（发酵工程专业论文）克拉维酸的发酵优化及分离纯化.pdf

摘要 摘要 克拉维酸( c l a v u l a n i ca c i d ，c a ) ，是由带棒链霉菌产生的一种次级代谢 产物，它由b 一内酰胺环( c 。) 和噻唑环( c 。) 构成。克拉维酸作为一种b 一内 酰胺酶抑制剂，能抑制由大肠杆菌之类的革兰氏阴性和革兰氏阳性致病菌产生 的b 一内酰胺酶。克拉维酸本身的抑菌效果非常微弱，临床上主要将其与b 一内 酰胺类药物联合应用，例如阿莫西林和替卡西宁钠盐等。 本试验主要利用序贯试验设计( p l a c k e t t b u r m a n 、析因设计、响应面设 计和最速爬坡法等) ，以带棒链霉菌作为发酵菌种，在培养基( g 1 ) 为：大豆 粉，3 5 8 6 ；甘油，1 5 ；k h 2 p 0 4 ，0 1 2 5 ；m g s o 。7 h 2 0 ，0 2 5 ；f e s o 7 h 2 0 ，0 4 2 ； 鸟氨酸，1 1 3 ，以及接种量4 5 m l 3 0 m l ，p h 6 8 的培养条件下发酵，获得克拉维 酸最大产量，约为7 0 6 u g m l 。 外界环境因子对c a 降解速率的影响大小不同，通过对带棒链霉菌对数生 长期和稳定期c a 降解情况的研究，可以判断，在p h 、温度等发酵条件一定的 情况下，导致发酵后期c a 严重降解的原因可能与菌体生长过程中产生的热敏性 物质或者稳定期产生的次级代谢产物有关。 在a 1 ：( s o 。) 。1 8 h 。0 为4 8 i g l ，壳聚糖为2 1 4 2 m m o l l 时，克拉维酸发酵 液的沉淀效果最好，而克拉维酸的损失不到5 。以丁醇和乙酸乙酯( 1 ：4 ) 为 萃取剂、油水比为3 7 6 、p h 2 和8 下分离纯化克拉维酸，萃取率为9 0 4 9 ， 溶胀率4 1 3 。 通过基因改造的带棒链霉菌，在相同发酵条件下，其克拉维酸的产量比原 始菌种提高了8 4 5 。 关键词：序贯设计：带棒链霉菌；克拉维酸；发酵优化；分离纯化 华南理工大学硕士学位论文 a b s t r a c t c l a v u l a n i ca c i d ( c a ) ，as e c o n d a r ym e t a b o l i t e ，w a sp r o d u c e db ys t r e p t o m y c e s c l a v u l i g e r u sa n dw a sc o n s t r u c t e dw i t hap - l a c t a m ( c 3s t r u c t u r e ) a n do x a z o l i d i n e r i n g ( c 5s t r u c t u r e ) a sap o t e n tp l a c t a m a s ei n h i b i t o r ，c ac o u l di n h i b i tt h ee n z y m e c a l l e d b e t a l a c t a m a s e s ，w h i c hw a s p o s s e s s e db y s o m e g r a m p o s i t i v e a n d g r a m n e g a t i v ep a t h o g e n i cm i c r o b e ss u c ha se s c h e r i c h i ac o l i a n dc l a v u l a n i ca c i d h a db e e n s u c c e s s f u l l ya p p l i e d i nc o m b i n a t i o nw i t h p l a c t a ma n t i b i o t i c s ， e g ，a m o x i c i l l i na n dt i c a r c i l l i nd i s o d i u m s e q u e n t i a l s t a t i s t i c a l e x p e r i m e n t a ld e s i g n ( p l a c k e t t - b u r m a n ，f a c t o r i a l ， r e s p o n s es u r f a c ea n ds t e e p e s ta s c e n t ) w e r eu s e di nt h et h e s i s a n ds t r e p t o m y c e s c l a v u l i g e r u sw a su t i l i z e d a st h ep r o d u c t i o n a ls t r a i n i tw a si n v e s t i g a t e dt h a tt h e c o m p o s i t i o no ft h e c u l t u r em e d i u m ，t h ec o n d i t i o no ft h ec u l t u r e , t h ep r e t r e a t e d l i q u i d o f f e r m e n t ，t h e s e p a r a t i o n a n d p u r i f i c a t i o n o f p r o d u c t i o n ，a n d t h e c o m p a r i s o no f t h ef e r m e n to no r i g i n a la n dm u t a n ts t r a i n s t h eo p t i m i z e dm e d i u mc o m p o s i t i o n i n c l u d e d ( g l ) ：s o y b e a nm e a l ，3 5 8 6 ； g l y c e r o l ，1 5 ；k h 2 p 0 4 ，0 1 2 5 ；m g s 0 4 7 h 2 0 ，o 2 5 ；f e s 0 4 7 h 2 0 ，o 4 2 ；o r n i t h i n e ， 1 1 3 t h eo p t i m i z e dc u l t u r ec o n d i t i o ni n c l u d e d ：i n o c u l u m 4 5 m l 3 0 m l ；p h6 8 t h em a x i m u mp r o d u c t i o no fc ai s a p p r o x i m a t e l y7 0 6 u g m l i nt h i sc u l t u r e c o n d i t i o n t h ei n f l u e n c e d e g r e e o fc ad e g r a d a t i o nt h a ti n f e c t e d b y e n v i r o n m e n t c o n d i t i o nf a c t o r sw e r ed i f f e r e n c e i tw a se x a m i n e dt h a tt h ed e g r a d a t i o nr a t eo fc a i nt h ee x p o n e n t i a lg r o w t ha n ds t a t i o n a lp h a s e i ti n d i c a t e st h a ts o m eh e a t s e n s i t i v e c o m p o n e n t s ，f o re x a m p l es e c o n d a r ym e t a b o l i t e p r o d u c e a n dp r o t e i n ( e n z y m e ) ， i n f l u e n c et h es t a b i l i t yo fc a t h ee f f e c t so ft h ed e p o s i t i o no fc aw e r eb e s t ( p e r m e a t i o nr a t ey = 0 0 0 5 4 ) ，a t t h ec o n d i t i o no fa 1 2 ( s 0 4 ) 3 1 8 h 2 0 ，4 8 l g l ；c h i t o s a n ，2 1 4 2 m m o l l a n dt h el o s s o fc aw a sl e s st h a n5 c aw a ss e p a r a t e da n dp u r i f i c a t e da tt h ec o n d i t i o nt h a t i n c l u d e d ：b u t a n o la n db u t y la c e t a t e 。1 ：4 ；t h eo i l - w a t e rr a t i o ，3 7 5 ；p h ，2 ；8 t h e e x t r a c t i o nr a t ew a s 9 0 4 9 ，t h es w e l l i n gr a t ew a s 4 13 a tt h es a m ec o n d i t i o n ，t h ep r o d u c t i o no fr e c o m b i n e ds c l a v u l i g e r u sw a s 1 8 4 。5 t i m eo fo r i g i n a ls t r a i n a b s t r a c t k e yw o r d s ：s e q u e n t i a l s t a t i s t i c a l d e s i g n ；s c l a v u l i g e r u s ；t h eo p t i m i z a t i o n o f m e d i u m c o m p o n e n t s ；s e p a r a t i o n a n d p u r i f i c a t i o n h i 华南理工大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研 究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文 不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研 究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：伍篪 日期：名脾年多月曙日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权华南理工大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密口。 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名： 伍燕 导师签名： 日期：二卯4 年占月f 譬日 日期：功| 年1 月纠日 第一章绪论 第一章绪论 1 9 2 9 年，英国学者a l e x a n d e rf l e m i n g ( 1 8 8 1 1 9 5 5 ) 在研究葡萄球菌的变 异时，发现在一个培养皿污染了霉菌，后来被确认为点青霉( p e n i c i l l i u mn o t a t u m ) 的菌落周围，出现了无葡萄球菌生长的透明抑菌圈。f l e m i n g 对这一霉菌进行了 培养，用所得到的培养滤液进行动物抗感染实验，获得了肯定的疗效，而未见对 宿主兔的白血球产生影响。他把存在于点青霉培养滤液中产生这一抗菌作用的有 效物质叫做青霉素( p e n i c i l l i n ) 1 1 1 。1 9 4 5 年，意大利撒丁岛卡利阿里市行政官员 兼细菌学者g u i s e p p eb r o t z u 在借助微生物的拮抗作用杀死城市污水中伤寒杆菌 的研究中发现了头孢菌素【2 】。1 9 5 8 年研究发现了青霉素的活性母核6 一氨基青霉烷 酸( 6 - a m i n o p e n i c i l l i n i ca e i d ，6 - a p a ) ：1 9 6 1 年，又获得头孢菌素c 的母核7 一 氨基头孢烯酸( 7 - a m i n o c e p h a l o s o r a n i ca e i d ，7 - a c a ) ：2 0 世纪6 0 年代及9 0 年 代，还分别由青霉素化学扩环获得头孢菌素的另一些母核7 一氨基脱乙酰氧头孢烯 酸( 7 - a m i n o d e a c e t o x y c e p h a l o s p o r a n i ca c i d ，简称7 - a d c a ) 和氯甲基头孢苄 酉目( 7 一 p h e n y l a c e t a m i d - 3 一c h l o r o m e t h y l 3 一c e p h e m 一4 c a r b o x y l i c a c i d p m e t h o x y b e n z y le s t e r ，简称g c l e ) 1 1 经历几十年的发展历程，b 一内酰胺抗生素作为临床药物为人类的健康事业作 出了卓越的贡献。但随之带来的是，临床上耐药菌株的日益增多。细菌的耐药性 问题已经成为现今乃至今后一段时期内，临床感染领域急需解决的重大问题。直 到上世纪七十年代，随着b 一内酰胺酶抑制剂的发现，如从带棒链霉菌 ( s t r e p t o m y c e sc l a v u l i g e r u s ) 的发酵液中分离得到具有氧青霉烷结构( b 一内 酰胺环上的硫原子被氧原子取代) 的新b 一内酰胺抗生素一一克拉维酸( c l a v u l a n i c a c i d ) 3 1 ，细菌的耐药性问题才开始得到有效的解决，有关细菌耐药性的研究也 真正发展起来。 四十多年过去了，曾经有效解决细菌耐药性的克拉维酸依然活跃在临床感染 领域。然而，克拉维酸生产却一直存在诸多问题，对于克拉维酸生产的研究，一 直是医药企业乃至各国政府关注的问题。 1 1 b 一内酰胺抗生素 1 1 1 b 一内酰胺抗生素的分类 b 一内酰胺抗生素是分子中含有四元b 一内酰胺环的一类天然和合成抗生素的 总称，也是迄今已知抗生素中毒性最低、品种最多、临床应用最广泛的一类抗生 华南理工大学硕士学位论文 素。目前，临床上应用的1 3 一内酰胺抗生素主要分为五大类：青霉素类( 又称青 霉烷类，包括青霉素c 、青霉素y 和各种半合成青霉素) ；青霉烯类( 包括青霉 烯类和碳青霉烯类) ；头孢霉素类( 包括头孢烯类、碳头孢烯类和氧头孢烯类) ； 单环b 一内酰胺类；b 一内酰胺酶抑制剂类( 包括氧青霉烷类和青霉烷砜类) h 。前三种合并称为典型b 一内酰胺抗生素，后两种统称为非典型b 一内酰胺抗生 素4 1 。 1 1 1 1 青霉素类 青霉素类抗生素是应用于治疗的第一类抗生素，至今仍被认为是治疗许多感 染性疾病的首选药物。青霉素类有共同的母核6 一氨基青霉烷酸( 6 - a p a ) ，它是由 b 一内酰胺环和噻唑环组成，其基本结构如下【l j ： 图卜i 青霉素类抗生素的分子结构 f i 9 1 1t h e m o l e c u l a rs t r u c t u r eo fp i n i c i l l i n s 除了临床上已经应用了7 0 多年的青霉素g 外，先后研制出抗葡萄球菌青霉素、 广谱青霉素和抗革兰氏阴性( g - ) 杆菌青霉素等3 0 多个品种【5 】。 代表品种有：苯唑西林( o x a c i l l i n ) 、氢苄西林( a m p i c i l l i n ) 、呋苄西林 ( f u r b e n i c i l l i n ) 以及近年又新开发出的两种新型高效广谱青霉素： a s p o x i c i l l i n ，与细胞膜脂蛋白结合，破坏细菌的细胞壁，故具有双重杀菌作用。 b r l 一4 4 1 5 4 ，将第三代头孢菌素的侧链2 一氨基噻唑肟基引入青霉素母核而成， 从而大大增强了与细菌p b p 的亲和性，对m r s a 活性强，显示出与万古霉素同样的 疗效。 1 ，1 1 2 头孢菌素类 是一族广谱抗生素，与青霉素共有b 一内酰胺环，可从青霉素母核改造合成。 其基本结构式为7 一氨基头孢烷酸( 7 - a c a ) ，置换其侧链r i r 4 基团，可获得抗菌 谱不同的头孢菌素【l 】。 j 2 埤雄 图卜2 头孢烯、碳头孢烯和氧头孢烯的分子结构式 f i g l 2t h e m o l e c u l a rs t r u c t u r eo fc e p h e m s ，c a r c e p h e ma n do x a c e p h e m 2 第一章绪论 1 第一代头孢菌素的特点有：对革兰阳性菌( 包括对青霉素敏感或耐药的 金葡菌) 的抗菌作用较第二、三代强，对革兰氏阴性菌的作用较差；对青霉素 酶稳定，但仍可为革兰阴性菌的b 一内酰胺酶所破坏；对肾脏有一定毒性。注 射剂品种有头孢噻吩( c e p h a l o t h i n ) 、头孢唑啉( c e f a z o l i n ) 、头孢匹林 ( c e p h a p i r i n ) 等。口服剂有头孢氨苄( c e p h a l e x i n ) 、头孢羟氨苄( c e f a r o x i l ) 、 头孢曲秦( c e f a t r i z i l i e ) 等。 2 第二代头孢菌素的特点有：对革兰阳性菌作用与第一代头孢菌素相仿或 略差，对多数革兰阴性菌作用明显增强，部分对厌氧菌有高效，但对绿脓杆菌无 效；对多种b 一内酰胺酶比较稳定：对肾脏的毒性较第一代有所降低。其产 品有：头孢孟多( c e f a m a n d 0 1 ) 、头孢呋新( c e f u r o x i m e ) 、头孢西丁( c e f o x i t i n ) 、 头孢美唑( c e f m e t a z o l e ) 、头孢替安( c e f o t i a m ) 、头孢替坦( c e f o t e t a n ) 和头 孢克罗( c e f a c l o r ) 等。 3 第三代头孢菌素的特点有：对革兰阳性菌有相当抗菌活性，但不及第一、 二代头孢菌素，对革兰阴性菌包括肠杆菌属和绿脓杆菌及厌氧菌如脆弱类杆菌均 有较强的作用：其血浆t m 较长，体内分布广，组织穿透力强，有一定量渗入 脑脊液中：对b 一内酰胺酶有较高稳定性；对肾脏基本无毒性。其产品有： 头孢噻肟( c e f o r a x i m e ) 、头孢唑肟( c e f t i z o x i m e ) 、头孢三嗪( c e f t r i a x o n e ) 、 头孢哌酮( c e f o p e r a z o n e ) 、头孢他啶( c e f t a z i d i m e ) 、头孢磺啶( c e f s u l o d i n ) 、 拉氧头孢( m o x a l a c t a m ) 和头孢克肟( c e f i x i m e ) 等1 6 】。 4 第四代头孢菌素：1 9 9 2 年开始陆续出现头孢匹罗( c e f o p i r o m e ) 、头孢匹 肟( c e f e p i m e ) 、头孢唑兰( c e f o z o p r a n ) 与头孢瑟利( c e f o s e l i s ) 4 种第四代头 孢菌素。其结构特征是：在主核的7 位连有2 一氨基噻唑一2n 一2 一甲氧亚胺基乙 酰基侧链。3 位存在的季胺基团与分子中的羧基形成内盐。其性能特征是： 对p b p s 有高度亲和力。可通过g 一性菌外膜孔道迅速扩散到细菌周质并维持高 浓度。具有较低的b 一内酰胺酶亲和性与诱导性，对染色体介导的和部分质粒 介导的b 一内酰胺酶稳定【7 l 。 1 1 1 ，3 青霉烯类 它包括青霉烯类和碳青霉烯类。其结构式如下【1 】： 一够每 乒i 寸酽 c 0 2 h 图卜3 青霉烯( 左) 和碳青霉烯( 右) 的分子结构式 f i 9 1 3t h em o l e c u l a r s t r u c t u r eo f p e n e m ( 1 e f t ) a n dc a r b a p e n e m ( r i g h t ) 华南理工大学硕士学位论文 青霉烯类是值得注意的新类型。它们对包括革兰氏g + 和g 一菌以及需氧和厌氧 的许多细菌都具有很强的活性，且对b 一内酰胺酶和肾脱氢肽酶均稳定，目前正在 开发的品种有1 0 多个，其中f e c 2 2 8 9 l 是本类中最好的药物，目前尚未临床应用。 其他还有s c h 3 4 3 4 3 、c g p 3 0 7 7 9 、s c h 2 9 4 8 2 、c g p 3 1 6 0 8 、s y 5 5 5 5 和h r e 6 6 4 等。 碳青霉烯类的代表药物是硫霉素与亚胺培南( i m i p e n e n ) 。硫霉素很不稳定， 只有亚胺培南供临床应用，其抗菌谱极广，抗g + 菌的活性有如青霉素g ，抗g 菌 的活性与氨基昔类相似，抗绿脓杆菌活性壁氨基苷类强，抗厌氧菌的活性与甲硝 唑相似。而且对b 一内酰胺酶很稳定，并能使之失活【8 】。 1 1 1 4 单环b 一内酰胺类 仅含b 一内酰胺环及侧链，其基本结构式为【”： 8 肖 矽 图卜4 单环b 一内酰胺类分子结构式 f i g l - 4 t h em o l e c u l a rs t r u c t u r eo fm o n o b a c t a m 本类抗生素的特点是：对g 一需氧菌作用强，对酶稳定，过敏反应率很低，结 构简单，可合成制造。制剂有氨曲南( a z t r e o n a m ) 和卡芦莫南( c a r u m o n a m ) ，抗 菌谱酮氨基糖苷类抗生素，对绿脓杆菌作用似头孢哌酮，对g + 球菌和厌氧菌活力 低，可进入脑脊液，无耳肾毒性【5 】。 1 1 1 5b 一内酰胺酶抑制剂类 它包括氧青霉烷类和青霉烷砜类。其代表化合物结构如下【l 】： 图1 5 克拉维酸( 左) 和舒巴坦( 右) 的分子结构式 f i g l 一5t h e m o l e c u l a rs t r u c u t u r eo fc l a v u l a n i ca c i d ( 1 e f t ) a n ds u l b a c t a m ( r i g h t ) 0 一内酰胺酶抑制裁本身抗菌力不强，但是制成合剂后能明显提高抗生索的活 性。主要商品有：安美汀( a u g m e n t i n ) ，阿莫西林与酶抑制剂克拉维酸钾 ( c l a v u l a n a t ep o t a s s i u m ) 的合剂，后者可摧毁b 一内酰胺酶以保护b 一内酰胺环。 口服吸收好。特美汀( t i m e n t i n ) ，含替卡西林及克拉维酸钾，对g + 、g - 菌包括 绿脓杆菌及厌氧菌均有较强活力，临床治疗各种感染总有效率为9 5 8 。优立 4 第一章绪论 新( u n a s y n ) ，为酶抑制剂青霉烷砜( 舒巴坦，s u l b a c t a m ) 与氨苄西林按i ：2 的 合剂，显著改善了细菌对后者的耐药性。s u l p e r a z o n ，为青霉烷砜与头孢哌酮 按1 ：l 的合剂，对葡萄球菌、假单胞菌属和脆弱类杆菌的活性明显增强9 1 。 1 1 2 b 一内酰胺抗生素的作用机理 1 1 2 1 细菌肽聚糖的生物合成 有关细菌肽聚糖的生物合成途径是利用溶菌酶( 1 y s o z y m e ) 和青霉素对细菌 细胞壁的溶解作用来推测的，肽聚糖的生物合成途径如图卜6 【1 1 。 l - g i n乙酰c o a l l - g l u l c o a 6 p 果糖2 6 p 葡糖胺二1 z 卜6 _ g l c n a c + 1 p - g l c n a c k ： k y 辆鳓 a d m a t p a d ma 什旷“脚h + 小 l 、芦“弋7 胁卜n a d w u d p m 岫q a c l a l a n g l u 二! s zu d p m i 心a c l a l a 二zu ：恤n a c u d p - m m n a c l - a i a - d - g h t - d p m - d - a i a - d - a l a 图卜6 肽聚糖的生物合成途径 f i g l 一6t h ep a t h w a y o fp e p t i d o g l y c a nb i o s y n t h e s i s 乒一 彳 套 华南理工大学硕士学位论文 1 1 2 2 青霉素结合蛋白 0 一内酰胺抗生素分子由于在空间构型上与上述肽聚糖生物合成最终步骤转 肽反应底物c 端的d 一丙氨酸一d 一丙氨酸部分类似，因而能够同位于细胞膜上，参 与上述转肽反应的酶共价结合，使其失活，导致细菌细胞不能形成完整的细胞壁， 并因细胞壁缺损、破裂和细胞质漏出而死亡。这一现象最初是用青霉素阐明的， 故这些能与b 一内酰胺抗生素共价结合的酶被称之为青霉素结合蛋白 ( p e n i c i l l i n b i n d i n g p r o t e i n s ，简称p b p s ) 。目前，在大肠杆菌中至少已发现 1 0 种p b p s ，按分子量大小可分为大分子p b p s ( p b p i a 、i b 、i c 、2 、3 ) 和小分子 p b p s ( p b p 4 、5 、6 、6 b 、7 ) 两类。表卜1 列出了大肠杆菌的7 种p b p s 及其生理 功能1 们。 表l 。l 大肠杆菌的7 种青霉素结合蛋白( p b p s ) t a b l e l - 17p e n i c i l l i nb i n d i n gp r o t e i n s ( p b p s ) o fe c o l i 1 1 2 3b 一内酰胺抗生素的作用方式 b 一内酰胺抗生素与p b p s 或b 一内酰胺酶的相互作用，具有如下式所示的同样 反应模式： t + i e + s 甘e s 马e s 马e - i - p k - 1 式中，e 是p b p s 或b 一内酰胺酶，s 是b 一内酰胺抗生素，e s 是米氏 6 第一苹绪论 ( m i c h a e l i s ) 反应复合物，e s 是共价复合物，p 是失活降解产物。对p b p s 来 说，反应速度参数k 3 比k 2 小得多，从而导致e s + 积累，p b p s 失活；而对b 一内 酰胺酶来说，k 3 和k 2 都很大，由此造成b 一内酰胺抗生素降解失活。 b 一内酰胺抗生素的这种作用方式，使其主要对生长和分化中的细胞有效，而 对静止细胞不产生作用。 1 1 24 细菌的耐药性机理 半个多世纪过去了，抗生素研究领域正以前所未有的速度继续发展着，大量 的抗生素变得轻而易得，显著得降低了感染性疾病的发病率。但是，在b 一内酰胺 类抗生素繁荣景象的背后，却掩盖不住个严峻而危险的事实：细菌的耐药性问 题。它的直接后果就是，感染耐药菌的病人更有可能需要住院治疗和较长的住院 时间，并且死亡率也更高。细菌的耐药性促使人们不得不使用毒性更大、价格更 高的替代药品。 对于细菌，其耐药性主要涉及4 个途径【l l 】： 1 细菌产生b 一内酰胺酶 细菌产生8 一内酰胺酶使0 一内酰胺抗生素开环失活，约有8 0 的病原菌与这 个有关。迄今为止，报道的b 一内酰胺酶已经超过3 0 0 种。它们通过与b 一内酰胺 环上的羰基共价结合，水解酰胺键使b 一内酰胺抗生素失活。1 9 9 0 年a m b l e r 根据 酶分子结构的不同将酶分为a 、b 、c 、d 四类，a 、c 、d 类酶活性位点是丝氨酸， b 类酶活性基团为锌。其中，a 、d 类酶可被抑制剂所抑制。1 9 9 5 年b u s h 等将 b 一内酰胺酶分为型：第1 型为不被克拉维酸抑制的头孢菌素酶；第1 i 型为常能 被活性位点诱导的抑制剂抑制的0 一内酰胺酶，结构上属于a m b l e r 分类中的a 和 d 类：第1 i i 型为不被所有的b 一内酰胺酶抑制剂( 乙二胺四乙酸和对氯苯甲酸泵除 外) 抑制的金属b 一内酰胺酶；第型为不被克拉维酸抑制的青霉素酶。其中重要 者为第1 和i i 型【”】。 第1 型酶又分为由染色体介导产生的a m p c 型b 一内酰胺酶和由质粒介导产 生的a m p c 型b 一内酰胺酶【l3 1 ，前者的产生菌有阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌等，后 者主要由肺炎克雷伯氏菌和大肠埃希氏菌产生。第1 型酶主要作用于大多数青霉 素，第一、二、三代头孢菌素和单环类抗生素。而第四代头孢菌素、碳青霉烯类 不受该酶作用。该酶不能被b 一内酰胺酶抑制剂所抑制。 2p b p s 基因的改变 b 一内酰胺类抗生素的抗菌活性是根据其与p b p s 的亲和性强弱决定的。当b 一 内酰胺类抗生素与p b p s 结合，便使其失去酶活性，结果使细胞壁的形成部位破损 而引起溶菌，反之，则成为耐药菌。p b p s 基因变异，使b 一内酰胺类抗生素无法与 之结合，是形成耐药的根本原因。p b p 2 x 、p b p l a 、p b p 2 b 的基因排序已经证明l 3 个位点基因变异，位点变异造成p b p s 结构变化，使b 一内酰胺类抗生索不易与 7 华南理工大学硕士学位论文 其结合，使其之间的亲和性下降，而引起抗菌力低下，并可迸一步转化为高度耐 药性菌株。肺炎链球菌对头孢菌素、青霉素及碳青霉烯类耐药性的产生分别是因 为p b p 2 x 及p b p 2 b 的变异所致【1 ”。 3 细菌外膜通透性改变 g 细胞外膜通透性下降，阻碍抗生素进入菌内膜靶位，即改变菌外膜蛋白， 减少抗生素吸收：g + 缺少菌外膜，所以不存在膜通透性下降的耐药机理。g 。对膜 通透能力变化较大，膜孔蛋白通道非常狭窄，能对大分子及疏水性化合物的穿透 形成有效屏障，外膜通透性下降导致耐药性主要由于：1 膜孔蛋白( f 、c ) 缺陷； 2 多向性突变；3 特异性通道的突变；4 脂质双层改变。外膜屏障使细菌对药产 生固有的抗药性，且多数g 产生b 一内酰胺酶。研究表明，外膜屏障与b 一内酰胺 酶有明显的协同作用，即通透性降低的作用可使有效的酶灭活系统加强【l ”。 4 主动外排 细菌的能量依赖性主动转运机制，能将已经进入细菌体内的抗生素泵出体外； 降低了抗生素吸收速率或改变了转运途径，也导致耐药性的产生。 1 2 克拉维酸简介 1 2 1 克拉维酸 克拉维酸( c l a v u l a n i ca c i d ，c a ) ，又名棒酸，是一个稠合双环b 一内酰胺结 构( 图卜7 ) ，它以氧原子取代了青霉素及头孢菌素噻唑环中的硫原子，具有作为 b 一内酰胺酶抑制剂所必须的3 r ，5 r 立体化学结构埔1 。 图1 - 7 克拉维酸的分子结构式 f i g l 一7 t h em o l e c u l a rs t r u c t u r eo f c l a v u l a n i ca c i d 克拉维酸本身的抑菌作用非常微弱，但是它是强力、广谱且不可逆的b 一内 酰胺酶抑制剂。无论在体外或体内都能同耐药的革兰氏阳性菌和革兰氏阴陛菌， 特别是同金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌和奇异变形菌所产生的b 一内酰胺酶 生成牢固不可逆的结合物，从而解除耐药性细菌对b 一内酰胺类抗生素的分解作 用，恢复青霉素及头孢菌素类抗生素对许多产生b 一内酰胺酶的耐药菌的抗菌活 性。 第一章绪论 1 2 2 克拉维酸产生菌 1 9 7 i 年l i l l y 研究所的h i g g e n s 和k a s t n e r h 从南美土壤中分离到一株头孢 霉素c 产生菌带棒链霉菌( s c l a v u l i g e r u s ) 3 1 。s c l a v u l i g e r u s 的不同菌株还 能产生非b 一内酰胺类抗生素如全霉素( h o l o m y c i n ) ，衣霉素( t u n i c a m y c i n ) 等。 1 9 7 6 年英国b e e c h a m 公司b r o m n 等首次从带棒链霉菌( s c l a v u l i g e r u s a t c c 2 7 0 6 4 ) 的发酵液中发现了天然的b 一内酰胺酶抑制剂，克拉维酸酸，后来发 现该菌株还产生b 一内酰胺酶抑制蛋白( b 1 a c t a m a s e i n h i b i t o r yp r o t e i n ，b l i p ) 1 7 1 。 最近研究发现带棒链霉菌还能合成增效磺胺( c e f m i n o x ) 。除带棒链霉菌( s c l a y u l i g e r u s ) 作为c a 产生菌外，s j u m o ，l ，i n e n s i s 及s k a t s u r a h a m a n u s 也曾被用作 c a 的产生菌。新近有报道在重庆地区筛选到一株c a 产生菌带棒链霉菌亚种( s c l a vu l i g e r u ss u b s p 3 0 4 8 ) 1 8 o 1 2 3 克拉维酸作用机理 克拉维酸同1 3 一内酰胺酶的活性位点有很高亲和力，能与1 3 一内酰胺酶的催化中心 相结合，以竞争性抑制剂方式发挥作用。它通过其b 一内酰胺羰基与酶分子中的丝 氨酸羟基发生反应打开0 一内酰胺环而使酶酰化( 图卜8 ) 。该反应类似于b 一内酰 胺酶同敏感底物如青霉素之间的反应。对于1 5 一内酰胺类抗生素底物，酰基一酶复 合物迅速水解，释放出酶和无抗菌活性的产物；而由c a 与酶形成的酰基一酶复合 物则相对比较稳定，水解很慢，或者因为1 5 一内酰胺环的水解及随后嗯唑烷环的打 开使暴露出的反应基团同酶发生进一步反应而使复合物更加稳定。 酰基一酶 b - 内酰胺酶 图卜8 克拉维酸和1 5 一内酰胺酶之间的反应 f i 9 1 8 t h ei n t e r a c t i o no fb e t w e e nc a a n d l 3 一l a c t a m a s e 产生这种类型抑制作用的化合物被称为自杀性抑制剂或依赖失活作用机理的 灭活剂。由于这些反应具有时间依赖性，因此，c a 可称是一个进行性抑制剂1 9 1 。 9 华南理工大学硕士学位论文 1 2 4 克拉维酸的生物合成机制 1 2 4 1 克拉维酸生物合成前体 1 9 7 8 年e l s o n 等进行标记前体化合物掺入c a 的研究。结果表明，酯酸盐可 形成c a 分子的一部分五碳骨架( 碳2 ，3 及8 ，9 ，1 0 ) ，甘油可提供b 一内酰胺环 ( 碳5 ，6 ，7 ) 的碳骨架【2 0 1 。随后研究发现，鸟氨酸与精氨酸均可有效掺入c a ( 碳 2 ，3 ，8 ，9 ，1 0 ) 。但因鸟氨酸为精氨酸合成代谢中的一个中间产物，故精氨酸的 掺入并不能排除鸟氨酸作为c a 合成的直接前体i 。v a l e n t i n e 等m 1 利用不能将 精氨酸转变为鸟氨酸的a r g f 、a r g g 突变株进行研究发现，精氨酸为c a 的直接前 体。标记的甘油、甘油酸、丙酸盐和b 一羟基丙酸盐均可掺入到c a ( 碳5 ，6 ，7 ) ， 但乳酸或甘油酸二位碳上的氢却不能掺入，说明这两种物质在掺入前均需被转变 成丙酮酸盐。最近，催化连接精氨酸和三碳单元的酶( c e a 合成酶) 已得到纯化， 此酶以d 一3 一磷酸甘油醛为底物。因此，尽管其它三碳物质可能最终有不同的利 用效率，但显然d 一3 一磷酸甘油醛是c a 分子中三碳单元的直接前体。 1 2 4 2 克拉维酸生物合成途径 通过同位素标记、中间代谢物的分离、酶的纯化及其特性和基因的研究，c a 生 物合成途径如今已部分阐明( 图卜9 ) 【2 引。研究中首先分离到的代谢中间产物是 克拉维胺酸( c l a v a m i n i ca c i d ) 和前克拉维胺酸( p r o c l a v a m i n i ca c i d ) ，后来又分 离到两种胍基化合物n 2 - 羧乙基一精氨酸( n 2 2 一c a r b o x y e t h y l a r g i n i n e ，c e a ) 以及脱 氧胍基前克拉维胺酸( d e o x y g u a n i d i n o p r o c l a v a m i n i c a c i d ，d g p c ) 。 c e a 合成酶( c e as y n t h e t a s e ) 由位于c a 基因簇中的p y c ( p y r u v a t e c o n v e r t i n g ) 基因编码，含5 8 2 个氨基酸，具有识别丙酮酸盐及硫氨素焦磷酸( t p p ) 的结构 域。在a t p 、m 9 2 + 存在下，c e a 合成酶以类似于肽键合成酶的方式催化d 一3 一磷酸 甘油醛同精氨酸以c - n 键连接形成c e a ，但其辅因子t p p 的功能却不同于常用于 辅助催化形成c - c 键的t p p 的功能。因为丙酮酸盐并不是c e a 合成酶的真正底 物，故p y c 基因应当重新命名为c e a s 。 c a 基因簇中，o r f 3 的破坏将导致s c l a v u l i g e r u sb l s 突变株积累大量的 c e a ，但通过化学添加d g p c ，可使突变株恢复c a 生产能力。催化c e a 转变为d g p c 的酶被命名为b 一内酰胺合成酶( b l a c t a ms y n t h e t a s e ，b l s ) 。在a t p 、m g 。+ 存在 下，它催化c e a 在分子内形成酰胺键，产生d g p c 。利用d g p c 作底物，克拉维胺 合成酶( c l a v a m i n a t es y n t h a s e ，c a s ) 可将其转变为克拉维胺酸【”】。纯化后的c a s ， 其活性与4 5 1 6 k u 和4 6 1 6 k u 的两条多肽相关，即c a s i 、c a s 2 。它们均为非血红 素铁双加氧酶，以d g p c 和a 一酮戊二酸作为底物，将氧分子中的一个氧原子以羟 基的形式引入d g p c ，形成胍基前克拉维胺酸。尔后通过两步氧化即环化和去饱 和( 脱氢) 使前克拉维胺酸转变为克拉维胺酸。因c a s 2 不能以胍基前克拉胺酸 第一章绪论 作为环化底物，故在c a s 2 催化环化及去饱和反应之前，胍基前克拉维胺酸上的胍 基必须先被除去。一个3 1 1 8 k u 的辅助催化蛋白在纯化a c v ( 三肽，头孢霉素c 合 成前体) 合成酶时被偶然分离到。利用此蛋白的n 端设计寡核营酸序列克隆获得 了p a h 基因。它编码的蛋白与脒基转移酶非常相似，催化需要m n 2 + 的存在。通过 麦芽糖结合蛋白与p a h ( p r o c l a v a m i n i ca m i n i d i n o h y d r o l a s e ，前克拉维胺氨基 水解酶) 融合进行表达，在除去融合伙伴( 麦芽糖结合蛋白) 后得到的多肽具有 p a h 活性，催化胍基前克拉维胺酸转变为前克拉维胺酸。此反应的k m 值为c a s 2 的k m 值的5 0 1 0 0 倍，由此知，它很可能是c a 合成的限制性步骤。 c a 碳9 位上的氧来自于标记的0 2 表明，克拉维胺酸碳9 位上的氨基被氧 化脱氨后形成c a 碳9 位上的醛基( 即克拉维醛) 。这种化合物已在s c l a v u l i g e r n s d c l 2 8 ( c a 合成缺陷型) 突变株中被检测到。克拉维醛因具有相应的3 r ，5 r 立 体化学结构而有b 一内酰胺酶抑制活性，但与c a 比较不够稳定。目前催化形成克 拉维醛的酶尚未得到分离，c a 基因簇中亦未发现具有编码氨基转移酶的基因。 o r m ( c a d ) ( c a d ) n a 嗍 ij | l 磊i驻蚤i 墨ii h 蛩 i 暑i ii 图1 - 9 克拉维酸的生物合成途径和基因簇 f i 9 1 9 t h e p a t h w a y a n dg e n ec l u s t e ro fc a b i o s y n t h e s i s 华南理工大学硕士学位论文 催化克拉维醛转变为c a 的酶是依赖n a d p 的克拉维醛还原酶( c l a v a l d e h y d e r e d u c t a s e ，c a r ) ，此酶分子量为2 7 1 8 k u ，分子大小及n 端序列表明，它由位于 c a s2 基因下游4 k b 处的c a r 基因编码。更多的有关c a 生物合成的基因可能位 于c a r 基因上游。o r f i o 即为其中之一，它编码类细胞色素p 4 5 0 蛋白，对c a 的 生物合成是不可或缺的。 化合物名称：1 一n 2 一( 2 - 羧乙基) 精氨酸，2 一脱氧胍基原棒胺酸，3 一胍基原 棒胺酸，4 一原棒胺酸，5 一棒胺酸，6 一棒酸一9 一醛( 棒醛) ，7 一棒酸，8 一其他棒 烷对映体( 生物合成中的副产物) ； 酶名称；c e a s 一羧乙基精氨酸合成酶，e l s 一8 一内酰胺合成酶，c a