（发酵工程专业论文）含活酵母啤酒的研究.pdf

摘要 摘要 国际上著名酒种都有其典型的口味特征，而我国则以下面酵母发酵的l a g e r 型啤酒为 主。含活酵母啤酒不仅营养丰富，而且其中的活酵母能够在一定程度上抑制老化物质的 产生。本论文通过研究酵母菌种的性能、添加酵母后啤酒的浊度变化等情况，选择了合 适的添加酵母菌株以及合适的酵母添加浓度，并对其发酵工艺进行了初步的探讨；通过 对添加酵母啤酒的风味研究，验证了含活酵母啤酒工艺的可行性。本文的主要研究结果 如下： 通过对四株酵母菌株的生理生化指标与发酵性能的分析，按照含活酵母啤酒的特性 要求，综合考虑酵母的死灭温度、凝聚性、酵母活力以及酵母发酵液的风味情况，选择 死灭温度略高、凝聚性差、活力强，产风味物质较少的t 菌株作为添加菌株；选择凝聚 性略高于、而活力略低于t 菌株的g t 菌株作为备选添加菌株。 分别添加t 菌株与g t 菌株至啤酒样品中，考察不同温度条件下酵母活力变化情况； 并对添加了不同浓度活酵母的啤酒样品及其在储存过程中的浊度变化情况进行分析。在 相对低温条件下储存含活酵母啤酒，酵母的活力较强；菌株t 添加的细胞浓度达到1 0 4 个 m l 时，啤酒样品外观澄清透明，在整个储存过程中浊度稳定性高。选择细胞浓度为1 0 4 个m i ，作为合适的酵母添加浓度。在实验室对含活酵母啤酒的生产工艺进行了研究，确 定采用常规的啤酒发酵工艺，在啤酒成熟后过滤除去酵母，再添加活酵母，使添加酵母 的浓度达到1 0 4 个m l 。 通过分析添加活酵母浓度为1 0 4 个n l l 的啤酒与未添加活酵母啤酒的常规指标、反 2 烯醛、d p p h 、还原力、总多酚、双乙酰以及风味物质的变化情况后发现：添加活 酵母后，啤酒的常规指标与风味均没有发生明显改变：添加活酵母啤酒中反- 2 _ 壬烯醛的 含量低；添加活酵母的浓度越高，反- 2 - 壬烯醛的含量越低；添加t 菌株的啤酒中反_ 2 一 壬烯醛的含量低于添加了同浓度g t 菌株的啤酒。而d p p h 、还原力、总多酚和双乙酰 含量这四项指标，与啤酒中是否含有活酵母没有明显的相关性。 通过本论文的研究，确定了合适的添加酵母菌种t 、合适的添加浓度、适当的添加 方式，啤酒中反- 2 烯醛含量的降低较好的反映出活酵母添加后的效果。 关键词：活酵母，凝聚性，活力，啤酒，反- 2 壬烯醛 a b s t r a c t t h ef a m o u sb e e ri nt h ew o r l dh a si t st y p i c a lt a s t ec h a r a c t e r i s t i c t h em a i nt y p eo fb e e ri n o u rc o u n t r yi sl a g e rb e e r i ny e a s t - c o n t a i n i n gb e e r , t h e r ea r er i c hn u t r i t i o n s ，a n dt h ea c t i v ey e a s t i nb e e rc a ns u p p r e s sf l a v o ra g i n gi ne x t e n t t h ep r o p e ra d d i n gy e a s ta n dt h ep r o p e ra d d i n g c o n c e n t r a t i o no fy e a s tw e r es t u d i e dw i t ht h ep e r f o r m a n c eo fy e a s ts t r a i na n dt h et u r b i d i t y c h a n g e so fb e e ra f t e ra d d i n gy e a s t t h ef e a s i b i l i t yo fy e a s t - c o n t a i n i n gb e e rw a sc o n f i r m e db y s t u d y i n go nf l a v o ro f b e e rw i t ha d d i n gy e a s t t h e p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a li n d e x e sa n dt h ef e r m e n t a t i o np e r f o r m a n c eo ff o u rs t r a i n s w e r es t u d i e d a c c o r d i n gt ot h ec h a r a c t e r i s t i c so fy e a s t - c o n t a i n i n gb e e r , e x t i n c t i o n t e m p e r a t u r e ， f l o c c u l a b i l i t y , a c t i v i t ya n df l a v o ro ff o u rk i n d so fy e a s ts t r a i n s ，s t r a i ntw a sc h o s e nt ob e a d d i n gy e a s tb e c a u s eo fi t sh i g he x t i n c t i o nt e m p e r a t u r e ，l o wf l o c c u l a b i l i t y , h i g ha c t i v i t ya n d l o wf l a v o rc o n t e n t s s t r a i ng tw a sc h o s e nt ob es t a n d b ya d d i n gy e a s tb e c a u s eo fi t sl i t t l e h i g h e rf l o c c u l a b i l i t ya n dl i u l el o w e ra c t i v i t yt h a ns t r a i nt t u r b i d i t yc h a n g e so fb e e rw h i c hc o n t a i n e dd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o ny e a s t sa n dt u r b i d i t y c h a n g e sd u r i n gb e e ra g i n gw e r es t u d i e d 10 4c e l l m lw a sc h o s e nt ob et h es u i t a b l e c o n c e n t r a t i o no fs t r a i n a d d i n gc o n c e n t r a t i o n t h ey e a s t - c o n t a i n i n g b e e ri n1 0 4c e l l m l c o n c e n t r a t i o nw a sc l a r i f y i n ga n d t r a n s p a r e n te v e nd u r i n gb e e ra g i n g t h er o u t i n et e c h n o l o g yo f b e e rb r e w i n gw a su s e d a f t e rf e r m e n t a t i o nt h ey e a s ts t r a i ntw a sa d d e dt ob e e rw i t h1 0 4 c e l l m lc o n c e n t r a t i o n t h ec h a n g eo f t r a n s - 2 - - n o n e n a l ，d p p h ( 1 ，1 - - d i p h e n y l - 2 - p i c r y l h y d r a z y lr a d i c a l2 , 2 - d i p h e n y l 一1 - ( 2 ，4 ，6 - t r i n i t r o p h e n y l ) h y d r a z y l ) ，r e d u c i n gp o w e r , t o t a lp o l y p h e n o la n db i a c e t y lc o n t e n ti n y e a s t - c o n t a i n i n gb e e ro nd i f f e r e n ty e a s tc o n c e n t r a t i o nw e r es t u d i e dc o m p a r i n gw i t hb e e rw h i c h d i dn o tc o n t a i ny e a s t t r a n s - 2 - n o n e n a lc o n t e n ti ny e a s t - c o n t a i n i n gb e e rw a sl o w e rt h a nb e e r w i t h o u ta d d i n gy e a s t t h e r ea r el i t t l ee f f e c t so fa d d i n gy e a s to nd p p h ，r e d u c i n gp o w e r , t o t a l p o l y p h e n o la n db i a c e t y lc o n t e n ti nb e e r y e a s ts t r a i nta n d1 0 4c e l l m lc o n c e n t r a t i o nw e r ed e t e r m i n e dt ob et h es u i t a b l es t r a i na n d c o n c e n t r a t i o nf o rp r o d u c i n gy e a s t - c o n t a i n i n gb e e r k e y w o r d s ：a c t i v ey e a s t ，f l o c c u l a b i l i t y , a c t i v i t y , b e e r ，t r a n s - 2 - n o n e n a l 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 签 名：王磋建日 期：2 0 07 辱方问三日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留，使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名： 导师签名： 日期： 第一章绪论 第一章绪论 1 1 含活酵母啤酒的简介 从是否含有酵母这个角度来对啤酒进行分类，可以分为含酵母啤酒( 浊生啤酒) 和 不含酵母啤酒( 清啤酒，即普通啤酒) 两大类。其中含酵母啤酒又包括含活酵母啤酒和 含死酵母啤酒。含活酵母的啤酒一般是在啤酒中添加一定量活的酵母。德国生产的白啤 酒是含死酵母的啤酒，生产时在啤酒中加入活酵母后灌装，放置2 4 小时，使酵母菌消 耗包装内的氧气，再经巴氏杀菌( 灭酵母活性) 后出厂，这种啤酒含氧量很低，因此货 架期较长，大多出口国外【l 】。啤酒随着存放时问的延长，不可避免的发生老化。而含活 酵母啤酒由于大大减少了啤酒的氧化作用，所以可以维持啤酒新鲜度。并且，含有的活 性酵母营养价值很高，有5 0 多种有效成分，特别是含有较多b 族维生素、核酸、蛋白 质、矿物质以及人体无法自行合成的必需氨基酸，也产生一些具有保健功能的活性物质。 啤酒酵母是含维生素b 最丰富的天然食品。此外，啤酒酵母还能促进食欲、改善人体的 消化吸收能力，并具有美容保健之功效【2 】。因此，这种啤酒倍受人们的青睐，是真正有 益于健康的精制啤酒。含活酵母啤酒中酵母含量越高，还原能力越强，对于防止啤酒的 老化就越有益，但是，随着活酵母浓度的提高，啤酒的浊度也会相应升高，外观混浊 不透明，易使人产生啤酒变质的误解；若储存时间过长，还极易产生沉淀，消费者会 认为混浊啤酒是老化了或者是坏掉了。因此，含活酵母的啤酒不只是要在添加酵母后， 更要在储存几个月之后防止啤酒变混浊。研究人员将研究重点集中在生产含活酵母细胞 相对较少一些、外观澄清透明的啤酒，这样的啤酒易于被消费者接受。 1 2 活酵母与啤酒风味老化的关系 1 2 1 啤酒中的主要老化物质 啤酒在储存过程中风味发生变化，或多或少地产生一些异味，这是由不同的物质造 成的。1 9 5 4 年，b u r g e r 等 3 1 首先发现了老化味，随后也发现越是颜色浅、淡爽的啤酒越 易老化。经过十几年的研究，他们认为多酚是影响啤酒风味稳定性的重要因素。在这个 阶段，鉴定出了啤酒的主要老化味道纸板味物质一反- 2 一壬烯醛，并被认为这是啤酒风味 稳定性研究的重大突破【4 5 】。啤酒老化过程中风味变化如图卜1 所示。 强 度 时闫 图1 - 1 储存过程中啤酒风味的变化 f i g 1 - 1f l a v o rc h a n g e sd u r i n gb e e ra g i n g l 垩塑盔堂婴主兰垡笙茎 图1 1 是d a l g l i e s h t 6 】所描述的啤酒在储存过程中的风味变化图。从图中可以看出， 随着储存时间的延长，纸板味不断形成，而纸板味通常被认为是啤酒老化的典型风味。 h a s i m o t o t 7 于1 9 6 6 年首次报道在啤酒的老化过程中，挥发性羰基化合物的含量显著 增高。羰基化合物同时存在于新鲜和老化啤酒中，阈值如表1 - l 所示【s 】。目前已经确定 对啤酒风味变化起主要作用的是羰基类化合物，有研究表明在啤酒中己测出9 8 种羰基 化合物( 5 1 种醛类和4 7 种酮类) 9 1 ，其中最主要的是醛类及其衍生物，氧化前体物质 包括易挥发醛类以及碳原子数为7 。1 0 的2 - 不饱和烯醛，分别是：2 庚烯醛，2 辛烯醛， 2 一壬烯醛，2 暌烯醛。虽然它们的阈值均f h l j , ( o 3 。1 0 班) ，但却很重要。在长期存放 过程中仍没达到阈值的羰基化合物对啤酒风味影响较小，而2 一壬烯醛不但超出阈值同时 还被认为是老化物质的重要组成部分。因此，可以把2 一壬烯醛和反- 2 一壬烯醛视为评估啤 酒新鲜度的指标化合物。而啤酒中的纸板味物质反_ 2 壬烯醛，即使其含量很少时，也能 使啤酒呈现氧化味【l o l 。 表1 - 1 新鲜与老化的下面发酵啤酒中羰基化合物含量的比较 t a b 1 - 1 c o m p a r i s o no fc a r b o n y ll e v e l si nf r e s ha n da g e dl a g e rb e e r 1 2 2 添加酵母对啤酒风味的影响 由于啤酒随着存放时间的延长不可避免的出现老化，尽可能保持啤酒新鲜度是多年 来啤酒生产企业面临的一大问题。而在啤酒中添加一定量活酵母可以维持啤酒新鲜度。 因为啤酒中存在的活酵母大大减少了啤酒的氧化。老化物质中的一种醛类化合物反- 2 2 第一苹绪论 壬烯醛，可以作为氧化味的关键指标，它即使含量很低时，也能使啤酒呈现氧化味。啤 酒中含有大量酵母可以抑制反- 2 壬烯醛的生成，大大减少氧化物质含量。但是啤酒中添 加的酵母在抑制反- 2 壬烯醛生成的同时，又可能进行其它的代谢活动，比如代谢产生一 些醇、酯等物质，进而影响到啤酒的风味。因此，啤酒中所添加的酵母必须既能够抑制 反_ 2 - 壬烯醛的产生，同时又尽可能不进行其它额外的代谢活动。 在瓶装啤酒中添加少量酵母的前提下，以乙酸乙酯和异戊酸乙酯作为考察指标，酯 类的含量并没有因为酵母的存在而有明显的改变；以丙醇作为指标，不管是否添加酵母， 丙醇的含量几乎没有变化【8 】。 1 3 立题背景与意义 国际上著名品种啤酒都有其典型的口味特征，而我国啤酒仍以下面发酵啤酒为主【1 1 1 。 我国现在已经成为了啤酒大国，2 0 0 8 年啤酒产量超过4 0 0 0 万千升，但还不是强国。中国 啤酒行业还需要不断革新，丰富啤酒种类，满足消费者对啤酒的安全、多元化的需求。 新鲜啤酒以其独特的香味，清纯、爽口的口感倍受消费者的喜爱，然而随着储存时 间的延长，啤酒的风味逐渐发生变化，各种异杂味随之产生，降低了啤酒的可饮用性。 如何延缓啤酒风味老化，提高啤酒风味稳定性，使啤酒在储存期间不易老化是酿造者们 所面临的最大挑战之一。为了保持啤酒的新鲜度，防止其老化，研究人员开始着眼于啤 酒酵母本身的还原作用。在啤酒中添加活酵母被视为防止啤酒老化的安全有效的途径， 通过活酵母来抑制老化物质的形成以保持啤酒的新鲜度。国外添加酵母的啤酒即白啤酒 历史悠久，表1 _ 2 是欧洲四种含酵母啤酒的一些指标【1 2 1 。但是，与国内传统啤酒相比， 这种白啤酒含有大量的酵母( 1 0 5 1 0 6 个m l ) ，酒体混浊不透明，浊度均大于2 0e b c ， 酒体呈乳白色【13 1 ，不易被国内的消费者所接受。如果啤酒中活酵母的数量过少，也会相 应减少酒的还原能力，不能有效抑制啤酒在储存过程中老化物质的形成，从而难以达到 增强啤酒新鲜度的效果。因此，开发外观澄清透明的、含一定数量活酵母啤酒是国内啤 酒行业所共同关注的。 表1 - 2 欧洲四种含酵母啤酒的指标 t a b 1 - 2p a r a m e t e r so f f o u rk i n d so fe u r o p e a nb e e rc o n t a i n i n gy e a s t 3 江南大学硕士学位论文 国内含活酵母啤酒的生产最早是珠江啤酒厂从1 9 9 6 年开始，并在2 0 0 4 年1 月上市， 作为高档啤酒，白啤酒的市场反应比较理想。珠江白啤酒是运用了下面酵母进行主发酵， 后发酵结束后排掉沉降于发酵罐底的酵母，经过滤得到清酒，然后在啤酒灌装线上接入 上面酵母进行二次发酵，采用两种完全不同的酵母和工艺巧妙配合生产而成【1 3 1 。北京轻 工院的廖永红也对白啤酒生产工艺进行了研究，是由上面发酵啤酒酵母与乳酸菌混合发 酵而成【1 4 】。除此之外，也有一些其它关于白啤酒的报道，但大多是概念混淆，将小麦啤 酒误认为是白啤酒。1 9 8 7 年我国烟台啤酒厂研制生产的以小麦芽为主要原料生产的白啤 酒，并在当时制定了国内第一个白啤酒标准【15 1 ，但当时的白啤酒仅要求参加发酵的酵母 为上面发酵啤酒酵母，实际上所生产的成品啤酒中并不含有活酵母，酒体澄清透明。近 些年，国内添加酵母啤酒没有得到进一步的发展，不能满足消费者的需要。 开发含活酵母啤酒具有重要的意义，即可以突破技术上的难点，又能够为消费者提 供新的品种，真正丰富了啤酒的种类，可以增强企业竞争力。 1 4 课题研究思路、主要内容和目标 本论文从所添加酵母菌种的筛选出发，以实验室保藏的菌种为实验材料，筛选出适 合于生产含活酵母啤酒的酵母菌株：研究不同浓度酵母添加后啤酒的浊度变化，以确定 最大活酵母添加浓度；调整麦汁制备工艺及酵母培养工艺，以培养得到优良的添加用活 酵母；研究添加酵母后啤酒风味变化情况，使啤酒风味基本保持不变。 本课题的主要研究内容和目标包括： ( 1 ) 研究拟添加酵母菌种的发酵性能，重点考察其利用碳源、凝聚性、死灭温度、 活力、发酵性能、发酵液中醇酯种类等。以凝聚性、活力、发酵液中醇酯种类为主要指 标，选择合适的添加酵母菌株。 ( 2 ) 研究了酵母细胞浓度对啤酒浊度的影响，以及含活酵母啤酒储存过程中浊度的 变化，以及温度对酵母活力的影响等，并在实验室研究了含活酵母啤酒的生产工艺。 ( 3 ) 研究含活酵母啤酒的风味变化情况，重点考察其中的反2 一壬烯醛、d p p h 、还 原力、总多酚四种老化指标以及风味变化，确定反映含活酵母啤酒品质的合适指标，得 到风味基本不变、但口感更加新鲜的啤酒。 通过本课题的系统研究，期望能开发出啤酒风味基本不变、口感更加新鲜的含有一 定数量活酵母的、能够有效减缓老化口味形成速度的啤酒新产品。 4 第二章含活酵母啤酒中添加酵母的筛选 第二章含活酵母啤酒中添加酵母的筛选 2 1 前言 新鲜啤酒以其独特的香味，清纯、爽口的口感倍受人们的喜爱，然而随着储存时间 的延长，啤酒的风味逐渐发生变化，各种异杂味随之而来，降低了啤酒的可饮用性。如 何延缓啤酒风味老化，提高啤酒风味稳定性是啤酒酿造者们所面临的最大挑战。 啤酒的风味稳定性有两层含义【1 6 】：一是同一品牌的啤酒应具有同样的风味，不同批 次问产品之间的口感差别很小：二是啤酒能保持其特有的新鲜、纯正、柔和的风味，在 货架期内的风味变化尽可能小。对于第一层含义，可以通过控制原辅料质量、加强工艺 控制和稳定酵母发酵性能等措施加以改进。而对于第二层含义，可以采用提高成品啤酒 自身还原力的方法来解决。而提高其还原力的最直接有效的办法就是在成品啤酒中添加 活酵母，利用活酵母的还原力来抑制老化物质的产生速度。 由于成品啤酒大多采用瓶装形式销售，啤酒瓶中的压力大、c 0 2 含量高、0 2 含量少， 成品啤酒中含有的活酵母生长所需要的营养成分少，这些条件对酵母的生存极为不利。 因此，对于所添加的酵母要求较高。所选酵母菌株必须活力强、凝聚性较低( 能够充分 悬浮于成品啤酒中) 、尽可能不产生过多的风味物质以免影响原啤酒的风味，使得消费 者易于接受此新品种啤酒。 本章主要研究了待选实验室自有酵母菌种的部分生理特性及发酵性能，包括碳源利 用、凝聚性、死灭温度、活力、发酵性能、发酵液中醇酯种类。以凝聚性、活力、发酵 液中醇酯种类为主要考察指标，选择合适的拟添加酵母菌株。 2 2 材料与方法 2 2 1 实验材料与试剂 实验室自有酵母菌种：4 5 1 5 为下面发酵啤酒酵母，g t 、t 和g b 为上面发酵啤酒 酵母； 无水乙醇；e d t a - n a ；美蓝染色液，均为国药集团分析纯。 2 2 2 仪器设备 m p 2 0 0 0 d 型电子天平 s k 一1 型快速混匀器 l r h _ 2 5 0 型生化培养箱 1 0 c 4 0 c 型精密电子天平 1 0 8 6 型精密水浴锅 电热恒温鼓风干燥箱 l s - 3 5 0 l 型立式压力蒸气灭菌锅 8 1 - 2 型磁力搅拌器 上海精科天平厂 江苏金埴医疗仪器厂 上海一恒科技有限公司 美国o h a u s 公司 德国g f l 公司 上海跃进医疗器械厂 上海医用核子仪器厂 上海司乐仪器有限公司 5 江南大学硕十学位论文 p h s - 2 5 型精密数显酸度计 d g - 2 b 多功能恒温箱 超净工作台 台式低速离心机 血球计数板 w a t e r s 6 0 0 高效液相色谱仪 气相色谱 2 2 3 实验方法 上海天达仪器厂 上海医疗器械修造厂 苏净集团安泰公司制造 北京医用离心机厂 上海求精生化仪器厂 w a t e r s 公司 日本岛津公司 ( 1 ) 酵母的死灭温度旧 微生物的死灭温度是指液态培养的微生物在某温度1 0m i n 后被杀死，此温度为该 微生物的死灭温度。在一组5m l 无菌麦汁试管中接入培养2 4h 后的酵母液o 1m l ，于 4 8 、5 0 、5 2 、5 4 、5 6 、5 8 下分别保温1 0m i n ，立即用冷水冷至室温， 2 5 培养。每天观察发酵情况，一周为止，在某温度下不繁殖，即为其死灭温度。 ( 2 ) 酵母的凝聚性- 光密度改良法【1 8 】 用y p g 培养基培养种子：斜面- 1m l 培养基一9m l 培养基。种子培养是在2 5 进行，每级培养2 4h 。二级种子直接接种于装有9 0m l 培养基的三角瓶中，瓶口扎好纱 布，同样在2 5 培养，3 。4d 后，将在y p g 培养基中培养的酵母连同培养基用离心机 在3 0 0 0r m i n 下离心1 5m i n ，得到酵母泥。弃去上清液，称取酵母泥o 2 5g 于1 5m l 的指管中，用o 0 1m o l l 的e d t a - n a 溶液洗涤、离心( 3 0 0 0r m i n ，1 5m i n ) 一次，弃 去上清液，再用去离子水洗涤、离心两次，弃去上清液，沉淀酵母泥转入5 0m l 具塞比 色管中，加入5 0m l p h 4 5 的h a c - n a a c 缓冲溶液，振荡5m i n ，迅速吸取2m l 于6 7 0 n l n 处测定光密度o d j ；比色管于2 0 水浴中保温3 0m i n 后，在距液面下1c m 处，吸 取2m l 于6 7 0m i l l 处测定光密度o d 2 。测定中以p h4 5 的h a c - n a a c 缓冲液为空白。 f ：o d l - o d ex 1 0 0 o d l 注：f 值越大，反映出酵母凝聚性或沉淀性的倾向越大。 ( 3 ) 酵母的活力一美蓝染色法【1 9 】 f i n k - - k u h e l e s 美蓝染色液制备方法： 溶液a ：美蓝蒸馏水溶液，o 1g 5 0 0m l 。 溶液b ：k h 2 p 0 4 蒸馏水溶液，1 3 6g 5 0 0m l 。 溶液c ：n a 2 h p 0 4 蒸馏水溶液，2 4g 1 0 0m l 。 溶液d ：4 9 8 7 5m l 溶液b 加1 2 5m l 溶液c 。 溶液e ：混合5 0 0m l 溶液d 和5 0 0m l 溶液a ，配置好的溶液p h 为4 6 。 酵母活力大小用死亡率表示。取等量酵母悬浮液与美蓝液混合，置于载片上。细胞 浓度为每视野约5 0 个，置载片与显微镜下观察，分别计总细胞数和蓝色细胞数。计数 时如果有芽孢大于酵母细胞的一半者则算两个。 ( 4 ) 酵母对糖类的利用 分别对酵母进行发酵试验，分析麦汁与发酵液的糖谱，比较其对糖的利用。用移液 6 第二章含活酵母啤酒中添加酵母的筛选 管移取3 0 0m l 麦汁( 或发酵液) 样品，加入7 0 0m l 无水乙醇，混匀，使蛋白质充分 沉淀析出，经普通滤纸过滤后，再用孔径为0 2 5l x m 的微滤膜过滤。将样品用进样针注 入高压液相色谱分析。基本信息如下： 仪器：w a t e r s 6 0 0 高效液相色谱仪，配置w a t e r s 6 0 0 四元输液泵，2 41 0 示差折光检 测器，7 7 2 5 i 进样阀，e m p o w e r 2 色谱工作站。台式离心机。 色谱条件：s u g a r p a k l 色谱柱( 3 0 0m m 6 5r a m ) ：检测器灵酸敏度：4 ；流动相：纯 水； 流速：o 4 m l m i n ：柱温：8 5 ；进样量：1 0 “l 。 ( 5 ) 酵母的降糖速度【1 7 1 菌种接入1m l 麦汁于2 5 下培养2 4h ，再移液体菌种2 环入5m l 麦汁培养基中， 培养2 4h ，接入2 5 0m l 麦汁中于2 5 发酵，称重记录原始重量。逐日观察发酵情况， 同时称重记录，以了解失重情况。每天失重情况反映酵母的降糖速度。 ( 6 ) 酵母菌株的发酵性能【冽+ 麦汁分别接种酵母后，塞上加入浓硫酸的发酵栓，按如下工艺进行发酵： 1 8 1 6 一1 4 p 嚣1 2 赠1 0 链8 梢6 4 2 012 3 4 5 6 7 8 91 01 11 21 31 41 5 0i2345678 9 1 01 11 21 3 发酵时间( 天) 发酵时间( 天) ( a )( b ) 图4 _ 1 发酵工艺曲线( a ) 和( b ) f i g 4 - 1p r o f i l e so ff e r m e n t a t i o np r o c e s s ( a ) a n d ) 测定发酵液p h 、总酸、酒精度、真浓、双乙酰、a 氧基氮和外观发酵度等指标， 考察菌种发酵是否正常。 ( 7 ) 发酵液醇酯种类及含量 样品的处理：于1 5m l 顶空瓶中放入搅拌子一枚和2 5g 食盐，并用保鲜膜封住瓶 口，置于冰水中3 0w i n 以上，加入5m l 样品或标准溶液( 样品需置于冰水中1 2h 以上) ， 同时加入内标溶液1 0 0 “l ( 需冷藏至0 ) ，密封瓶口。将样品放入2 5 水浴中1 0m i n ， 放到磁力搅拌器上搅拌1m i n ，再放到4 0 水浴中保温3 0m i n ，顶空进样。色谱条件： 装置岛津制g c 一1 4 b p f 数据处理岛津制c 求7 a 色谱柱u l b o nh r - 2 0 m0 5 3m mx3 0m 、膜厚3 01 t m 载气氮气约8m l m i n 追加气体氮气约3 0m l m i n 色谱柱室温度6 0 l m i n 至5 m i n 至1 5 0 2m i n 气化室温度 1 6 0 7 l 0 9 8 7 6 5 4 3 ， 一p一趟赠越越 江南大学硕十学位论文 2 3 结果与讨论 2 3 1 酵母的死灭温度 啤酒厂的灌装流程中，要进行温瓶操作，目的是去除瓶身的凝结水汽。目前啤酒厂 多采用5 0 的温瓶温度。添加的活酵母必须能够耐受5 0 温瓶处理，才能够保持其 活力，发挥其还原能力。因此，酵母的死灭温度就很重要。 测定时，将接种酵母的麦汁培养基分别于不同温度下，保温1 0m i n ，只要死灭温度 高于5 0 的酵母，在温瓶处理后应能保持活力。如表2 - 3 所示，1 5 株酵母死灭温度均 高于5 0 ，经温瓶处理后，能保持活力。除t 菌株死灭温度为5 4 ，其余1 4 株啤酒 酵母死灭温度均为5 2 。除t 菌株外其余啤酒酵母均为啤酒厂的生产酵母，死灭温度 在5 2 左右，测得的结果与实际情况基本吻合；而t 菌株为比利时进口白啤酒中分离 得到的菌株，测得死灭温度略高于其余啤酒酵母。对于含活酵母的啤酒而言，热稳定性 高的啤酒酵母更加适宜。 表2 - 11 5 株啤酒酵母的死灭温度 t a b 2 - 1e x t i n c t i o nt e m p e r a t u r eo ff i f t e e nk i n d so fy e a s ts t r a i n s 2 3 2 酵母的凝聚性一光密度改良法 酵母的凝聚性是其生理特征之一。每一酵母菌种均有一定的凝聚性，凝聚性不同， 酵母在酒液中的沉降速度不一样，发酵程度也有差异。凝聚性过强的酵母，沉降早、快， 酒液中酵母细胞数少，发酵缓慢，发酵度低；凝聚性差的酵母，沉降晚、慢，酒中酵母数 多，发酵较快，发酵度高。根据含活酵母啤酒的特性要求，在已经完成发酵的啤酒中， 所添加的啤酒酵母应该尽可能的悬浮在酒液中，同时生长缓慢，因此，趋向于选择凝聚 性差的酵母菌株。 表2 - 21 5 株啤酒酵母的凝聚性 t a b 2 - 2f l o c c u l a b i l i t yo ff i f t e e nk i n d so fy e a s ts t r a i n s 由表2 - 2 可知，其中4 5 一1 5 的凝聚性最差，g t 、t 的凝聚性其次，而g b 的凝聚性 最强。凝聚性差的酵母，沉降慢，在酒中悬浮的酵母数就多，酵母的还原性能就发挥的 越强；而且，凝聚性差的酵母，在储存过程中不易沉降于瓶底，以免形成沉淀。 由含活酵母啤酒的特性，结合1 5 株酵母菌株的死灭温度及凝聚性测定结果，下面 的实验选择4 5 1 5 ，g t ，t 三种菌株，而将g b 菌种作为正常发酵用下面啤酒酵母，进 行性能考察。 第二章含活酵母啤酒中添加酵母的筛选 2 3 3 酵母的活力一美蓝染色法 包装好的啤酒具有较高的压力、较差的营养条件，添加的活酵母不但不能自溶，而 且还要保持一定的活力，这就要求添加的活酵母必须具有较高的活力，也就是说酵母死 亡率必须较低。比较添加细胞浓度为1 0 6 个m l 的4 株酵母菌种在啤酒中的死亡情况。 + ( 迅- 4 1 - g r+ t * 一4 5 - 1 5 o5l o1 5 2 u2 53 l 3 54 j 时间( 天) 图2 - l 四株啤酒酵母的死亡率 f i g 2 - 1d e a t hr a t eo ff o u rk i n d so fy e a s ts t r a i n s 由图2 - 1 可知，在5 周时间内，四株菌株的死亡率均处于较低的水平，最大死亡率 低于2 0 。四株酵母菌株中，t 菌株的死亡率最低，在5 周的时间内死亡率一直维持在 低水平，最高不超过4 ；g t 菌株的死亡率较t 菌株略高，但其最大值也低于7 ，这 两菌株相对4 5 1 5 菌株与g b 菌株而言，死亡率低，稳定性强。4 5 一1 5 菌株的死亡率较 高，不适宜采用。 2 3 4 酵母对糖类的利用 将不同酵母对同样的麦汁进行发酵后，测定发酵液中残糖的种类及含量，见表2 _ 3 。 9 幻 塔 m 5 o ij6一鼯u鼷 江南大学硕士学位论文 表2 - 3 发酵液中的糖类及浓度 t a b 2 - 3t h es o r t sa n dc o n c e n t r a t i o n so ft h es a c c h a r i d ei nf e r m e n t a t i o nb r o t h 样品糖类浓度( m g l ) 麦芽五糖以上 1 6 0 麦芽五糖 1 8 0 4 5 - 1 5麦芽四糖0 5 3 麦芽三糖 1 9 1 麦芽糖2 9 l 麦芽五糖以上 1 3 4 麦芽五糖 1 8 2 g t 麦芽四糖 0 5 6 麦芽三糖0 9 6 麦芽糖 2 8 3 麦芽五糖以上0 3 4 麦芽五糖0 8 5 t 麦芽四糖 o 2 4 麦芽三糖 1 1 8 麦芽糖 2 1 8 麦芽五糖以上1 3 6 麦芽五糖0 6 5 g b 麦芽四糖 0 4 3 麦芽三糖0 8 5 麦芽糖 o 8 9 l 9 0 8 0 7 0 拿6 0 静5 0 霹4 0 3 0 2 0 1 0 o 5 一 _ _ 匕 餮 匠 一j l 隅 5园g t 口g b 麦芽五稀以上麦牙血糖夏岿：u q 裙麦芽= 秸麦牙裙 图2 - 2 四株啤酒酵母对糖的利用率 f i g 2 - 2s u g a ru t i l i z a t i o no f t h ef o u rk i n d so fy e a s ts t r a i n s 四种啤酒中均没有检测到葡萄糖，说明葡萄糖都已被酵母完全利用。发酵液中虽然 还含有麦芽糖，但浓度相当低，利用率均较高；除4 5 1 5 这株酵母的发酵液中麦芽三糖 含量稍高外，其余各菌株麦芽三糖的利用率较高；特别值得注意的是，t 菌株对各种糖 的利用率均很高，尤其是对麦芽四糖、麦芽五糖及麦芽五糖以上的利用率明显高于其它 菌株。 2 3 5 酵母的降糖速度 为了研究酵母主发酵时各自的降糖情况，降糖量的评价采用二氧化碳减重法，即每 2 4h 对三角瓶称重，记录重量的差值。在称量之前，要先尽量摇晃发酵液，使其中的二 1 0 第二章含活酵母啤酒中添加酵母的筛选 氧化碳逸出，保证每次称量的准确性。 234567 时间( 天) 图2 - 3 四株啤酒酵母的降糖情况 f i g 2 - 3s u g a rr e d u c i n gs i t u a t i o n so ft h ef o u rk i n d so fy e a s ts t r a i n s 其中t 的起发酵速度最快，降糖量也最大；所有四株酵母降糖的高峰几乎同步，发 酵高峰均出现在第二天，之后呈明显的下降趋势。四株酵母总的降糖情况相似。五天后， 降糖基本保持不变。 2 3 6 酵母菌株的发酵性能 2 3 6 1 四株啤酒酵母发酵液的常规指标 表2 1 4 四株啤酒酵母的发酵情况 t a b 2 - 4f e r m e n t a t i o ns i t u a t i o no ft h ef o u rk i n d so fy e a s ts t r a i n s 由表2 _ 4 可知，总体而言，四株酵母发酵情况正常。四株酵母除t 外对o 【氧基氮的 利用率都较高。啤酒酵母不能全部吸收麦汁中的氨基酸，对u 毒c 基氮的同化率随酵母的 品种和发酵条件的不同有较大的差异，波动一般在5 0 。7 5 之间。四株酵母发酵液中 总氮含量都较高，啤酒中残存的含氮化合物对啤酒的浓醇性影响很大。啤酒中的含氮化 合物( 特别是肽和蛋白质) ，在饮用者口腔中很容易浸润舌、口腔、喉头，使之有润湿 感，这样高含量的啤酒( 4 5 0m g t , ) ，就显得浓醇性，而含氮量在3 0 0 4 0 0m g m 就显 得爽口，若低于3 0 0m g m 就会使啤酒寡淡如水。 5 3 5 2 5 1 5 0 3 。 江南大学硕士学位论文 2 3 6 2 发酵液中醇酯种类及含量 表2 - 5 发酵液中主要高级醇与酯的含量( m e l ) t a b 2 - 5v a l u e so fa l c o h o la n de s t e ri nf e r m e n t a t i o nb r o t h s 由表2 - 5 可知，七种主要的醇酯在四株菌种的发酵液中都有存在，但含量有较大差 距，其中g t 菌株酯香味较重，而t 菌株总醇酯含量均比其余三株菌株少。对于本文所 研究的含活酵母啤酒，为了不改变其主发酵液的风味，应尽量选择风味物质产生少的菌 株，因此，就风味而言，t 菌株是比较理想的选择。 2 4 本章小结 ( 1 ) 测定了四株酵母菌株的死灭温度，t 菌株为5 4 ，其余均为5 2 ，这些酵母 死灭温度均高于5 0 ，使其在温瓶处理后仍能够保持活力。 ( 2 ) 测定了不同酵母菌株的凝聚性，其中g b 菌株凝聚性最强，为8 3 1 9 ，较低凝 聚性的菌株分别为4 5 1 5 菌株( 凝聚性3 5 2 6 ) ，t 菌株( 凝聚性4 3 1 7 ) ，g t 菌株( 凝 聚性5 6 4 4 ) 。含活酵母啤酒所采用的啤酒酵母应该凝聚性较差。 ( 3 ) 测定了酵母菌株的活力，在5 周时间内，菌株t 与g t 的死亡率均较低，菌株 4 5 1 5 与g b 的死亡率都较高，含活酵母啤酒所采用的啤酒酵母的死亡率应该较低。 ( 4 ) 测定了不同酵母菌株对糖的利用及其发酵性能。菌株t 、g t 、4 5 1 5 与g b 都能 够完全利用葡萄糖，对麦芽糖与麦芽三糖的利用率也较高。这些菌株的发酵状况均正常， 但是产生的七种主要醇酯物质的含量有较大差别，t 菌株产生的总醇酯量均低于其余三 株菌株。 根据含活酵母啤酒的特性要求，必须选择死灭温度高于5 0 ，凝聚性较差，酵母 死亡率低，发酵产生的风味物质含量相对较少的菌株作为拟添加酵母。综合考虑，选择 t 菌株作为拟添加菌株；同时选择菌株g t 作为备用拟添加菌株，以备放大试验之用。 1 2 第三章添加活酵母啤酒生产工艺的研究 第三章添加活酵母啤酒生产工艺的研究 3 1 前言 成品啤酒中所添加的酵母必须既满足达到其代谢活动保持啤酒的新鲜、不产生异味 的要求，又不能引起啤酒的浑浊。因此，除了要求酵母本身的活力强外，含活酵母啤酒 的生产工艺也至关重要。 欧洲生产的白啤酒是混浊型含活酵母小麦啤酒，是采用3 5 5 0 的小麦麦芽生产 的浅色和天然浑浊的啤酒，原麦汁浓度约为7 5 ，酒精含量为2 7 一2 8 。在啤酒中 再次添加麦汁和酵母并进行瓶内发酵。其糖化工艺采用投料温度为3 5 3 7 c 的双醪煮出 糖化工艺( 或单醪煮出糖化工艺) 。醪液的煮沸时间为2 0 - 2 5 m i r a 料水比为1 ：( 2 矿3 ) ； 最终发酵度为7 8 。8 5 。接种温度为1 2 c ，酵母添加量为o 3 1 l 。主发酵非常强劲， 在1 3 。2 1 下3 。4 d 便达到最终发酵度，然后回收酵母。 含酵母小麦啤酒的生产特点是瓶内发酵。分为无中间罐储藏的瓶内发酵和带中间罐 储藏的瓶内发酵。无中间罐储藏的瓶内发酵，添加了高泡酒和酵母的嫩啤酒灌瓶后分两 个阶段储藏：第一阶段：1 r 2 0 下储藏3 。7 d 。浸出物发酵到o 1 。0 2 ，还原双乙酰。 瓶内压力升高到1 5 0 - 2 0 0 k p a ；第二阶段：在5 c 下储藏1 4 - 2 1 d ，压力约为2 0 0 k p a 。采 用带中间罐储藏的工艺时，短暂起发酵后的啤酒在罐中被发酵至终了( 6 d 热罐，1 4 d 冷 罐1 ) 及成熟，最后灌瓶【2 l 】。 欧洲生产的白啤酒有如下显著特点：啤酒的颜色较深；从极限发酵度与发酵度之间 的区别来看，啤酒中可发酵残糖的含量很低；欧洲白啤酒中二氧化碳的含量远高于普通 啤酒；啤酒中所含活酵母的含量较高时是混浊的。本课题开发的含活酵母的啤酒与欧洲 白啤酒的区别在于：原料为大麦麦芽与大米，不含小麦麦芽；主酵工艺采用国内普及的 下面酵母进行发酵；原麦汁浓度较低；不进行瓶内二次发酵：成品酒澄清透明。而两者 最明显的区别在于前者在风味方面只有微小改变，而后者白啤酒由于瓶储时进行了二次 发酵，风味改变较大。 本章主要研究了温度对酵母活力、添加不同浓度酵母细胞对啤酒浊度的影响、含活 酵母啤酒储存过程中浊度的变化、添加的活酵母对啤酒中残糖的利用、添加活酵母啤酒 生产工艺的研究。旨在得到合适的含活酵母啤酒的生产工艺。