（发酵工程专业论文）华根霉全细胞脂肪酶催化制备生物柴油.pdf

摘嘤 摘要 生物柴油是一种以动植物油脂为原料生产的可再生的绿色燃料。与传统的化学法相 比较，生物酶法生产生物柴油以反应条件温和、醇用量小、产物易于分离、无污染物排 放等优点成为国内外研究的热点，但是生物酶的价格昂贵、甲醇在油脂中的溶解度小， 以及对酶产生毒害作用等技术问题限制了该方法的使用。本论文针对以上问题较系统地 研究了全细胞脂肪酶无溶剂系统中催化油脂制备生物柴油的技术。主要结果如下： 1 ) 通过比较5 种不同商品化脂肪酶和自制的华根霉全细胞脂肪酶催化油脂制备生 物柴油的结果后表明：华根霉c c t c cm 2 0 1 0 2 1 全细胞脂肪酶能有效应用于无溶剂体系 催化合成脂肪酸甲酯。初步解决了酶法生产生物柴油的催化剂成本太高的瓶颈。对该酶 催化大豆油脂合成脂肪酸甲酯的条件进行系统地研究，结果表明：以大豆油脂为底物， 反应所需甲醇分3 次等量加入、总醇油摩尔比3 ：1 、体系水含量2 o 、反应温度3 0 、 加酶量8 ，生物柴油最终最高得率可达8 6 以上。以l o g 尸值为指标选择不同有机溶 剂作为助溶剂进行转酯化反应，发现正庚烷等l o gp 值为似5 的有机溶剂转化效果最 好。无溶剂体系相比于有机溶剂体系最终转化效果相差不大，具有更好的应用前景。 2 ) 对华根霉c c t c cm 2 0 1 0 2 1 全细胞脂肪酶催化脂肪酸乙酯合成的研究表明：华根 霉全细胞脂肪酶催化大豆油脂的转乙酯化效果较转甲酯化效果要好一些，最终得率可达 8 8 。但是由于甲醇对酶蛋白的毒害作用要远大于乙醇的毒害作用，反应条件相同程度 的改变对于甲酯的影响更为剧烈。 3 ) 考察了无溶剂体系华根霉c c t c cm 2 0 1 0 2 1 全细胞脂肪酶对不同的底物油脂以 及游离脂肪酸的作用效果：该酶在无溶剂体系下具有较好的催化油酸酯合成的能力，进 一步研究发现该酶可以较好地催化模拟高酸油脂的能力，并且酸价越高，效果越好。而 对于含有杂质的地沟油等酸价油，转化率也可以达到8 0 以上。对于麻疯籽油等近年来 比较热门的用于合成生物柴油的非可食用性油脂，其转化率达到8 8 以上，同时该酶对 多种植物油脂都具有很好的转化效果，这表明：该酶具有催化不同油脂原料合成生物柴 油的能力，对原料的要求低，从而扩大了原料的来源，初步解决了生物柴油生产工业化 中原料成本高的难题。 4 ) 对所得的生物柴油粗产品进行分离、精制得到产品。减压蒸馏条件：真空度5 m m h g ，油浴温度2 5 0 ，蒸馏约1 2 h ，脂肪酸甲酯回收率达到9 0 。通过外观、主要 成份的气相色谱分析以及性能指标的检测，表明分离后的产品明显优于粗产品。生物柴 油成品各主要性能指标优于国家o 撑柴油( g b2 5 2 2 0 0 0 ) 的主要。1 1 4 上t - 6 月匕匕指标，基本达到了中国 生物柴油标准( b d l 0 0 ) 和德国生物柴油的标准( d i nv 5 1 6 0 6 ) ，同时对华根霉全细胞脂肪 酶催化制备生物柴油的成本进行了初步核算，表明该方法具有一定的应用可行性。 本研究就开辟生物柴油生产的新途径、降低生物柴油的生产成本等内容进行了有益 的探索。 关键词：华根霉；全细胞脂肪酶；转酯反应；生物柴油；无溶剂体系 a b s t r a c t a b s t r a c t b i o d i e s e l ( 1 0 n g c h a i nm o n o a l k y lf a t t ya c i de s t e r s ) ，ar e n e w a b l ea n dg r e e nf u e l ，i sm a d e f r o mv e g e t a b l eo i l sa n da n i m a lf a t s c o m p a r e dw i t hc h e m i c a lm e t h o d ，e n z y m a t i cp r o c e s si sa p r o m i s i n ga l t e r n a t i v eb e c a u s eo fi t sm i l dr e a c t i o nc o n d i t i o n s ，e a s yr e c o v e r yo fp r o d u c t ，b e i n g f r e eo fc h e m i c a lw a s t e sa n dl o wd e m a n d i n go nr a wm a t e r i a l s ，w h i c hm a k e si tp o s s i b l et ou s e w a s t eo i la ss u b s t r a t ef o re n z y m a t i cp r o d u c t i o no f b i o d i e s e l h o w e v e r t h e r ea r es e v e r a l p r o b l e m sw i t ht h ee n z y m a t i cr e a c t i o n ，s u c ha sh i g hc o s to fb i o c a t a l y s t su s e d ，p o o rs o l u b i l i t y o f m e t h a n o lr e s u l t i n gi ni n a c t i v a t i o no fe n z y m ea n ds oo n t os o l v e t h e s ep r o b l e m s ，t h ee f f e c t o fr e a c t i o np a r a m e t e r sf o rb i o d i e s e lp r o d u c t i o nw i t hi n e x p e n s i v el i p a s e ，t h ew h o l e c e l ll i p a s e o f r h i z o p u sc h i n e n s i sc c t c c m 2 0 10 21w a se x p l o r e di nt h i sd i s s e r t a t i o n 1 ) i nt h es t u d y ，c o m p a r e dw i t hf i v ec o m m e r c i a ll i p a s e s ，t h ew h o l e c e l ll i p a s eo f r h i z o p u sc h i n e n s i sc c t c cm 2 0 10 21s h o w e dh i g h e r c a t a l y t i ca b i l i t yi nt h et r a n s e s t e r i f i c a t i o n o fo i lt op r o d u c ef a t t ya c i dm e t h y le s t e r ( b i o d i e s e l ) w h e nu s e dd i r e c t l yi nt h es o l v e n tf r e e s y s t e m 。t h ee f f e c to fi m p o r t a n tr e a c t i o np a r a m e t e r so ni m p r o v i n gt h ec o n v e r s i o no f t r a n s e s t e r i f i c a t i o nw a si n v e s t i g a t e di n t h i ss t u d ys y s t e m a t i c a l l y t h em e t h a n o l y s i so fo i lw a s p e r f o r m e db yt h r e e - s t e pa d d i t i o no fo n em o l a re q u i v a l e n to fm e t h a n 0 1a n dt h eo p t i m i z e d c o n d i t i o n sw e r et h a t ，t h ea d d i t i o no fl i p a s ea m o u n tw a s8 ( b yt h ew e i g h to fo i l ) t h es u i t a b l e w a t e rc o n t e n tw a s2 ，a n dt h er e a c t i o nw a sp e r f o r m e da t3 0 t h em a x i m a ly i e l dw a sm o r e t h a n8 6 u n d e rt h i sc o n d i t i o n t h ee f f e c to fd i f f e r e n t o r g a n i c s o l v e n t so nt h e t r a n s e s t e r i f i c a t i o ni n d i c a t e dt h a tt h eb e s to n ew a sn h e p t a n ew i t hh i g h e rl o gp ( 4 4 5 ) c o m p a r e dw i t ht h eo r g a n i cs o l v e n ts y s t e m ，t h es o l v e n tf r e es y s t e mh a dab e t t e rp r o s p e c to f a p p l i c a t i o n ，b e c a u s et h ec o n v e r s i o nw a ss i m i l a ri nt h et w os y s t e m s 2 ) t h ew h o l e - c e l ll i p a s ew a sp r o v e dt ob ea ne 伍c i e n tb i o c a t a l y s tf o rp r o d u c i n gb i o d i e s e l b ye t h a n o l y s i si nt h es o l v e n tf r e es y s t e m n ey i e l do fe t h a n o l y s i si sh i g h e rt h a nm e t h a n o l y s i s u n d e rt h eo p t i m a lr e a c t i o nc o n d i t i o n s ，a b o v e8 8 a n db e c a u s ei n s o l u b l em e t h a n 0 1i nt h eo i l c a u s e di r r e v e r s i b l ed e n a t u r a t i o no fp r o t e i n sm o r es e r i o u s l yt h a ne t h a n o l ，t h e s er e a c t i o n p a r a m e t e r se f f e c tt h ey i e l do fe t h a n o l y s i ss m a l l e r 3 ) t h ew h o l e c e l ll i p a s ew a sa l s op r o v e dt ob ea ne f f i c i e n tb i o c a t a l y s tf o rp r o d u c i n g b i o d i e s e lb ye s t e r i f i c a t i o na n do t h e rk i n d so fo i l se s p e c i a l l yw a s t eo i la n ds e e do i lo f j a t r o p h a c u r c a si nt h es o l v e n tf r e es y s t e ma n dh a dan i c ep r o s p e c to f p r o d u c i n gb i o d i e s e lf r o mv a r i o u s k i n d so fv e g e t a b l eo i l s t h i ss o l v e st h ep r o b l e mo fv a r i o u sr a wm a t e r i a ls o u r c e so nb i o d i e s e l p r o d u c t i o n 4 ) t h ep r e t r e a t m e n to fr a wp r o d u c t sw e r et h a t ，w a s h i n g ，c e n t r i f u g i n gt oo b t a i nt h eu p p e r l a y e r , d r y i n ga n de l i m i n a t i n gm e t h a n o lt h r o u g hr e d u c e dp r e s s u r ed i s t i l l a t i o n a n dt h e n b i o d i e s e lw a ss e p a r a t e db yd i s t i l l a t i o nw i t ho i lp u m pa n dm e t h y ls i l i c o n eo i lb a t h t h e d i s t i l l a t i o nc o n d i t i o n ：t h ev a c u u md e g r e ew a s5m m h g ，t h eo i lb a t ht e m p e r a t u r ew a s 2 5 0 。c ， a n dt h er e c o v e r yo f f a t t y a c i d m e t h y le s t e rw a s9 0 a f t e r12 h c o m p a r e dw i t h a p p e a r a n c e ，a n a l y s i so fm a j o rc o m p o s i t i o nb yg ca n dq u a l i t yo fr a wp r o d u c ta n dp u r i f e d b i o d i e s e l ，t h eq u a l i t yo f p u r i f i e db i o d i e s e li sb e t t e rt h a nr a wb i o d i e s e l t h em a i np e r f o r m a n c e p a r a m e t e r so ft h ep u r i f i e db i o d i e s e lm e e tt h ec h i n e s eb i o d i e s e ls t a n d a r d ( b d l0 0 ) ，g e r m a n a b s n 诅c t b i o d i e s e ls t a n d a r d ( d i nv 516 0 6 ) ，b e t t e rt h a nt h ec h i n e s e0 ”d i e s e ls t a n d a r d ( g b2 5 2 - 2 0 0 0 ) a c c o r d i n gt o c o s ta c c o u n t i n gp r e l i m i n a r i l y ，t h es t u d yh a sap r o s p e c to fa p p l i c a t i o ni n i n d u s t r y t h i sw o r kf o r m st h et h e o r e t i c a lf o u n d a t i o nf o rd e v e l o p i n gan o v e lr o u t ea n d l o w e r i n gt h e c o s tf o rb i o d i e s e lp r o d u c t i o n k e yw o r d s ：r h i z o p u sc h i n e n s i s ；w h o l e - c e l ll i p a s e ；t r a n s e s t e r i f i c a t i o n ；b i o d i e s e l ；s o l v e n t f l e es y s t e m l i 独创性j 声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注乖致谢的地方外，论 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： 疆筹 e l期：2 p p8 了 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘， 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 导师签名： 贸矛 2 咖t 弓7 日期：叫 第一章绪论 1 1 生物柴油研究进展 1 1 1 生物柴油 第一章绪论 柴油是一种重要的动力燃料。我国柴油需求量很大，尤其是近几年，某些城市已经 对柴油采取了限量供应的措施。石化柴油大量使用造成了很大的问题：石油资源逐渐枯 竭，石油价格不断上涨；我国每年进口大量石油，石油安全是我国亟待解决的重大问题； 柴油的供需平衡问题也将是我国未来较长时间石油市场发展的焦点问题。因此生物柴油 作为一种可再生的绿色能源已经引起了人们的广泛重视。 生物柴油( b i o d i e s e l ) 是指由动植物油脂与短链醇( 甲醇或乙醇) 进行酯交换反应所制 备的脂肪酸单酯，是一种性质与柴油十分相似的可再生的生物燃料川。植物油不能直接 作为燃料使用的主要原因在于植物油中的甘油三酸酯的碳链过长导致其粘度高流动性 差不易在燃烧室中气化且燃烧不完全。生物柴油利用甲氧基取代长链脂肪酸上的甘油基 将甘油三酸酯断裂为三个长链脂肪酸甲酯从而减短碳链长度、降低油料粘度、改善油料 的流动性和汽化性能以达到作为燃料使用的要求。与石化柴油相比，生物柴油具有下述 无法比拟的性能【2 j ： ( 1 ) 具有优良的环保特性。主要表现在由于生物柴油中硫含量低，使得二氧化硫和硫 化物的排放降低，生物柴油中不含对环境会造成污染的芳香族烷烃，因而废气对人体损 害低于柴油。检测表明，与普通柴油相比，使用生物柴油可降低9 0 的空气毒性，降低 9 4 的患癌率；由于生物柴油含氧量高，使其燃烧时排烟少，一氧化碳的排放与柴油相 比减少约1 0 ( 有催化剂时为9 5 ) ；生物柴油的生物降解性高。 ( 2 ) 具有较好的低温发动机启动性能。无添加剂冷滤点达2 0 。 ( 3 ) 具有较好的润滑性能。使喷油泵、发动机缸体和连杆的磨损率低，使用寿命长。 ( 4 ) 具有较好的安全性能。由于闪点高，生物柴油不属于危险品。因此，在运输、储 存、使用方面的优点是显而易见的。 ( 5 ) 具有良好的燃料性能。十六烷值高， 使催化剂和发动机机油的使用寿命加长。 ( 6 ) 具有可再生性能。作为可再生能源， 努力，其可供应量不会枯竭。 使其燃烧性好于柴油，燃烧残留物呈微酸性 与石油储量不同，通过农业和生物科学家的 此外生物柴油的优良性能使得采用生物柴油的发动机废气排放指标不仅满足目前 的欧洲1 i 号标准，甚至满足随后在欧洲颁布实施的更加严格的欧洲i i i 号排放标准。而且 由于生物柴油燃烧时排放的二氧化碳远低于该植物生长过程中所吸收的二氧化碳，从而 改善由于二氧化碳的排放而导致的全球变暖这一有害于人类的重大环境问题。可见生物 柴油是一种真正的绿色柴油。 因此生产和推广应用生物柴油，对于我国实施可持续发展战略具有十分重要的意 江南人学硕i ：学位论文 义： ( 1 ) 保障我国石油安全：传统能源的日益枯竭，液体燃料的不足己严重威胁到我国的 能源与经济安全，能源紧张需要丌发可再生能源；生物柴油制备原料易得且价廉，可以 在一定程度上摆脱对石油资源的依赖； ( 2 ) 保护生态环境：生物柴油是以生物质为原料的可再生绿色能源，燃烧时不排放二 氧化硫，排出的有害气体比石油柴油减少7 0 左右，且可获得充分降解，有利于生态环 境保护，它对环境的保护作用体现在原料、生产以及消费的各个层面，环境保护与汽车 工业的发展需要清洁油料； ( 3 ) 调整农业产业结构：生物柴油的发展可以创造大量就业机会，促进农村经济发展， 提高农民收入，有助于社会的稳定。 ( 4 ) 经济效益方面：生物柴油生产过程中产生甘油、油酸、卵磷脂等副产品，既可降 低生物柴油的生产成本，又增强了产品的市场竞争力，有较好市场前景。以菜籽油原料 为例，i t 油菜籽可制取约1 6 0 k g 生物柴油，同时可副产1 6 k g 甘油。而纯度高达9 9 7 的特级甘油价格为2 0 0 0 美元t 。可见，制取生物柴油与精制甘油工艺联产，能取得较为 理想的经济效益。 1 1 2 国内外生物柴油的生产和应用现状 目前，世界各国都在积极发展生物柴油【3 】。德国、奥地利、法国、意大利、瑞典、 美国等已陆续制订了生物柴油的质量标准。德国的生物柴油主要是利用油菜籽提炼而 成，是目前生物柴油利用最广泛的国家，其2 0 0 2 年消费生物柴油达1l o 万吨，占世界总 消费量2 1 0 万吨的一半左右。在德国1 7 万家加油站中，有1 4 0 0 个生物柴油加油站。德国 政府鼓励使用生物柴油，对生物柴油生产企业全额免除税收，致使其价格低于普通柴油， 目前每升生物柴油零售价比普通柴油便宜3 1 0 欧分。另外，美国、意大利、日本等国也 已经开始正式生产生物柴油。由于生物柴油竞争力不断提高、政府的扶持和世界范围内 汽车车型柴油化的趋势加快而使其发展前景更加广阔。各国生物柴油的应用概况如表 1 1 n 剥4 ，5 1 。 现在世界生物柴油的总产量为2 0 0 - 2 5 0 万吨，我国目前的生产能力仅2 4 万吨。但我 国有丰富的植物油脂及动物油脂资源，我国每年豆油产量达5 0 0 万吨以上，而且饮食业 产生大量的煎炸油，如加以充分利用，将会有很大的发展空间。然而我国生物柴油工业 生产比国外晚几年，在2 0 0 1 年之后才陆续有工业装置投产，这主要包括海南正和、福建 卓越、四川古杉等，都建立l 2 万吨年左右的生物柴油厂，原料基本都是采用地沟油、 酸化油等。 海南正和机构( 公司) 在河北邯郸建立了年产1 万吨生物柴油的试验工厂，油品通过 石油化工科学研究院以及环境科学研究院的测试，产品性能符合美国生物柴油标准，且 汽车尾气排放比石化柴油低。 四川古杉油脂化学公司已成功开发出生物柴油，该公司以植物油下脚料为原料生产 生物柴油，产品的使用性能与0 “柴油相当，主要性能指标达到德国d i n5 1 6 0 6 标准，年 2 第一章绪论 产量约1 5 万吨，燃烧后废物排放较普通柴油下降7 0 。 我国已经制定了自己的第一项生物柴油国家标准b d l o o ，并由国家质监总局批准自 5 月1r 起实施。这是自乙醇汽油国家标准实施后，我国发布的第二种生物质替代能源的 国家标准。目前，我国柴油的用途主要集中于农用动力机械及公路、水路及铁路运输动 力机械，与美国类似。因此，我国生物柴油标准技术要求是参照美国试验与材料协会标 准a s t m d 6 7 5 1 - 0 3 a 馏分燃料凋合用生物柴油( b l o o ) 标准，并对近年来国内市场上有 一定影响、有一定销售量、不同原料生产的生物柴油产品进行考察、试验，根据情况综 合考虑而确定的。 表1 i 国外生物柴油的应用情况 t a b l el 一1a p p l i c a t i o no fb i o d i e s e la b r o a d 注：b 1 0 表示在石化柴油中添加了1 0 的生物柴油。 1 1 3 生物柴油的制备方法 生物柴油的生产一般采用酯交换反应，通过酯交换反应可以使天然油脂( 甘油三酸 酯) 的分子量降至原来的l 3 ，粘度降低8 倍，同时也提高了燃料挥发度。生产出来的生 物柴油的粘度与柴油接近，十六烷值达到5 0 6 1 。根据反应中不同催化剂的使用，酯交换 法主要可以分为化学法和生物酶法。 ( 1 ) 化学酯交换法制备生物柴油 化学法主要指将动植物油脂和甲醇或乙醇等短链醇在酸或碱性催化剂和 2 3 0 2 5 0 的高温下，转化成脂肪酸甲酯或乙酯。其中最为常用的短链醇是甲醇，这 是由于甲醇的价格较低，同时其碳链短、极性强，能够很快地与脂肪酸甘油酯发生反应， 且碱性催化剂易溶于甲醇等。虽然脂肪酸甲酯与乙酯相比虽然具有生产成本低、产品燃 烧温度低、产能较大等优点，但是甲醇对脂肪酶的毒性较大，而且一般由石油裂解生产， 不能实现生物柴油生产的绿色化、生物化；而利用乙醇生产生物柴油可以实现生物柴油 江南人学硕i ：学位论文 生产的生物化来源，同时乙醇对脂肪酶的毒性较小并且能够更好地溶于油脂，所以虽然 脂肪酸乙酯的粘度和流动性不如甲酯好，但是因其燃烧性能较好，倾点较t l 毛 7 - 1 0 l 而受到 人们的青睐。 化学法常用碱性催化剂包括n a o h 、k o h 、各种碳酸盐等，酸性催化剂则为硫酸、 磷酸或盐酸等。 化学法虽然反应时| 白j 较短，但是存在很多缺点，不仅对原料有很高的要求，反应能 耗高，原料预处理和产物分离纯化的过程较为复杂，同时酸碱废液的排放量较大对环境 造成了很大的污染。 ( 2 ) 生物酶法制备生物柴油 生物酶法指动植物油脂和低碳醇通过脂肪酶进行转酯化反应，得到相应的脂肪酸甲 酯或乙酯。对于酶催化油脂的转酯化反应，2 0 世纪8 0 年代就已经出现在油脂的性质改 造过程中，而酶催化生产生物柴油是n e l s o n 在1 9 9 6 年提出的。至此以后，许多研究者 都对酶催化生产生物柴油过程作出了自己的贡献。目自i 用化学方法生产生物柴油使用的 催化剂存在难以分离以及耗能高等问题，都可以通过酶催化剂的使用加以解决。例如以 多孔高岭石作为载体的固定酶催化剂【1 1 1 ，与其他催化剂相比，不但寿命长，无需经常更 换，而且活性高，易于分离，是一种性能上和经济上都具有竞争力的新型催化剂。b a n 等【1 2 】以固定化脂肪酶催化橄榄油和油酸进行反应，生物柴油转化率可达9 0 。 但是生物法存在以下局限性：一是生物催化剂价格昂贵；二是甲醇对生物催化剂有 毒害作用；三是反应体系粘度过高；四是甲醇转化率不高。而生物柴油工业化最大的瓶 颈就是价格昂贵的酶制剂，因此很有必要开发新型脂肪酶，以制备高品质、低成本的生 物柴油。表l 一2 所示为利用化学法和酶法生产生物柴油的优缺点比较。 表1 2 化学法与生物法的比较 t a b l e1 - 2c o m p a r i s o no fc h e m i c a la n de n z y m a t i cc a t a l y s t s 1 1 4 生物柴油生产原料 理论上一切动物、植物油脂都可以作为生产生物柴油的原料，特别是油脂产量与含 4 第一章绪论 油量高的油料植物，是生产生物柴油的最重要原料。目前，生物柴油主要是在美固和欧洲 国家进行商业化生产与消费，美国主要用大豆，欧洲主要用油菜，大豆和油菜成为当前世 界生产生物柴油的主要原料。另外投入生产的还有棉籽油、米糠油、棕榈油、野生植物 油、桉油、花生油或它们油脚料等。不同国家根据自己的生物资源条件，已经开辟了多 种生物原料来发展生物柴油。加拿大利用海洋鱼类脂肪在自产自用生物柴油，而畜牧业 发达的澳大利亚和新西兰利用牛羊肉食加工中产生的动物脂肪副料进行生物柴油生产， 东南亚国家则采用棕榈、椰子、蓖麻、麻疯树等油脂为原料，而美国可再生能源国家实 验室( n r e l ) 通过现代生物技术建成“工程微藻”，即硅藻类的一种“工程小环藻”，在实 验室条件下生产生物柴油。 虽然我国有丰富的植物油脂，是大豆、油菜生产大国，广袤千里山区又大量种植麻 疯树等油料植物，饭店产生的煎炸油也不少。但是目前我国植物油脂的食用缺口太大同 时增产潜力不足，而且地沟油等垃圾油一般都作为废物处理，还有一些经过地下作坊重 新流入餐桌，直接造成污染。必须在上述资源加以利用的情况下，开发新的油脂来源。 采用廉价原料从而降低成本是生物柴油能否商业化的关键。精制动、植物油的使用 会增加生物柴油的成本，此外还可选择以下几种廉价原料：食品与餐饮行业回收油，如： 煎炸后氧化劣变废煎炸油；非可食用性植物油脂如麻疯籽油、蓖麻油、桐油等。选择一 种价格低廉、转化效果好且来源丰富的油脂是生物柴油工业化生产的关键。 1 1 5 国内外有关课题组利用酶法生产生物柴油的研究状况 目前国内外利用脂肪酶催化合成生物柴油的研究主要以下几个研究小组比较具有 代表性：日本神户大学( k o b eu n i v e r s t i y ) h i d e k if u k u d a 教授为中心的研究小组，y u j i s h i m a d a 教授为中心的大坂市立技术研究院( o s a k am u n i c i p a lt e c h n i c a lr e s e a r c hi n s t i t u t e ) 研究小组以及国内的清华大学刘德华课题组和北京化工大学谭天伟课题组等。这几个小 组目前对酶法合成生物柴油的研究处于领先水平，下面对其研究状况进行概述。 ( 1 ) 同本神户大学h i d e k if u k u d a 教授为中心的研究小组 该小组从1 9 8 8 年开始就对全细胞真菌催化油脂改性进行了研究，在以后的近3 0 年 中，主要对生物柴油的合成做了广泛的研究，主要研究成果如表1 3 所示。 ( 2 ) y u j is h i m a d a 教授为中心的大坂市立技术研究院研究小组 该小组主要从事有关脂肪酶用于油脂深加工的运用，包括油脂多产物分离，生物柴 油生产等。其生物柴油生产大多是和上面的研究小组联合进行( 两个小组有关生物柴油 的生产均为日本新能源工业技术发展组织资助) 。他们对填充床式反应器酶转化生物柴 油进行了研究，论证了酶法生产生物柴油的工业可行性，同时还对酶法醇解用于油脂过 程生产生物柴油进行了综述。该小组在酶法提取油脂工业副产品的研究中取得了较好的 成果，包括从油脂脱臭组分中酶法分离维生素e ，从豆油脱臭组分中分离f 箱醇酯等。 5 江南人学硕 ：学位论文 表1 3 日本神户大学h i d e k if u k u d a 教授为中心的研究小组 t a b l e1 - 3r e s e a r c h e s0 1 3h i d e k if u k u d ag r o u p 年份 研究内容 1 9 8 8 血 1 9 9 9 鱼 2 0 0 0 血 2 0 0 1 年 2 0 0 1 2 0 0 7 生 全细胞真菌催化油脂改性进行了研究，并对固定化华根霉的胞内脂肪酶 进行了研究 利用c a n d i d aa n t a r c t i c al i p a s e 和r h i z o p u so r y z a el i p a s e 对酶法 生产生物柴油进行了初步研究 将固定化c a n d i d aa n t a r c t i c al i p a s e 进行预处理后作为催化剂进行研究， 转化率可达9 7 将r h i z o p u so r y z a el i p a s e 在酵母中表达，得到了酵母重组脂肪酶，并用于 生物柴油的生产中，转化能力也可以达到7 0 有关文章9 篇，分别涉7 2 至l j r h i z o p u so r y z a el i p a s e 发酵条件优化，固定化 处理方法，重复使用批次的影响，发酵底物添加对细胞膜的影响，利用 废油脂作为底物，2 0 l 罐发酵的可行性研究以及利用填充床反应器制备生 物柴油等方面的内容 多年水我国丌腱了一些酶法生产生物柴油的研究开发工作，主要集中在各火高校等 研发单位所进行的实验研究阶段。 ( 1 ) 清华大学刘德华课题组采用乙酸甲酯代替甲醇酶法生产生物柴油的研究已经申 请了多项专利。使用商品化的固定化酶n o v4 3 5 和l i p o z y m et li m 的混合物在叔丁醇溶 剂中反应，最终脂肪酸甲酯得率最高可以达到9 0 以上，反应批次达到了l o o 多次【l 3 1 ， 并对反应的机理和动力学进行了研究。同时该课题组利用米根霉r o r y z a ei f o4 6 9 7 在无 溶剂添加磷酸缓冲的最优化条件下催化大豆油脂反应，最终得率可达8 6 【l 4 1 。 ( 2 ) 北京化工大学谭天伟课题组采用生物酶法制备生物柴油技术也已经获得一定成 果，目前正在进行中试实验。该课题组采用其实验室自制的固定化假丝酵母c a n d i d as p 9 9 1 2 5 作为催化剂，石油醚作为溶剂的情况下，最终转化率可达9 2 【l5 1 。 除了上面这些课题组外，国外基本上涉及到脂肪酶研究的课题组，在酶法生产生物 柴油上都做了一定的工作。包括y yl i n k o 课题组【1 6 1 ，u w et b o m s c h e u e r 课题组【1 7 】等。 国内从事酶法生物柴油研究的还有华南理工大学【l8 j 等。 表1 4 为各相关课题组进行酶法生产生物柴油的研究小结。虽然转化效果都较好， 但是其或者采用商品化酶，或是采用有机溶剂体系，无疑这大大增加了生物柴油的制备 成本。 6 第一章绪论 表l _ 4 各课题组关于酶法生产生物柴油的研究 t a b l e1 - 4r e s e a r c h e so nb i o d i e s e lc a t a l y z e db yl i p a s e 1 2 脂肪酶的研究与应用 脂肪酶( l i p a s e ，e c 3 1 1 3 ，全称t r i a c y l g l y c e r o la c y l h y d r o l a s e ) 三酰基甘油酰基水解 酶，能催化水解三酰甘油为脂肪酸、二酸甘油酯、单酸甘油酯以及甘油，其天然底物一 般是不溶于水溶液的长链脂肪酸酰基酯。可以在异相系统油、水界面或有机相中起作用， 对均匀分散的水溶性底物不起作用，即使有作用也很缓慢。因此，脂肪酶可以说是专门 在异相系统或者非水介质中油( 或酯) 与水的界面上催化的酶【2 4 1 。通过控制反应体系中水 的含量，改变反应条件可以使水解反应向合成方向进行，这些反应通常具有高度的区域 或立体选择性。 1 2 1 脂肪酶的研究概况 脂肪酶是分解油水界面上脂肪的酶。根据n o v on o r d i s k 公司的定义，脂肪酶与酯酶 的区别在于：脂肪酶是可以水解一类特殊的酯键三酸甘油酯的酶，而酯酶则是可以 水解羧酯键的酶。虽然脂肪酶产品市场销售份额只占全球酶制剂产品的百分之四，在工 业生产中的作用还无法与淀粉酶和蛋白酶相比较，但近二十年来由于其用途的不断扩 大，加上脂肪酶的结构、催化机理及特性的复杂性都远远超过了淀粉酶和蛋白酶，因此 其研究也在不断加大。尤其是自1 9 8 8 年，n o v on o r d i s k 公司首次用基因工程菌生产洗 涤剂用碱性脂肪酶获得成功以来，脂肪酶酶源的丌发进入了一个新的时期。商业应用的 脂肪酶通常来自于微生物，除了在水溶液里表现出的水解功能外，大多数在有机溶剂里 能表现出较强的催化活性，脂肪酶可催化一系列不同的反应，一般用来催化酯的水解， 在反应体系中仅存微量水时也能催化酸和醇作用形成酯，并且在这两个反应的基础上可 以催化更多的反应，如图1 1 所示【2 5 1 。其主要反应包括酯化反应【2 6 3 2 1 、酯交换反应、多 肽合成3 3 , 3 4 1 和其他的一些有机合成f 3 5 。7 1 。 目前，随着基因工程手段在酶制剂开发和研究方面的广泛应用以及脂肪酶的品种和 7 江南人学硕i j 学位论文 催化活力的提高，脂肪酶的应用范围也不断扩大，如：洗涤剂、化妆品、医药、农化、 造纸和功能性食品的生产和开发。预计在不久的将来，脂肪酶将同蛋白酶和淀粉酶一样 得到更为普遍的应用。 水解反应： r i 一鼍o r 2 + h 2 0 - r l 一车o h + r 2 o h 6占 酯合成反觑 r ，玉h + r 2 _ o h r 1 1 一。r 2 + h 2 0 l i i i o o 酸解反应： r 1 q 娲甲oh r 3 弋o 卸r 2 + r 1 川hoo 转酯化反应： r 1 _ o r 2 + r 3 1 - 。r 3 1 川r 2 + r l 掣6 ooo 醇解反应： r 川r ：+ r 3 _ o h r t 气o _ 0 r 3 + r 2 _ o h o 氨解反应： r l o r 2 +r 3 一n h 2 - r l 号一m 狼，+ r 2 _ 一d h oo 图1 1 脂肪酶在水相及非水相中催化不同的反应 f i g 1 1d i f f e r e n tr e a c t i o n sc a t a l y z e db yl i p a s ei na q u e o u sa n dn o n - a q u e o u ss o l u t i o n s 1 2 2 脂肪酶的催化机制 脂肪酶的主要来源是微生物、, f i - 孚l 动物和植物。不同来源脂肪酶可催化同一反应。 脂肪酶作用在体系的亲水一疏水界面层，催化部位含有亲核催化三联体( s e r - h i s a s p ) 或 ( s e r - h i s g l u ) 3 8 】。其催化部位位于分子内部，表面被相对疏水的氨基酸残基形成的0 【螺 旋盖状结构覆盖，对三联体催化部位起保护作用【3 9 l 。通过界面活化可提高催化部位附近 的疏水性，导致a 螺旋再定向，从而暴露出催化部位【4 0 】；油水界面的存在，还可以使酶 形成不完全的水化层，这有利于疏水性底物的脂肪族侧链折叠到酶分子表面，使酶催化 易于进行。 1 2 3 脂肪酶的底物特异性 酶的底物特异性取决于酶分子的结构，特别是酶活性中心的结构。因此，不同来源 的脂肪酶，其结构的差异使酶的底物特异性也不同。脂肪酶的底物特异性包括： ( 1 ) 脂肪酸特异性 脂肪酸特异性是指脂肪酸对底物油脂中具有不同的链长、不 同饱和度及不同双键位置的脂肪酸表现出的特殊反应性。不同来源的脂肪酶水解甘油三 酯的脂肪酸特异性有很大差异，并可以通过蛋白质工程对脂肪酶的脂肪酸特异性加以改 造。 第一帝绪论 ( 2 ) 位置特异性位置特异性足指酶对底物甘三酯中l ( 或3 ) 和2 一位置酯键的识别 和水解的反应性。研究证明，不少微生物脂肪酶具有1 ，3 一位置特异性，即它们只能选择 性地催化l ，3 一位置酯键水解，对2 位置酯键没有作用。但在具有l ，3 位置特异性酶催化 的反应中，一般存在速度较慢的非酶催化的酰基迁移，使2 位置酰基跃迁到1 ( 或3 ) 位 置。来源于猪胰、黑曲霉和根霉的脂肪酶，及牛奶脂蛋白脂肪酶( 纯酶) 和人的脂蛋白脂 肪酶均具有1 ，3 位置特异性，对2 位置酯键没有作用；而圆弧青霉的脂肪酶和大鼠脂肪 组织的脂蛋白脂肪酶能水解2 位置酯键，无l ，3 位置特异性。 ( 3 ) 立体特异性立体特异性是指酶对底物甘油三酯中立体对映结构的l ，3 位置 酯键的识别和选择性水解，在有机相中酶促酯合成和酯交换时，酶对底物的不同立体结 构也表现出立体特异性。 脂肪酶不仅在催化甘油三酯水解反应中具有上述三种底物特异性，在催化酯合成与 交换时，同样具有底物特异性。在有机体系中，酶的底物特异性对催化反应有重大的影 响。 1 2 4 脂肪酶在油脂工业中的应用 脂肪酶具有来源广泛和底物特异性多样化的特点，使其在油脂加工和有机合成中有 巨大的应用潜力。近年来，脂肪酶产生菌的选育、微生物脂肪酶的分离纯化及固定化技 术的发展，为油脂工业全面引入脂肪酶生物技术提供了条件。根据反应体系的不同，脂 肪酶可以催化油脂的水解、酯交换、醇解等【4 1 1 。 ( 1 ) 酶促油脂水解由于水和油的不溶性，脂肪酶催化油脂的水解一般都是在双 相的水溶液中进行【4 2 1 。脂肪酶可水解天然油脂，制备脂肪酸、甘油和单甘酯，且特别适 用于具有生理活性而又不稳定的脂肪酸和具有特定结构的甘油单酯的生产。应用酶法催 化油脂水解可避免高温高压的化学法水解所引起的不饱和脂肪酸的氧化、变性，且利用 酶的位置特异性和脂肪酸特异性，可以选择性地水解甘三酯中特定位置的酯键和特定脂 肪酸。 ( 2 ) 酶促酯交换脂肪酶还可应用于催化酯交换反应，通过酯交换反应，可以把 廉价的油脂改良成具有高价值的工业和食用特殊油脂。例如：利用脂肪酶可催化菜籽油 和甲醇进行酯交换反应，制取生物柴油等。 ( 3 ) 油脂甘油醇解脂肪酶可以催化油脂甘油醇解生产单甘酯和双甘酯，且甘油 三酯转化率比化学方法的高，无氧化副产物，产物分离简单。在石化能源同益枯竭的今 天，应用脂肪酶促油脂甘油醇解技术，把天然动植物油脂转换为生物柴油成了目前的研 究热点【4 3 1 。 ( 4 ) 生物精炼生物精炼是借助微生物脂肪酶在一定条件下能催化脂肪酸与甘油 之间的酯化反应，从而把油中的