（环境科学专业论文）白腐真菌高效产酶反应器设计及应用研究.pdf

a b s t r a c t i nm i sp a p e r n o t0 n l yt h es p e c 谢m e c h a i l i s ma j l d 印p l i c a t i o n so fl i g n i np e m x i d a s ei nt h e a r e ao fe n v i m 砌e mp r o t e c t i o n ，b u ta l s ot h ep r o p e r t i e s ，印p l i c 砒i o n sa n dc u r r e n tr e s e a r c h s i n l a t i o no f r e a c t o r su s e df o r t h el i g l l i np e m x i d a s ea td o m e s t i ca i l da b r o a dh a v eb e e nr e v i e w e d t h ei m p r o v e da i r l i rr e a c t o ri s d e s i g n e d a n dm a d eo nt h eb a s eo fo v e r c o m i n gt h e s h o n c o m i n go ft h et r a d i t i o n a la i r _ i i f tb i o r e a c t o r s t h ee 位c t so fc a r b o na i l dn i t m g e ns o u r c e ( i n c l u d i n g 血e i ra p p m p r i a t ea m o u i l t ) ，p h ，t e m p e r a t u r e ， a e r a t i o na 1 1 di n d u c e r 锄o u i l to n l i g i l i n o l ”i ce i l z y m e sp r o d u c t i o nu s i n gs u c har e a c t o ra r es t u d i e d w ea l s oo b t a i n e dh i g h e r c o n t i n u o u se n z y m e sp r o d u c t i v i t yr a t ei na no p e ns y s t e mc o m p a r e dt oc o n v e m i o n a lc u l t u r e t h eh i g h e rd e g r a d a t i o nr a t eo fc o m m o na 丑od y e sb yt h ee n z y m ew h i c hp r o d u c e di np r e v i o u s o p t i m i z e ds y s t e mw a sa c l l i e v c d o nm eb a s eo ft h ec h a r a c t e r i s t i co fl i g n i n o l ”i cp r o d u c t i o ne n z y m e sb yt l l ew h i t e _ r o t 如n g u s ，a p p r o p r i a t eh y d r o d y n a m i c sa n dh i g ho x y g e nc o n d i t i o n sa r ec r e a t e db yf i l l i n gi nt h e p o r c e l a i nr a s c h i n gr i n g sb e t w e e nt h ei i l i l e ra i l do u t e rp i p e ，w h i c hb r e a kt 1 1 e1 0 n gr e s t r i c to ft h e h i 曲e m c i e n c yo f e n z y m e so u t p u t w eo p t i m i z e p a r a m e t e r s t l l a ta r et h em o s te n e c t i v ei nm el i g n i n o l ”i c e n z y m e s p m d u c t i o na n df i n do u tm a x i m 岫e n z y m e sa c t i v i t i e sw i l lr e a c h ( 1 ) w h e nt h e 印p r o 砸a t e c a r b o ns o u r c ei sg l u c o s ea n di t s a p p r o p r i a t ea m o u n ti s 2g l ；( 2 ) w h e nm e 印p r o 脚a t e n i t r o g e ns o u r c ei st a n r a t ea r n m o n i u ma n di t s 印p r o p r i a t e 锄o u n ti so 2 l ( 3 ) w h e nt h e a p p r o p r i a t ec a r r i e ri sp o r c e l a i nm s c h i n gr i n g sa i l di t s 印p r o a t ea m o u i l ti s2 2 6 1c m 2 l ，( 4 ) w h e nt h e 印p m p r i a t eb u f r e rl i q u o ri sa c e t u m a c e t a t es o d i 啪a i l di t s 印p r o 州a t ep hi s 4 ，5 ， ( 5 ) w h e nt h ea p p r o p r i a t ea e r a t i o nl e v e l i s1 5v v m l i pe n z y m e sa “i v i t i e sw i l ll a s tf o r2 0d a y s i ns e m i - c o n t i 删o u sm o d ea n dd e c o l o r i z a t i o nm t eo ft h ed y e si so v e r8 7 i no p t i m i z e d c o n d i t i o n s t h i ss t u d yr e a l i z e sh i 曲e rc o m i n u o u se i l z y m e sp r o d u c t i v i t yr a t ei na no p e ns y s t e m ，w h i c h w o l l l dp r o v i d et h er e f c r e n c ef o r 血ep r a c t i c a l 印p l i c a t i o no ft 1 1 i s t c c h n o l o g y o nt h e e n v i r o 砌e n tp r o t c c t i o nf i e l d k e yw o r d s ：w h i t e r o tf h g u sl i g n i np e r o x i d a s ee n z y m eh i 曲l y e f f e c t i v er e a c t o rf o r e n z y m e sp r o d u c ec u l t i v a t i n gc o n d i t i o n s a z od y e sd e c o l o r i z a t i o n i i 第一章绪论 第一章绪论 1 i 自腐真菌降解有机污染物的原理 白腐真菌在分类学上属于担子菌纲( b a s i d i o m y c e t e s ) 。l ，腐生于树木或木材上，侵入木 质细胞腔，释放降解酶，导致木材腐烂成白色海绵状团块( w h i t er o t ) 。其典型种黄孢原毛平 革菌( 砌册e m 幽口p 膪c i d s 即r f 舯2 ，又名黄孢展齿革菌) ，属于非褶菌目、伏革科、显革菌 属它们普遍分布于北美，在我国尚未发现”j 。 白腐真菌降解有机物的原理非常复杂，它主要发生在细胞外，既包括生物学原理，也 有一些化学过程，是两者的有机结合。白腐真菌的独特之处在于它特有的降解机制，最主 要有以下几点：1 白腐真菌降解酶的产生不同于一般细菌需要一定底物浓度诱导力。产生， 主要是靠营养限制来实现的，这样它就可以降解低浓度污染物，且可以便污染物浓度降到 很低的水平。2 因降解主要靠胞外酶来完成，故一般不易对其产生抑制作用。3 降解底 物的非专一性，使其具有广阔的应用前景。目前已经发现的酶主要有三种，分别是：木质 素氧化酶( l i p ) 、锰依赖过氧化物酶( m n p ) 和漆酶( l a c c a s e ) ，因此获得高浓度的胞外 酶是整个降解过程中最关键的步骤。 l ，1 1 木质素过氧化物酶的氧化还原机制【4 - 木质素过氧化物酶具有比其它过氧化物酶更高的氧化还原电位势，这使它能对许多物 质进行直接或浏接的氧化，它还能借助于一些自由基催化氧化还原反应。 ( 1 ) 直接氧化：如图1 1 所示l i p 催化机制。l i p 生成两个有活性的中间体，把木质素和 底物氧化成自由基。直接氧化导致c c 键的断裂，芳环丌环，苄基醇化，去甲基化，羟基 化，二聚化等等。 ( 2 ) 间接氧化：对于某些电位较高而不能被l i p 直接作用的物质，可以靠一些易被l i p 直接 氧化成自由基的化学物质的帮助而发生氧化，这种依赖于中间物调节的氧化q 做问接氧 化。黄孢原毛平革菌的次级代谢产物藜芦醇( v e r a 时la l c o h o l 。v a ) 就是这样一种电子调节者。 f 3 1 还原途径：l i p 对一些较难氧化的化学物质如c c l 4 也能降解，降解的第一步是先发生 还原反应。在还原过程中，黄孢原毛平革菌自身分泌的草酸为生理还原剂与电子供体，生 成的羧酸根阴离子自由基作为还原剂还原各种物质c c l t ( 电子受体) 。 第一章绪论 图1 - 1 木质素过氧化物酶( l i p ) 的催化机制 1 1 2 锰过氧化物酶的氧化还原机制旧1 5 】 ( 1 ) 氧化反应：m n p 催化的氧化反应类似于l i p 的直接氧化，m n p 的催化机制如图1 2 所示，与l i p 氧化不同的是m i l p 表现出对m n ”的绝对需要。m n 2 + 是酶中间体m n p 2 的 还原剂。形成的m n 3 + 与a 羧酸结合生成高氧化势的结合物，然后将底物氧化。m n “是 一个可扩散的氧化还有偶联剂。 ( 2 ) 还原反应：黄孢原毛平革菌的细胞内存在氢醌、纤维素二糖和氢醌还原酶。在m n p 的 作用下将m n 2 + 转化成m n 3 + ，m n 3 + 将氢醌氧化成对应的半氢醌自由基，半氢醌自由基再 作为还原剂将一些高度氧化的化学物质在降解前先还原，氢醌还原酶参与为m 1 1 p 所催化 的还原反应以维持一定的氢醌库。 m n p l m n p 2 、 膏 。a h 图1 2 锰过氧化物酶( m n p ) 的催化机制 1 2 木质素降解酶的重要作用 1 2 1 木质素简介 木质素( “g n i n ) 是植物的主要成分之一，它是植物细胞胞间层和初生壁的主要填充物 第一章绪论 通常在木质细胞中占1 5 3 0 。木质素是一种由苯丙烷为基本结构单元构成的芳香族高 分子化合物，在植物组织中木质素与半纤维素以共价键形式结合，将纤维素分子包埋在其 中，形成一种坚固的天然屏障，使一般微生物及其酶很难侵染和进入，导致木质素的降解 成为地球生物圈中碳素循环的主要障碍。 1 2 2 木质素降解酶系的藿要作用 在自然界中，能攻击、降解木质素的微生物主要是真菌。其中白腐真菌对木质素降解 具有最强的特异性，并被认为是顽固性有机污染物降解中最具应用前景的一类真菌【5 】。研 究发现，黄孢原毛平革菌对异生物质的降解主要依赖于由该菌细胞分泌的胞外酶的工作， 需氧并启动一系列的自由基链反应，实现对底物的非特异性的氧化分解。细胞外的非专一性 的降解体系，不仅对木质素有降解作用，更重要的是多种污染物也同样有很好的降解效果， 因为该降解体系使污染物不必进入细胞，使该菌对不溶的、有毒的、结构各异的物质均有作 用能力。在严酷的环境中，白腐真菌利用菌丝、木质素降解酶及自由基反应作为“利器”攻 击和降解木质素，以获得自身的生存及繁殖，并由此决定了它们在木质素及其他难降解有 机物转化中的核心地位。特别是对环境保护同益重视的今天，白腐真菌对污染物的降解这 特殊功能意义更为重大。 1 2 3 木质素降解酶的应用 白腐真菌降解木质素的主要酶系是过氧化物酶，它们作用于底物的机制是夺取电子和 自由基的形成，这些特点决定了它们的底物非专一性，即它们的底物不是一种而是一类或 几类有机化合物。鉴于白腐真菌及其产生的相关酶类对多种有机化合物的降解能力，因此它 们在很多方面得到广泛应用f m l9 1 。 造纸工业分解木质素的酶类，一方面可用来改造旧的造纸工艺，用于生物制浆、生 物漂白和生物脱色。如用某菌种进行生物制浆预处理降低了4 7 的能耗，并增加了纸浆 的张力【2 0 】；直接用菌丝体或经提取后的酶降解木质素，在处理硬木牛皮纸浆时取得较好 结果，5 天后纸浆的k 印p a 指数从li 6 降到7 9 。另一方面用于造纸废水的处理，可以 显著降低废水的c o d 浓度、色度和毒性。 生物肥料以白腐菌为代表的木质素降解微生物为秸秆就地还阳快速腐熟提供了理 论上的可能性，有可能解决传统高温堆肥使秸秆转化为有机肥料的操作劳动强度大等问 题。 第一章绪论 饲料工业木质素分解酶或分解菌处理饲料可提高动物对饲料的消化率，并且已经突 破了秸秆仅用于反刍动物饲料的禁区，对饲养猪、鸡的实验效果已有报道。目前，木质素酶 等组成的饲料多酶复合添加剂已达到了商品化的程度。 食品工业啤酒、果汁等饲料在储存期间往往出现浑浊或沉淀，这与其中含有酚或芳胺 类物质有关。在啤酒的生产中，可使用漆酶等进行沉淀和絮凝的脱除，使酒类得到澄清【2 “。 表l l 白腐真菌能够降解的物质类别 类别 天然物 多环芳族有机 物( p a h s ) 氯化芳族 有机物 农药 染料f 3 l - 3 2 】 军火眇3 5 j 其他 能够降解的底物 一一一禾鬲綦_ 。牙磋綦_ 。孚歼磋纂2 籀计一一 苯并芘，茚并芘苯并萤蒽，萤蒽，菲，葸，芘【2 7 1 ，蒽油，噻 吩杂酚油煤焦油，重油，【2 8 之9 j 多氯联苯，多氯苯酚，氯代苯胺，三氯二苯， d d t ，高丙体六六六，毒杀芬，氯丹，氨基三唑，2 ，4 ，5 三 氯苯氧乙酸 偶氮类，杂环类，三苯甲烷类，聚合染料 t n t ，d n t ，r d x ( 环三亚甲基三硝基胺) ，h m x ( 环四距甲基 四硝胺) 氰化物3 6 】，叠氮化物，四氯化碳，氯化木质素，漂白工厂排除 液f 3 7 _ 4 0 】 环境领域白腐真菌在治理固废、废水和废气等多方面均有应用，因为它不但能够降 解多种天然有机物，而且能够治理多种人工合成的有机污染物。p e r a l t a z a m o r ap 等人在 1 9 9 8 年使用固定在安伯来特i r a 4 0 0 树脂上的木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶处理纸 浆废水，离子交换树脂固定酶的效率很高，脱色和除酚效果好且经多次重复使用仍具有较 高酶活。张朝晖在黄孢原毛平革菌菌体降解染料和印染废水方面做了一些研究工作，他们 培养黄孢原毛平革菌同步产酶降解含有卡布龙红和弱酸大红的染料废水。美国犹他州立大 学a u s t 教授将黄孢原毛平革菌技术转让给i n t e c h o n e e i 曲t yc o r p ，利用黄孢原毛平革菌 处理被t n t 、d d t 等严重污染的土壤。y a t e e n 等利用白腐真菌治理受石油烃污染的土壤， 结果在1 2 个月内，使土壤中的总石油烃由3 2g k 下降到7g 瓜g ，油去除率高达8 0 ，且 随接种浓度的增加而提高。英国b i o t a l 公司利用白腐菌处理被二氧芑和多氯联苯( p c b ) 污 4 第一章绪论 染的土壤，投资5 2 2 万美元，处理后土壤中的p c b 5 浓度从2 0 0m g 服g 降到lm g 化g 以下； 美国洛根的i n t e c ho n e e i g h t yc o r p 对t n t ，d d t 等污染土壤进行生物修复等，白腐真 菌能降解物质的类别详见表1 1 。 其它方面由于煤、石油的基本结构和木质素相似，故可用黄孢原毛平革菌将煤、石油 进行深加工成为高效的清洁能源。美国的b 啪p u s 研究利用白腐菌对煤进行解聚及增溶， 避免了直接使用煤所引起的大气污染；t i e n 则致力于该菌对煤和石油的脱硫工作，并己取 得了肯定性成果【2 2 23 1 。 1 3 白腐真菌产酶的影响因素 影响木质素降解酶生产的因素：培养基的成分，培养条件( 如氧浓度，温度，搅拌强度) 等其它因素。 j o l l na b u s w e l l l 4 i j 以葡萄糖为碳源进行限碳培养生产m 1 1 p ：当氮浓度大于2 6m m 时， m l l p 的合成受到抑制。此外研究还发现m n 2 + 对m n p 的合成有激活作用。当m n 2 + 的浓 度达到1 1p p m 时，培养基中可以取得较高的酶活。李华钟1 4 2 j 等人在限氮培养条件下研究 了黄孢原毛平革菌合成m n p 的情况：培养基中葡萄糖浓度为l og l ，酒石酸铵的质量浓度 为o 2 l ，吐温- 8 0 的质量浓度为2 l ，硫酸锰的质量浓度为0 1 4g l ，采用苯二甲酸为 缓冲液，p h4 5 条件下进行产酶实验，取得了较高的酶活。同时对培养条件进行优化后， 其m n p 酶活高达5 5 9u l ，比未优化时高出3 6 。 s u s a n ar o d r i 叠u e zc o u t o 用聚丙烯泡沫固定黄孢原毛平革菌在生物反应器内半固态下 生产m 1 1 p ，其最大m n p 的酶活为1 4 0 0u 几。x u f u j i a n 等人利用稻草固态培养生产m n p ， 在最佳培养条件下酶活可达1 3 7 5u l 。 1 3 1 培养基的影响 黄孢原毛平革菌在限碳或限氮培养基中都能合成l i p 。除了碳、氮源的比例不同外， 这两种培养基的其它组成基本相同。常用的培养基成分包括：碳氮源、缓冲液、维生素、大 量元素、微量元素。为了提高l i p 的活力，在培养过程中还加入黎芦醇和吐温等。 山东大学李越中【4 5 】等人的研究表明：糊精是最优碳源，d 葡萄糖、纤维二素和麸皮浸 汁均有利于l i p 的合成，混合碳源比单独碳源要好。对于氮源来说，复杂的有机氮酵母膏 和牛肉膏培养基的产酶最高。硝酸铵、硫酸铵、丙烯酰铵和l - 谷氨酸也有利于酶的合成。 他们还以糊精和酒石酸铵为碳氮源，研究不同碳氮比对产酶的影响。结果表明，低氮高碳 第一章绪论 培养基合成的酶活极低，高碳高氮培养基能得到较高酶活。低碳高氮培养基最有利于酶的 合成。 一k e n t 在限氮条件下，用摇瓶静止培养生产l i p ：添加黎芦醇( 0 4m m ) ，同时把培养 基中微量元素提高6 倍，与未提高微量元素相比酶活可增加2 1 倍；实验的进一步研究表明： 微量元素中c u 2 十、m n 2 + 浓度对l i p 酶活提高起着关键性作用，但是，同时增加c u 2 + 、m n 2 + 的浓度对酶活的影响不大。李华钟4 7 1 等人研究表明：高浓度的m n 2 + 对l i p 的合成有抑制作 用。 y a s 啪i a k a m a t s u l 4 8 】等人研究了在l i p 培养过程中加入氨基酸时对酶活的影响：苯丙氨 酸能够有效地抑制木质素过氧化物酶的合成。谷氨酸和氨根离子在低浓度下( 小于i m m ) 能 够有效地提高酶活，高浓度下对酶活有显著的抑制作用。p a t r i c k j 【4 9 l 研究发现：在l i p 的 生产中加入色氨酸能够极大地提高其活性。经过反相p c r 进一步研究确认：其酶活的提高 是由于色氨酸能够防止h 2 0 2 对l i p 失活作用，并且色氨酸以及它的衍生物均具有与藜芦醇 相同的性质，可防止酶失活。 j a g e r 等人通过添加表面活性剂吐温成功地解除了振荡培养对产酶的抑制( 转速为 2 0 0 r p m ) 。吐温的最佳浓度是o 0 5 0 1 。吐温不仅增加了细胞膜的通透性，从而解除 了已合成的酶在胞内的积累所产生的抑制作用，而且它还有一定的生理作用。然而，z a c c h i 等人以纤维素代替葡萄糖作碳源，结果却表明，即使不通氧和不加表面活性剂，浸没振荡 培养也能产酶，“p 的活力达2 0 0 4 0 0u l 。 1 3 2 培养条件的影响 d o s o r e t z 等人考察了限氮浸没培养条件下通氧和通空气对两种过氧化物酶合成的影 响。他们研究了5 种通氧和4 种通空气的情况，发现通气条件对酶的合成有很大影响。空 气条件下菌丝不合成木质素过氧化物酶，能合成锰过氧化物酶但酶活低于通氧条件。连续 通氧比周期性通氧增加了葡萄糖的消耗，产生较多的蛋白酶和多糖，因此得到的两种过氧 化物酶酶活相应较低，酶活越过峰值后下降也越快。张朝晖研究了限碳培养时氧浓度的影 响，结果表明空气环境能够产酶，无须通氧。柯世省f s o 】在限氮摇瓶培养条件下，研究了氧 浓度对l i p 合成的影响：菌丝生长阶段氧浓度对合成l i p 不明显，但在产酶阶段氧浓度的影 响很大：2 1 的氧浓度f 空气浓度) 是合成l i p 的必需条件增加氧浓度，胞内蛋白酶的活力 提高，不利于木质素过氧化物酶的积累。 a u s t i n l 5 i j 在限碳培养条件下，研究了氮浓度对l i p 的生产通过游离和固定化聚氨脂泡 第一章绪论 沫生产木质素过氧化物酶，在游离态培养过程中，当氮源的浓度为2 2m m 时，其酶活达 到最大，为2 0 0u ，l ，相比之下，在固定化培养过程中，当氨源的浓度达到2 2m m 时，其 酶活可达3 4 0u l 。 n a m a i lr o t l l s c h i l d l 5 2 j 以聚氨脂泡沫为载体固定化黄孢原毛平革菌进行 浅层液体培养实验：当c n 低于7 1 4 时，通入空气时可以产“p ，此时酶活为1 8 0u l ：而 当c n 比较高( c n ；5 6 2 2 ) 时，培养基在通入空气时产生大量的聚合多糖，仅当通入纯氧 时才会产生l i p ：在富氮环境中，当培养基中通入纯氧时，其酶活可达1 8 0 0u 几：在通过 空气时，其酶活可达到1 2 0 0u l 。 a s t h e r 等研究了温度策略对木质素过氧化物酶合成的影响。一般来说生长结束后降 低温度有利于次级代谢物的启动，因此可以把培养温度分两阶段控制：第一阶段是生长阶 段，第二阶段是木质素过氧化物酶合成阶段。如果生长温度为3 7 ，酶合成期温度降为 3 0 ，这种方式培养所得的最高酶活与温度恒定在3 7 培养相比，要高l 倍多。l i e b e s k i n d 【5 3 】 以丙三醇作为碳源，在搅拌深层培养条件下，进行合成l i p 的实验，在培养过程中，在二 次代谢过程开始时，将搅拌速率下降，并将培养温度由3 9 低到2 5 ，并且添加适当的 诱导剂二甲氧基苯氨酸代替黎芦醇诱导产酶，与对照样品相比，其酶活可提高5 倍以上， 且最大酶活可达1 3 1 2u l 。m a r c e la s t h e r 【”l 证明：在黄孢原毛平革菌合成l i p 的过程中， 有两个最适的温度：3 7 是菌丝生长的最适温度：3 0 是产生l i p 的最适温度，故黄孢原 毛平革菌生长产酶过程中应该有适当的温度变化。 s u s a i ll i n k 0 【s 5 1 以尼龙网作为载体固定l i p ，在菌丝的生长阶段以2 2 4 “m i n 进行机械搅 拌进行产酶实验：搅拌对菌体的生长没有负面影响，葡萄糖在3 4 小时内消耗完，加入l l 的葡萄时，在继续搅拌过程中，“p 迅速分泌。其最大酶活达到6 4 8u l 。 d o s o r 比等人发现在限氮培养的生长和次级代谢阶段分别生成的两种蛋白酶( 初级蛋白 酶和次级蛋白酶) 对木质素过氧化物酶有破坏作用。流加葡萄糖或加入蛋白酶抑制剂能减小 这种作用，从而提高酶活。 p a s c a lb o 衄a n n e 【5 6 】等研究了初级和次级蛋白酶的生产与l i p 的关系：在初级代谢阶段， 蛋白酶在培养2 天后，其酶活最大，它能完全抑制l i p 活性。而在蛋白酶的代谢过程中， 不会使l i p 失活，或使l i p 活延期到来。 1 3 3 操作工艺的影响1 5 7 1 3 3 1 分批培养 分批培养是指将菌体和液体培养基次性装入反应器内，进行培养，菌体不断生长繁 第一章绪论 殖，产物不断形成，经过一段时间培养后，将整个反应系取出。 对于分批操作，菌体所处的环境时刻都在发生变化，不能使菌体自始至终处于最优条 件下，在这个意义上它并不是一种好的操作方式但由于其操作简便，容易掌握，因而又是 最常用的操作方式。 1 3 3 2 半连续培养 半连续培养又称为反复分批培养或换液培养，是指在分批培养的基础上不全部取出反 应系，剩余部分重新补充新的营养成分，再按分批培养的方式进行操作。这是反应器内培 养液的总体积保持不变的操作方式。 这种操作方式可以反复收获培养液，对于培养基因工程动物细胞分泌有用产物或病毒 增殖过程比较实用，尤其是微载体培养系统更是如此。例如，采用微载体系统培养基因工 程r c h 0 细胞，待细胞长满微载体后，可反复收获细胞分泌的乙肝表面抗原( h b s a g ) 制 备乙肝疫苗。 1 3 3 3 连续培养 连续培养是指将细胞种子和培养液一起加入反应器内进行培养，一方面新鲜培养液不 断加入反应器内，另一方面又将反应液连续不断地取出，反应条件处于一种恒定状态。与 分批培养和半连续培养不同，连续培养可以控制菌体所处地环境条件长时间地稳定。因此， 可以使细胞维持在优化状态下，促使细胞生长和产物形成。此外，对于菌体( 或细胞) 的 生理、代谢、繁殖等规律进行研究，连续培养是一种重要的手段。 连续培养过程可以连续不断地收获产物，并能提高细胞密度。如英国c e l l t e c h 公司采 用连续培养杂交瘤细胞地方法，连续不断地生产单克隆抗体。 1 4 木质素降解酶生产现状 自从1 9 8 3 年t i e ne ta l 俐和g l e i u le ta l 同时发现白腐真菌黄孢原毛平革菌 ( p h 姐e r o c h a e t ec 1 1 r y s o s p o r i u m ) 对木质素降解的关键是其产生的胞外过氧化物酶系的作用 后，人们已经相继从白腐真菌中分离出木质降解酶，不同白腐真菌木质素降解酶系的组成 有很大的差异，大体可分为3 种类型，即l i p m n p ，如黄孢原毛平革菌；l a c c a s e m n p ，如 豹斑革菌；l i p m n p l a c c a s e ，如采绒革盖菌和射脉菌。但是这种分法并非绝对的，不同营 养源和微量元素的加入等均会在3 种酶的产生上发生不同的扶抑作用1 6 “6 2 j 。 白腐真菌因能降解多种污染物而受到人们重视，但是自然界该菌产酶能力很低，要对 第一章绪论 白腐真菌的木质素降解酶进行大规模的实际应用，必须人为强化该酶的生产。目前人们对 该酶系的生产研究主要集中在以下两个方面： 1 4 1 木质素降解酶的摇瓶生产 常用的摇瓶体积多为2 5 0 ，5 0 0 ，l 0 0 0 m l ，因受摇瓶自身体积的限制，摇瓶培养的规 模很小，多为实验室对白腐真菌产酶时条件优化( 包括碳源及其最佳浓度、氮源及其最佳浓 度、培养温度、p h 值、诱导因子及其最佳浓度、振荡速率、培养方式、接种量等) 的研究 手段1 5 8 j 。 自从1 9 8 3 年发现和分离出在降解中起关键作用的木质素过氧化物酶后，学者们的注意 力转到如何提高该酶的活性上来。k j r k 等在限氮静置通纯氧培养条件下研究了添加藜芦 醇( o 4m m o l l ) 和7 倍的微量元素木质素过氧化物酶活力提高4 倍，达到9 5u l 。路福平等 人在用摇瓶对白腐真菌的培养基和培养条件研究后认为：静置培养时，l i p 在碳氮比( c 小) 低的培养基中显示较高的酶活力，碳源以葡萄糖( o 0 2 ) 和糊精( o 1 8 ) 同时存在及分段 时加入要比葡萄糖作为单一碳源时获得更高的酶活；振荡培养时，在碳氮比高的培养基中 l i p 酶活最高，优化后，静置培养在第6 天可获得7 5 6 0u ，l 的酶活：振荡培养在第8 天获得 6 5 0 0u l 的酶活。 1 4 2 木质素降解酶的反应器生产 研究白腐真菌木质素降解酶的最终目的是为了实际应用。因摇瓶培养仅能摸索出有限 的条件，而且其规模太小，与实际应用有很大差距。人们便又转向与实际应用更为接近的 反应器产酶的研究。转盘反应器最早合成木质素降解酶：在2 5 l 的反应器中( 转速为1 “m i n ) ，得到最大木质素过氧化物酶活性为3 0u l - l i 川。j g e r 等通过添加表面活性剂吐温 成功解除了振荡培养对产酶的抑制，为生物反应器的研究丌辟了道路。最早成功的例子是 使用转盘反应器，在2 5 l 的反应器中( 转速lr m i n ) ，得到最大木质素过氧化物酶活1 3 0u l ， 用4 0l 的搅拌釜反应器游离培养，加入0 1 的聚丙烯醇2 0 0 0 ，最高酶活可以达到1 0 0u l 。 为了更好地让菌丝和氧气接触，有人还设计出一些特殊的膜反应器。发酵罐是常用的生物 反应器，l i n k o 【65 】用尼龙网固定黄孢原毛平革菌，在1 0l 发酵罐中通纯氧培养并多次加入 葡萄糖刺激酶活增加，最高酶活可达7 3 0u l 。固定床反应器常用于连续生产，最大酶活 为1 7 2u l ，反应器可连续运行2 0 多天，f e i i o o 等【6 6 l 认为平推流和全混都不利于固定床产 酶产酶的最佳回流比是2 ：1 。 第一章绪论 1 s 生产木质素降解酶的反应器特点及研究现状 由于木质素降解酶在一定的程度下能够降解有毒的物质，其中许多是难以降解的芳 香族化合物，故木质素降解酶在有毒废水的生物降解方面有着广泛的应用前景。因此如何 扩大木质素降解酶的生产，特别是如何利用反应器大规模地生产木质素降解酶具有极大的 应用潜力。 反应器的构型设计和参数确定是关键，也是国内外研究的热点。合成酶所用的生物反应 器应该满足如下基本要求； 生物因素：生物反应器必须有很好的生物相容性，能很好地提供菌体所需要地生长 环境。 传质因素：充分供应反应过程所需地营养物，特别是氧地传递，及时排除反应产生 地废产物。 流体力学因素：能够提供充分的混合，使反应器中的反应条件一致，同时又不产生 过大的流体剪切力致使菌体受到伤害，特别要防止气泡对菌体的损伤作用。 传热因素：能及时、均匀地除去或供应反应过程的热量，无过热点。 安全因素：具备严密的防污染性能，还应有防止反应器中有害物质或生物体散播到 环境的功能。 操作因素：便于操作和维护。 为了满足这些互相关联和互相制约的要求，使反应器的设计和生产成为复杂而困难的 工作。近几十年来，反应器的研究工作已经有了很大进展，种类越来越多，规模越来越大。 目前反应器的发展趋势是结合工艺的改进，提高菌体密度、生产效率和产物表达水平，而 不再片面强调反应器的规模。 1 5 1 机械搅拌式反应器 机械搅拌式反应器是最常用的反应器，其最基本的特征是一个带搅拌装置的反应容 器，由于很多培养基对反应器都具有腐蚀、磨损的作用同时灭菌过程也会对反应器造成 磨损，所以在大多数情况下，反应器通常用耐腐蚀材料不锈钢、碳钢或玻璃制造，为了进 行灭菌。要求能耐0 3m p a 以上的内压，搅拌装置出电机、变速器、轴和搅拌浆组成。其 形状一般为立式圆筒形，高径比在1 7 2 5 之间，这样液体培养基可以有较大的深度，从 而增加空气在培养液中停留的时阃。为了提高混合效果，反应器中可以安装多个搅拌器。 0 第一章绪论 搅拌器的中间部分为圆盘状，这样可以阻挡搅拌产生气泡为了防止杂菌和噬菌体的污染， 在搅拌轴穿过容器的部位必须有良好的密封装置。机械搅拌式反应器主要用于好氧发酵， 因而都有空气进口和分布装置。空气分布装置一般都安装在最接近反应器底部的搅拌浆的 正下方。 培养基的混合程度主要是由搅拌功率决定的。而搅拌浆则是决定发酵液在反应器内流 动状况的主要部件。搅拌浆有多种形式，在青霉素发酵的研究开发过程中，经过大量的比 较研究，发现平板浆既能维持较小的气泡直径、增加传质的相界面积，又能提供适当的剪 切力，使液态培养基混合良好、菌体保持较高的活力。这种浆型至今仍广泛用于机械搅拌 式反应器设计。为了防止搅拌时液体产生漩涡，通常在容器内测安装挡板，增强液体的径 向混合。 培养和灭菌一般在同一装置中进行。灭菌要求用直接蒸汽，为了及时将液体培养基冷 却、及时移去生物反应和机械搅拌产生的热量、维持发酵所需的合适温度，机械搅拌式反 应器上必须安装热交换装置。 此外，机械搅拌式反应器上还有若干进出物料的进出料口、接种口、用于观察培养时 情况的视境等。先进的机械搅拌式反应器必须配备性能优越的传感器和自动控制系统，如 p h 值、温度、溶解氧、氧化还原势及液位等，有些机械搅拌式反应器还安装了出口气体 成分分析仪。 机械搅拌式反应器能适用于大多数的生物培养过程，已经形成标准化的通用设备。只 有在它的气液传递性质或剪切力不能满足生物过程时才会考虑选用其他类型的反应器【6 7 】 。为了防止搅拌时液体产生涡流，可在反应器内侧安装挡板，以增强液体的径向混合。 l i n k o 等在1 0l 的发酵罐中，把黄孢原毛平革菌固定在尼龙网上，以限碳培养方式 合成木质素过氧化物酶。为提高产量，根据富氧环境对产酶有利的特点，他们在生长期通 空气，而在产酶期通纯氧( 氧分压维持在5 0 7 0 ) 。第三天出现酶活性后，多次加入lg l “ 的葡萄糖刺激酶活性的增加，最高酶活性为7 3 0u l 。v e n k a t a d r i 等人在普通的发酵罐 中插入缠绕着聚硅氧塑料管的不锈钢管，在管内通氧给生长在塑料管表面的菌丝供氧，最 高酶活性达到2 0 3u l ，可连续重复产酶5 周以上。s u s a n ar o d r i g u e zc o u t o 【8 】等在发酵罐 中实现了固体培养，他们采用问歇式操作时，l i p 酶活性均值高达2 4 6 8u l _ i ，l a c c a s e 均 值为6 8 5u - l ；当进行3 0 天的连续培养时，m n p 酶活性均值为1 5 0u l _ l ，l a c c a s e 酶活性 均值可高达3 3 0u l 1 。 第一章绪论 1 5 2 固定床 固定床反应器的基本原理是反应液连续流动通过静止不动的固定化菌体( 或生物催化 剂) 。固定化的主要优点是可以重复利用菌体细胞，便于将菌体细胞与反应产物分离 6 9 7 0 1 。 s h i m 等人【7 l 】把生长培养基和诱导培养基交替通入到8l 的固定床反应器中，间歇培养合成 木质素过氧化物酶，最高酶活性为8 1 0 0u l 1 。m i e l g o 等人以2 ，6 二甲氧基苯酚为底物， 在固定床生物反应器中半固体培养黄孢原毛平革菌，最大m n p 酶活性达1 2 9 3u l 1 ，l i p 酶活性最大为2 2 5u l 。d m 0 1 d e s 等在填充有尼龙海绵的管式固定床反应器中，以半固态 条件操作进行了两批培养，第一批中，葡萄糖消耗速率为o 5 7g - l i - d - l ，氨氮在第4 天消耗 完，m n p 在第三天开始出现，酶活性为7 6u - l ，第七天达到峰值为1 2 9 3u l ；l i p 在第 二天开始出现，酶活性为1 6u l ，第八天达到峰值为2 2 5 u l ：而l a c c a s e 的合成不规 则，最大值为3 3u l _ l 。在第二批操作中，葡萄糖的消耗速率为0 3 3g l d ，此时m n p 在第2 天出现为4 5u l ，第6 天达到峰值9 5 6u l _ l ，比第一批低了3 5 ；而l i p 在第2 天出现为2 0u l _ 1 ，第5 天达到峰值1 6 5u l 一，比第一批略微下降；l a c c a s e 更不规则，峰 值达到5 8u l 。这也说明了营养调控的重要性。 1 5 3 滴流床 填充床适合于固定化微生物细胞连续产酶过程。一般从上端流出含较高浓度产品的反 应液，这种情况下，单位体积反应器内固定化颗粒的装置量比流化床大得多。但由于固定 化细胞长期静止地堆积在一起，随着细胞的不断生长，容易造成营养供应不良。对于好氧发 酵，也可以有限度地向填充床通气，这时一般称为滴流床。但由于固定化细胞装填过密以及 必须避免产生流化，通气量受到严格的限制。r u g g e r i 等人利用滴流床生物反应器间歇 培养黄孢原毛平革菌，反应器内散堆鞍形填料( 填料表面经处理形成一层海藻酸钙薄膜) ， 膜内固定菌体，培养基循环利用，在第1 0 天木质素过氧化物酶活性达1 2 2 0 u - l 。 1 5 4 转鼓式反应器 转鼓式生物反应器通常是通过转盘或转鼓的旋转达到混合的目的，其混合程度一般， 取决于发酵的要求。通常是用较低的旋转速度( 1 1 5 r p m ) ，高速旋转混合的应用很少。原 因是高旋转速度会损伤菌丝体，而且能过多的产生热量，影响微生物产酶和其他次级代谢 产物。转鼓式反应器的转鼓直径不宜过长、体积不宜过大，否则不仅操作困难，而且在旋转 第一章绪论 过程中会导致培养基结成球状，从而影响微生物对营养物的利用。除机械搅拌式反应器以外 的其它类型反应器中，转盘反应器最早合成木质素降解酶：在2 5l 的反应器中( 转速为l r m i n - 1 ) ，得到最大木质素过氧化物酶活性为3 0u l 1 【7 4 】。d o m i n g u e z 等人采用转鼓式生物反 应器半浸没培养黄孢原毛平革菌，以尼龙海绵为载体，菌丝固定在尼龙海绵体上，采用间 歇式培养，通气量分别为o 5w m ( 1v v m 为1l l - l m i n 。) 和l v v m 时进行试验。结果表明： 在通气量为1w m 时酶活性是0 5w m 时的3 倍，m n p 在第1 1 天峰值达1 3 5 0u l ，l i p 在第6 天峰值达3 6 4u l 。而且在此操作下还出现了l a c c a s e ，在第3 天出现峰值为5 6u l 。 1 5 5 鼓泡塔 鼓泡式反应器属于非机械搅拌式反应器，又叫空气搅拌高位反应器，适用于多缴连续 发酵。反应器内没有机械搅拌装置，因此也没有轴封装置，它是利用通入反应器内的空气 上升时的动力来带动液体培养基的运动，从而达到混合的目的鼓泡塔的主体是一个容器， 通常呈圆柱形，高度和直径之比通常为4 6 。需要较高压力的压缩空气才能克服反应器一 般塔体的静压力。在容器底部通过多孔管、多孔盘、烧结玻璃、烧结金属或者微孔喷雾器向反 应液通气。当压缩空气从反应器的底部进入时，喷嘴或通风管的作用使空气破碎并与液体 培养基充分混合，之后气泡由于自身的浮力和喷射时的压力作用而向液体培养基上部扩 散。为了加强混合，还可以在容器内安装一系列水平的多孔板、垂直的隔板等。鼓泡塔的优 点是结构简单、不需要机械传动设备、动力消耗小。噪声小、造价低、溶氧系数高、避免了 机械搅拌反应器因为轴封不严引起的杂菌污染和因为机械搅拌所引起的剪切力损伤。鼓泡 式反应器由于省去了机械搅拌装置，生产成本仅是机械搅拌反应器的3 0 左右：缺点是不 能提供足够高的剪切力，传质效率低，丝状菌有时会形成很大的菌丝团而影响代谢和产物 合成。 鼓泡式反应器适合于固形物含量低、黏度小、需氧量低的微生物培养和发酵过程，但 是不适合固形物含量高、黏度大、需氧量高的微生物培养和发酵过程。 张朝晖等【 1 以聚氨酯泡沫塑料为固定化载体，在三相鼓泡塔反应器中培养黄孢原毛平 革菌，可以高效地合成木质素降解酶系。实验表明，合成木质素过氧化物酶和锰过氧化物 酶的最佳通气量均是1 ow m 。在此通气量下，最大木质素过氧化物酶韵酶活性达3 6 7u l - i 最大锰过氧化物酶的酶活性达4 7 2 0u l 1 。在培养基相同和单位体积载体用量相同的条件 下，与摇瓶培养相比，酶活性分别增大1 倍和1 2 倍。这是因为在摇瓶培养中，气液间的传 质只在液相表面进行，而在三相鼓泡塔中，通过分布器进入液相主体的气体己经分散成许 第一章绪论 多微小的气泡，大大增加了气液相界面积，强化了传质，气泡问的扰动也大大促进了三相 问的物质传递，培养液所受的剪切力比摇瓶小得多。一定条件下，在三相鼓泡塔中可以进 行重复间歇培养生产木质素过氧化物酶，连续进行了5 批培养，每批木质素过氧化物酶的 - 一 最大酶活性均在2 5 0u l _ i 以上，最高酶活性出现在第二批为4 8 0u l _ 1 ，总培养时间达2 2 天。 1 5 6 气升式反应器 1 5 6 1 气升式反应器简介 气升式反应器是应用最为广泛的反应器，是在强化鼓泡塔传质的基础上发展起来的一 种新型的多相反应器，按结构和操作形式可分为内环流和外环流两种类型，见图1 3 。( a ) 为气体通过分布器进入中心管( 导流筒)