（发酵工程专业论文）制麦过程中根霉对大麦溶解影响的研究.pdf

摘要摘要本文以米根霉c i c c3 1 0 2 、葡枝根霉c i c c4 0 3 1 5 和华根霉c c t c cm 2 0 1 0 2 1 作为实验菌株，研究微生物制麦中菌株选择依据及根霉对国产麦芽改善效果。结果表明葡枝根霉c i c c4 0 3 1 5 对麦芽质量的改善效果最好，其特点为菌丝体健壮，生长最适p h 值为7 0 ，产酶最适p h 值为9 0 ，产酶时间早且延续时间长，制麦过程产酶曲线与大麦一致。“微生物麦芽”中b 葡聚糖含量下降也证实了“微生物酶的降解作用，孢子萌发处理使孢子更好地附着在大麦表面，葡聚糖含量下降7 4 8 ，p 葡聚糖酶酶活增加1 9 3 o ，木聚糖酶酶活增加1 5 2 。在浸麦阶段接种葡枝根霉活化孢子悬液，考察浸麦温度、发芽阶段后期温度及4 5 干燥时问对麦芽中b 葡聚糖含量的影响。以b 葡聚糖含量为指标，采用响应面法对主要工艺参数进行优化并得到回归模型。方差分析结果表明：模型较好反映了b 葡聚糖含量与浸麦温度、发芽阶段后期温度及4 5 干燥时间的关系；最优工艺条件为：浸麦温度2 0 ，发芽阶段后期温度1 5 ，4 5 干燥时间为5h ，在优化条件下微生物麦芽中b 葡聚糖含量为18 8 ( m g 10 0 9 绝干麦芽) ，比优化前下降2 8 4 。微生物麦芽溶解良好，其有机酸组成有利于啤酒酿造的风味要求。从总体上看，微生物麦芽所得的发酵液指标没有异常，微生物麦芽是可以运用于生产的。小剂量丫射线照射对大麦发芽率影响不大；大剂量照射会显著降低大麦发芽力，推迟发芽，照射剂量越高，对芽长的抑制作用越明显。适当照射可以降低麦芽中b 葡聚糖含量，降低麦汁粘度，照射剂量为6k g y 时p 一葡聚糖含量最低，麦芽中p 葡聚糖酶活性最大。t 射线照射可显著影响微生物麦芽的溶解。丫射线的引入利于接种根霉的生长，麦芽中有机酸的变化趋势与接种微生物的代谢有关。微生物分泌的相关降解酶通过菌丝体运输到麦芽内部，菌丝体的侵入是微生物麦芽溶解的关键因素。微生物麦芽不含常见真菌毒素，且葡枝根霉能抑制某些产呕吐毒素菌株的生长。关键词：根霉，制麦，麦芽质量，b 葡聚糖，真菌毒素，丫射线a b s t r a c ta b s t r a c tr h i z o p u ss t r a i nw a ss e l e c t e da n di t si n f l u e n c eo ni m p r o v i n gd o m e s t i cm a l tq u a l i t yw a si n v e s t i g a t e d t h r e er h i z o p u ss t r a i n s ，s u c ha sr h i z o p u so r y z a ec i c c310 2 ，r h i z o p u ss t o l o n i f e ，c i c c4 0 315a n dr h i z o p u sc h i n e n s i sc c t c cm 2 010 21w e r eu s e d i tw a si n d i c a t e dt h a tr h i z o p u ss t o l o n i f e ，c i c c4 0 315w a st h eb e s ts u i t a b l es t r a i nw i t hv i g o r o u sm y c e l i u m t h eg r o w i n ga n de n z y m i cp r o d u c i n go p t i m a lp hw a s7 0a n d9 0 ，r e s p e c t i v e l y , t h ee n z y m ew a sp r o d u c e de a r l i e ra n dl o n g e r ，w h i c hw a sc o n s i s t e n tw i t hb a r l e yd u r i n gg e r m i n a t i o n i tw a sc o n f i r m e dt h a tt h e1 3 - g l u c a nw a sd e g r a d e db yt h ee n z y m ew h i c hw a se x c r e t e db ym i c r o o r g a n i s mi nt h em a l t 1 3 - g l u c a nc o n t e n tw a sd e c r e a s e db y7 4 8 t h ea c t i v i t yo f1 3 - g l u c a n a s ea n dx y l a n a s ew a si n c r e a s e db y19 3 0 a n d15 2 ，r e s p e c t i v e l y a c t i v a t e ds p o r e so fr h i z o p u ss t o l o n i f e rw e r ei n o c u l a t e dd u r i n gs t e e p i n gs t a g e t h ei n f l u e n c eo fs t e e p i n gt e m p e r a t u r e ，g e r m i n a t i n ge v e n i n gt e m p e r a t u r ea n dd r y i n gt i m eo f4 5 o n1 3 - g l u c a nc o n t e n to fm a l tw e r ei n v e s t i g a t e d i tw a ss h o w e dt h a tt h er e g r e s s i o nm o d e lw a sf i t t e d 、撕t 1 1t h ea c t u a lp r o c e s sw e l lb yr e g r e s s i o nc o e f f i c i e n ta n da n a l y s i s b a s e do nt h er e s u l t so fr e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y , t h eo p t i m a lc o n d i t i o n so fm i c r o b i a lm a l t i n gt h a t1 3 - g l u c a nw a sl e a s ti nm a l tw e r ea sf o l l o w s ：s t e e p i n gt e m p e r a t u r ew a s2 0 ，g e r m i n a t i n ge v e n i n gt e m p e r a t u r ew a s15 ，d r y i n go n4 5 f o r5 h t h e1 3 - g l u c a nc o n t e n to fm a l tw a sr e a c h e dt o18 8 ( m g 10 0 d b ) ，d e c r e a s e db y2 8 4 t h a np r e v i o u s l yc o n t e n t d e g r a d a t i o no fm i c r o b i a lm a l tw a sg o o da n dc o m p o s i t i o no fo r g a n i ca c i dh a saf a v o r a b l ee f f e c to nf l a v o ro fb e e r t h e r ew a sn oa b n o r m i t yp e r f o r m a n c ed u r i n gf e r m e n t a t i o no fm i c r o b i a lm a l t ，w h i c ha p p r o v e dm i c r o b i a lm a l t sw o r k a b i l i t y l o wd o s a g eo fg a m m ai r r a d i a t i o nh a v eal i t t l ee f f e c to ng e r m i n a t ea c t i v i t yo fb a r l e y , b u th i g hd o s a g ec o u l dm a r k e d l ye f f e c t e dg e r m i n a t ea c t i v i t ya n dd e l a i e dg e r m i n a t i o n t h eh i g h e rd o s a g ew a su s e d ，t h er e s t r a i n a b l ee f f e c to ns p r o u tw a sm o r em a r k e d p r o p e rd o s a g eo f 丫i r r a d i t i o nc o u l dd e c r e a s e df l - g l u c a ni nm a l ta n dd e c r e a s e dt h ev i s c o s i t y t h ec o n t e n to f1 3 - g l u c a nw a sl o w e s ta n d1 3 - g l u c a n a s ea c t i v i t yw a sh i g h e s tw h e nyi r r a d i t i o nw a s6k g y 丫i r r a d i t i o nc o u l di m p a c t e dd e g r a d a t i o no fm a l ta n dc h a n g e de n t i r o n m e n to fb a r l e ym o r ef i t a b l ef o rs t a r t e rc u l t u r e ，t h ev a r i e t yo r g a n i ca c i di nm a l tw a sa s s o c i a t e dw i t hm e t a b o l i s mo fs t a r t e rc u l t u r e d e g r a d a t e de n z y m ef r o mm i c r o b eg o ti n s i d eo fm a l tb ym y c e l i u m ，w h o s ei n v a d i n gw a st h ek e yf o rm a l t sd i s s o l u t i o n m i r c o b i a lm a l tw a ss a f ef o ru s e ，h a v i n gn on o r m a lm y c o t o x i n s ，a n dr h i z o p u ss t o l o n i f e ，c o u l dr e s t r a i n e dd e l e t e r i o u ss t r a i n st h a tc a ne x c r e t e dd e o x y n i v a l e n 0 1 k e yw o r d s ：r h i z o p u s ；b a r l e y ；m a l t sq u a l i t y ；1 3 - g l u c a n ；m y c o t o x i n s ；丫i r r a d i t i o ni i独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意签名：益私啦日期：j 幽望吐关于论文使用授权的说明本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致保密的学位论文在解密后也遵守此规定签名：j 日j 良导师签名：日期：亍丑血第一章绪论1 1 前言第一章绪论弟一早珀化啤酒有五千年的历史，现在已成为世界上饮用最广泛的饮料之一。我国啤酒年产量居世界第一，目前啤酒产量仍继续增长，啤酒饮料化是当前啤酒风格发展的大趋势。在新世纪，要以质量竞争为首要竞争，并且应加速发展啤酒大麦，加快麦芽厂大型化，推广使用国产大麦l l j 。麦芽是啤酒酿造的主要原料之一，占啤酒成本的重要部分。由于进口啤酒大麦质量较好，国内啤酒厂大量使用来自澳大利亚、加拿大和法国的进口啤酒大麦。2 0 0 2 年以前，我国啤酒行业使用的大麦7 0 靠进口，至u 2 0 0 6 年，国产大麦用于啤酒的原料达至1 j 2 4 9 万吨，占到市场份额的5 3 8 嘣2 1 。啤酒大麦也许从整个国民经济角度来看是个“边缘产业 ，但对于适宜区的农民来讲，它既是传统产业，又是核心产业，所以发展国产啤酒大麦不仅有利于农业产品结构调整，而且有利于降低啤酒成本。但国产大麦存在一定问题，如蛋白质和b 葡聚糖含量高等，可能在麦汁过滤、成品酒过滤乃至成品酒稳定性方面造成负面影响。如果针对国产大麦特点采取相应措施，获得优质麦芽，可以提高国产麦芽使用率，促进啤酒大麦种植业的发展，在质量竞争的新世纪获胜。大麦上的微生物群与大麦的质量及酿造中的问题息息相关【3 l 。制麦条件很适合大麦上的微生物进一步生长，使得成品麦芽上存活的微生物总量为大麦上的2 0 倍以上j 而且某些真菌抗热性很强，经历焙燥阶段仍能存活，生长过程中分泌的真菌毒素威胁麦芽的安全性。谷粒上的微生物易于影响麦芽质量，在制麦时引起质量恶化。如何利用经济有效的方法改善国产麦芽质量，是麦芽制造商迫切需要解决的问题。近年来发展起来的微生物制麦技术倍受关注。据报道【4 】，该技术能够有效改善麦芽的溶解性，提高麦芽质量，制得啤酒的感官质量也非常优秀，而且利用微生物方法改善麦芽质量所需技术相对简单，且具有经济和技术上的可行性。1 2 麦芽品质的影响因素1 2 1 胚乳( 麦芽) 的溶解制麦过程实际上是麦芽逐渐溶解的过程，麦芽溶解可分为两部分：细胞壁组织的降解和蛋白质基质的水解。胚乳是由蛋白质连结的胚乳细胞组成。胚乳细胞壁主要成分是半纤维素和麦胶物质。细胞壁内包含着由蛋白质支撑的淀粉颗粒。发芽开始后，由糊粉层分泌出的蛋白酶首先分解细胞壁间的蛋白质，使细胞壁隔离。细胞壁与半纤维素酶接触被分解，接着蛋白酶进入细胞内分解蛋白质，随之淀粉酶与淀粉接触使淀粉分解1 5 】。上述一系列酶解过程，使得整个胚乳细胞由坚韧变疏松，此过程即麦芽的溶解过程，它是发芽过程的综合结果，其实质是半纤维素、蛋白质及淀粉等高分子物质都发生了不江南大学硕士学位论文同程度的生化反应，相对分子质量有所下降。麦芽的溶解从胚附近开始，沿上皮层逐渐向麦粒尖端发展，靠基部一端比麦粒尖端溶解较早、较完全、酶活性相应较高。麦芽溶解适度则浸出率高，制麦损失也较少。麦芽生产过程中，存在着“度 的控制。溶解过度和溶解不足都不符合生产的要求，如何得到溶解度适当的麦芽，需要在生产中适时调整。1 2 2 决定麦芽质量的因素麦芽是啤酒酿造的主要原料之一，直接或者间接为啤酒提供了丰富的营养物质，占啤酒成本的重要部分。成品啤酒质量的优劣与原料麦芽的品质有直接关系。制麦的目的简单说就是将大麦转变成麦芽。整个制麦过程中有许多重要的生化反应，从浸麦开始并在发芽过程中持续，直到焙燥阶段才告终& 1 6 1 。为获得溶解较好的麦芽，制麦前需要根据大麦特性制定合理的制麦工艺，主要技术指标应满足酿造工艺的需求，符合酿制优质啤酒的要求。麦芽质量除了与制麦工艺有关外，还受大麦质量及微生物的影响。麦芽质量的优劣与原大麦质量有关，大麦质量的好坏会影响到啤酒质量。虽然大麦自身的发芽作用是制麦过程的重要环节，但是大麦上的微生物群对大麦质量、麦芽质量及后续的酿造都有重要影响。大麦中大量微生物的生长使大麦种子的休眠期增长、发芽力减弱，增加制麦损失。污染造成的损害可导致麦芽的变味及变色，可能使麦芽中含有真菌毒枝菌素。已有文献报道【7 - l o 】从大麦、麦芽及啤酒中检测出赭曲霉毒素a ，并建立了相应检测方法。如何在确保麦芽安全性的前提下利用生物学方法控制制麦过程中有害微生物，并寻求合理工艺以得到溶解良好、安全性高的麦芽是制麦行业研究的热点。1 3 利用微生物方法提高麦芽质量的研究1 3 1 微生物制麦研究进展若干年前，人们就发现人为接种一些有益微生物的培养物启动子培养物( s a r t e rc u l t u r e ) ，会与有害微生物形成竞争，抑制有害微生物的生长繁殖，消除其对麦芽质量的不利影响【1 1 】。近年来有关微生物对麦芽质量的有益影响也有报道，利用微生物制麦技术改善麦芽质量的研究也有所发展【1 2 1 。利用有益微生物抑制有害微生物的生长能取得明显效果，例如：交链孢霉、青霉、地霉能提高啤酒的胶体稳定性，乳酸菌、根霉等能改善麦芽的溶解性。y i n 等1 1 3 】报道了从大麦表皮分离到的许多微生物都可以降解p 一葡聚糖；f l a n n i g a n 等【1 4 】报道了大麦表皮的许多微生物能降解阿拉伯木聚糖；h o y 等i l5 j 认为发芽过程中产生的半纤维素酶绝大部分来自于微生物而不是麦芽本身，指出大麦表皮自身存在的微生物菌群种类和数量与制麦过程中大麦b 葡聚糖的降解程度有关。h a i l a r a 【l6 1 7 j 、b o v i n l l 8 , 1 9 、n o o t s l 2 0 。2 2 】分别对制麦过程中接种不同乳酸菌、自地霉和根霉进行了研究，实验表明这些有益微生物能显著提高麦芽品质，n o o t s 等人利用荧光白染色方法对胚乳细胞壁的降解做了更直观的描述，结果表明根霉能很好地促进胚乳细胞壁的降解，促进2第一章绪论麦芽溶解，提高麦芽品质。制麦过程中接种有益微生物根霉，除提高麦芽品质外还可以有效抑制有害微生物生长，抑制麦芽中真菌毒素的含量，提高麦芽安全性。1 3 2 微生物制麦及其机理的初步研究微生物制麦是在制麦过程中添加有益微生物以提高麦芽质量。朱俊勤等】以华根霉为接种菌株初步研究了接种量、接种时间及孢子活化对制麦的影响，结果表明根霉麦芽的许多指标都优于对照组，如粗细粉差、库值、粘度、b 葡聚糖含量等。微生物制麦机理可以简单概括为：接种微生物在生长过程中可以分泌抗生素类物质，抑制其它微生物的生长；协助麦芽溶解：微生物穿透麦芽表皮，分泌的酶系直接协助溶解麦芽胚乳细胞壁；菌丝体的穿透作用改变了麦芽表皮的通透性，间接协助了麦芽的溶解 2 4 】。n o o t s 等人2 0 0 3 年的研究报道了微生物促进胚乳细胞壁降解的作用；朱俊勤又通过扫描电镜技术进一步证实了华根霉菌丝体可侵入麦芽内部。1 3 3 根霉启动子能用于制麦接种的微生物种类很多，包括乳酸菌、假单孢菌、曲霉、地霉、毛霉、根霉等。利用根霉制麦被证明是改善麦芽溶解性的有效办法【2 l 】，成品麦芽称根霉麦芽。根霉麦芽的研究开始于2 0 0 1 年，前人研究成果有：根霉孢子萌发处理有助于接种微生物在制麦过程中尽快达到生长优势；在第一次浸麦水中接种根霉孢子同样促进接种微生物获得生长优势，也具有更好的制麦效果；在制麦过程中引入y 射线，杀死大麦表面的杂菌，达到纯种培养接种微生物的目的，而且射线照射会抑制大麦发芽性能，大麦胚乳细胞壁的降解与接种微生物的作用密切相关；微生物制麦机理可以通过荧光白染色和扫描电镜图证实，可直观观察到胚乳细胞壁的降解及菌丝体的侵入。1 3 4 微生物制麦的应用前景当前德国乳酸菌麦芽、比利时根霉麦芽都已成功进入中试生产阶段，我国尚处于起步阶段。微生物制麦技术之所以成为国内外研究热点，是因为它能用生物方法提高麦芽质量，操作简单，所需费用少，尤其对蛋白质含量高、溶解差的大麦起改善作用。对于啤酒及原料中真菌毒素的研究也早有报道，啤酒作为全球消费饮料，安全性意义重大。大麦在田间生长时，植株上就存在微生物菌群。因此，所有大麦颗粒或种子都具有若干数量和种类的微生物群。在大麦贮存、发芽和麦芽贮存时同样存在各种微生物【3 】。接种微生物能抑制大麦上原有有害微生物生长，减少大麦中真菌毒素含量。通过微生物相互间竞争作用控制有害微生物比外加抑菌素或其他试剂要安全和方便，而且有益微生物的添加还能促进麦芽溶解。1 3 5 微生物制麦需解决的问题选择合适的启动子培养物可以确保发芽所需酶体系平衡，抑制有害菌生长，确定菌株筛选的标准及要求，可以扩大菌株选择面，也可为分子生物学方法改造菌株提供依据。麦芽上接种微生物的有效控制，关系到微生物麦芽的安全应用性，如何在制麦后合江南大学硕士学位论文理控制接种微生物数量是微生物制麦必须考虑的问题，在控制了有害微生物的前提下，有益微生物的数量要尽量少。微生物麦芽的安全性关系到微生物麦芽的推广和应用。大麦及麦芽上原有可分泌真菌毒素的有害微生物是否能在接种菌的作用下得到有效抑制，抑制程度是多少，以及接种菌的各种性能是否会对制麦过程有影响，仍需进一步研究。接种菌株在制麦中对大麦自身的发芽特性有无影响，对麦芽溶解的作用仍处于研究阶段，还需要借助其它技术和方法做深入探讨。y 射线在微生物制麦中仅用于研究微生物对胚乳细胞壁的降解，射线对大麦及麦芽特性和成分的影响尚未研究。一定剂量的射线处理能有效控制害虫，且不会对麦芽造成影响。据报道【2 副丫射线可以降解p 葡聚糖，从而降低粘度、提高过滤速度，说明射线可以为提高麦芽质量提供方法，但具体机理及综合效果还需证实。但是要把y 射线照射技术推荐用于大生产，仍需要继续研究。1 4 立题背景与意义麦芽是啤酒生产的主要原料。麦芽的品质直接影响啤酒质量，要提高啤酒质量，首先要提高麦芽的质量，这是保证生产优质啤酒的第一要素。国产大麦普遍存在蛋白质含量高，玻璃质粒多，皮厚，底色较深等缺陷。表现为制麦过程吸水慢，溶解速度慢，一旦控制不适则难以溶解。当叶芽长度达到籽粒的4 5 时，胚乳的小粒淀粉及贮存蛋白质基本上被溶解，但大粒淀粉的细胞壁部分基本上未穿孔。甚至有的叶芽达到籽粒的4 5 时，胚乳的小粒淀粉部分被溶解大粒淀粉未触动【2 6 1 。因蛋白质含量高，只能以增加物质消耗来改善其品质。同时发芽过程散发热量高、温升快，给工艺控制带来困难。所以，大麦蛋白质含量对麦芽质量有明显影响。使用国产大麦对于降低啤酒成本，增强市场竞争能力，有着决定性作用，因此如何高效利用国产大麦麦芽，是促进我国啤酒行业飞速发展，促进啤酒大麦种植业发展急需解决的问题。近年来利用微生物方法改善麦芽质量已成为制麦工业的新课题。微生物麦芽较普通麦芽有更好的溶解性，且其他方面的指标均有所提高。对于国产大麦蛋白质含量高引起的一些问题有适当的改善作用。基于微生物制麦机理的初步研究，菌丝体对胚乳细胞壁的穿透作用使得大麦自身产生的酶及微生物产生的酶能及时运输到细胞内，对胞内各成分进行降解，极大促进国产麦芽的溶解。接种微生物能有效抑制大麦及麦芽上有害微生物，减小微生物在制麦过程中的负面作用，提高麦芽的安全性，对大麦及麦芽中真菌毒素的降低也有一定作用。利用微生物方法控制啤酒原料真菌毒素含量将是制麦行业新的研究热点。1 5 主要研究内容( 1 ) 微生物制麦菌株选择的依据及对麦芽的溶解作用。( 2 ) 微生物制麦工艺的研究及微生物麦芽的应用性。( 3 ) 丫射线照射对微生物麦芽质量的影响及微生物麦芽的安全性。4第二章用于微生物制麦的较佳菌株选择2 1 前言第二章用于微生物制麦的较佳菌株选择制麦过程中通过引入有益微生物菌株，用来提高麦芽质量是一种新兴的制麦技术，将其定义为微生物制麦技术。合适的微生物菌株是成功进行微生物制麦的核心和首要前提。谷粒上大部分真菌所分泌的酶包括内切木聚糖酶、p 葡聚糖酶和蛋白酶。这些酶促进了谷物基质的降解，同时，谷粒外层的营养物质可被真菌吸收【3 1 。筛选可以在大麦上生长并分泌胚乳细胞壁降解酶以促进胚乳细胞壁降解的菌株是目前研究的主要任务。本章以酶系丰富、根系发达、产孢子多及食品安全性为依据，选择3 株食品工业中常用的华根霉c c t c cm 2 0 1 0 2 1 、米根霉c i c c3 1 0 2 、葡枝根霉c i c c4 0 3 1 5 为实验菌株。本章研究的目的是确定微生物制麦中较优菌选择的依据，比较不同孢子和大麦处理对麦芽溶解的影响。2 2 材料与方法2 2 1 主要材料a 菌种米根霉c i c c3 1 0 2 、葡枝根霉c i c c4 0 3 1 5 ，中国工业微生物菌种保藏中心。华根霉c c t c cm 2 0 10 2 1 ，实验室保藏。b 原料苏啤3 号，江苏( 2 0 0 7 )表2 - 1 大麦理化指标t a b l e2 - 1t h ei n d e x o fb a r l e y2 2 2 仪器设备h p x i i 系列恒温恒湿培养箱h y g a 全温摇瓶柜2 3 0 0k j e l t e c 型凯氏定氮仪5 8 0 4 r 冷冻离心机u v - 2 0 0 0 型紫外分光光度计b g y 8 a 糖化仪电子天平数显鼓风干燥箱上海新苗医疗器械制造有限公司太仓市实验设备厂f o s s 公司e p p e n d o r f ( g e r m a n y )优尼柯( 上海) 仪器有限公司杭州博日梅特勒一托利多仪器( 上海) 有限公司上海博迅实业有限公司医疗设备厂江南大学硕士学位论文h v e 5 0 全自动高压蒸汽灭菌锅日本h i r a y a m a 株式会社s p x 2 5 0 型生化培养箱上海跃进医疗器械厂2 2 3 测定方法a 麦芽中b 葡聚糖酶酶活的测定样品粉碎后( 1 0g ) 悬浮于1 0 0m lp h4 2 醋酸钠浸提缓冲液中。悬浮液于室温下振荡1 5m i n 并离一o ( 1 8 0 0 x g ，1 0m i n ，1 0 ) f 2 0 1 。取上清液按照蓝色大麦p 葡聚糖法【2 伽测定p -葡聚糖酶酶活。酶活单位定义：在4 0 ，p h6 5 条件下，每分钟分解大麦d 葡聚糖产生1p m o l 还原糖为1 个酶活单位，以u g 表示，以麦芽干基计。b 麦芽中木聚糖酶酶活的测定样品粉碎后( 1 0g ) 悬浮于5 0m lp h4 7 的醋酸钠浸提缓冲液中。悬浮液于室温下振荡2 0 m i n 并离，心( 2 8 0 0 x g ，1 5m i n ，1 0 - c ) 1 2 0 1 。取上清液按照d n s 法测定木聚糖酶酶活。酶活单位定义：在5 0 ，保温3 0m i n 条件下，每分钟分解大麦木聚糖产生1 p m o l木糖所需的酶量为1 个酶活单位，以u 儋表示，以麦芽干基计。c 麦芽中蛋白酶酶活的测定样品粉碎后( 1 0 9 ) 悬浮于5 0m lp h 7 2 的醋酸钠浸提缓冲液中。悬浮液于室温下振荡2 0m i n 并离一心( 2 0 0 0 x g ，1 0m i n ，1 0 ) 。取上清液测定蛋白酶酶活。酶活单位定义：在4 0 ，保温1 0m i n 条件下，每分钟分解酪蛋白产生1 p m o l 酪氨酸所需的酶量为1 个酶活单位，以u g 表示，以麦芽干基计。2 2 4 实验方法a 根霉的培养与孢子的收集综合土豆培养基上2 8 培养5d 至平板长有较多孢子，用无菌生理盐水冲洗平板，收集孢子悬液，离，心( 1 6 0 0 x g ，1 0m i n ) ，去上清液。孢子用无菌生理盐水振荡重悬，计数。b 孢子的萌发将孢子悬液转入营养肉汤培养基中( 孢子浓度为2 1 0 6 个m e ) ，于摇床培养( 2 8 ，2 0 0r m i n ) 3h 后，每半小时取一次样，观察孢子有无萌发。c 固态法收集根霉孢子及孢子计数5g 麸皮置于2 5 0m l 三角瓶中，加水比1 ：1 4 ，灭菌。接种孢子悬液1m l ( 事先调整孢子浓度为1 0 6 个m e ) ，八层纱布覆盖，2 8 培养。向固态培养物加入少量o 1 吐温溶液，粗粉碎，充分振荡使孢子分散。8 0 目筛过滤。用吐温溶液冲洗滤渣，一并转入量筒，最后定容至2 0 0m l 。稀释一定倍数后用血球计数板计数，结果换算成每克麸皮的孢子产量。重复3 次，取平均值。d 制麦工艺a浸麦( 2 9h ) ：浸6 断9 浸4 断6 浸4 ；1 5 ：通氧量：l o 次h ；发芽( 9 6h ) ：1 8 2 4h ，1 6 4 8h ，1 5 2 4h ；湿度控制：9 0 。6第二章用于微生物制麦的较佳菌株选择焙燥( 2 2h ) ：4 5 5h ，5 0 6h ，6 0 6h ，7 0 。c 2h ，8 3 3h 。2 3 结果与讨论一2 3 1 菌株的生长特性a 根霉生长最适p h 值环境中的p h 值对微生物的生命活动影响很大，主要作用在于：引起细胞膜电荷的变化，从而影响了微生物对营养物质的吸收；影响代谢过程中酶活性；改变生长环境中营养物质的可给性以及有害物质的毒性。根霉的生长发育必须保持一定的热平衡及酸碱平衡，才能正常摄取营养，合成体内细胞质，繁殖菌丝，分泌各种酶。文献报道 2 3 】在浸麦初期添加孢子效果较好，而浸麦时为促进谷皮中酚类物质的溶出，第一次浸麦水p h 值一般调至1 0 左右，所以要求所选菌株能在碱性环境中生长。图2 - 1根霉在不同p h 值的生长活力图2 - 2 根霉在最适p h 值的生长活力f i g 2 1g r o w i n ga c t i v i t yo f r h i z o p u sw i t hd i f f e r e n tp hf i g 2 - 2g r o w i n ga c t i v i t yo f r h i z o p u sw i t ho p t i m a lp h如图2 1 所示华根霉在碱性环境下生长速度迅速下降其最适p h 为6 0 ，而米根霉和葡枝根霉在碱性环境下可得到良好生长，最适p h 分别为9 0 和7 0 。在浸麦初期添加孢子后，华根霉孢子生长会受到很大抑制，生长活力有所下降，影响后续各种产酶力。对米根霉和葡枝根霉的生长活力和产酶活力影响很小。b 根霉在最适p h 值下生长周期微生物污染过的大麦或麦芽对啤酒会造成危害已在学术界形成共识。微生物污染能形成多种真菌毒素，有些毒素具有强烈致癌性，被微生物污染后的麦芽引发的食品安全问题也是当今研究的一大热点【2 7 渊。所以所选菌株不能在大麦上大量繁殖，在最适条件下进行固态发酵，形成第二代孢子时间较长，在大麦表皮形成第二代孢子的可能性就很小，可以为微生物制麦的安全性提供一定依据。由图2 2 可知三种茵在最适p h 下生长周期均大于7d ，大于制麦周期。再经历焙燥阶段8 3 的高温，大多数不耐热微生物会被杀死，麦芽经烘干后水分仅为5 左右( 数据未显示) ，其表面残留孢子也不会继续生长，而且麦芽经18 个月贮藏后，湿度若为4 - 6 ( w w ) ，其微生物总量基本不变。江南大学硕士学位论文2 3 2 菌株产酶特性麦芽溶解是指麦粒中胚乳结构理化性质的变化。麦粒胚乳由许多细胞组成，其中大颗粒淀粉是糖类中浸出物的主要部分，淀粉小颗粒外包围着定数量的胚乳贮存蛋白质，在小颗粒淀粉之间形成骨架结构，而淀粉与蛋白质又被细胞壁所包围，细胞壁是由葡聚糖、戊聚糖和半纤维素等组成。胚乳溶解过程是蛋白酶首先作用于胚乳细胞壁间的蛋白质，接着葡聚糖酶、戊聚糖酶和半纤维素酶分解细胞壁使其形成多孔结构，随后淀粉酶和蛋白酶等进入胚乳细胞内，进行一系列分解反应，致使胚乳组织疏松，并且淀粉质外露而呈现粉状结构。制麦实际上是麦芽逐渐溶解的过程，在制麦过程中引入有益微生物，可以通过其分泌的各种酶协助麦芽溶解【2 4 】。本章主要考察菌株产蛋白酶、木聚糖酶和p 葡聚糖酶的产酶力，评价菌株的优劣。a 不同p h 下的产酶力各种微生物都有其最适p h 值和一定的p h 范围。在最适范围内酶活性最高，如果其他条件适合，微生物的生长速率也最高。随着环境p h 值的不断变化，微生物生长受阻，产酶力受影响，当超过最低或最高p h 值时，将引起微生物的死亡。所以所选菌株在碱性环境下要有较高的产酶力。a ：争葡聚糖酶b ：木聚糖酶c ：蛋白酶图2 - 3 根霉在不同p h 值产各种酶活力f i g 2 - 3e n z y m ea c t i v i t yo fr h i z o p u sw i t hd i f f e r e n tp h8懈憎旧地蛳嘲蛳哺蛳帅母牛biflr磐窿舞踩*第二章用于微生物制麦的较佳菌株选择产酶p h 偏碱性菌株经历碱性条件不会对自身产酶力有影响，如图2 3 所示华根霉产三种酶的最适p h 为6 o ；米根霉产p 葡聚糖酶和蛋白酶的最适p h 值为7 o ，产木聚糖酶的最适p h 值为9 o ，葡枝根霉产三种酶的最适p h 值为9 0 ，且酶活均较高。结合图2 1 可知华根霉生长与产酶最适p h 均为6 0 ，在碱性环境下不能很好生长，产酶力大为下降；米根霉生长与产酶最适p h 值不致，在生长不受影响的条件下产酶力低，这与菌株自身特性有关；葡枝根霉生长与产酶最适p h 不一致，产酶最适p h 均为9 0 ，酶活性远高于其余两株菌。b 菌株生长阶段产酶力制麦各阶段大麦中酶的质和量对成品麦芽的品质及酿造性能有重大影响。浸麦阶段，胚芽代谢很慢只能形成少量酶类，发芽阶段，酶被激活同时形成大量与制麦和啤酒酿造都有较大关系的酶类，如：淀粉酶、蛋白酶、半纤维素酶、磷酸酯酶和氧化还原酶。干燥阶段，随着水分的降低各种酶活都会有所降低1 2 9 】。接种根霉的产酶时间应延续至发芽阶段，同大麦自身的酶协同作用促进溶解。时间( d )a ：肛葡聚糖酶时间( d )b ：木聚糖酶c ：蛋白酶图2 4 根霉生长阶段产各种酶活力f i g 2 - 4e n z y m ea c t i v i t yo fr h i z o p u sd u r i n gg r o w i n g如图2 - 4 所示华根霉在最适p h 下生长至第5d 时产p 葡聚糖酶和木聚糖酶活力达到最高，第4d 时产蛋白酶活力达到最高，随后逐渐下降；米根霉在最适p h 下生长至第3d 时产酶力达到最高；葡枝根霉产各种酶活力均可持续到生长第5d ，在接种至大麦后对大麦各成分降解时间更长，相同酶活力下作用效果更好。c 制麦过程中根霉产酶力9如”mn博bn963o卜露牛oi1一最蝤誉正暇江南大学硕士学位论文比较了三种根霉和大麦自身经历制麦过程，产酶力的变化，以每克麦芽中酶活表示。麦芽降解速率不仅取决于大麦表面的水分分布和淀粉质胚乳的结构特性，也取决于酶的合成及在胚乳中的释放速率。菌丝体健壮的菌株能够侵入并渗透麦芽表皮，改变麦芽表皮的通透性，其分泌酶体系可以直接作用于麦芽胚乳细胞壁的各成分，协助麦芽溶解【2 4 1 。时间( d )a ：p - 葡聚糖酶时间( d )b ：木聚糖酶c ：蛋白酶图2 5 根霉及大麦制麦各阶段产各种酶活力，f i g 2 - 5e n z y m ea c t i v i t yo fr h i z o p u sd u r i n gg r o w i n g华根霉接种到大麦上经历制麦过程，受大麦自身产酶系统的影响或保护，产酶力一直上升，但是在后续微生物麦芽指标的测定中发现华根霉作用效果并不理想，这与它的菌丝体不够健壮有关，作为菌株运输酶通道的菌丝体不能很好侵入大麦内部，所以菌株产生酶只分布在大麦表面，没有对大麦中b 葡聚糖和蛋白质等起降解作用。米根霉在制麦过程中b 葡聚糖酶经焙燥后活力大为下降，木聚糖酶活力不受高温影响，蛋白酶活力在发芽阶段已经下降，对大麦改善效果也不好。葡枝根霉在制麦过程中产酶曲线与大麦自身产酶曲线一致，且菌丝体健壮，使得各种酶能很好的发挥作用，并且能很大幅度的降低麦芽中p 葡聚糖含量，为理想菌株。2 3 3 根霉对大麦溶解的影响大麦淀粉质胚乳未降解部分的形成与d 葡聚糖含量高有关，而且与大麦中的p - 葡聚糖含量和制麦中p 葡聚糖降解酶的活性有关【2 0 1 。可依据3 - 葡聚糖含量的降低评价根霉对麦芽的溶解作用。l o蔓三里旦堡兰塑型茎塑墼堡堕堡墨堡比较了不同孢子状态及大麦状态对麦芽的改善效果：未萌发孢于悬液，萌发孢子悬液， 萌发孢子悬液+ 擦皮大麦，调整孢子浓度使浸麦水中孢子浓度为1 0 4 + m l 。图2 - 6 根霉施干萌发过程f i g2 q 5s p r o u tp r o c e s s o f r h i z o p 蚶s p o r e图2 - 6 为孢子萌发示意图，将三种菌的孢子接种于营养肉汤培养基中，3h 后取样于显微镜下观察孢子是否萌发，由于三种根霉孢子形状相似，萌发过程相似，所以用同一组图表示，三种根霉孢子萌发时间分别为：华根霉6 h 、米根霉7h 、葡枝根霉5h 。按照制麦工艺a 进行制麦，测定终产品麦芽的b 一葡聚糖含量、b - 葡聚糖酶酶活和木聚糖酶酶活。袁22 接种未萌发抱子悬液所得麦芽指标t a b l e2 - 2i n d e xo f m a l ti n o c u l a t e dn o n s p r o u t e ds p o r e江南大学硕士学位论文表2 4 接种萌发孢子悬液于擦皮大麦所得麦芽指标t a b l e2 - 4i n d e xo fr u b b e dm a l ti n o c u l a t e ds p r o u t e ds p o r e在制麦中添加根霉孢子可使麦芽中b 葡聚糖酶和木聚糖酶活力提高，增加胚乳细胞壁降解。孢子活化和接种条件优化可以增加酶含量，对细胞壁的降解有更持久的作用u 。三组实验比较得出葡枝根霉对大麦改善效果最好，为理想菌株。第一次浸麦水中种接种未萌发孢子悬液，华根霉和米根霉由于菌丝体不够健壮不能很好侵入大麦内部，分泌的酶大多在大麦表皮不能很好地对胚乳各组分起降解作用，菌丝体的部分侵入作用对大麦造成的损伤远大于“微生物酶 的降解作用，使“微生物麦芽 中d 葡聚糖含量高于对照；葡枝根霉菌丝体健壮，分泌的酶可以充分发挥降解作用，麦芽b 葡聚糖含量下降5 1 4 ，p 葡聚糖酶和木聚糖酶酶活分别增加1 1 6 0 和1 6 4 。第一次浸麦水中接种萌发孢子利于孢子附着在大麦表面，增强了华根霉和米根霉菌丝体的穿透作用，d 葡聚糖含量较表2 2 有所降低，葡枝根霉的促进作用进一步增强，麦芽中d 葡聚糖含量下降7 4 8 ，b 葡聚糖酶和木聚糖酶酶活分别增加1 9 3 0 和1 5 2。第一次浸麦水中接种萌发孢子并使用擦皮大麦，由于大麦发芽率低，擦皮处理后影响赤霉酸的分泌，极大减弱了大麦自身酶体系的作用，总降解效果有所下降；葡枝根霉使麦芽中b 葡聚糖含量下降了6 2 2 ，b 葡聚糖酶和木聚糖酶酶活分别增加4 0 0 和1 0 ，受大麦自身理化指标影响，擦皮大麦( 空白及接种根霉) 比未经擦皮处理大麦的1 3 葡聚糖含量高很多。2 4 主要结论1 葡枝根霉c i c c4 0 31 5 为最佳菌株，其最适生长p h 值和产酶p h 分别为7 o 和9 0 ，经历碱性环境生长力和产酶力都不会受很大影响；在最适条件下生长周期小于制麦周期，可有效控制麦芽上根霉含量，还可以作为微生物控制因子抑制其他微生物的繁殖；产酶时间早且延续时间长，可以延续至发芽期，相对作用时间长；制麦阶段产酶曲线与大麦一致，发达菌丝体协助酶在大麦中运输提供大麦各阶段所需酶，协同促进麦芽溶解。2 “微生物麦芽 中p 葡聚糖含量的下降也证实了“微生物酶 的降解作用，孢子萌发处理有利于孢子附着在大麦表面，菌丝体侵入大麦内部，p 葡聚糖含量下降7 4 8 ，1 3 葡聚糖酶和木聚糖酶酶活分别增加19 3 0 和15 2 。第三章响应面法优化微生物制麦工艺及微生物麦芽的应用性第三章响应面法优化微生物制麦工艺及微生物麦芽的应用性3 1 前言国产麦芽与进口麦芽相比，其蛋白质和p 一葡聚糖含量相对较高、浸出率偏低，因此国产麦芽在糖化生产中会出现麦汁黏度大、浊度高、过滤困难等问题，影响啤酒的质量和产量。如果能针对国产麦芽存在的问题采取相应措施，就能同时达到保证质量和降低成本的目的。麦芽淀粉质胚乳细胞中出现的溶解不良区域与b 葡聚糖含量高有关，其受大麦中b 葡聚糖含量和制麦过程中b 一葡聚糖降解酶活性的共同影响。由于这类分子的不对称性和高分子量( 1 5 3 0 万) 以及d 葡聚糖链间可能存在的氢键，酿造中残留过多的b 葡聚糖可能会导致粘度过大以及p 葡聚糖与其它糖化产物结合成聚集物。b a r n f o r t h l 2 0 l 总结了由b 葡聚糖引起的问题：阻止与酶的接触而降低浸出率、减小过滤速度、形成凝胶和浑浊。高蛋白啤酒大麦蛋白结构紧密，大部分组织结构蛋白与b 葡聚糖相结合形成细胞壁，溶解性降低。所形成的结构紧密的玻璃质粒，又影响了大麦的吸水及酶的向内输送，结果必然是蛋白溶解不足【3 0 1 。大麦蛋白质含量越高，原料大麦中的p 葡聚糖含量也高，但是成品麦芽中的b 葡聚糖含量并不一定高。研究表明，麦芽中b 葡聚糖含量与b 葡聚糖酶的活力有关，而与原料大麦中的p 葡聚糖含量无关【3 ，关键是在制麦时提供合适的制麦条件，。提高p 葡聚糖酶的活力，加快b 葡聚糖的降解，可制造出优质麦芽：虽然大麦的生理活动对麦芽质量至关重要，但是大麦上的自然微生物菌群对麦芽质量的影响也不容忽视【3 2 1 。利用微生物方法提高麦芽质量是近年来制麦工业的研究热点。微生物制麦技术通过添加有益微生物来限制其它有害微生物生长和繁殖，并且微生物自身的生理活动也会影响大麦胚乳细胞各成分的降解，进而达到提高麦芽质量的目的。本章以葡枝根霉为接种微生物，研究了制麦过程中浸麦温度、发芽后期温度及4 5 烘干时间对微生物麦芽溶解的影响，鉴于麦芽中b 葡聚糖含量的重要性本文通过响应面分析优化制麦工艺，以麦芽中b 葡聚糖含量为响应值确定最佳制麦工艺。考察了微生物麦芽的酿造性能。3 2 材料与方法3 2 1 主要材料a 菌种葡枝根霉c i c c4 0 3 1 5 ，中国工业微生物菌种保藏中心。b 原料苏啤3 号，江苏( 2 0 0 7 )江南大学硕士学位论文3 2 2 仪器设备高效液相色谱样品处理柱o d s c 1 8循环水式多用真空泵s h b i i i混合纤维素酯微孔滤膜微孔过滤器：其余同第