（发酵工程专业论文）光滑球拟酵母中糖酵解效率与丙酮酸合成的调控研究.pdf

摘要 摘要 本文以一株能在胞外大量积累丙酮酸的光滑球拟酵母( 而卸s 括g 缸6 阳缸) 四重维生素( 硫胺素、生物素、毗哆醇和烟酸) 的营养缺陷型菌株c c t c cm 2 0 2 0 1 9 为研究菌株。以丙酮酸高效生产为目标，在充分了解光滑球拟酵母中能量和碳代 谢途径的基础上利用生物化学和菌种选育的理论和方法，就调控糖酵解效率和丙 酮酸合成的关键因素及其作用机理开展研究。主要研究结果如下： 1 利用氧化磷酸化抑制齐啊鱼藤酮，抗霉素a 和寡霉素) 和菌种诱交从内外源两个 方面研究降低胞内能荷水平对酵解途径的影响及调控机理。添加外源抑制剂 显著降低了胞内a r p 水平，提高了糖酵解关键酶磷酸果糖激酶( p f k ) 活性，进 而提高z 砌6 阳搬葡萄糖消耗速度和丙酮酸生产速度。改变胞内a i p 水平并不 影响糖酵解途径其他关键酶己糖激酶( h k ) 、丙酮酸激酶( p k ) 活性。在氧化磷 酸化途径中，f o f i - 筒r p a s c 在a t p 合成中起着关键性的作用。利用菌种选育技 术获得f o f l a r p a s e 活性降低6 5 的突变株n 0 7 。添加f 庐1 衄a 抑制剂双环 己基碳二亚胺c c d ) 、叠氮钠( n a n 3 ) 、新霉素并不降低突变株n 0 7 的 f 而a t p a s e 活性。f o f l a t p a 活性的降低提高了底物水平磷酸化途径( 酵解 途径诀键酶的活性。与出发菌株比较，n 0 7 菌的葡萄糖消耗速度和丙酮酸生 产速度分别提高了3 4 和4 2 9 ，发酵周期缩短1 2h ； 2 综合外源抑制帮和内源突变对z 幽6 ，玎船能量代谢和酵解的影响，发现：降低 胞内a t p 含量能显著提高p f k 活性( r 2 卸9 9 7 1 ) 和葡萄糖消耗速度( r 2 = o 9 9 6 7 ) 以及丙酮酸生产速度( r 2 = o 9 6 5 1 ，葡萄糖消耗速度的增加是糖酵解途径中关键 酶p f k 活性( 1 0 2 = o ，9 9 5 8 ) 和p k 活性( 】5 海o ，8 7 0 6 ) 增加所导致的。这一结果从能量 代谢流、碳代谢流和关键酶活性等三方面揭示了真核微生物细胞中氧化磷酸 化途径与中心代谢途径( 酵解) 的定量关系； 3 利用高溶氧条件下阻断电子传递链和低溶氧下提高乙醇脱氢酶活性的方法， 研究改变z 幽矗m 幻中n a d h 氧化途径对能量代谢和酵解途径的影响。在摇 瓶中增加培养基中n 朋旷前体物质一烟酸m ) 的浓度促进了葡萄糖消耗速度 ( 2 o l 鲥 l h ) ) 和丙酮酸产量f 4 6 4g 几) 的提高。z 幽胁细c c t c cm2 0 2 0 1 9 经 溴化乙锭( e t b r ) 处理后获得f o f l - a t p a s e ，复合体i ，复合体i + i 、复合体i i + i i i 、 复合体活性下降2 2 2 、4 1 6 、5 3 1 、2 3 6 和8 4 7 的呼吸缺陷型突变 株r d 1 8 ，在细胞生长对数期流加2 1m m o 扎外源电子受体乙醛使呼吸缺陷 型突变株r d 1 8 单位细胞消耗葡萄糖和生产丙酮酸的能力分别提高了1 5 4 江南大学博七学位论文光滑球拟酵母中耱酵解效率和丙酮酸台成的调控研究 和2 3 4 、丙酮酸产量提高1 4 3 、葡萄糖消耗速度提高1 7 6 。外源电子受 体乙醛的添加提高了磷酸果糖激酶活性，降低了胞内n a d h 浓度和 n a d h n d i 十比率： 4 为了提高低溶氧条件下胞内n a d 十含量，zg 肠6 阳船c c t c cm 2 0 2 0 1 9 经亚硝 基胍诱变处理后获得能以乙醇为唯一碳源生长且乙醇脱氢酶( a d m 活性提高 1 1 0 的突变株w s h 1 3 。低溶氧条件下( d o - 2 0 呦，在突变株w s h 1 3 培养体 系中添加并将外源电子受体乙醛浓度维持在4 m 窖几，使得葡萄糖消耗速度、 丙酮酸生产速度、丙酮酸产率和丙酮酸浓度分别提高了1 6 2 、6 8 ，4 4 和4 5 ，而胞内a m 水平和n a d h n a d + 比率则分别下降了1 2 。6 和6 3 9 。 这一结果表明，通过阻断电子传递链或降低溶氧水平能有效地抑制n a d h 通 过氧化磷酸化途径氧化且能显著降低胞内瑚曙水平，在添加外源电子受体乙 醛的条件下，将n a d h 氧化途径从产生大量埘p 的氧化磷酸化途径转向无 a t p 产生的乙醇发酵途径，从而加速了葡萄糖代谢和提高丙酮酸的生产强度； 5 ，通过添加己糖激酶抑制剂c j b a c r o nb 1 u e3 g - a 降低z 咖锄缸己糖激酶( ) 活 性使得葡萄糖消耗速度下降，表明由h k 所催化的葡萄糖磷酸化过程在糖酵 解中起着关键作用。m 9 2 + 需与胞内a = r p 形成m g a r p 复合物才能激活h k 活 性。将菌株c c t c cm 2 0 2 0 1 9 和n 0 7 经n r g 诱变处理后获得h k 活性均提高 4 5 左右的突变株d g r 0 9 和d n l l 。尽管突变株d g r 0 9 中h k 活性提高4 5 ， 葡萄糖磷酸化能力提高4 5 j 3 ，胞内葡萄糖含量降低4 2 4 ，但并不能提高 葡萄糖消耗速度。而突变株d n ll 中己糖激酶活性同样提高4 5 3 ，但葡萄 糖消耗速度提高了1 6 2 ( 菌株n 0 7 ) 、5 1 9 ( 菌株c c l cm 2 0 2 0 1 9 ) 和 4 9 4 f 菌株d g r 0 9 ) 。这一结果表明，在降低细胞能荷水平的基础上提高h k 活性和葡萄糖磷酸化能力促进了f 础6 m 船葡萄糖消耗速度的提高； 6zg 缸6 阳细菌体生长和丙酮酸生产能力随着培养基中氯化钠或山梨醇浓度的 增加而降低。利用p h 控制的连续培养方法，以高浓度氯化钠为选择性压力， 获得了一株能耐受7 0g 几氯化钠或o 6m o l 几山梨醇的突变株r s 2 3 。突变株 在含有1 5 0 以葡萄糖培养基中，发酵8 2h 时葡萄糖消耗完毕，此时丙酮酸 浓度为9 4 3 以，丙酮酸的产率为o 6 3 5 9 值。比出发菌株分别提高了4 i 1 和 1 1 1 。这一结果表明。提高z 幽6 m 以耐受高浓度氯化钠的能力促进了丙 酮酸的生产，为如何解决工业发酵普遍存在的产物抑制提供了新的策略； 7 以解除了酵解抑制的突变株d 咐l l 和解除了产物抑制的突变株r s 2 3 为亲本菌 摘要 株，经三轮g e n o m es h u m i i l g 操作获得了最佳重组子f 3 2 8 。7 - l 发酵罐实验 证实f 3 2 8 丙酮酸产量比c c t c c m 2 0 2 0 1 9 、r s 2 3 和d n l l 分别提高了6 8 1 、 1 9 和5 9 9 ；丙酮酸产率提高了2 9 3 、1 6 s 和5 7 4 ；葡萄糖消耗速度 提高了1 3 3 6 、5 0 5 和3 0 9 ；丙酮酸生产强度提高了1 9 9 、7 3 9 和1 0 5 。 这一结果将两株具有不同遗传背景、具有不同优良工业应用特性的突变株实 现了有机结合 关键词：光滑球拟酵母# 丙酮酸；糖酵解效率：糖酵解；能量代谢；产物抑制 m a b s 扛a d a b s t r a c t t 1 l i sd i 船e r t 撕o nc h o 辩n l em e t a b o l i 锄o f 朗e r g ya n dc a r b o ni n 砀m 砌”西 g 缸6 ，霄细，am m t i 一、，i t a m i l la u x o t r o p l l i ca n dp y n l v a t eo v e r _ p r o d u c d n gy e a s t ，嬲am o d e l s y s t e i nt o 咖d yt l l cp 血c i p a lp h y s i o l o g i c a l 锄db i o c h e l i c a lc h a r a c t e r i s t i c s n e e 丘b c t so fe n e f g ym e t a b o l i 锄0 nt l l e9 1 y c o l y t i cp a t h w a 孔a n dt h em e c h a l l i s mo f p r o d n c t 砌m 劬巧缸zg f 4 6 阳埘w e mi n v e s t i g a t e dj nd e t a i l t h em a 证r 黜i 乜w e r e d e s c r i b e da sf b l l o w s ： 1 t 1 1 i ss t i l d ya i m e da ti n c r e a s i n gt l l eg l y c o l y t i cn l o fam l l l t i 埘t a m i n 懈。仃叩l l i c y e a s t 乃呦妇g 肠6 阳缸b yd e f b c 缸g 晒d a 6 v ep h o s p l l o r y l a t i o mw 毫e ) 【a i n i n c d 锕o d i 儆叫s 仃a t e 百e st 0d e f e c t 商捌v cp h o s p h o f y l a t i o n f i r s ts 仃a t e 舒i sl l s e dt 0 d i s l t l p tm ea c 石、，i 啦o fe t cb ya d d i n g1 0m g 甩s p e c 姬ci n l i i b i 衙o f 唧l e x1 0 悯o n e ) 觚db c lc o m p l e x m 岖m y c i na ) t 0t l l ec m t i l 聆b l 诎o fzg 如6 阳细 c c t c cm 2 0 2 0 1 9 ，w d c h s u l t e di nas i g i l i f i c a n t l yd e c f e a s e di n 仃a c e n u l 盯a = r p l e v c i ( 4 3 姐d2 7 7 ) 弛das i 呈面f i c a n t l yi n c r e a s e dr a ：【e so fg l u c o 踺c o n s u m p t i o n r a t e ( 吼 a i l dp y r i i v a t ep r o h d u 吐i o n ( q p ) f o rt h es e c o n ds b 锄e 鼬i s 、l s e dt od e c r e a s em es p e c i 矗ca c t m 锣o ff 声】一a r p s y n m 嬲c 0 0 5 彻。儿o l i g o m y c i l l ( t h es p e c i f i ci n 坷b i t o ro f f o f t a t p a s e ) w a sa d d e d t ot | 圯c l l l t 啦eb r o mo fz 咖6 m 幻 c c l cm 2 0 2 0 1 9 玷a d d i 石o n ， a n 蚰y c i n - 】f e s i s t a n lm 吣m tn 0 7 ，w 油6 5 o ff 而- a t p a s ca c t i v 毋d e c r e a s e ，w a s s c r c e n e d a sac o n q u c n c e ，m ei n 仃a c e u i d a ra r pl e v e lo f t l l em u t a mn 0 7d e c r e a s e d b y2 4 ，w 1 1 i c hr e 鲫1 t e di n 也eg l u c o s ec p 6 0 n m t ea l l dp y n l v a 把p f o d u c t i v 时o f 也c 枷t a mn 0 7i n 蝴s c db y3 4 a n d4 2 9 ，r e s p c c t i 、，e l y - c o 璐i s t e n d y ，t h e a c t i 伽e s o f k e y9 1 y c 0 1 ”i ce l l 巧m e s o ft l 峙肌l t a n t n 0 7 ， m c l u d i n g p h o s p h o 自j c t o k i n 嬲e ，m m l 、，a t c “r m s ea i l dg l y c e r a l d y d e - 3 - p h o s p b t ed e h y d r o g e n 勰e ， i i l c r e a db y6 3 7 ，2 8 8 孤d1 4 4 ，r e s p e c t i v e l y h l 咖a 埘t 1 1t l l ct w os t r a t e g i e s ，t l l es p e c 访c 删v i t yo fp f k _ = o 9 9 7 1 ) ，龇 a v e m g es p e c i f i cg l u c o c a 删m i r 耳) t i a nr a t e ( = o 9 9 6 7 ) a n d 也ea v e r a g eg p e c i 6 c p y m 伯t ep r o d u c t i m t e 耐= o 9 6 5 ) w e r ec l o s e l yc 0 玎e l a t e dw i mi n 咄e l l l l l a ra t p l e v e la i i da uo fm e mw e r ei 1 1 c f e a s e du n d e rai o w e ri 咖c e l l u l a ra t pl e v d o u r s t i l d i e ss h o w e dm a ti i i l p a i r c do x i d a t i v ep h o s p h o r y l a t i o ni nz 幽6 ，口缸l e a dt 0a d e c r e a s e di n 仃a c e l l u l a ra t pp r o d u c t i o nt i l e r e b ym cg l y c o l y t i cf l l l 】【c o u l db el a r g e l y e n h a n c e d 江南大学博士学位论文光屑球拟酵母中糖酵解效率和丙酮酸台成的调拧研究 2 ho f d c rt 0i n c r e a s et l l ep ”u 、m ep m d u c t i v i 哆t 量l r o u g hr e d i r e c t i l l gn a d ho ) 【i d a t i o n 舶ma 口- p f o d u 翻o np a t l l w a y ( o x j d a 6 v ep h o s p h o 叫a l j o np a i 】w a y ，t 0n 0 丑，a 1 p p r o d u c t i o np 砒w a y ( f 锄c 眦岖v ep 砒唧a y ) w 色e x 锄i n e d 铆od i 仃舐n ts 廿a t e 西e s t 0r e d 曲c tn a d ho x i d 8 t i o mf o rf i r s ts 缸m e g y t w or e s p i r a t o r yd e 6 c i e n t 枷t a n t s ， r d 1 7a n dr d l8 w e f cs c r e c l l e da n ds e l e c t e da f i e re i l l i d i u mb m l l l i d e ( e t b r ) m 渤g e n e s i so f t 量l ep a r ；e n ts 鼢i l lz 肋6 阳细c c t c cm 2 0 2 0 1 9 珏ea c t i v i t i e so f k e y e t ce n z y m e so ft h em u t a n tr d - l8 ，i n c l u d i n gf o f t a = r ps v n m a s e c o m p l 阿t ， c o m p i e xi + m ，c o m p l e x + ia n dc o m p l e x d e c r e a s e db y2 2 2 ，4 1 6 ，5 3 1 ， 2 3 6 锄d8 4 7 ，r c s p e 幽v e l y a ne x o g e n o u se l e c 仃o na c c 印t o r ，a c 咖l d e h y d e ，w a s a d d e dt ot h eg t r a 证r d - j sc u i t u r cb r o t l lt 0o x i d i z et l l ee x c e s s i v en a d h c o m p a r e d 谢也t h ep a r 跚ts 姐i l l t l l cc o n c e n t r a t i o no fp y r i l v a t e 龃dm e 酉u c o s ec o n s u m p t i o n r a t eo fs 嘶i nr d 1 8w e 他i i i c 他a s e db y1 4 3 蠲d1 7 6 ，r e s p e “v e l y ，u p o n a d d i t i 叫o f 2 1n u n o l 甩o f a c e t a l d e h y d e ， f 研曲es e c o n ds n m e 鼢a ne n l a n o i l n j l i z i n gm u t 明tw s h _ 娼、张ss c r e e n e d 粕d l e c t e d 勰e rn i 馆o s o g u a 撕d i n em u t a g e n e s i so f 也ep a r e n t 蛐i nr 咖6 阳幻c c t c c m 2 0 2 0 1 9 c o 删卿l e dw i m t h ep a r e ms 订a 沁m ea l c o h o id e h y d r o g e l l a s ea c 石v 时o f t h e 棚l - a n tw s h - 1 3i n c r e a s e da b o u t1 1 0 柚dn l em u t 卸tc o u l du t n i z ee m a n o la s t h es o l ec a r b o ns o u r c ef o r 寥伽l 砒l ( 1 8g 几d r yc e nw e i g h t ) w h e ng r o w i n go n g l l l c o s e ，t h ea d d i t i o no f4m 班a c e 诅l d e h y d et om c 删t 肌tw s h _ 1 3 “l 咖b r o t i l l e dt 0as i g i l i f i c a mi n c ”嬲ei i l1 l l e9 1 u c o s ec c 咀翮m p t i o nr a t e ( 2 6 3 ) a n dp y n w a t e p r o d u c t i o n ( 2 2 5 ) ，b u tt h c 瑚| t i oo f n a d h ，n a d + d e c r ；e a s e dt oo 2 2 a c e t a l d e h y d e d i dn o ta 腩c tt l l eg j u c o s e 锄de n e 嚼7m e 协b o l i s ma th 曲d i s s o l v e do x y g e n o ) c o n c e n l 舶t i o l l h a w e v e f ，a 毫l d w e rd oc o n c e n l 伯t i o n ( 2 0 ) ，m a i n t a i l l 证gm e a c e t a l d e h y d ec o n c e r 衄a t i o n 血m em u 胁tc u i t i l r eb r o t ha t4mg 几c a u s e da n i n c r e a s e dn a 【) 十c o n c e n 仃a t i o nb u tad e c r e a s e dn a d hc o n c e n t 勰t i o 扎a sa c o l l s e q u e i l c e ，m ep y n l v 撕p r d d u c t i o nr 咖，也ep y m v 如y i e l do ng l u c o s e 铋dt h e p y r u v a t ec o n c e n t r a t i o nw e r e6 8 ，4 4 a n d4 5 h i g h e r ，把s p e c t i v e l y t h a i lt l l e c o l ”s p o n d i n gv a j u e so f t h ec o i i n d l ( w i t l l o u ta c c t a l d c h y d e ) 3 t h ee 疗e c to fc i b a c r o nb i u e3 g a ，as p e c i f i ci i i l l i b i t o ro fh e x o “i l a s e ，o ng i u c o m e t a b o l i s md 厂z 咖矗阳船w a si n v e s t i g a t e d w h e l lo ，3 舢o l lc i b a c f o nb 1 u e3 g a 一。一 w a sa d ( 1 c dt 0 幽ec u l t l l r eb f o t ha tt h cm i d d l ee x p o n e n t i a l 芦。讹p l l a s e ，m ea c t i v 毋 o fh e x o k i m s e ，m em t eo fg l u c o s e p h o s p h o r y l 撕o l l ，t l l e c 彻c e n 仃a t i o no f g l u c o s e 6 一p h o s p h a t ea i l da 1 甲d e c r e a s e d9 0 ，8 8 ，6 4 a n d9 2 5 ，r e s p e c t i v e ly h o w e 、7 e r t h ec o n c e n t r a t i o no f 抽t r a c e l h l l a fg l u c o s e 抽c r e a s 甜2 1 0 ，a sc o m p a r e d a b m r a c c w i m 吐l a to fd l cc o i i 仃o lo l oi l l l l i b i t o ra d d i t i o n ) n e s er e s u l t s m g g e s t e dt l l a t h e ) o l ( i n a s ep l a y c dak e yr 0 1 eo nt h eg l u c o s em e t a b o l i s m t 1 l es p e c i 丘ca c t i v i 锣o f h e x o l d n 髂c j n c r e a d w 让l e i n c r e a o f 也cc o n c e n 仃商o n o f m 尹证缸姒嘣i o n m e d i 咖f o rt h ec a o fw i m o u tm a g n e s i 吼p r e s 哪i i it l l ef e 彻e n t a t i o nm e d i m l l ， t l a c t i v i 锣o fh kd i dn o tc h a n g em u c hr e g a r d l e s so fw h a ta r pc o n c 锄缸a 石o n h o w c v n l es p e c i 矗ca c t i v 时o fh e 】【o k i m s ci n c f e a s e d1 ) l ，i 廿lt l l ei n c r e a o ft l 圮 c c c n t 刎o no f a r pw h e nm a 罂圮s i 岫w 船p 把s e mi l lt h e 鼬锄t i o nm e d i 吼i t i s d u e t o 也e f 融t l l a t t h ea c t i 啦o f h k w a s a c 如a t e d b y 付把m g - 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h x “及h x t 6 7 是主要 的葡萄糖转运蛋白口嘲。另外，h x t 5 、 h t 8 1 1 、h x t l 3 一1 7 、g a l 2 和麦芽糖转运 体如a g t l 、呦7 w 、和y j r l 6 0 c 都参与了葡萄糖的转运【2 1 ，”。这些蛋白对葡萄糖 表现出不同的亲和力，如h n l 和h x t 3 是低结合力转运蛋白，5 0 一l o o 蚰田， 融t 2 、l i x t 4 和融5 则是中度结合力转运蛋白( k 。，l o 衄o n 0 ，i b 嘶和l 蝴是葡 、萄糖高结合力转运蛋白( k 。，1 2 蛐o l 压，) 【5 1 2 ，施加。葡萄糖转运蛋白不仅动力学性 能不同，而且表达类型不同。当葡萄糖浓度高对，己糖转运蛋白与葡萄糖结合力 低；当葡萄糖浓度低时，转运蛋白葡与葡萄糖结合力高【6 ，勰2 4 2 刎。 除对酵母细胞