“v ”) 。 作者签名：互鹏弧 日期：7 年( l 月 导师签名：日期：年月 日 日 且基本发酵性能优良的突变株，考察了突变株的耐酒精、耐高温和耐高渗性能，最终确定了 株最佳菌株并进行了5 l 罐放大试验。 对生料和熟料酿酒这两种发酵工艺进行了比较，结果表明熟料酿酒发酵速度较快，残糖 较低，而生料酿酒淀粉出酒率及原料出酒率较高。运用保留时间法定性和内标法定量分析了 酒样中的高级醇，结果表明异戊醇含量为高级醇总量的5 0 以上，熟料发酵酒样总高级醇含 量和异戊醇含量均比生料发酵酒样中的含量要高的多。因此，在玉米原料熟料发酵生产白酒 中，必须降低高级醇的含量尤其是异戊醇的量，严格控制在合适的范围内，从而提高酒的风 味。 对6 株酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v s a e ) 菌株进行发酵实验，测定基本发酵性能和高 级醇的生成情况，筛选出发酵速度快、残糖含量少、酒精度高、高级醇生成量少的a y - 1 5 作 为出发菌株。以高级醇代谢途径为理论依据，采用低能n 离子注入选育出1 9 株亮氨酸营养 缺陷型菌株，通过发酵试验表明：与出发菌株相比，有6 株突变株高级醇生成量明显降低， 高级醇总量减少量最高达4 1 4 1 ，异戊醇减少量最高达5 9 4 1 ，其中菌株a 7 1 3 、w 1 3 0 和 x 2 1 2 的高级醇总量减少量和异戊醇减少量均在3 0 以上；菌株a 7 1 3 、b 9 9 、f f l 7 发酵性能 与出发菌株a y - 1 5 基本相当，而菌株m 6 2 、w 1 3 0 和x 2 1 2 发酵性能较出发菌株a y - 1 5 有所 降低。 通过耐性试验表明，这6 株突变株的耐性较出发菌株均有所变化。x 2 1 2 和m 6 2 的耐酒 精能力最强，可达到2 w k v v ) ，其次为a 7 1 3 ，耐酒精度达1 8 0 , ( v v ) ，均比出发菌株a y - 1 5 有所提高；耐渗发酵试验表明a 7 1 3 和b 9 9 耐高渗发酵性能最好，在3 5 9 1 0 0 m l 糖浓度下均 能正常发酵，比a y - 1 5 有所提高；a 7 1 3 和b 9 9 耐高温发酵性能最好，在3 8 高温下还能保 持优良发酵性能，较3 0 时变化不大，其耐高温性能与出发菌株a y - 1 5 基本相当。 综合考虑高级醇生成量、发酵性能和耐性等因素，确定a 7 1 3 为最优菌株。将突变株a 7 1 3 进行5 l 罐发酵试验，并与出发菌株作比较，结果表明，与出发菌株a y - 1 5 相比，突变株a 7 1 3 酒精度提高3 4 2 ，异戊醇降低3 9 3 1 ，总高级醇生成量降低3 3 6 5 ，但发酵周期略有延 长。 本论文选育出了低产高级醇酿酒酵母，对在高温和高渗发酵条件下液态法发酵生产优质 白酒有重要意义。 关键词：酿酒酵母；高级醇；发酵性能；离子注7 、 a b 警u l c t ht h ep a p e r , ac o m p a l 砸v er e s e a r c ho np r o d l c t i o no fl i q u o rf r o mu m 加k e da n d0 0 0 k e dr i c e w a sc a r r i e do u t , n + i o nw a su s e dt os 咖y e a s tw i t hl o wy i e l do fh i 孚l 盯a l c o h o l sa n db e t t e r f e r m e n t a t i o nd 3 a r a a e f i s t i c s , m o r e o v e r , e t h a n o lt o l e r a n c e , o s m o - t o l e r a n c ea n dt h a 田1 ( 卜1 1 0 i e 翻n c e0 f m u t a t i o n 蚰：a i 璐w 讹i i i v 诫鲥t o o , f i m u y , t h eb e s t 蛐w 弱s l 比t e da n df c d - b a t 出f e r m e n t a t i o n w a se x p e r i m e n t e di n5 1 , f e r m e n t o rf o ri t 。 ac o m p a r a t i v em s c a r d lo np i o d u c t i o no fl i 釉o ff r o mu n c o o k e da n da x ) k e dr i c ew a s i n v c s t i g = e d , t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tf e r m e n t a t i o nr a t ew a s 丘s 呀锄dr e s i d u a l # u c o i sl o w e ri n l i q u o ro f c o o l 湖m a t e r i a lf e r m e n t a t i o nt h a nt h a ti nu n c 加k e dm a t e r i a lf a m c n t a t i o n h o w e v e r , o u l p u t l a t eo fs t a r c ha n di a wm a t e r i a l s 憾h i g h e ri nu 瑾x 日k e dm a t e r i a lf e r m e n t a t i o n a r c a - i n t a n a l s t a n d , 蠲tm e t h o do fg cw a su s e dt od e t e r m i n et h en a t u r ea n dt h eq u a n t i t yo fh i g h e ra l c o h o l si nl i q u o r , r c 敏l l ti n d i c a t e dt h a tt h e 缸咖to f j s i 姗姐a l c o h o lw a su p w a r d so f 5 0 i nt h et o t a la m o u n to f h i g h 盯 a l c o h o l s , a n dt h a tt h e 卸田。嘣o fi s o a m y la l c o h o la n dt o t a lh i g h e ra l c o h o l si nl i q u o ro fc o o k e dr i c e w 贸e a n h i g h e r t h a n t h a t i n l i q u o r o f u m ) o o k e d r i c e t h e r e f o r e , i n o r d e r t o i m p r o v e f l a e f l a v o r o f l i q u o r o f c o o k e dr i c e , i ti si m p e r = i v et od e a e 教t h ey i e l do f h i g h e ra l c o l c s , i s o a m y la l c o h o lp a r t i c u l a r l y s i xs w a i n sw e r ee m p l o y e df o rr u m c n t a t i o nt r i a l s a y - l 5w a ss e l e a e d a sp a t e n ts a - a i nf o ri t sf a s t f e r m e n t a t i o ns p e c ：d l e s sr e s i d u a ls u g a ro o n t m gh i g h e ry i e l do fa l c o h o l , l e s sy i e l do fh i g h e ra l c o h o l s u n d e rt h ei n s t m a i o no fm e t a b o l i cc o n t r o lt l x x 眄, 1 9l _ e u s l z a i mw e r es d e a e da f t e rn i o nt r e a t m e n t t ot h e 硭i r 嘣s t r a i na y - 1 5 t h ef e r m e n t a t i o nt r i a l si n d i c a t e dt h a ts i xs t r a i n s y i e l do fh i # l e ra l c o h o l s d e c r e a s e dd r a m a t i c a l l y , 衄p a i i n gt ot h eo d g i n a l 鼬痂，t h em o s ta m o u n to fm y la l c o h o la n d t o t a lh i g h e ra l c o h o l sw 叮ed e o e a s e db y5 9 4 1 a n d4 1 4 1 删e l y , t h ea m o u n to fi s o 锄y l a l c o h o la n dt o t a lh i 曲e ra l c o h o l so fy e a ra 7 1 3 、w 1 3 0 、x 2 1 2w e r ea l ld o 强s 。d 叩傩o f3 0 ； a n dt h a tf e r m e n t a t i o nd k 匝誓艇斑i s 6 岱o f g r a i na 7 1 3 、b 9 9 、f s l 7w e r ea l m b s ti n v a r i a b l ec o m p 雒i n gt o t h eo r i g i n a ls t r a i n , w h 骶a st h a to fs t r a i nm 6 2 、w 1 3 0 、x 2 1 2w e r e 删 t o l e r a n c et r i a l si n d i c a t e dt h a tt o l e r a n c ec h - a a e l i s t i c so fa l lt h es i xs t r a i n sw 翻呤v a r i a b l e y e a s t x 2 1 2a n dm 6 2h a dt h eb e s te t h a n o lt o l e r a n c ec a p a b 丑i t ya se t h a n o lc o n c e n t r a t i o nw 撼2 0 9 ( v v gt h e b e t t e ro n ew 罄a 7 1 3 ，w h i c hc a ng 阳w t hn o r m a la se t h a n o lc o n o m t r a t i o nw a s1 8 ( v 咻t h e s et h r e e s w a i n s e t h a n o lt o l e r a n c ew c i ea l lb e t t e rt h a na y - l s ；t h eb e s to s m o t o l e m 啦s t r a i n s ，e 犯y e a s t a 7 1 3a n db 9 9 , w h i c hh a dn o r m o lf e r m e n t a t i o nd 均矗屺l i 幽a ss u g a ra 跚x 魍叫矗i t i 肌w a s 3 5 9 1 0 0 m l ；i na d d i t i o n , t h et h e r m 0 4 0 l e m n c e t e s ti n d i c a m it h a ty e a s t 4 , 7 1 3a n db 9 9h a dt h em o s t e x c e l l e n tt h e r m o - t o l e r a n c ec a p a b i l i t y , t h e r ew a sl i t t l ec h a n g ei nf e r m e n t i n gp e 俩嘶吡a 峨f o ra 7 1 3 a n db 9 9s w a i n sa st h et e m p r e t u r ew a sa t3 8 u o ra t3 0 0 c o n s i d e r e dt h e y i e l d o fh i g h e ra l c o h o l s 、t o l e r a r c ed 比匿烈为贸i s 缸圆a n df e r m e n t a t i o n c h a m c t e r i s t i 岱, a 7 1 3 磷l a i nw a ss l c a e da st h eb e s t 伽e a 7 1 3a n da y - 1 5w a et e s t e di n5 lt a n k , t h e r e s u l t si n d i c a t e dt h a to m n p a r e dw i t ha y - l 5 ，a 7 1 3 e t h a n o lp r o d u c t i o ni n 口e a s e du pt o3 4 2 ，a n d t h ea m o u n to fi s o a m y la l c o h o la n dt o t a lh i g h e ra l c o h o l sw 明弓d e c r e a s e dt o3 9 3 1 a n d3 3 6 5 r e s p e c t i v e l y , h 0 喝i t sf a 皿肋妇删w 签i n 蹦戚 t a e 韶f 洒m e n t 筑陀即l o das t r a t aw i t hl o wy i e l do fh i g h e ra l h o l s , w h i c hw a sq u i t e 瓯酽曲b 缸蕾dy i e l d 锄l h 璐i a l 蛳w i l h 捌r 妣a t h i g h t e i 田i 葶盈n e 锄dh i 曲s u 萨0 0 舭 k 眄w o r d s ：s a c c h a r o m y c e sc e r e v s a e ， i 1 1 】p l a 】删 目录 1 前言。1 1 1 酿酒工业概况1 1 2 高级醇对酒风味的影响1 1 3 酵母发酵过程中高级醇的形成与控制2 1 3 1 高级醇的形成机理。：2 1 3 2 影响发酵过程中高级醇含量的主要因素及控制o 。4 1 4 高级醇代谢控制育种的研究进展5 1 4 1 传统育种方法5 1 4 2 基因工程育种方法6 1 5 离子注入诱变育种8 1 5 1 离子注入诱变原理及特点8 1 5 2 离子注入在微生物中的应用9 1 6 本课题的立题依据及研究内容“9 1 6 1 本课题的立题依据j 9 1 6 2 本课题的研究内容。1 0 2 辛才料与f 方法。一。一。一。一。1 l 2 1 材料与仪器1 1 2 1 1 菌种1 1 2 1 2 主要试验材料。j 1 1 2 1 3 主要试验仪器1 2 2 1 4 主要溶液。1 2 2 1 5 培养基。1 3 2 2 分析方法1 4 2 2 1c 0 2 失重的测定1 4 2 2 2 还原糖和总糖的测定。1 4 2 2 3 酒精度的测定1 5 2 3 实验方法1 5 2 3 1 气相色谱法分析白酒中风味物质。1 5 2 3 2 酿酒工艺1 7 2 3 3 生长曲线的绘制。1 7 2 3 4 离子注入诱变处理1 8 2 3 5i 肌菌株筛选方法1 8 2 3 6 酵母耐性试验：1 9 2 3 75 l 罐发酵试验1 9 3 自占果与讨专仑。一。一。2 1 ， 3 1 气相色谱法分析高级醇条件的确定。2 1 3 1 1 柱温对物质出峰的影响。2 1 3 1 2 载气流量对物质出峰的影响2 3 3 1 3 其它操作条件的选择2 5 3 1 4 气相色谱仪准确度的测定2 6 3 1 5d 、结2 7 3 2 生料酿酒和熟料酿酒工艺的比较2 7 3 2 1 发酵速度和发酵成熟醪的比较2 7 3 2 2 高级醇类物质的分析和比较2 8 3 2 3d 、1 2 ；3 1 3 3 出发菌株的选育3 1 3 3 1 不同菌株发酵发酵性能的比较。3 1 3 3 2 不同菌株高级醇生成量的比较。3 2 3 3 3d 、l ；占3 ：i 3 4 矿离子注入诱变育种3 3 3 4 1a y 1 5 菌株生长曲线的绘制3 3 3 4 2 矿离子注入诱变效应的研究3 4 3 4 3 低产高级醇菌株的筛选3 5 3 4 4d 、! 右3 8 3 5 突变株耐性试验3 8 3 5 1 耐酒精杜氏管试验。3 8 3 5 2 耐高渗杜氏管试验4 0 3 5 3 耐高渗发酵试验4 1 3 5 4 耐高温发酵试验南。4 2 3 5 5d 、结z m 3 6 菌株a 7 1 3 的遗传稳定性试验4 4 3 75 l 罐发酵试验：4 4 4 结论。一。一。一。4 5 5 展望。一一4 6 6 参考文献。一。一一一一一。一一。一。一。一4 7 7 攻读硕士学位期间发表论文情况。一一一一。一。一。一5 l 8 致谢。一。一一。5 2 天津科技大学硕士学位论文 l 前言 1 1 酿酒工业概况 酒文化在五千年中华文化发展史中起着积极的作用，同时对人类文明的发展有着巨大的 影响【u 。在其漫长的发展过程中，中国酒类的酿造也形成了独特的风格用，这种特征是以霉菌 为主要微生物的酒曲为糖化发酵剂，经复式发酵、固态或半固态发酽】进行酿制，这特点 也是东方酿酒业的典型特征。随着人们生活方式的改变，白酒消费心理正在发生着悄然的变 化：从高度转向低度，从醇厚转向醇爽，从大众转向个性，从应酬转向娱乐h 。这些变化初 步适应了人们健康文明饮酒观念的变化，促进了酿酒技术的进步，直接影响着市场的各种白 酒品类的消费，启迪人们去寻找白酒消费的新热点。白酒的变淖| 方向应谚提期排统工艺生 产精华，口味由辛辣向剩啊 转变，酒度由高度向中低度和超低度转变，香味由浓烈醇厚向淡 爽醇净转变，成份众多向相对纯净卫生转变，并可做到可随意加冰加水或与其他饮料混饮。 我国现在的白酒、低度酒( 含酒精加枷) 相对于啤酒、葡萄酒以及国外的些洋酒， 其酒精含量仍然较高。有资料显示，低度酒的销量占据了市场份额的半以上，而且有进一 步发展的趋势。随着酒行业的普遍发展趋势，降低酒品的酒精含量以及将香味成份的含量调 整到适宜的水平，既有社会效益又有健康效益。 1 2 高级醇对酒风味的影响 酒的风味物质，除了极少量的无机化合物( 固形物) 之外，绝大部分是有机化合物，均 具有挥发性，并且都具有呈香呈味的特定基团。这些风殊物质是构成酒典型特征的物质基础。 它们以一定的比例共存于酒体中，互相配合、补充、衬托和制约，发挥各自的特点形成不同 香型和不同风格的酒。其中主要的挥发性风殊成分包括醇、酯、酸、醛酮等化合物。 高级醇俗称杂醇油，是具有三个碳链以上的价醇类，包括正丙醇、异丁醇、异戊醇、 活性戊醇、苯乙醇、色醇等。高级醇是酵母发酵过程中生成的重要副产物，与酵母合成细胞 蛋白质有关，大约8 0 的高级醇是在主发酵期间随酵母繁殖而形成，也就是酵母在合成细胞 蛋白时形威罔。高级醇是形成酒风味和口感的主要成分之一，它对形成酒的风味和促使酒体 丰满、浓厚起着重要的作用网。高级酵是醇甜( 更高的境界是绵甜) 和助香剂的主要物质来 源，是酯类物质和酸类物质的桥梁( 酸醇酯化反应生成酯) 。适宜的高级醇含量及各种高级 醇之间的协调比例可使酒的口感柔和协调、酒体丰满圆润和味道独特。但如果白酒中根本没 有或十分缺少高级醇的话，酒味将变得十分单调淡薄。当含量过高时与酸、酯等成分比例失 调，会使白酒产生异杂味，破坏酒体及风味的协调，影响酒的口感。因此，高级醇的含量! 凶 须控制在合适的范围内。般情况下，啤酒中高级醇含量标准值为：下面发酵啤酒印- 9 0 m 虮。 上面发酵啤酒小于1 0 0 n 吲l o 研究表明，高级醇含量超过1 0 0 毗会使啤酒口味和受欢迎程 度明显下降。啤酒中高级醇含量过高就会影响啤酒的风味和口味，近代用高温发酵、快速发 酵菌株酿造啤酒，高级醇含量常常超过1 0 0 m i 儿，饮用后易“上头，对人体有很大伤害闭。 黜p p 和m 咖发现在葡萄酒中总的高级醇含量在8 瞻5 4 咖叽之间网，含量达3 0 蚴时 1 前言 会产生令 愉快的风味，当达到4 0 0 m g 压以上时就产生刺激的口厦秽。蒸馏酒中高级醇含量 较高，我国固态发酵法白酒中高级醇含量_ 般为5 0 - 1 8 0 m g 1 d m l 。小曲液态发酵法白酒中 为a ) - - z s 0 m 矾0 0 m l ，白兰地1 0 0 讹酊l ，威士忌s 0 - l 触1 0 0 m l ，老姆酒 0 s 2 0 0 m g l ( d m l , 日本磁酒3 1 7 蚴0 响l i l u j 。 在高级醇的组成分e ，各种酒中高级醇种类以及含量都不样，可以说几乎所有蒸馏酒 中异戊醇都占据首位。中国传统的固态发酵法白酒中高级醇含量依次为异戊醇、正丙醇、异 丁醇三大种，在浓香及酱香型酒中还有一定量的正丁醇，有的清香型酒异丁醇大于正丙醇。 在特香型酒中正丙醇含量出众。b _ 苯乙醇在豉香型酒中含量最多，比其它蒸馏酒都多。国外 其它蒸馏酒高级醇成分含量大体依次为异戊醇、异丁醇、活性戊醇和正丙醇，只有重型朗姆 酒是以正丙醇为首，其次为异戊醇、异丁醇、活性戊醇。白兰地、威士忌等蒸馏酒中异戊醇 与异丁醇的比值威士忌为1 2 ，日本烧酒2 - 4 ，白兰地3 - 6 。 各种高级醇离洧各自的香气和口味( 贝表1 1 ) ，因此，高级醇 之间的平衡也非常重要， 当某一高级醇含量过高时会产生不良作用，例如异岗擎渤过阈值时会使人感到头疼；正 丙醇含量超过总高级醇的加则会产生不良口味并易“上头 ；雎苯乙醇是种芳香族高级 醇，有种郁闷的玫瑰花香味，在接近阈值时，有脂洋的酸味，超过其阈值时，将协同其它 高级醇而使酒产生不良风味；色醇超过阀值时给人以微苦味和轻微的苯酸味。 表1 1 酒中常9 嗽及其显昧特征 t a b 忙1 1c o m m o na l c o h o l si nw i n ea n dt h e i r 曲瞰翟钯r i ! 缸岱o f f l a v o r 1 3 酵母发酵过程中高级醇的形成与控制 1 3 1 高级醇的形成机理 1 3 i 1 分解途径( e h d i c h 代谢途径) 最早在1 9 0 7 年，德国化学家埃尔利希( f e l i xe h r l i s h ) 提出高级醇形j i 5 滞i 理：这些醇类 是原料中的蛋白质经过分解发酵生成的i l l 】i 。经过不断修正完善，现- - j - 归纳为：有十科尝【基酸， 天津科技大学硕士学位论文 在发酵晡鞯印巨躺驰砉转移到a 酮戊二酸上，形成谷氨酸和a - 酮酸，后者经脱羧、还原，形 成比原来氨基酸少个碳的高级醇。如图1 1 所示。 萎坠r c h ，n h l c o o h + r c o c o o h 嘞甚h o r c h ，o h r c 一 ：= 二= n a d h * rn d 根揖此反应柳制，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸等转化为相应的高级醇。氨基酸与相应的 高级醇的关系见表1 - 2 所示。 表1 - 2 氨基酸代澍产物与相应高级醇 t a b l e1 - 2a m i n oa c i dn 譬舡出o l j k 锄di t s 嗍h i g h e ra l c o a l 1 3 1 2 合成途径( h a r r i s 途径) 在1 9 5 3 年哈里斯( h a r r i s ) 研究并提出了高级醇由糖代谢通过丙酮酸合成的途倒翊，即 葡萄糖经e m p 途径和t c a 循环及其它的中间产物合成氨基酸的途径中形成中间体a 酮酸， 进_ 步还原形成相应的高级醇，如图1 - 2 所示。有研究已经证明丙醇、异丁醇、异戊醇和活 性戊醇分别是由糖在合成分支链氨基酸的过程中形成的1 t 3 - 1 6 1 前言 d h z i 醛_ 乙醇 异丁尊 脱羧酶，一。岛a d h + n a d h e 御 ltppc啦pm协 i_ 葡萄糖丙酮硬叫h 一乙璇乳酸一吨- 酮基异戊馥异丁匿 ll 脱黼 转氮舅悄飓 正丙醇 缬氯酸 图i - 2i - l a r r i s 途径 ：f嘻i-2 i - l a n i sp s s s w a y 二 在培养基中缺乏某些所需氨基酸时，由糖通过合成途径生成所需的氨基酸，但在合成氨 基酸过程中，如果遇到培养基中氮源不足，不能供其全部氨基化，则在合成过程中生成大量 的酮酸，经脱羧、还原，产生高级醇，而不进行合成新的氨基酸。 1 3 1 3 两条代谢途径对高级醇形成的贡献 j 两条途径对高级醇形成的贡献大小是不同的，受培养基中可同化氮源的组成和含量水平 的影响。在可同化氮源缺乏时，细胞内会走生化合成途径合成氨基酸，此时会形成高浓度的 高级醇；随着可同化氮源浓度的升高，高水平的氨基酸会反馈抑制氨基酸生化合成途径中酶 的活性，从而降低了高级醇在合成途径的形成量，同时从分解代谢途径形成的高级醇量增加。 因此可以说高级醇最终的生成量是两条代谢途径随着培养基中可同化氮源的增加而逐渐平衡 的结果。除了匕述调节模式外，有人认为两条途径对高级醇形成的贡献量还随高级醇种类不 同而异，随着高级醇的碳原子数的增加，合成途径对其生成量的影响会逐渐减少。c n x ，w e l l 等于1 9 6 1 年指出，正常发酵中7 5 的高级醇来自糖代谢，2 5 来自氨基酸脱羧还原生成。 i _ 3 2 影晌发酵过程中高级醇含量的主要因素及控制 。 ， 1 3 2 1 原料的影响 酿酒原料对高级醇的生成有很大影响，蛋白质含量高则高级醇生成量就高，因此优质的 酿酒原料要求蛋白质含星b 看b 曼，。我国白酒主要生产原料为高粱、玉米、大米、小麦、大麦 和薯干，其中玉米、小麦和大麦蛋白质撇高，可达到1 0 - 1 2 ，因此，以这些为主要原 料酿造的酒高级醇含量就高，而高粱和大米中蛋白质含量较低，般为6 8 ，因此以高粱 和大米为主要原料酿造出的酒就不会存在高级醇含量高的问题。 1 3 2 1 酵母菌种的影响 优质蒸馏酒源于良好的发酵，酿酒酵母则是发酵的灵魂和命脉。酵母的质量直接影响到 酒的质量，如何保证酵母具有良好的生理性能，就成了保证酒质量的关键。高级醇的形成是 酵母代谢的必然产物，高级醇的生成量不仅随着培养条件的改变而变化，还与酵母菌的科t 类 有密切关系【嘲。酿酒酵母各菌种之间，高级醇生成量差异高达5 0 , - - - , 1 0 0 。 1 3 2 - 2 酵母在发酵中增殖倍数对高级醇形成的影响 高级醇是酵母啥傲细胞蛋白质时形成的副产物。因此，酵母增殖倍数越大，形成的高级 适当限制酵母在发酵中最 笳劈黻，缩短发酵周期，但也促进了酵母的繁殖，相应增加了高级醇的含量。o u g h ，g u y m o n 和o - o w e l l 等认为发酵温度影响高级醇的合成，在温度高时异戊醇合成最多，正丙醇合成最 少，他们从试验中还得知发酵温度的变化可提高异戊醇的形成量，对异丁醇和正丙醇无显著 影响p g 。a r i al c , - a r d a 等人通过研究，建立了套酿酒发酵过程的动力学模型，对在不同温度， 不同p h 下高级醇的产量进行了描述，通过这套模型可以对蒸馏酒发酵过程进行预测网。 1 3 2 4 控制高级醇的方法 高级醇是酵母发酵的副产物，含量过高时很难除去。从生产工艺匕来考虑和实施，般 可从以下几个方面降低高级醇的含量：( 1 ) 控制酒醅中蛋白质的含量；( 2 ) 控制酵母的接 种量，下曲时加入酒醅的酵母越少，则在发酵过程中形成高级醇就多；( 3 ) 控制酒醅的发酵 温度和含氧量，般温度高，酒醅含氧量多都会促进发酵时高级醇的形成。另外，液态法发 酵后蒸馏时，应注意稳定操作，正确控制精塔的底温和顶温，稳定塔内存酒量，定时分油。 ” 1 4 高级醇代谢控制育种的研究进展 在酵母发酵过程中，通过控制发酵温良和接种量等发酵条怍可以控制高级醇的形成。而 根据代谢调控理论，选育高级醇生成量低的优质酵母菌株可以从根本匕减少高级醇的生成， 降低生产成本，提高酒的质量和风味。 高级醇代谢途径已经由e h r l i c h 和h a r r i s 等人提出，即高级醇可以通过分解代谢途径由氨 基酸生成，也可通过合成代谢途径由糖代谢生成。在此基础匕，各国科学家和科研工作者对 。高级醇的形成及代谢调控撒了进步的研究，并由此产生些降低高级醇产量的思路和方法。 1 4 1 传统育种方法 1 4 1 1 选育支链氨基酸营养缺陷型菌株 在e h d i c h 代谢途径中，高级醇作为氨基酸代谢的副产物，例如亮氨酸分解产生异戊醇， 缬氨酸分解产生异丁醇，异亮氨酸分解产生活性异戊醇，这些代谢都由细胞中转氨酶、酮酸 脱羧酶、还原酶等酶的活性决定，即酶活性越高，所生成的高级醇就越多。因此，根据代谢 调控原理，可以通过添加氨基酸加强反馈调节来减少高级醇的生成量，或是选育支链氨基酸 营养缺陷型菌株，使其相应氨基酸合成途径中的某些酶缺失，特别是与生成高级醇有关的酶 缺失，从而减少合成高级醇的前体物质a 酮酸的积累，以：达到降低高级醇的目的。k u n k e e 的研究表明通过添加氨基酸加强反馈调节作用并不能明显降低高级醇的形成尸】，h g r a h a m 和 g u y m o n 则验证了通过选育酵母突变菌株降低高级醇生成的可能性，他们得到的突变菌株在 富含亮氨酸的培养基中生长，异戊醇的生成量减少了9 5 ，然而由于其发酵速度大幅度降低 没能得到更广泛的应用网。 r o u s 等选育出支链氨基酸( 缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸) 营养缺陷型突变菌株，在葡萄 酒酿造中总高级醇产量比出发菌株m o n t r a c j 讶y e a s ts t r a i n 减少2 0 ，其中异戊醇产量减少 1 前言 5 0 2 3 1 。 1 4 1 2 选育乳酸脱氢酶活性强的菌株 育种思路是以酵母的干弋：i 射理论为基础，结合高级醇水蕊自阚乳酸代谢及翼湘互关系而设计 的。由高级醇冶词黼司知高级醇的形威宽隗群鸦目嘁中间产物a - 瞅，因此要降低高级醇 的产量就要降低a 酮酸的产量。 乳酸脱氢酶 p w 4 - 7 8 a 硼酸妣h 寻= = = = = 兰乳酸州a d p h 8 8 - 9 8 图1 - 3 羽酸代谢途径 飑1 - 3 l a c t i ca d d m a a b o l i 压p a s s w a y 在酵母细胞内，酵母乳酸脱氢酶催化生成乳酸的反应要比其逆向反应快刚。高级醇和乳 酸的生成都需要消耗n a d h 。在酵母细胞中，细胞质核酸池内n a d h 和n a d 的总量是一定 的。乳酸代谢能力的增加伶j 蛹，必然消耗更多的n a d h ，如果同一时间内n a d h 的合成并 不增加的话，则其它途径消耗的n a d h 必然凋r v j , 。也就是说用于还原酮酸的n a d h 必然相 应减少，因而产生的高级醇也必然会降低。 从另方面讲，假定酵母路代谢的能力不变，则乳酸代谢能力的增加饴成) ，必然会降 低a 酮酸的浓度，也就是说有更少的糖用于细胞的合成，细胞生长速度必然降低，而高级醇 正是细胞生长的副产物，因而其生成量必然降低闭。天津科技大学李春明用此方i 趱育出一 株低产高级醇的果酒酵母菌株罔。 1 4 1 3 选育渗漏型突变株 可筛选针对正丙醇、异丁醇、异戊醇、活性戊醇等高级醇的渗漏型突变株，即采用高浓 度底物筛选突变株。原因是氨基酸代谢或糖代谢生成高级醇的途径受到影响的结果。珠江啤 酒的夏雪采用此方法选育的突变株，其异戊醇生成量降低了1 9 。 1 4 2 基因工程育种方法 近年来，在e 砒i c h 和i 蜥s 的基础匕许多科学家对高级醇的代谢途径尤其是异戊醇的 代谢途径进行了深入研究，由此形成了较为完整的异戊醇代谢途径，见图1 4 ，在此基础匕， 也逐渐采用基因工程和分子生物学方法对菌种进行有目的的改造，以降低高级醇的生成量。 魂马乙醇叩 t； 葡萄塘翌一丙酮酸_ 口- 乙酰乳酸盘一酮薹舁戍酸寻墼垒k 缬氯酸 j i 正高醇a - m i n i m 磐揪正丙醇 j 兰三告 旯虱欧 i 丙酮酸脱 i 羧异构酶 异戍醇卫坠乙酸异戊酯告舁焘爵 图1 4 异戊醇代蝴鑫径 鼬1 - 4 1 s o a m y la k ：o i 的lr n e u 蜘l i z ep a s s w a y a e d 锄等研究表明氨基酸的合成与分解使用的是两种不同的转氨酶，这两种转氨酶个 是由线粒体中的1 哪基因编码，而另个是由细胞质体中的 r w r 2 基因编码，并分别命名 为以挪9 和国翻钔阿铡。a e d 和v a nn e d e r v c l d e 等还研究了支链氨基酸转氨酶基因片段 e c a l 妈g ，e c a x 4 0 对不同高级醇的影响，得出结论，e c a z 塑9 和e c a 4 0 对正丙醇的生成都没 有影响，而对异丁醇的影响显著，活性戊醇，异戊醇也受e c a z 4 0 或e c a l 垫9 的影响p 删。 构建支链氨基酸转氨酶( 日c a t ) 基因片段b a t i 、b a t 2 缺失的工程菌，因为丑c a t 的缺失而阻断或减弱了氨基酸转变成a 酮酸，从而减少高级醇的生成。基于分支链氨基酸分 解代谢理论的研究，b e n w n i s t y , n m s i m 戍a l 构建出缺少个或两个编码支链氨基酸的氨基酸 转移酶( b o 虹) 基因e c a z 塑g ，e c a x 4 0 的啤酒酵母菌株，发酵试验表明突变菌株可以降低 异丁醇的生成量，而且对酒精产量没有多大影响，但没有报道突变株对异戊醇的影响及其它 发酵性能的改变情移矿l j 。 d i c i ( e 咖等人研究证实；从缬氨酸到异丁醇的代谢途径中丙酮酸脱羧酶是合成异丁醇 的关键步骤，而构建丙酮酸| l ；6 羧酶活性降低的工程菌株能够降低异丁醇的生成量圈。而后， 他们又发现a 酮基异己酸分解为异戊醇的关键酶是丙酮酸脱羧异构酶，由y d i , 0 8 0 c 基因编 石马网，因此，构建丙酮酸脱羧酶异构酶基因片段 y d x 0 8 0 c 缺失的工程菌，能阻断或减弱a - 酮基异己酸向异戊醇的代谓p 调，因此可使异戊醇的生成量显著降低。 在清酒酿造中，异戊醇分解代谢研究的较多，已形成了较为完整的代谢体系：a 酮基异 己酸在丙酮酸脱羧异构酶的作用下分解为异戊醇，异戊醇在乙酰辅酶a 的存在下经a a t f a s e 催化生成乙酸异戊酯，乙酸异戊酯在经水解酶( e s t a s e 2 ) 作用下，分解为异戊醇和乙霞妒6 。删。 因此，要降低异戊醇含量并提高香味成分酯的含量，就必须阻止乙酸异戊酯的分解。这 样