（材料学专业论文）电化学交流阻抗研究bsa在壳聚糖及精氨酸修饰的壳聚糖表面的吸附.pdf

摘要 电化学交流阻抗是研究吸附等界面现象的先进手段，它能够用来研究蛋白质在 表面的覆盖率，蛋白质吸附热力学，蛋白质吸附的传质过程和蛋白质在表面吸附量 等。壳聚糖及其衍生物在酶固定化、蛋白质分离与提纯、生物材料的开发等方面有 着广泛的应用，深入研究蛋白质在壳聚糖及其衍生物表面的吸附行为有着重要的理 论和现实意义。本文利用电化学交流阻抗法研究了牛血清白蛋白( b s a ) 在壳聚糖和 精氨酸修饰壳聚糖表面的吸附行为，探讨b s a 在这两种表面的吸附覆盖率、吸附量、 吸附的等效电路模型、吸附对材料表面性质的影响和吸附热力学参数，并对蛋白质 吸附过程进行探讨，证明利用电化学交流阻抗法研究蛋白质在聚合物表面吸附行为 的可行性，以揭示蛋白质在壳聚糖及精氨酸修饰的壳聚糖表面的吸附特性。 不同温度和不同浓度的b s a 在壳聚糖表面的吸附特点的研究表明：随着蛋白质 浓度的增大，吸附量也随之增大，最终达到饱和吸附后，吸附量不再随着浓度的增 大而增大；随着温度升高，蛋白质吸附量也增大。所选的等效电路能很好的描述蛋 白质吸附体系的实际状况。 壳聚糖表面的吸附热力学分析研究表明：b s a 在壳聚糖表面的吸附是放热过程， 吉布斯自由能为负值，即b s a 在壳聚糖表面的吸附是一个自发过程，吸附熵值增大。 与用石英晶体微天平研究b s a 在壳聚糖表面吸附行为的实验结果相一致，两者都表 明b s a 在壳聚糖表面的吸附符合l a n g m u i r 等温吸附方程，吸附为单分子层吸附， 吸附量都随着浓度的增大而增大。这表明交流阻抗不仅能有效的研究蛋白质在聚合 物表面的吸附行为，而且在研究与电化学过程相关的蛋白质在聚合物修饰的电极表 面的吸附更有优势。 b s a 在精氨酸修饰的壳聚糖表面的吸附行为研究表明吸附精氨酸修饰的壳聚糖 电极不带电荷，吸附b s a 后精氨酸修饰的壳聚糖电极表面带有一定量的负电荷。b s a 在精氨酸修饰的壳聚糖电极表面吸附覆盖率与本体b s a 浓度以及吸附温度有关。利 用阻抗法和循环伏安法计算出的ag a d s 、h a d s 、s a m 能够较好的吻合，结果都 表明b s a 在精氨酸修饰的壳聚糖表面的吸附行为稍稍放热，是一个自发过程，其主 要推动力是熵值的变化。吸附过程可以用l a n g m u i r 等温方程来描述，吸附为单分子 层吸附。但是温度较高时，出现多层吸附。 b s a 在两种表面的吸附有很多相似性：吸附量都随着b s a 浓度的增大而增大； 吸附过程都是放热过程；吸附都是自发进行的，吸附的主要推动力是熵值的增大。 其主要区别是在同等条件下，b s a 在精氨酸表面的吸附量比在壳聚糖表面吸附量少。 关键词：蛋白质吸附；吸附热力学；电化学交流阻抗；壳聚糖 a b s t r a c t t h eb e h a v i o ro f p r o t e i na d s o r p t i o no ns o l i ds u r f a c e sp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nm a n y i n d u s t r i a la n dm e d i c a lp r o c e s s e s a l t h o u g hg r e a tp r o g r e s sh a sb e e nm a d ei nt h er e s e a r c h o fp r o t e i na d s o r p t i o no ns o l i ds b r f a c 虻si nr e c e n ty e a r s ，p e o p l ek n o wl i t t l ea b o u tp r o t e i n a d s o r p t i o nm e c h a n i s m n o wt h ec h a n g eo fc o n f i g u r a t i o na n do r i e n t a t i o na f t e rp r o t e i n a d s o r p t i o no ns h i f a c e sc 缸ta c c u r a t e l yb ep r e d i c t e d b u ti ti sv e r yi m p o r t a n tt 0p r e d i c ti t f o ru n d e r s t a n d i n g ，c o n t r o l l i n ga n dm a k i n gf u l lu s eo fp r o t e i nb i o l o g i c a lp r o c e s sa t i n t e r f a c e i ti sn e c e s s a r yt os e l e c ta d v a n c e de q u i p m e n t st os t u d yp r o t e i na d s o r p t i o n e l e c t r o c h e m i c a li m p e d a n c es p e c t r o s c o p y ( e i s ) i sap o w e r f u lm e t h o dt os t u d yt h e i n t e r r a c i a lp h e n o m e n o ni n c l u d i n gp r o t e i na d s o r p t i o n , i tc a nb eu s e dt oi na n o t h e rh a n d , c h i t o s a na n di t sr a m i f i c a t i o nh a v ee x t e n s i v ea p p l i c a t i o ni nb i o m a t e r i a la n db i o s e n s o r s s oi nt h i ss t u d y , t h ea d s o r p t i o nb e h a v i o ro fb o v i n es e r u ma l b u m i no nc h i t o s a n s u r f a c eh a sb e e ns t u d i e do v e rt h et e m p e r a t u r er a n g e2 9 3 - 3 3 3 ku s i n ge l e c t r o c h e m i c a l i m p e d a n c es p e c t r o s c o p y t h ei m p e d a n c es p e c t r aw e r ei n t e r p r e t e d i nt e r m so fa l l e q u i v a l e n te l e c t r i c a lc i r c u i t ( e e c ) b a s e do nap o s s i b l ep h y s i c a lm o d e lw i t ht h ec i r c u i t e l e m e n t sr e p r e s e n t i n gt h ee l e c t r o c h e m i c a lp r o p e r t i e so ft h ei n v e s t i g a t e ds y s t e m t h e a d s o r p t i o na m o u n ti n c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s eo ft h eb s a b u l kc o n c e n t r a t i o ni nt h e b e g i n m n g ，a n dt h e ni t d i d n td e p e n do nt h ec o n c e n t r a t i o n b e s i d e s ，t h eh i g h e rt h e t e m p e r a t u r e ，t h eg r e a t e ra m o u n tw a s t h r o u g ht h e r m o d y n a m i c sa n a l y s i s ，t h eg i b b sf r e e e n e r g y , t h ev a l u eo f e n t h a l p ya n de n t r o p yo f a d s o r p t i o nw e r eo b t a i n e d t h er e s u l ts h o w e d t h a tt h ea d s o r p t i o np r o c e s so nc h i t o s a ns u r f a c ei ss l i g h t l ye x o t h e r m i c ；t h el a r g ep o s i t i v e e n t r o p yo fa d s o r p t i o nc o n t r i b u t e ss u b s t a n t i a l l yt ot h ed r i v i n gf o r c ef o ra d s o r p t i o mt h e a d s o r p t i o np r o c e s sw a sas p o n t a n e o u sp r o c e s s c o m p a r e dw i t ht h er e s u l t so b t a i n e db y q u a r t zc r y s t a lm i c r o b a l a n c e ，b o t ho ft h e r e s u l t ss h o w e dt h a tb s a a d s o r p t i o no nc h i t o s a n o b e y sl a n g m u i ri s o t h e r ma d s o r p t i o ne q u a t i o n , a n dt h ea d s o r p t i o nl a y e ri sm o n o l a y e r o n e c a nc o n c l u d et h a te i si so n ee f f e c t i v em e r r sf o rs t u d yp r o t e i na d s o r p t i o n0 np o l y m e r s u r f a c ea n dc a ng e ts o m eu s e f u li n f o r m a t i o n t h es t u d yo fp r o t e i na d s o r p t i o no nc h i t o s a ns u r f a c eh a sp r o v e dt h ef e a s i b i l i t yo f u s i n ge 1 st os t u d yp r o t e i na d s o r p t i o no np o l y m e rs u r f a c e i no r d e rt oc o n f i r mt h e c o n c l u s i o na n ds t u d yt h ep r o t e i na d s o r p t i o nc h a r a c t e r i s t i c w ea l s ou s ee i st os t u d yb s a a d s o r p t i o nb e h a v i o ro na r g i n i n em o d i f i e dc h i t o s a ns u y f a c e t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e e e cs e l e c t e dc a nb eu s e ds u c c e s s f u lt om o d e lt h ep h y s i c a lp r o p e r t yo fp r o t e i na d s o r p t i o n t h es o l u t i o nr e s i s t a n c 2 ( i b ) d e c r e a s e dw i t ht h el n c r c 鹤eo f b u l ks o l u t i o nc o n c c n l r a t i o no r a d s o r p t i o nt e m p e r a t u r e n 帕a r ：i i l = i n cm o d i f i e dc h i t o s a ns u r f a c eh a sn os u r f a c ec h a r g e b u t a f t e rb s aa d s o r b e do nt h es u r f a c e t h es u r f a c ec a r r i e dn e g a t i v ec h a r g e s , w h i c hi n d i c a t e d t h a tt h ep r o p e r t yo f t h es u r f a c ec h a n g e x lb e c a u s eo f p r o t e i na d s o r p t i o no ni t w h a t sm o r e , t h ea d s o r p t i o nc o v e r a g eo fp r o t e i ni n c r e a s e dw i t ht h eb s ac o n c e n t r a t i o na n dc h a n g e d w i t ha d s o r p t i o nt e m p e r a t u r e n l et h e r m o d y n a m i c sp a r a m e t e r so b t a i n e df r o mc vw m c o n s i s t e n tw i t ht h a to b t a i n e d ，b ye i s 1 1 1 ea d s o r p t i o nl a y e rw a sm o n o l a y e ra tm o s t t e m p e r a t u r e ，b u tw h e nt h ea d s o r p t i o nt e m p e r a t u r ew a sr e l a t i v eh i g h , m u l t i a d s o r p t i o nm a y o o c t l r t h e r ea l es o m es i m i l a r i t i e sb e t 、e e nb s a a d s o r p t i o nb e h a v i o r so nc h i t o s a na n d a r g i n i n em o d i f i e dc s a n ：1 1 1 ea d s o r p t i o na m o u n ti n c r e a s e dw i t ht h em “e a s eo fb s a c o n c e n t r a t i o na n da d s o r p t i o nt e m p e r a t u r e ；t h ea d s o r p t i o np r o c e s sw a ss p o n t a n e o u sa n d e x o t h e r m i c t h em a i nd i f f e r e n c ew a st h a tt h ea d s o r p t i o na m o u n to na r g i n i n em o d i f l e d c s a nw a sm u c hm o r et h a nt h a to f c h i m s a n k e yw o r d s ：p r o t e i na d s o r p t i o n ；a d s o r p t i o nt h e r m o d y n a m i c s ；e l e c t r o c h e m i c a li m p e d a n c e s p e c t r o s c o p y ；c h i t o s a n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研 究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获得鑫鲞盘鲎或其他教育机构的学位或证书而使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： 带娟 签字日期：沙口二年月扩日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解鑫鲞盘鲎有关保留、使用学位论文的规定。特 授权叁洼盘茎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有 关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：程始 签字日期：撕6 年f 月熘日 导师签名： 签字日期：少衫年，月侣 彳 日 第一章绪论 1 1 引言 第一章绪论 吸附的本质是因为固体不具有流动性，所以不能像液体那样减少表面积，降低 系统的表面能。固体表面的剩余力场对碰到固体表面的分子产生吸引力，使分子在 固体表面上发生相对聚集，降低表面能。 凡是固体表面暴露于气体或液体之处，都有分子的吸附。在气体与固体、气体 与液体、液体与固体或两种液体之间的任何接触处，甚至是在某种情况下的两固体 接触之处，都可以发现此种现象。一般地说，任何一对原子或分子彼此都相互吸引。 此种引力可以暂时地或者或多或少带永久性地使两者结合起来。若这样一对原子或 分子之一是构成表面的原予，而另一个是自由的气体分子或溶解于液体中的分子， 它们相互作用的结果就把后者暂时束缚于表面上，因此发生了吸附。若在结合过程 中，每一个被吸附的分子与表面组成部分的特性都保持不变时，我们就称之为物理 吸附。若在吸附过程中，分子给表面一个电子，或者由表面得到一个电子，或分子 被撕成原子或自由基而分别被束缚起来，或者分子与组成表面的一个或数个质点共 用电子时我们就称之为化学吸附”。 蛋白质吸附现象的研究对生命科学与工业生产都有着重要意义。蛋白质在固一液 界面的吸附行为对于基础生物化学、生物物理以及各种技术应用领域的研究都相当 重要。蛋白质吸附研究可以追溯到1 9 世纪。早在1 8 5 1 年，人们观察到摇动蛋白质 溶液会造成蛋白质由于变性或不溶而在界面上聚集。从二十世纪二十年代到四十年 代初，l a n g m u i r 等人研究了蛋白质在空气水界面上的吸附行为。近些年来，随着 生命科学研究的深入，人们更加关注蛋白质在固一液界面上的吸附行为 2 - ”，因为这 对生物材料的开发、食品加工和固定化酶都有非常重要的意义。 一般来说，在两相之间形成的界面的表面自由能要比本体相的表面自由能高， 正因为如此在界面上就会吸附各种不同于溶剂的物质来维持界面的热力学稳定性。 由于吸附了某种物质，基质的结构和性能或多或少发生变化。在各个领域，蛋白质 在固体表面的吸附都是非常普遍的现象，吸附蛋白质的结构和功能以及它们的吸附 量都是影响基质物理、化学性质的重要因素。 蛋白质是一种两性大分子，它具有很好的表面活性。目前虽说已经开发了一些 能抑制蛋白质吸附的表面，但蛋白质几乎能吸附在任何表面上，并形成非共价键相 互作用，如氢键、亲疏水、静电相互作用等。小分子吸附同样也存在这种相互作用， 但是蛋白质体积远大于小分子，且吸附过程中蛋白质分子可能会发生各种转变，因 此它的吸附行为又不同于小分子在固体表面的吸附。这种转变最终会导致蛋白质变 l 一 第一章绪论 性或者失活。另外，蛋白质吸附过程通常都是不可逆的。 蛋白质的竞争吸附则更复杂，与小分子存在很大差别，这也是因为蛋白质分子 的吸附是不可逆的。例如，如果吸附行为是可逆过程，可以通过同种类的表面活性 剂的吸附行为来推测混合体系中的另一种低分子表面活性剂的吸附行为，这是因为 它们之间很容易进行替换。但是，已经被吸附的一种蛋白质可能被另一种蛋白质替 换下来，也可能不会被替换下来，所以蛋白质的吸附行为不能象小分子那样进行替 换推测。 由于吸附蛋白质的取向和构象极其重要，人们试图提出各种理论来解释蛋白质 吸附行为，包括与蛋白质折叠有关的熵变。 吸附蛋白质的固体表面的性质对蛋白质吸附行为有很大影响。材料表面的化学 性质不仅影响蛋白质吸附的初始速率和蛋白质吸附的整个过程，同时还影响蛋白质 吸附的机理。一般认为蛋白质的疏水性越强，吸附蛋白质量越大。在这一理论的验 证方法中，有很多实验是通过将吸附剂从溶液中分离出来，然后去除残留溶液的办 法来计算蛋白质吸附量的，这种方法可能会造成测得的在亲水性表面上的蛋白质的 量要比实际值低，因为在亲水性表面上蛋白质的吸附可能是可逆的。因此，现在人 们趋向于采用更有说服力的在线的方法来测定蛋白质吸附量，如椭圆偏振、荧光法、 石英晶体微天平等。除了实验办法，人们还用各种蛋白质吸附动力学模型来预测蛋 白质吸附的动态过程。 1 2 蛋白质吸附的动力 蛋白质吸附研究的一个重要方面就是吸附的动力问题。这是因为吸附动力将会 对蛋白质吸附量、蛋白质吸附层结构和蛋白质吸附动力学等产生影响。与较简单的 均聚物相比，蛋白质吸附的推动力更加复杂。对蛋白质吸附熵有贡献的推动力可能 包括范德华力、亲疏水作用和静电相互作用等，而熵变的基本机制可能包括反电荷 的释放，和或由于吸附诱导的构象的改变而使有序结构( 如a 一螺旋或b 一折叠) 分子 数量减小睁”。下面将对蛋白质吸附的动力作一个简单的分析介绍。 1 2 1 界面传质过程 蛋白质吸附是通过以下步骤进行的：( 1 ) 蛋白质分子从溶液中传到界面；( 2 ) 吸 附到表面；( 3 ) 高表面覆盖率处的蛋白质与邻近的蛋白或溶液中的蛋白质吸附作用 发生解吸；( 4 ) 吸附蛋白质发生构象或者取向的重排；( 5 ) 蛋白质的解吸。 对蛋白质吸附来说，第一步是扩散或者传送过程，这一过程是由本体溶液的浓 度，液相中液体的动力学过程以及吸附物质的扩散系数决定的。蛋白质在固体表面 的黏附通常是很快而且不可逆的，接下来就是蛋白质分子的松弛或不同分子在表面 2 第一章绪论 上重新取向，如果松弛过程非常慢，则松弛和取向过程是控制吸附速率的主要因素， 如果松弛时间很短，则扩散过程控制吸附速率的主要因素，总的吸附动力学不会发 生改变。 1 2 2 蛋白质一表面相互作用 近年来，已经有很多高聚物被用来制作生物医用仪器，这些仪器在很多情况下 都与血液、体液、组织等接触。当生物材料与血液接触后，血浆蛋白就会很快吸附 在材料表面，依据吸附蛋白质的种类和吸附量的不同，吸附层可能会引起血小板黏 附和活化，从而导致血栓的形成。为了避免这种现象的出现，人们对材料性能进行 大量的研究，试图得到能够大大减少蛋白质在表面吸附的材料。例如，接枝有p e o 的表面能够减少蛋白质的吸附。虽然对其表面抑制蛋白质吸附的机理没有完全弄清 楚，但是这似乎与空间位阻有关。 表面能抑制蛋白质吸附的材料与其应用息息相关。蛋白质具有极好的表面活性， 因此，需要采用切实可行的方法来得到一种表面，这种表面易于在活性蛋白如纤维 蛋白原表面上吸附层惰性的蛋白如血清蛋白。有些蛋白能吸附在大部分固体表面 上，因此研究蛋白质在固液界面上的非特异性吸附是非常重要的。为了研究蛋白质 在不同表面上的非特异性吸附，有必要提及以下两种吸附机理：( 1 ) 亲疏水性吸附；( 2 ) 静电相互作用吸附( 两种吸附机理可能同时存在) 。深刻理解亲疏水相互作用和其对 蛋白质吸附、蛋白质松弛的影响对生物相容性材料的开发至关重要。正因如此，很 多研究都选用具有不同疏水性的材料作为研究对象。除了亲疏水相互作用外，对蛋 白质与表面间的电荷电荷相互作用的深刻了解也相当重要。虽然对静电相互作用的 影响还没有形成明确的一致结论，一种假设认为电荷问的吸引力将会支配同电荷间 的排斥作用。如果这种假设成立，情况将会更加复杂，因为蛋白质本身就是一个带 有很多带电基团的物质，有的基团带正电，有的带负电。我们必须考虑到蛋白质在 吸附过程中是一个纯点电荷的颗粒还是一个带有很多电荷的组装起来的颗粒。 虽然存在很多例外情况，多数蛋白质更容易吸附在疏水性表面上而不是亲水性表 面上 6 - 8 。这可以通过一系列具有梯度的疏水性表面来很好的验证【9 】。这种现象很可 能与吸附在亲水性表面和疏水性表面上蛋白质的构象有关 t o q 3 。蛋白质吸附表面之 间的静电相互作用也是相当复杂的。简单地说，根据蛋白质静电力的作用情况的不 同，可以将它们分为两类。那些在吸附过程中构象发生巨大变化的蛋白质( 根据文献 称之为“软”蛋白) ，非静电相互作用对吸附起重要作用，因此蛋白质吸附行为一般 不受静电力控制。而那些吸附过程中表现出的构象变化很小或者几乎没有构象变化 的蛋白质( u p 所谓的“硬”蛋白) ，吸附趋于受静电作用支配。这样的体系与某些简 单的胶体体系有着相似性。有效的探测蛋白质表面相互作用的方法是对蛋白质结构 做一些可控制的修饰( 如引入亲水或带电荷基团) 。需要指出的是使用这种修饰时必 第一章绪论 须保证这种变化不会对蛋白质的结构或者稳定性、蛋白质蛋白质相互作用以及蛋白 质溶剂相互作用产生很大影响。否则，就不能将蛋白质表面相互作用与其它相互 作用区别开。 1 2 3 蛋白质一蛋白质相互作用 对均聚物和共聚物吸附的一个重大发现就是吸附量随着分子量的增大而增大。 虽然聚电解质吸附量对于分子量的依赖性很小，而主要依赖于电解质浓度，聚电解 质的吸附也是随着分子量的增大吸附量增大。如果蛋白质吸附也象共聚物、均聚物 以及聚电解质吸附行为一样，则可以推测吸附量也会随着分子量的增大而增大。然 而对于蛋白质来说这种效应的研究不能直接进行，因为蛋白质的分子量不能象合成 聚合物那样可以方便地改变。即便得到不同分子量的蛋白质，由于不同分子量的蛋 白质同时也会表现出不同相互作用和不同的稳定性，因此也无法直接研究分子量对 蛋白质的吸附行为的影响。 用来研究蛋白质分子量效应的一个替代方法是研究蛋白质自组装是如何影响蛋 白质吸附行为的。例如，o k u b o 等研究了单分子的牛血清白蛋白和牛血清白蛋白二 聚物的吸附行为，结果发现在一定的浓度范围内，b s a - - 聚物选择性吸附在b s a 单 体表面【l4 】。l e n s e n 等对人血清白蛋白的研究也发现了类似的现象。b e l f o r t 和 z y d n e y 也对b s a 二聚物的选择性吸附进行了深入的研究【1 5 】。 1 2 4 蛋白质一溶剂相互作用 当大分子的溶解性降低时，溶液体系就会通过自组装( 如嵌段共聚物会形成胶 束，蛋白质分子体系会发生聚集或寡聚) 、相分离或增加表面活性而产生某种变化。 很明显，影响这一行为的因素包括大分子与大分子、大分子与溶剂、大分子与表面 的相互作用，这些影响因素之间没有明显的界限。目前人们发现聚合物的溶解状况 越差，在固体表面吸附的趋向越大。因此，一般说来，在一定的浓度范围内，吸附 量随着溶解状况的恶化而增大。随着吸附量的改变，吸附层的结构也会发生变化， 对于共聚物和均聚物来说随着溶解性的减小，吸附层会变得更加密集以便尽量减少 与溶剂的接触【l 州。对蛋白质来说，情况比简单的共聚物和均聚物更加复杂，这是因 为蛋白质自身的结构取决于无数相互作用间的微妙平衡，这些相互作用大部分都随 着溶解状况的变化而变化【7 】，因此蛋白质的结构和稳定性可能随着溶解状况发生巨 大的变化，典型的例子就是在高浓度的尿素溶液中蛋白质分子会发生变性。尽管具 有这些复杂性，溶液性质对蛋白质吸附行为的影响在一定程度上有可能与对聚合物 吸附行为有着相似性。事实也证明了这一点，a s a i i o v 等研究牛血清白蛋白在不同的 溶液状态下的吸附行为，发现在溶液中加入硫酸铵后，蛋白质吸附发生了聚集现象 i l ”。溶液性质对蛋白质的另一个影响因素则是溶液的p h 值。一般来说，在等电点附 4 第一章绪论 近出现最大吸附量。随着蛋白质静电荷的减少，蛋白质一蛋白质相互作用减弱，蛋白 质一表面相互作用也减弱，这样有利于蛋白质的吸附。另外，蛋白质在溶液中的结构 和吸附层的结构都受蛋白质静电荷的影响。 1 2 5 蛋白质构象稳定性的影响 蛋白质构象的稳定性对蛋白质的吸附状态有重要的影响，尤其是对蛋白质吸附 层的结构和吸附强度有很大的影响。原因是天然的蛋白质构象十分规整，因此构象 熵很小，在吸附过程中，大量的蛋白质分子发生构象的变化减少了有序结构。因此 蛋白质吸附过程可能会引起构象上的熵增。然而问题是与蛋白质吸附过程有关的熵 增非常复杂，其它吸附机制也会引起熵值的变化，包括抗衡离子和化合水的释放等。 1 3 吸附蛋白质层的的结构。 大部分蛋白质都是大的两亲性分子，这一性质使得蛋白质分子本质上是一个表 面活性分予。蛋白质分子以及其它的具有复杂结构的大分子在固体表面的吸附会发 生构象和取向的变化。蛋白质吸附层的结构是一个相当复杂的问题，不同的体系上 蛋白质吸附层呈现, 出s f n 的结构。简单一点说，我们可以认为蛋白质吸附层的结构 主要包括柔性聚合物状卷曲结构、刚性棒状结构和刚性胶状微粒结构。 1 3 1 “柔性”聚合物状蛋白质 “柔性”聚合物状蛋白质，会不断地发生结构的变化，并且对于一个不稳定系 统，通过加入其它溶质，或者改变p h 值，或者改变电解质浓度来改变静电相互作用， 蛋白质吸附层的结构就会发生很大的变化，这是“柔性”聚合物状蛋白质的典型特 征。从这个观点出发，柔性蛋白质有望与简单的大分子( 如合成的共聚物、均聚物以 及聚电解质) 有着非常相似的界面行为。糖蛋白类和蛋白多糖就属于这一类。 1 3 2 颗粒状蛋白质 蛋白质吸附层结构的另一个极端就是刚性颗粒状蛋白。理论上，这一类蛋白质 应该象胶状颗微粒那样。在各种研究中，都发现无机微粒、聚合物微球以及油包水 型乳化剂是靠静电相互作用沉积在表面上。对于“硬”蛋白质吸附在界面上，则没 有或很少发生结构上的变化。按照不同的堆积密度和蛋白质的形状，可能会有不同 的界面取向。球状对称蛋白质，如溶菌酶( 三维大小为3 0x 3 0x 4 5h i l l ) ，吸附层 上大量的蛋白质有序排列。实验也证明了这一点。i - l a g g e m j 和l e n h o f 佣扫描隧道 显微镜溶菌酶在石墨表面吸附的研究发现蛋白质的有序排列【l 副。m a l m s t e n 利用椭圆 第一章绪论 偏振仪研究了溶菌酶在硅表面的吸附发现吸附层的厚度为3 0 5 r i m ，这说明表面上 吸附一层单分子层平躺式吸附的溶菌酶。然而在一个看似简单的体系中，吸附问题 也是相当复杂，有报道表面吸附的蛋白质存在平躺式和直立式吸附的转换n 卅及构象 的转变1 2 0 。 1 3 3 “软状”蛋白 对于无规线团状、刚性胶体状、刚性棒状蛋白质，其结构的重排程度则是一个 更加微妙的问题。与一系列参数包括吸附层的拥挤程度、温度、蛋白质的稳定性、 蛋白质表面相互作用，蛋白质不同程度的界面构象的变化均有关。一个决定蛋白质 吸附过程中取向、变形和构象的改变的主要因素是吸附层的拥挤程度。例如， m o r r i s s e y 和f e n s t c r m a k c r 表明y 球蛋白直接与表面接触的片段随着蛋白质吸附量 的增加而减少。因此，随着p 球蛋白吸附量的增大，分子要么调整取向或者改变分 子的构象【2 1 】。 1 4 研究蛋白质在固体表面吸附行为的方法 1 4 1 研究蛋白质吸附的常用方法 蛋白质在材料表面的吸附是生物材料与生物机体界面交互作用的重要过程，如 生物材料引起的血栓与纤维蛋白原在材料表面的吸附行为有关。因此研究纤维蛋白 原在材料表面的吸附行为对于研究和表征材料的血液相容性有着重要的意义。表1 1 列出了研究蛋白质吸附的常用方法及其基本原理和所能获得的基本信息。常用研究 蛋白吸附行为的方法有同位素标记法、免疫标记、椭圆偏振分析、生物传感器分析 法等。其中，同位素标记法应用最为普遍，它能够原位检测材料表面蛋白的吸附行 为，但操作复杂且有放射性污染；椭圆偏振分析、生物传感器分析法由于实验仪器 昂贵，操作复杂且不能实现原位检测，因而很少被采用。石英晶体为天平是一种较 先进的在线检测蛋白质吸附的研究方法，它能够实时监测蛋白质吸附过程中所引起 的石英晶体振荡频率的变化，然后根据频率的减少量与蛋白质吸附量之间的换算关 系，获得蛋白质吸附量。电化学交流阻抗法是一种有效的研究界面行为的方法，它 能检测不同频率下的交流阻抗值，然后根据等效电路图和相关软件获得等效电路图 中各元件的相关参数，分析研究界面现象。也可以固定某一频率测定不同电压下的 阻抗值，得到电极表面形成的电容值。 6 第一章绪论 1 1 研究蛋白质吸附的常用方法的基本原理和所得的信息 1 4 2 电化学阻抗法 1 4 2 1 电化学交流阻抗法简介h 5 】 交流阻抗谱e e l s ) 方法是一种以小振幅的正弦波电位或电流为扰动信号，在不同 频率下，测量物质或系统的电响应的电化学测量方法。将测量结果画成一系列谱图， 这一系列谱图就称为交流阻抗谱。交流阻抗方法是电化学研究的主要手段之一，尤 其是研究电极过程和电极表面现象的重要工具，广泛用于化学电源、金属腐蚀、金属 电沉积、表面现象( 如钝化、吸附) 及其它各种电极过程的研究中，在交流阻抗研究 中，常常用等效电路来描述电极过程。例如，溶液电阻可以用一个纯电阻表示；电 荷迁越相界面的过程，即法拉第过程也可以用一个纯电阻表示；电极和电解质溶液间 的双电层可以用一个纯电容表示：由扩散引起的浓差极化可以用w a r b u r g 阻抗( 可 7 第一章绪论 表示为电阻和电容的串联) 表示；而当电极表面有膜层或吸附层覆盖时，电化学双层 可以用复数电容表示。 1 4 2 2 交流阻抗的表示方法 交流阻抗谱是常用的一种电化学测试技术，该方法具有频率范围广、对体系扰 动小的特点，是研究电极过程动力学、电极表面现象以及测定固体电解质电导率的 重要工具它是基于测量对体系施加小幅度微扰时的电化学响应，在每个测量的频 率点的原始数据中，都包含了施加信号电压( 或电流) 对测得的信号电流( 或电压) 的相位移及阻抗的幅模值，从这些数据可以计算出电化学响应的实部与虚部阻抗 谱中涉及的参数有阻抗幅模( i z l ) 、阻抗实部( z 5 、阻抗虚部( z ，) 、相位移( h ) 、频率( 国) 等变量，同时还可以计算出导纳( y ) 和电容( c ) 的实部与虚部，因而阻抗谱可以通 过多种方式表示，每一种方式都有其典型的特征，根据实验的需要和具体体系，可 以选择不同的图谱形式进行数据解析。 1 ) n y q u i s t 图 电极的交流阻抗由实部z 和虚部z ”组成 z = z j z ” ( 1 1 ) n y q u i s t 图是以阻抗虚部( z ”) 对阻抗实部( z ，作的图，是最常用的阻抗数据的表示 形式有的书刊将阻抗的复数形式表示为z = 乃j z ”，因而n y q l l i s t 图也表示为z ” z ，图这种图在文献中也被称为c o l e c o l e 图、复阻抗平面图、复数阻抗图或a r g a n d 平面图( a r g a n ds p a c ep l o r ) 。在一些电化学书籍中，均给出了各种典型等效电路的 n y q u i s t 图，根据图的形状，可大致推断电极过程的机理，还可以计算电极过程的动力 学参数。n y q u i s t l 虱特别适用于表示体系的阻抗大小，对纯电阻，在n y q u i s t 图上表 现为z 轴上的一点，该点到原点的距离为电阻值的大小；对纯电容体系，表现为与z ” 轴重合的一条直线。对w a r b u r g l ；g 抗则为斜率为4 5 0 的直线。 2 ) 导纳图 导纳是电极阻抗的倒数，电极的复数导纳可表示为： y = y ，+ j y ”( 1 2 ) 由导纳表达式可导出导纳的实部( y ) 与虚部( y ”) ，y y ”的图即为导纳图。在导纳 图中，对纯电阻y = 1 r ，表现为y 轴上的一点，该点到原点的距离为1 r ；对纯电 容y = j c o c ，表现为与y ”轴重合的直线。 3 ) b o d e 图 b o d e 图是阻抗幅模的对数l o g l z i 和相角h 对相同的横坐标频率的对数l o g f 的图， 在n y q u i s t 图中，频率值是隐含的，严格地讲必须在图中标出各测量点的频率值才是 完整的图。但在高频区，由于测量点过于集中，要标出每一点的频率就较为困难， 而b o d e 图则提供了一种描述电化学体系特征与频率相关行为的方式，是表示阻抗谱 8 星二皇笙笙 数据更清晰的方法。在b o d e 图d p ，纯电阻的l o g l z i l o 矿图为一条水平直线，相角h 为0 0 ，且不随测量频率变化。纯电容的l o g z l l o g f 图是斜率为一1 的直线，h 为- 9 0 0 w a r b u r g l j f l 抗的b o d e l 羽表现为斜率为一0 5 和h 为- 4 5 。的直线。 4 ) 复数电容图 电极的等效电路阻抗可以用一个复数电容c 表示，该复数电容也可以分解为电容 实部与电容虚部。 z = - j ( o o ( 1 3 ) c = 1 ( o j z ) = v f j 叻= y 撕( y ) = c - j c ” ( 1 - 4 ) 则电容实部与电容虚部分别对应于 c ky 。c ”= y c o ( 1 - 5 ) 电容复数平面图为c - c ”或y ”肠y v ( 0 图，在电容复数平面图中，纯电阻表现为一 条与c ”轴重合的直线，纯电容表现为c 轴上的一点，该点到原点的距离为电容值。 1 4 2 3 交流阻抗的应用研究进展 电化学交流阻抗( e i s ) 是研究电化学电极过程、研究表面吸附动力学以及传质参 数的有力的电化学测试手段 4 6 - 4 s 。通过合理的电化学等效电路分析能够得到电极表 面修饰薄膜的相关信息。同时也可以固定某一频率来测定电极的电化学阻抗( e i ) 。电 化学方法，如阻抗和循环伏安，已经被用于研究蛋白质吸附行为 4 9 。5 训。在固体和溶 液之间必然存在静电双电层，而蛋白质的吸附会导致静电双电层的变化，因此蛋白 质吸附行为可以用阻抗法来研究静电双电层的变化p “。 1 5 动力学模型 蛋白质在固液界面上的吸附表现为不可逆吸附，如慢的表面扩散和表面诱导构 象或取向的改变。因为这些不可逆因素，在某一时刻，蛋白质吸附层的状态与其吸 附时间有关，表明吸附过程动力学对吸附层的稳定状态和饱和状态有很大的影响。 因此，相对于所有的物理和化学过程来预测蛋白质吸附的时间效应，吸附动力学模 型显得尤为重要。 1 5 。1 随机顺序吸附模型( r s a 模型) 随机顺序吸附模型抓住了吸附的本质特征，精确描述了刚性和微球状物质如胶 体微球和蛋白质的饱和覆盖率和吸附动力学。其原则很简单，表面的物质沉积或吸 附不可逆，吸附位点是随机的。随机顺序吸附模型的最原始的含义是蛋白质吸附是 一个随机过程，在这个过程中，“硬”颗粒被不断地随机地加入到一维的空间中，条 件是所有的颗粒都不重叠。图1 1 为r s a 模型的示意图【跏。 9 第一章绪论 ( a ) ( b ) ( c ) 图1 1r s a 模型的示意图。图中表示吸附物质，僦表示吸附物质的排斥区域， 白色区域表示能吸附新物质的区域。( a ) 覆盖率为o 1 覆盖率为0 3 ( c ) 覆盖率为0 5 1 5 2 l a n g m u i r 模型【5 4 】 1 8 6 1 年，l a n g m u i r 发展了导致单分子层吸附的图景，l a n g m u i r 模型是一种最 简单、最常用的吸附模型。其主要假设为：( 1 ) 单分子层吸附且无分子间吸附( 2 ) 假 设碰撞于裸露表面上的每个分子的吸附热相等，并且此吸附热和吸附在表面上的其 它分子无关。( 3 ) 分子对表面上位点对蛋白质分子的吸附能力与附近位点的占据无 关、所有的吸附对蛋白质有相同的亲和性( 4 ) 吸附平衡是动态平衡。 其一般表达式如下： q q r i ( d 旦二( 1 - 6 ) c 其q + = q n - k c ( 1 + k e * ) 式中c 为蛋白质在流体相中的平衡浓度，g 为平衡吸附量，吼为饱和吸附量， 为解离常数，做s c a t c h a r d 图( g c 口) 可得q m 和。 l a n g m u i r 模型动力学方程为： 去- k a c ( 1 百笔) 一k 。p ( 1 - 7 ) 式中p m o n o a m 为被吸附蛋白按照单分子层吸附完全覆盖表面时单位面积吸附量。p 为 被吸附蛋白在表面单位面积吸附量。c 为被吸附蛋白的浓度。k a 和l 【d 分别为吸附和 解吸附速率常数。 在蛋白质的亲和吸附中一般可发生3 种类型的相互作用：( 1 ) 配体与配基的特异 性相互作用，( 2 ) 蛋白质与吸附剂上其它类吸附位的作用，( 3 ) 蛋白质与配体间相互 作用，包括蛋白质构型改变。( 2 ) 和( 3 ) 类吸附会使吸附偏离l a n g m u i r 型吸附，从而 导致更复杂的等温表达式。 1 0 第一章绪论 1 5 3h f r e u