（发酵工程专业论文）微生物利用甘油发酵生产乙醇的研究.pdf

摘要 摘要 近年来化石能源的日渐消耗引发了人们对新型、可再生能源的深刻思考，世界各国 正积极开发和利用生物质燃料乙醇和生物柴油的生产技术。生物柴油作为乙醇之后的第 二个有望得到大规模推广应用的生物能源产品，备受国内外各界的青睐。目前主要通过 酯交换法生产生物柴油，在生产过程中产生了大量的副产物粗甘油废液。如何合理 利用粗甘油废液，是这一产业面临的新问题，寻求粗甘油利用的新途径己引起人们的普 遍关注。本文从上述两个方面考虑，探索一条利用生物柴油废液发酵乙醇的生产途径， 不仅可解决生物柴油生产过程中大量副产物甘油的再利用问题，也有望为非粮食原料生 产乙醇找到另一种新途径。 本课题以甘油为原料，微生物发酵法生产乙醇。研究了甘油和乙醇的快速测定方法， 建立了发酵液中的甘油含量的h p l c 法，及乙醇的气相色谱顶空进样检测法。 对实验室现有菌种进行筛选，确定浸麻芽孢杆菌为后续乙醇发酵研究的菌种。浸麻 芽孢杆菌种子培养条件优化后的结果为：甘油8 9 ，葡萄糖1 2 9 ，蛋白胨5 9 ，酵母粉5 9 ， 碳酸钙1 0 9 ，水1 l ，p h 9 0 。接种量为1 0 ( v v ) ，4 1 静止培养3 6 h 。优化后的发酵培 养基为：甘油5 0 9 ，谷氨酸钠5 9 ，蛋白胨5 9 ，酵母粉5 9 ，氯化钠5 9 ，硫酸锌1 9 ， 水1 l ，p h 8 0 。在上述工作基础上j 浸麻芽孢杆菌发酵乙醇工艺条件优化得出，分批补 料发酵可以有效地控制底物甘油的浓度，解除高浓度甘油对乙醇发酵的抑制作用。 浸麻芽孢杆菌和红曲菌9 9 0 6 混合发酵可以明显地缩短乙醇发酵周期，提高乙醇产 量。在混合发酵基础上，确定了乙醇补料发酵较优的工艺条件：三角瓶1 l ，装液量7 0 0 m l 红曲发酵液，甘油初始浓度0 2 1 7 m o l l ，以补料方式每隔6 0 h 分五次补加0 2 1 7 m o l l 甘 油浓度的红曲发酵液，每次补加1 0 0 m l ，发酵培养3 6 0 h ，乙醇最高浓度达0 2 2 1 m o l f l ， 乙醇总产率0 6 2 8 m m o l h ，乙醇摩尔转化率为8 7 。5 l 玻璃三角瓶混合发酵甘油生产乙 醇，其乙醇浓度达到0 3 7 0 m o l l ，甘油利用率为8 2 3 ，乙醇摩尔转化率到达8 3 。 采用混合发酵技术，利用粗甘油作为底物发酵生产乙醇。在0 1 0 9 m o l l 粗甘油下， 混合发酵的乙醇甘油转化率高达8 0 7 ，接近乙醇甘油真实理论摩尔转化率8 1 8 ，但 乙醇产量较低仅有o 0 6 7 m o l l 。主要原因是高浓度甘油对浸麻芽孢杆菌生长具有抑制作 用；另一方面粗甘油中含有高浓度的盐离子以及未反应的游离脂肪酸，对浸麻芽孢杆菌 都有较强的毒害作用。因而甘油不能被快速转化，乙醇产量也无法得到提高。 关键词：浸麻芽孢杆菌；红曲菌9 9 0 6 ；混合发酵；乙醇；甘油；生物柴油 a b s t r a e t 。a b s t r a c t r e s e n t l y ，g r e a ta t t e n t i o nw a sp a i dt ot h er e n e w a b l er e s o u r c e sw h e np e t r o l e u ma r eb e i n g d e p l e t e dg r a d u a l l y t h et e c h n o l o g yo ff u e l e t h a n o la n db i o d i e s e lw e r ee x p l o i t u r e d a sa n a t t r a c t i v eb i o f u e l t h eb i o d i e s e li sh o p e f u lt ob ei n d u s t r i a l i z e da f t e rf u e l e t h a d 0 1i n d u s t r i a l i ti s t h em a i nm e t h o db vt r a n s e s t e r i f i c a t i o ni nt h em a n u f a c t u r eb i o d i e s e l a n dg l y c e r o lw a s p r o d u c e da sb y p r o d u c tp l e n t i f u l l y t h en e wp r o b l e mw a sa p p e a r e dt h a th o wt oh a n d l et h e n u m e r o u sq u a n t i t yo fc r u d eg l y c e r o la n dh o wt om a k er e a s o n a b l eu s eo fc r u d eg l y c e r o li nt h e n e a rf u t r u r e an e wm e t h o di se x p l o r e di nt h i ss t u d yt h a te t h a n o lw a sp r o d u c e df r o mc r u d e g l y c e r o lb ym i c r o o r g a n i s m s f i n a l l y ，t h ep r o b l e mo fu s i n gg l y c e r o lw i l lb es o l v e d ，a n da n e w w a y w i l lb ef o u n dt h a te t h a n o lw a sp r o d u c e db yo t h e rs u b s t a n c e si n s t e a do fg r a i n s t h et o p i co ft h i ss t u d yi st oe x p l o r ea p r o c e s sf o re t h a n o lp r o d u c t i o nf r o mc r u d eg l y c e r o l d i s c h a r g e da f t e rb i o d i e s e lm a n u f a c t u r i n gp r o c e s sb ym i c r o o r g a n i s m s t h ea n a l y s i sm e t h o d so fg l y c e r o la n de t h a n o lw e r ee s t a b l i s h e d t h e g l y c e r 0 1 c o n c e n t r a t i o ni nt h ef e r m e n t a t i o n1 i q u i dw a sd e t e r m i n e db yh p l c ；t h ec o n c e n t r a t i o no f e t h a n 0 1w a sm e a s u r e db yh e a d s p a c eg c t h em e t h o dw a ss i m p l ea n da c c u r a t e b y s t r a i n s c r e e n i n g ，p m a c e r a n s w a su s e da se t h a n o lf e r m e n t a t i o ns t r a i n t h e c o m p o s i t i o no fs e e dc u l t u r em e d i u mw a so p t i m i z e da sf o l l o w s ：g l y c e r o l8 9 ，g l u c o s e1 2 9 ， p e p t o n e5 9 ，y e a s te x t r a c t5 9 ，c a c 0 31 0 9 ，h 2 0 1 l ，p h 9 0 ；t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r e c o n d u c t e da t4 1 f o r3 6 ha n a e r o b i c a l l yw i t hi n o c u l u mv o l u m e1o t h eo p t i m i z e d f e r m e n t a t i o nm e d i u mw a sa sf o l l o w s ：g l y c e r o l5 0 9 ，g l u t a m i ca c i d5 9 ，p e p t o n e5 9 ，y e a s t e x t r a c t5 9 ，n a c l5 9 ，z n s 0 4 。7 h 2 0lg ，h 2 01l ，p h 8 0 b a s e do nt h eo p t i m i z e dc o m p o s i t i o no f m e d i u m ，t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t o n so fe t h a n o lw a ss t u d i e d ：i nf e d b a t c hf e r m e n t a t i o n ，t h e i n h i b i t i o no fh i g hc o n c e n t r a t i o ng l y c e r o lw a se l i m i n a t e d ，g l y c e r o lw a su t i l i z e de f f e c t i v e l y ni so b v i o u st h a tt h ef e r m e n t a t i o nt i m ew a ss h o r t e na tt h em i x e df e r m e n t a t i o no f 尸m a c e r a n sa n dm o n a s c u ss p 9 9 0 6 b a s e do nm i x e df e r m e n t a t i o n i nf e d b a t c hf e r m e n t a t i o n t h ei n i t i a lc o n c e n t r a t i o no fg l y c e r 0 1w a s0 217 m o l l t h ee x p e r i m e n tw a sc a r r i e do u ti n1l t l a s k sw i t h7 0 0 m lm o a n s c u sb r o t h s ；a d d i n g0 217 m 0 1 lg l y c e r o li nm o n a s c u sb r o t h sw i t ha i l i n t e r v a lo f6 0 h o u r s 1o o m lm o n a s c u sb r o t h sw a sa d d e da ta ni n t e r v a la n dt h ef e r m e n t a t i o n l a s t e d36 0 h t h ec o n c e n t r a t i o no fe t h a n o lr e a c h e d0 2 2lm 0 1 l t h et o t a lp r o d u c t i v i t yo f e t h a n 0 1w a s0 6 2 8 m m o l ha n de t h a n o lc o n v e r s i o nr a t ew a so b t a i n e da t8 7 i na5 lf l a s k , t h e c o n c e n t r a t i o no fe t h a n o lw a s0 3 7 0 m o l l 。t h eu t i l i z a t i o nr a t eo fg l y c e r o lw a so b t a i n e da t 8 2 3 a n de t h a n o lc o n v e r s i o nr a t er e a c h e d8 3 0 c o m p a r i n gw i t ht h ef e r m e n t a t i o nb y 尸m a c e r a n s t h eu t i l i z a t i o nr a t eo fg l y c e r o la n de t h a n o lc o n v e r s i o nr a t ew e r ei n c r e a s e d o b v i o u s l yb ym i x e df e r m e n t a t i o n t h em i x e df e r m e n t a t i o nw a sa d o p t e df o re t h a n o lf e r m e n t a t i o nu s i n gg l y c e r o l c o n t a i n i n g w a s t e s i n0 10 9 m o l lc r u d eg l y c e r 0 1 e t h a n o lc o n v e r s i o nr a t er e a c h e d8 0 7 t h a ta p p r o a c h e d t or e a lt h e o r yc o n v e r s i o nr a t e81 8 b u tt h ec o n c e n t r a t i o no fe t h a n o lw a so n l y0 0 6 7 m o l l t h em a i nr e a s o ni st h a th i g hc o n c e n t r a t i o no fg l y c e r o li n h i b i t e dt h eg r o w t ho fp m a c e r a n s ； a n dt h eh i g hc o n c e n t r a t i o no fs l a ta n dr e s i d u ef a t t ya c i dw e r eh a r m f u lt ot h em i c r o o r g a n i s m s k e y w o r d s ：p m a c e r a n s ；m o n a s c u s9 9 0 6 ；m i x e df e r m e n t a t i o n ；e t h a n o l ；g l y c e r o l ；b i o d i e s e l i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名：日期： 如留，弓、2 p 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名： 猩亟盐塑墨! 墨，垫 导师签名：期： 第一章前言 第一章前言 1 1 生物能源研究概况 据统计，全球石油可开采年限为4 0 6 年；而亚太地区能源危机尤其严重，可开采年 限仅为1 3 7 年。在原油如此稀缺的情况下，原油价格屡创新高就不难理解。在需求膨胀， 而原油价格高涨的前提下，各国纷纷寻找可替代能源，于是生物能源应运而生。乙醇和 生物柴油是其中较为突出的两种生物能源产品，国内外对其研究与发展尤其重视。 国际市场上，对于燃料乙醇的重视早已兴起。美国，巴西，欧洲等都是对燃料乙醇 这块市场推广较早的国家。美国燃料乙醇工业兴起最早，生产技术相对发达，其乙醇生 产主要原料为玉米。2 0 0 5 年美国消耗了3 6 0 0 万吨玉米，生产出1 3 7 0 万吨燃料级乙醇，这 一消耗量占美国玉米总产量的1 0 。2 0 0 6 年美国乙醇的产量达到1 5 6 0 万吨，投入4 2 0 0 万 吨玉米用于乙醇生产，按照全球平均食品消费水平，同等数量的玉米可以满足1 3 5 亿人 口一年的食品消耗，同时这一消耗量也接近美国每年5 0 0 0 万吨的玉米出口量。美国政府 计划在2 0 1 2 年以前生物燃料的使用量达塑j 2 3 9 0 万吨，谷物原料的消耗量大约为6 8 0 0 万 吨，这相当于加拿大、巴西或印度尼西亚各国谷物的总产量。 巴西是燃料乙醇生产和使用领先的国家，其乙醇生产主要原料为甘蔗。2 0 0 4 年巴西 的乙醇产量达1 2 3 0 万吨，乙醇消费量超过1 0 2 5 万吨。同期乙醇出口量超过2 0 0 万吨。2 0 0 4 年巴西的汽车燃料中乙醇占1 5 4 2 ，全球最高。2 0 0 5 年蔗糖乙醇的产量为1 3 4 0 万吨，2 0 0 6 年乙醇产量到达1 4 3 0 万吨，今后1 0 年内，巴西乙醇年消费量将增加到1 9 0 0 万吨。 欧盟是生物燃料的第三大产地。2 0 0 5 年欧盟生产了3 8 0 万吨生物燃料，占运输燃料 比例为2 ，可以满足1 的汽车燃料需求，其中乙醇8 0 万吨。2 0 0 6 年乙醇产量达n 1 3 0 万吨。欧盟计划在2 0 10 年以前使生物燃料占到所有汽车燃料的5 7 5 ，乙醇使用也将大 大增多。 国内对乙醇生物燃料也有很高的重视。2 0 0 5 年底，中国成为世界第三大的乙醇汽油 生产国，仅次于巴西和美国。燃料乙醇的产量从2 0 0 3 年的4 0 8 6 吨，快速增长至2 0 0 5 年的 1 0 5 万吨，这是一个跳跃式的增长。按照1 ：3 3 比例计算，大概消耗玉米4 3 0 万吨。2 0 0 6 年 燃料乙醇产量达n 1 3 2 万吨，2 0 0 7 年，全国燃料乙醇产量与2 0 0 6 年持平。估算n 2 0 l o 年， 乙醇年需求量将要达n 5 0 0 万吨，而年产量远远达不到要求量。 综合国内外研究状况，大规模的乙醇生产途径有两种：( 1 ) 淀粉质原料生产乙醇燃 料，现代高效的乙醇发酵反应器系统，使得乙醇生产成本大幅度降低n 1 。但生产乙醇的 原料资源明显不足，成本也越来越高，而且产量永远无法满足现实需求。如果一如既往 以大量粮食生产燃料乙醇势必和人“争食 “争地”，造成人类生存隐患，走“非粮” 路线是大势所趋。近来国家已经出台相关文件，除现有几家以粮食生产乙醇外，不再批 准任何企业以粮食生产乙醇，从而限制粮食的消耗。也给乙醇工业带来压力，急迫需要 解决。( 2 ) 农作物茎秆等纤维素废弃物生产燃料乙醇，以木质废弃物为出发点，开展纤 维素废弃物生产燃料乙醇技术的最佳工艺及示范工程研究，虽然原料易得，成本也较低， 但是由于纤维类物质的特殊构造及纤维素酶的水解效率较低，导致纤维素酒精生产成本 江南人学硕士学位论文 高，无法与粮食酒精相竞争。况且农作物废弃物运输困难，耗资大【2 训。因此有必要研 究乙醇生产的其它途径。 生物柴油是继乙醇之后的第二个可望得到大规模推广应用的生物能源产品，近年 来，国内外对其研究与利用也尤为重视。生物柴油近十几年发展很快，1 9 9 6 年世界生物 柴油的总生产能力为1 2 6 3 万吨，2 0 0 1 年世界生物柴油总产量达n 2 1 0 万吨，2 0 0 3 年世界 生物柴油总产量突破3 0 0 万吨。美国的生物柴油产量从1 9 9 9 年的不足4 2 0 0 吨到2 0 0 4 年的 2 5 0 0 0 吨。生物柴油使用最多的是欧洲，2 0 0 6 年中期，欧盟生物柴油产量可超过4 0 0 万吨。 德国目前生产和消费生物柴油11 0 万吨，约占世界总生产量3 5 0 万吨的1 3 。我国生物柴油 产业刚刚起步，但发展较快。目前我国生物柴油年产量已达到几十万吨，预计今后生物 柴油的年产量可达到110 0 万吨【6 。 目前生产生物柴油主要以回收废油、野生油料、植物油、泔水油和餐饮废油为原料， 在n a o h 的催化作用下，与甲醇( 乙醇) 进行发生酯交换反应生成生物柴油，经过反应 的液体分为两部分，上层为生物柴油，下层液为富含甘油的混合物，而且下层液中甘油 含量可达5 0 1 8 j 。如此丰富的生物资源，应进行含甘油的生物柴油副产物综合利用与研 究；并从中找到最有经济价值的产品、可再生资源的合理利用和生产方法最简单的工艺。 含粗甘油的生物柴油废液呈棕黑色，粘度较大，p h 为1 3 1 4 ，n a c i ( 或k c l ) 浓度达到1 。 除含有甘油外，还包括甲醇、碱以及少量溶解的生物柴油和未反应的脂肪酸。现阶段， 生物柴油副产物甘油主要通过直接加工分离，得到不同应用级别的甘油，但分离过程中 碱性条件下，甘油与甲酯、油脂皂化物呈胶状体，分离困难。同时废液中含有高浓度的 盐离子，也无法去除。通过离心或沉降分离出粗甘油后，其生物柴油废液仍然对环境具 有破坏作用，不能彻底地得到根除，有待于进一步研究。近年来，人们利用微生物发酵 甘油生产有用代谢产物，如果能利用微生物对生物柴油废弃物直接发酵生产，不但可以 得到有用的化工原料，降低生物柴油生产成本，而且减少污染物的排放。因此人们对微 生物利用甘油生产各种产品非常重视，其研究也成为国内外学者关注的焦点。 1 2 微生物利用甘油的研究进展 1 2 i 甘油代谢途径的研究 以甘油为唯一碳源和能源，可以沿着以下两条途径发生歧化反应( 如图1 1 所示) ： 还原途径( r e d u c t i v ep a t h w a y ) 和氧化途径( o x i d a t i v ep a t h w a y ) 。 ( 1 ) 还原途径：甘油在以维生素9 1 2 为辅酶的甘油脱水酶( g d h t ) 的催化下生成3 一羟基 丙醛( 3 一h p a ) ，随后在消耗还原当量n a d h 2 的基础上，通过1 ，3 一丙二醇氧化还原酶( p d o r ) 的催化而生成1 ，3 一丙二醇。 ( 2 ) 氧化途径：甘油在甘油脱氢酶( g d h ) 的催化下形成二羟丙酮，迸一步代谢成磷酸 丙酮酸，磷酸丙酮酸继续代谓十以提供微生物生长所需的能量a t p 、生物量、还原量，并 形成最终产物。丙酮酸代谢较多，主要有以下几个途径，其中一条途径经乙酰辅酶a 转 移酶转化为乙醛，最后在乙醇脱氢酶的作用下，最终生成乙醇。另一条途径是：在硫解 酶作用下2 分子的乙酰辅酶a 生成双乙酰辅酶a ，最终生成丁酸和丁醇【9 1 。另外丙酮酸可以 由t c a 循环生产所需有机酸如琥珀酸等 1 0 - 1 2 】，也可以经乙酰乳酸生成2 ，3 丁二醇。 2 第一章前言 a d p p y p h o ，p h o e 印】p 弘1 w 破l k 二，名：b u c c 如t e l a 弹斟一“m 3 厶，矗 图1 1 甘油代谢途径 f i g 1 1t h em e t a b o l i s mp m h w a yo fg l y c e r o l 1 2 2 微生物利用甘油生产乙醇的研究 目前国内利用微生物发酵甘油生产乙醇的研究较少；在国外，日本学者利用含甘油 的生物柴油废副产物，微生物厌氧发酵生产乙醇和氢气引。尽管所产生的乙醇含量较低， 但甘油转化为乙醇的效率高。m a a h n g a l l 等人【1 4 j 利用棕桐油下脚料发酵生产氢气和乙醇 等生物能源，乙醇产量较低，但氢气最大产率可为7 m m o l l h 一。理论上，l m o l 的甘油发 酵生成l m o l 的乙醇，同时产生l m o l c 0 2 和l m o l h 2 ，甘油得到充分利用。不仅乙醇可以作 为清洁燃料，生成的h 2 也可以用作清洁能源，生成的c 0 2 使得反应体系构成厌氧环境， 更加有利于乙醇发酵。从甘油代谢过程来看，甘油发酵产物较多，导致乙醇的理论产率 不可能达到1 0 0 ，同时自身菌体生长的需要也要消耗一部分甘油。因而可以通过代谢 机理的调控，来实现甘油高利用、乙醇高产率的目的。 本课题研究的方向正是由甘油向乙醇转化的过程。上述代谢途径为本课题建立了基 础，从理论上说明了本课题的可行性。近年来，由于大量粮食生产燃料乙醇，造成与人 “争食”“争地”地局面，造成人类生存隐患，走“非粮”路线是大势所趋。国家也规定，除 现有几家以粮食生产乙醇外，不再批准任何企业以粮食生产乙醇，从而限制粮食的消耗。 3 江南大学硕士学位论文 而利用生物柴油废弃物粗甘油发酵生产乙醇，在一定程度上可以缓解乙醇工业所面临的 压力，同时也可以较为合理有效地利用甘油。 1 3 乙醇生产菌株的研究 乙醇发酵过程中，优良的菌种是发酵的关键。传统的酒精生产采用酿酒酵母 岱c e r e v i s i a e ) 发酵，该类微生物具有高产乙醇、高底物耐受、耐酸等优点，是其它微生 物所无法比拟的。但它只能利用已糖，不能利用纤维素和大部分戊糖。而其它的酵母像 p i c h i as t i p i t i s ，c a n d i d as h e h a t a e 和p a c h y s o l e nt a n n o p h i l u s 能够发酵戊糖。但是这些酵母 需在有氧的条件下发酵，对乙醇的耐受力比酿酒酵母要低2 叫倍【”】。为克服酿酒酵母不 能利用纤维素和戊糖这一缺点，可以用木糖还原酶和木糖醇脱氢酶将木糖通过木糖醇转 变成木酮糖，而酿酒酵母可以发酵木酮糖。转化后，酿酒酵母就可以从木糖来生产乙醇， 但生产率很低。而其它一些戊糖如阿拉伯糖等几乎没有自然存在的酵母可以发酵。 运动发酵单胞菌( z m o b i l i s ) 具有较高的乙醇耐受力，允许乙醇浓度达l o o g l 。并且 z m o b i l i s 具有l 卜, s c e r e v i s i a e 较高的最适宜温度，这一点将减少发酵过程中冷却的费用。 然而，z m o b i l i s 只能将葡萄糖、果糖和蔗糖转化为乙醇，这一点限制了这种细菌的应用。 其它一些细菌也可利用混合糖，如：大肠杆菌、克雷伯菌、欧文氏菌、乳杆菌等。但它 们只能产生少量的乙醇，而大部分产物是混合酸和有机溶剂。因此我们可以采用细菌、 酵母重组菌，通过代谢工程来发酵纤维素物质生产燃料乙斛2 6 1 。近年来，通过基因工程 等手段对乙醇菌株进行改造，取得了一定的效果。n i c h o l s 2 6 】将葡萄糖磷酸转移酶( p t s g ) 的基因导入到大肠杆菌中，使之可同时发酵混合糖，乙醇产量可达理论值的8 7 。 m a r t i n e z 【l7 j 通过启动子取代和使用多拷贝基因来增加基因表达，即可消除导入乙醇基因 后的大肠杆菌对高浓度复杂营养物的需要。 随着生物柴油产业的兴起，副产物甘油被大量积累，甘油如何充分利用是近来研究 热点。最近有报道称，e c o l i 厌氧条件下，可利用甘油生产乙醇。产酸克雷伯菌和产气 杆菌直接利用生物柴油副产物甘油生产乙醇，产量虽低但转化率古【玛】。但从目前国内外 研究中发现，能利用甘油发酵生产乙醇的菌种现在还很少，需要通过广泛而有效地筛选， 得到一批甘油利用率高，高产乙醇的菌株。同时通过代谢工程和基因工程等现代科学手 段加以改造，得到更优更适合的乙醇工业菌株。 1 4 乙醇发酵工艺的研究及其应用 1 4 1 糖化发酵 糖化发酵( s f f ) 常用于淀粉质原料发酵生产乙醇，普遍受到人们的重视。它使糖化 和发酵在同一个反应器中进行，减少了总的反应器的体积；另外降低了高浓度的葡萄糖 对于酶水解和酒精发酵的抑制，加快了过程的速度。m o n t e s i n o s 1 6 】以先经9 5 液化后的 小麦面粉为原料，比较了先糖化6 h 再进行s f f ，先糖化后发酵及直接s f f 三种过程， 发现直接s f f 过程发酵周期最短。l p e e v a 2 4 】用已有的模型对s f f 过程进行了模拟，计 算结果与实验吻合。随着生料糖化酶的出现，集液化、糖化、发酵于一体的生料发酵工 艺也受到广泛的重视。u e d a t l 6 】从a a w a m o r i 和a n i g e r 中得到糖化酶可以糖化生淀粉， 成功地实现了生料发酵。但效率还是低于传统糖化发酵。由于生料发酵能耗低，工艺简 4 第一章前言 单，设备投资省等优点，将是糖化发酵的发展方向，具有良好的应用前景。 1 4 2 间歇式发酵 补料分批培养技术介于分批发酵和连续发酵之间，兼有两者的优点。不仅可以解除 底物抑制、产物反馈抑制和葡萄糖分解阻遏效应，而且无需严格的无菌条件，也不会产 生菌种老化和变异问题，适用范围广。目前国内酒精工业以间歇式发酵为主，逐步走向 连续发酵。李宜海等人【1 8 】利用z m o b i l i s j t 料分批培养，乙醇含量达最高值9 3 1 9 l 。钱名 字等人【1 9 】间隔补料发酵木质纤维素，乙醇产量最终为1 4 1 l ，乙醇转化率为9 0 2 。 1 4 3 连续发酵 连续发酵指的是以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同的速度流出 培养液，从而使发酵罐内的液量维持恒定，使培养物在近似恒定的状态下生长培养。目 前我国大多数糖蜜乙醇厂都采用连续发酵法，对淀粉质为原料生产乙醇的连续发酵工艺 还处于研究状态。a l l a i s 等【2 0 】用运动发酵单胞菌以连续发酵式把洋姜汁转化为酒精，生 产速率6 7 2 9 l - h 一，lo o g l 初糖最终产生4 2 9 l 乙醇。s a h m 和b r i n g e r - m e y e r 2 q 用淀粉 水解物为底物进行工业化规模连续发酵生产乙醇，酒精产量达到6 0 9 l ，转化率9 2 。 用聚丙稀制成的生物膜反应器的发酵效率高于悬浮培养发酵，连续培养3 d ，乙醇生产速 率7 0 7 9 l h - 1 ，最终酒精浓度4 9 5 9 l ，转化率o 5 g ，是理论值的9 8 。因此乙醇连续 发酵的工业化生产具有较好的前景，也是目前许多酒精厂乙醇的主发酵工艺。 1 4 4 混合发酵 混合培养酒精发酵的研究在2 0 世纪8 0 年代中期就已经出现，并一直陆续见诸报道。 其在酒精发酵中的研究主要有两个方面【2 2 1 。( 1 ) 混合培养糖化菌与酒精发酵菌，直接发酵 多糖生产酒精。( 2 ) 混合培养葡萄糖发酵菌与木糖发酵菌同步发酵葡萄糖与木糖产酒精。 常用的酒精发酵菌通常以葡萄糖、蔗糖等简单的碳源为底物，而不能直接利用淀粉、 纤维素等多糖，故必须先将这些多糖水解为葡萄糖后，再发酵生产酒精。而采用混合培 养同步糖化发酵淀粉和纤维素生产酒精，可以简化工艺，节约成本。混合发酵淀粉生产 乙醇的研究较多，也取得较好的效果；1 9 8 6 年，h i d e o t a n a k e 将能产0 【淀粉酶的好氧 微生物泡盛曲霉和z m o b i l i s 混合固定于海藻酸钙中，直接发酵淀粉生产酒精【2 3 o s u r e s h 口4 j 等将酿酒酵母和a n i g e r 混合发酵陈腐的高粱米和大米，当底物浓度为1 0 时，酒精浓 度可达2 9 0 和2 0 9 ( v v ) 。y e o n 2 5 j 等混合培养s c h w e n n i o m y c e sc a s t e l l i 和s c e r e v i s i a e ， 直接发酵可溶性淀粉，底物浓度为1 5 0 9 l 时，利用率达9 4 ，酒精浓度为6 4 3 9 m 。 混合发酵在直接利用纤维原料产酒精方面的研究相对较少，可能与纤维素较淀粉难 以糖化有关。d a m m a 【2 6 。2 7 】将s c e r e v i s i a e 与f u s a r i u mo x y p o r u m 混合培养发酵甜高梁杆， 其中f u s a r i u mo x y p o r u m 可在好氧条件下产酶，然后酶水解高粱秆中的纤维素和半纤维 素得到可发酵性糖。最大酒精得率与浓度分别为5 2 8 4 9 酒精1 0 0 9 新鲜高粱秆和 3 5 - - , 4 9 ( w v ) 。 混合发酵除用于直接发酵多糖外，混合培养在同步发酵混合单糖的研究中也受到了 关注。葡萄糖和木糖共发酵面临的主要问题也随之而来。从葡萄糖和木糖共发酵的研究 结果可看出，葡萄糖的转化不存在问题，主要是木糖的同步转化率偏低，因木糖发酵菌 江南大学硕士学位论文 本身代谢木糖能力不强所致。如何控制两种菌的生物量比例、合适的稀释率等参数将有 助于木糖酒精转化率的提高。混合发酵技术在酒精生产上的应用已越来越为人们所重 视，发酵技术也趋于综合化，各种发酵工艺的有效结合将是酒精发酵的最终方向。 1 4 5 固定化发酵 固定化技术在众多科学研究中得到广泛运用。在乙醇工业化生产中，通过对细胞固 定化，可有效增加细胞浓度，提高产率，同时固定化细胞可重复使用，是缩短生产周期、 简化工艺流程的重要措施。常用的方法有吸附、包埋、交联等，可用的固定载体多种多 样，如海藻酸钠【2 8 】、果胶口9 1 、p v a t 3 0 1 、纤维素等。还有人利用中空纤维膜和陶瓷膜反 应器 3 h 进行固定化发酵。田沈等人 3 2 j 用海藻酸钠对z m o b i l i s 进行固定化，在较短时间内， 乙醇产率达到理论值的9 8 。而同等条件下游离细胞的乙醇产率达到理论值的8 8 2 。 因此，固定化z m o b i l i s 可达到短的乙醇发酵周期和高的乙醇产率。但这些方法，使用了 载体材料，增加了附加成本；载体固定化细胞的传递性能差，整体的活性较低，还存在 细胞退化的问题；大规模的制备过程容易出现染菌现象。近些年来，利用某些酵母的自 身的絮凝能力1 3 3 j 形成颗粒无载体固定的方法，以其方法简单、不增加成本、生物活性高 等优点受到重视和得到应用【3 4 d 7 1 。 纵上所述，乙醇发酵工艺趋于多元化发展，不局限于一种技术，但连续发酵是乙醇 工艺的发展方向。因此，本课题中可应用多种发酵工艺手段，最大限度地发挥其优势， 最终达到工业化的水平。 1 5 立题意义 目前，生物柴油的副产物甘油含量较高，其产量占生物柴油的1 0 ；预计到2 0 1 0 年 国内生物柴油的需求达到1 亿吨，那么甘油产量将达至l j l 0 0 0 万吨，甘油量供大于求，剩 余甘油如何处理是面临的一个新的问题，寻求丙三醇利用的新途径已引起人们的普遍关 注。乙醇作为清洁能源一直备受人们的关注，而且燃料乙醇市场需求始终得不到满足。 利用甘油生产乙醇不仅可以解决积累过多的甘油，同时缓解能源燃料不足的局面。 从乙醇发酵方面来看，首先，利用微生物发酵甘油合成乙醇为乙醇工艺提出了一条 新的方向，打破乙醇发酵的传统工艺；其次拓宽了乙醇发酵原料的来源，可以很好地解 决传统工艺利用粮食生产乙醇带来的“与人争食”的矛盾。尽管利用甘油发酵生产乙醇 的研究刚刚起步，其产品仍处于实验室阶段，还不能和传统发酵产品相竞争。但通过菌 种性能的改善、新工艺和新反应器的优化来逐步提高产物浓度、转化率、生产强度以降 低产品生产成本，提高甘油发酵生产乙醇的市场竞争力，进行大规模生产将是无疑的。 从环境保护看，乙醇作为一种清洁能源有着无可挑剔的优点，解决了化石燃料给环 境带来的污染问题，逐渐被人们所接受。 1 6 主要研究内容 ( 1 ) 发酵液中甘油和乙醇含量快速检测方法的研究 ( 2 ) 利用甘油微生物菌种筛选及培养条件的优化研究 ( 3 ) 浸麻芽孢杆菌发酵培养基优化及发酵工艺条件的研究 ( 4 ) 浸麻芽孢杆菌和红曲菌9 9 0 6 混合发酵工艺条件的研究 6 第二章发酵液中甘油和乙醇含量榆测方法的研究 第二章发酵液中甘油和乙醇含量检测方法的研究 目前甘油测定最常用的是化学法 3 8 - 4 0 】，即在水溶液中，甘油与高碘酸钾反应生成甲 酸，以标准氢氧化钠中和生成的甲酸，即可得游离甘油含量。郭萍梅、刘伟伟等1 4 l 4 2 j 人分别研究了生物柴油中甘油含量的化学测定方法。化学法测定甘油含量费用较低，但 操作繁琐，试剂用量大，耗时长，且有时偶然误差极大。酶法测定甘油专一性强h 引，只 与溶液中的甘油特异性地反应，但需要的试剂昂贵，不利于工业应用和大量样品的检测。 测定游离甘油的最灵敏方法是气相色谱法【4 4 , 4 5 j ，精确度较高，但需对甘油进行硅烷化， 操作麻烦，成本也较高【46 ，有报道用w a t e r ss u g a r p a ki 钙型阳离子交换柱高效液相色谱 法同时测定果酒中的糖、甘油和乙醇【4 7 】，分离效果较好，但无机盐和有机酸对甘油分离 影响较大，而生物柴油废弃物中盐浓度较高，因而不能用该色谱柱进行分离。本文在色 谱法的基础上，选用z o r b a xn h 2 柱( 2 5 0m mx 4 6m m ，5 “m ) 高效液相色谱法检测生物 柴油废弃物或该废弃物制备的发酵液中甘油含量，通过色谱条件的优化研究，建立一种 新的快速简单而有效的定量定性甘油分析方法，在该条件下，甘油含量检测结果准确， 且重现性好。同时在前人【4 8 4 9 】研究的基础上利用顶空气相色谱法检测发酵液中低浓度的 乙醇。 2 1 材料与方法 2 1 1 化学试剂 甘油( 色谱纯) 、乙醇( 色谱纯) 、甲醇( 色谱纯) 、乙腈( 色谱纯) 、磷酸( a r ) 、 醋酸( a r ) 。 2 1 2 样品处理方法 甘油样品：生物柴油废弃物或该废弃物制备的发酵液按需要进行一定稀释，微孔滤 膜过滤处理后，用于h p l c ；乙醇样品：直接取3 m l 发酵液样品或乙醇标样于色谱瓶中， 用于g c 。 2 1 3 高效液相色谱条件 高效液相色谱仪：a n g i l e n t11 0 0 系列 方法一：色谱柱：z o r b a xc a r b o h y d r a t e ( 2 5 0m mx 4 6r n l t l ，5 “m ) ；检测器：示差检 测器；柱温3 0 ；流动相：乙腈和水的配比为8 5 ：1 5 ；流速l m l m i n 。 方法二；色谱柱：z o r b a xn h 2 ( 2 5 0m mx 4 6i i r a ，5 岬) ；检测器：示差检测器； 柱温可选2 0 、2 5 或3 0 c ；流动相：乙腈和水的配比可选8 5 ：1 5 ，8 0 ：2 0 ，7 5 ：1 5 或7 0 ：3 0 ； 流速可选0 5 m l m i n ，0 8 m l m i n ，l m l m i n ，1 2 m l m i n 或1 5 m l m i n 。 2 1 4 气相色谱条件 气相色谱仪：s h i m a d z ug c 2 0 1 0 和p et u r b o m a t r i x1 6 顶空进样装置 方法：色谱柱为d b 1 7 0 1 柱3 0 m ( 0 5 3 m m x l 0 u m ) 或p e g 2 0 柱3 0 m ( 0 3 2 m m x l 0 u m ) ： 检测器：f i d ；进样温度：1 6 0 ；检测温度：2 6 0 ；柱温：4 0 ( 保温3 m i n ) 1 8 0 。c ( 保 温2 m i n ) 1 0 。c ；载气为氮气，流速：5 m l m i n ；空气：流速4 0 0 m l m i n ；h z ：流速4 7 m l m i n ： 顶空进样条件：起始温度：7 0 ，保温2 5 m i n ，加压：5 m i n ；传输线温度：1 3 0 。 7 江南大学硕十学位论文 2 2 结果与讨论 2 2 1 发酵液中甘油含量检测方法的研究 2 2 1 1 不同色谱柱对甘油检测的影响 比较了z o r b a xn h 2 和c a r b o h y d r a t e ( 5 9 m ，2 5 0 m i n x4 6 m m ) 这两根正相柱对甘油定 性定量检测的影响。发现用z o r b a xc a r b o h y d r a t e 柱时保留时间为6 5 2 m i n 左右，无法 很好地分离出甘油( 图2 1 ) ，而用z o r b a xn h 2 柱时不仅保留时间与z o r b a x c a r b o h y d r a t e 柱相近，而且分离效果较好，可以得到甘油单一的谱峰且峰形较好( 图2 2 ) 。 所以在以后的实验中采用色谱柱z o r b a xn h 2 ( 5 p m ，2 5 0 m m x 4 6 r a m ) 。 i t 2 1z o r b a xc a r b o h y d r a t e 柱分离色谱图图2 - 2z o r b a x n h 2 柱分离色谱图 f i g 2 - 1t h eh p l cg r a p hu s i n gc o l u m nf i g 2 2t h eh p l cg r a p hu s i n gc