（发酵工程专业论文）杀虫剂多杀菌素菌种选育及发酵工艺优化.pdf

i 东大学额士学位论文 摘要 广潜生物杀虫剂多杀菌素是刺糖多孢菌( s a c c h a r o p o l y s p o r as p i n o s a ) 发酵 后的次级代谢产物，具有杀虫谱广，易降解，低残留，无抗药性，对人畜无害， 环境污染少等优点，因而在农牧业上有着广阔的应用前景，有望成为我国生物 农药产业一个新的经济增长点，该产品的开发具有很好的经济效益和社会效蓣。 本文进行了多杀菌素产生菌s a c c h a r o p o l y s p o r as p i n o s a 的诱变选育以及发酵 工艺条件的优化。运用紫外线、空间条件、微波等多种诱变因子进行菌种诱变， 并用紫外线诱变结合链霉素筛选，使多杀菌素的发酵单位不断提高，最后得到 一株高产菌株士s m - 5 2 3 ，发酵单位达到3 5 4p g l m l ，眈原始菌株提高了1 7 7 0 。 对该菌株的遗传稳定性考查结果表明，该菌株遗传性能眈较稳定。 本文对种子培养篡进行了优化。优化后的种子培养基比对照培养基不仅能 获得更大的生物薰，而且菌种生长更早，在培养6 0h 左右即可移种，缩短培养 对闻约1 0 h 。优化后的种子臻养鏊为：蛋白胨2 5 0 0 ，酵母膏0 3 ，葡萄糖0 5 0 0 ， 玉米浆1 o ，可溶淀粉0 3 ，麦芽糖0 4 0 0 ，硫酸镁0 2 0 1 0 ，碳酸钙0 0 5 。 由于种子液的菌体量增加，对发酵接种量进行了优化。发酵接种蚤以4 左 右为最佳。接稀爨超过1 0 0 0 会导致发酵单彼偏低。 本文对发酵培养基进行了优化。使用容易得到、廉价的农副产品。较适合 的原材料有豆油、可溶淀粉、黄豆饼粉、药媒、玉米浆、葡萄糖和酵母粉得到 的最佳培养基为：豆油2 o 、可溶淀粉2 + o 、黄豆饼粉1 5 、药媒1 0 、玉 米浆1 。0 、蕊萄糖5 。、酵母粉o 5 0 1 0 ，c a c 0 3o 3 ，m g s 0 4 7 h 2 00 1 ，k h p 0 4 o ，0 2 ，n a c lo 2 。最终优化后发酵培养基发酵单位达到4 6 3i j g l m l ，比对照提 赢了4 2 5 。 本文最后还赠5l 小罐小试，得到了5l 小罐发酵过程的菌浓、p h 筐、多 杀菌素含量等参数随时阀变化曲线。在5l 小罐中，多杀菌索发酵单位最高达到 2 6 3i j g l m l 。 关键词：多杀莹素，多刺糖多孢落，菌争 ，选育，发酵工艺优化 杀虫荆多杀越繁蒋种选育赦发酵工艺 托纯 a b s t r a c t 鼢似) s 嘲i s d e r i v e d f r o m t h e f e r m e n t a t i o n o f a n a t u r a l l y o c c u r r i n g a c t i n o m y c e t e s b a c t e r i u m , s a c c h a r o p o l y s p o r as t i n o s a d i t i san o v e lm i c r o b i a lb r o a d - s p e c t r u m i n s e c t i d d e , c o m p o 酬o fam i x t u r eo ft w o m o s ta c t i v en a t u r 捌l yo c c u r r i n gm e l a ) o l i t e s s 蟮r l o b - 攀n sa 黼dd ) l t h ea t t r i b u t e so f 蝌r l o s a di n c l u d i n gu n i q u ec h e m i s t r ya n d m o d eo fa c t i o n ，h i g hl e v e l so fa c t i v i t ya g a i n s te c o n o m i c a l l yi m p o r t a n tp e s t s | as h o r t h a l f - l i f 毫d e g r a d a t i o nt on a t u r a lb u i l c l i n gb l o c k s , a n dl a r g em a r g i n so f 心f o r r n 硝n m a l s , b i r d sf i s ha n de c e nm o 殴b e 憾f i c i a li n s e c t & i nt h i sd i s s e r t a t i o n ，蛙r a i n i m p r o v e m e n t o p t i m i z a t i o n o fs p i n o s a df e r m e n t a t i o np r o c e s sa n ds c d e - u pa f f e r 删a t i o np r o t e g e s w e r e i n v e s t i g a t e d + s t r a i ni m p r o v 锄n e n tw a sp e r f o r m e db ym u t s t i o n 蓍埘r a t i o n a l 鲫r e e n i n gt oo b t a i n a h i g h e rm i n o s y n s - p r o d u c i n g 蛙r a l n 。a f t e ru v , m i c r o w a v e , s p a c ec o n d i t i o nm u t a t i o n ， t h eh i g h e rp r o d u c t i v es t r a i nx s p i n o s a 善s 酗一5 2 3w a ss e l e c t e d 。t h ep r o d u c t i v i t y r ( 治c h e d3 5 4i j g l m l w h i c hw a st 7 7 。o m o r e t h a nt h a io ft h ep a r e n ts t r a i n t h eo p 秘m i z a t i o no ft h es e e dm e d i u mw a ss t u d i e d 。an 8 s e e dm e d i u mm a d e t h e s t r a i ng r o wb e l i e rw a s o b t a i n e d 。 t h eo p t i m i z a t i o no ft h ef e r m e n t a t i o nm e d i u mw 鹅s t u d i e d 。m a t e r i a l sc a l 3b e o b t a i n e de a r l ya n dc o s tl o w e r t h ep r o d u c t i v i t yo p t i m af e r m e n t a t i o nm e d i u m r e a c j l e d4 6 3 俐；w h i c hw a s4 2 。5 m o r et h a nt h a to ft h eo r i g i n a lf e r m e n t a t i o n m e d i u m 。 b a s e do nt h ea b o v em p e r i m e n t ad a t a , t e s t si n5lf e r r n e n l o rw e r e 翻c a r d e d o u t 剁ap r o d u c t i v i t yo f2 6 3i j g m lw a so b t a i n e d 。w h i c hl o w e rt h a nt h a t i nt h e s h a k i n gf l a s k s k e yw o r d s ：潮删：s a c c h a r o p o l y s p o r as p i n o s o ；r a t i o n a ls c e e n i n g ；f e r m e n t a t i o n p r o c e s so p t i m i z a t i o n 蠡东丈学壤士论文 原创性声明 本入郑重声蹭：所呈交的学位论文，是本入在导师的指露下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何萁链个入或集体纛经发表或撰写过的辩磷成果。对零文蕊雾 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明 的法律责任鸯零入承担。 ， 论文终考签盘；壹：l 兰塾 e t 籁：拿。：! z 关于学位论文使用授权妁声骥 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的瓣定，同意学校保留或向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论义被查阅和借阅；本人 授蔽由东大学霹瑷涛奉学霞谂文戆全部或蘩分内容编入蠢关数据痒邃纷捡索，霉 以采用影印、缩印或其他复制洋段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在勰密后痤遵守此规定) 论文作者签名：囱2 堑导师签名： 日期： 山东大学硕士学位论文 第一章文献综述 1 1 生物农药的研究概况 农药是人类研制出来的用来消灭农作物病虫害的药物。农药可分为化学农 药和生物农药。化学农药是使用化学手段合成的用于防治植物病虫害、杂草、 鼠害以及调节植物生长的制剂的总称。化学农药，特别是有机合成化学农药的 应用是人类社会文明发展的一大标志，它极大地保护和发展了人类社会的生产 力。比较而言，人工合成的化学农药具有毒力强，见效快，能迅速抑制病虫害 的大面积发生及蔓延的优势。化学农药目前仍是防治作物病、虫、草、鼠害的 主要措施，我国每年农药使用量在1 0 0 万吨左右，并且随着农业的发展，农药的 使用量呈上升势头。 但随着农药的广泛应用和发展其本身不可避免和弥补的潜在公害也日益暴 露出来。化学农药存在着农药残留、农药抗性、环境污染、非靶标生物受害和 慢性毒性等诸多问题。长期使用农药导致农作物农药残留过高，残留的农药通 过食物链进入人体内逐渐积累，易诱发癌症等多种疑难病症，甚至发生农药中 毒事故，引起人员伤亡事故。调查显示，人类癌症发病率逐年上升与农药田间 使用量呈平行关系。我国农村中4 0 - 5 0 j l 童白血病患者，其发病诱因便是农药 等有害化学物质。苏格兰科学家研究发现：暴露在化学农药中的孕妇所养育出 的儿童患白血病的机率是那些避免与农药接触的孕妇的1 0 倍。同时，化学农药 应用同时带给人类一定程度的破坏作用：长期、无节制地使用化学农药，致使 土质板结、地下水质污染、农产品质量下降以及自然生态平衡的破坏等。化学 农药不仅杀灭病虫害，同时也杀死了昆虫的天敌，主要病虫害被消灭，次要病 虫害又上升为主要病虫害，因此不能从根本上解决病虫害问题，而且破坏了生 态平衡! 此外，化学合成农药多为大分子有机物，长期使用易产生抗药性。这些 都严重影响农业的可持续发展【1 】o 我国已经于1 9 8 3 年开始全面禁止使用有机氯农 药，但仍存在农药品种结构极不合理、农药剂型相对单一、所用溶剂绝大多数 为有机化学物质、作用机理多为毒杀型、其它作用机理的农药品种不多等问题， 集中体现为 e 个7 0 ，即杀虫剂占农药总量的7 0 0 l o ，有机磷农药占杀虫剂的 杀虫剂多杀菌素菌种选育及发酵工艺优化 7 0 ，有机磷农药中高毒品种占- 7 0 。 近年来，随着环境保护和可持续发展观逐渐深入人心，人们越来越注重农 业生产的可持续发展及人与环境的协调，特别是由于化学农药的高毒及高残留 对农产品生产的负面影响，促使越来越多的国家制定了愈来愈严格的农药安全 标准，严格限制化学农药的使用并淘汰了部分剧毒、高残留类化学农药，相应 加大高效、低毒、低残留类新型农药特别是生物农药发展的计划，使得企业和 科研机构逐步转向生物农药的开发和推广。 生物农药( b i o p e s t i c i d e ) 为用来防治病、虫、革等有害生物的生物活体及 其代谢产物和转基因作物，可以制成商品上市流通的生物源制剂，包括生物源 农药、微生物农药、生物化学农药、生物合成农药、转人外源基因的抗有害生 物作物等田。生物农药与传统化学农药相比，很大的区别在于它们通常是控制而 不是消灭病虫，具有延迟的作用，更具有选择性。与化学农药相比，生物农药 具有以下有点：( 1 ) 毒性通常比传统农药低。( 2 ) 选择性强，只对目的病虫和与其 紧密相关的少数有机体起作用，而对人类、鸟类、其它昆虫和哺乳动物无害。 ( 3 ) 低残留，高效。( 4 ) 不易产生抗药性。( 5 ) 作为病虫综合防治项目的一个组成成 分，能极大降低传统农药的使用量而不影响作物产型”。r h 于具有以上优点，生 物农药被各国政府及广大农民重视和推崇。微生物源农药在我国的研究、开发 一直非常活跃，并且我国把高效安全生物农药及生物防治技术作为2 1 世纪优先 发展项目。从2 0 世纪7 0 8 0 年代开始，我国在化学农药品种更新换代的同时， 生物农药研究与开发也有长足进步。自1 9 8 6 年实施口b 6 3 高科技发展计划以来， 在生物农药方面取得了一批成果，如苏云金杆菌、灭稻瘟素- & 春雷霉素、多氧 霉素、井冈霉素、盐霉素、赤霉素、浏阳霉素、华光霉素、公主岭霉素、金核 霉素等，在农药方面发挥了重要作用。根据农业部农药检定所2 0 0 3 年公布的农 药注册统计，在我国登记的1 , 3 0 0 多个农药品种中，生物农药( 含农用抗生素) 品 种有8 0 多个，全国农药生产量约为1 2 万吨制剂，生物农药只占我国农药份额 的1 1 左右 3 1 。虽然生物农药占整个农药市场的份额小，但却以每年1 0 - 2 0 的 速度上升，发展势头迅猛 4 1 。我国是农业大国，农产品出口种类多，数额大，农 药市场潜力巨大，发展生物农药具有重大意义：( 1 ) 能防治多种病虫害；( 2 ) 可生 2 山东大学硕士学位论文 产无公害绿色食品。在国际农产品和食品贸易中，苛刻的农药残留标准制造贸 易壁垒的同时也为生物农药的发展提供了巨大的机遇。以生物防治病虫害为主， 少量施用化学农药是生产绿色安全食品的保证；( 3 ) 减少环境污染，确保人畜安 全：( 4 ) 保护天敌；( 5 ) 病虫不易产生抗药性。 1 2 多杀菌素的研究历史 多杀菌素是一种新型绿色广谱生物杀虫剂，属于微生物源生物化学农药圈。 1 9 8 2 年美国礼来公司天然产物研究部门一位正在度假的化学家顺便在加勒比海 地区废弃的甘蔗制甜酒厂附近采集了土壤样品，1 9 8 5 年从该土壤微生物中发酵 筛选得到a 8 3 5 4 3 a 生物活性产品并测定了其对鳞翅目害虫的摄食和触杀毒性【坷。 后来，该活性产品被命名为s p i n o s a d ，中文名为多杀菌素，又名刺糖菌素。1 9 8 6 年，多杀菌素产生菌被确定为放线菌中的一个新的属种，英文名为 s a c c h a r o p o l y s p o r a s p i n o s a m e r t z y a o 。1 9 8 9 年礼来公司和陶氏化学公司合并 了她们的作物科学部门，成立了一家新的美国陶氏益农公司。陶氏益农公司转 而成为陶氏农业科学公司后，由陶氏化学公司掌握全部的所有权。陶氏益农公 司投入了数以百计的员工和大批的科研小组，有多个部门发挥了团队精神，密 切合作；到1 9 9 7 年，产品在美国登记注册。1 9 9 9 年在2 4 个国家超过1 0 0 种作 物上登记注册i s 。目前，多杀菌素商业化的品种有用于棉花的催杀( t r a c e r ) ，用 于蔬菜类的菜喜( s u c c 瞄) ，以及c 0 1 3 8 e l v e 和s p i n t o r 。我国目前使用的有用于蔬 菜的菜喜和催杀们。 多杀菌素可用于防治各种鳞翅目、双翅目、缨翅目、鞘翅目及膜翅目害虫， 且对蓟马高效。与一般杀虫剂相比，多杀菌素见效快、无副作用、有选择性、 对天敌安全、半衰期短、易降解，并且残余物缓和、产生抗性的可能性低。多 杀菌素兼有生物农药的安全性和化学合成农药的快速效果，因其低毒、低残留、 对天敌安全、分解快而获美国口总统绿色化学品挑战奖酽。 3 杀虫剂多杀菌素菌种选育及发酵工艺优化 1 3 多杀菌素的理化性质与生物活性 1 3 1多杀菌素的组分及结构 多杀菌素是由多刺糖多孢菌( s a c c h a r o p o l y s p o r as p i n o s a ) 在培养基中发酵 后得到的次级代谢产物。b o e e k 等人删首次从ss p i n o s an r r l 1 8 3 9 5 培养液中分 离出了多杀菌素组份a 、b 、c 、d 、e 、f 、h 、j 和s p i n o s a d a 假糖苷配基，其 中s p i n o z a 组份约占8 5 - 9 0 ，s p i n o s 利d 组份约占1 0 - 1 5 0 o ，多杀菌素b 、c 、 e 、f 、h 、j 组份和s p i n o s a d a 假糖苷配基均为次要组分。后来又陆续发现了1 5 种多杀菌素类化合物【1 0 - 1 3 ，包括多杀菌素k 、l 、m 、n 、o 、p 、q 、r 、& t 、 u 、v 、w 、y 。在天然多杀菌素分离提取物中，两个最高活性组份s p i n o 岛j n a 和d 的混和物被称为s p i n o s a d s ，中文通用名为多杀菌素或多杀霉素、刺糖菌素。 k i r s t 等人通过光谱学( n m r ，m s , u v , i r ) 和x 衍射晶体学方法确定了 s p i n o s a d a d 的结构佣。从结构上看，这些化合物属大环内酯类，分子内包含 一个独特的四核环系，并连结着两个不同的六元糖。四核环系由一个5 , 6 ，孓顺 反一反三环系统和一个十二元大环内酯组成，一个a 1 3 不饱和酮和一个独立的双 键嵌在四核环系中。四核环部分在两个端分别由两个羧基取代，与其相连的两 个六元糖其中一个是f e r o m i ，另一个是鼠李糖( r h a m n 0 8 e ) 。多杀菌素其它 组分的结构则通过光谱学方法( n m r ，m s , u v , i r ) 以及通过与s p i n o s a d a 的结构 加以比较后确定。 多杀菌素的结构通式见图1 1 【伺。 4 山东大学硕士学位论文 r 1 f o r o s a m i n es u g a r l n 图1 1 多杀菌素的分子结构 多杀菌素的各组分结构见表1 1 。 表1 1 多杀菌素各组分结构 r h a m n o s es u g a r 组分 r 1 r 2r 3r 4r 5r 6 r 7r 8 多杀菌素a m em e e tm eh 多杀菌素b h m ee tm eh 多杀菌素c hh e lm eh 多杀菌素dm e m ee tm em em em em e 多杀菌素e m em e m em eh 多杀菌素f m em e e i hh 多杀菌素hm em e 日m e h 多杀菌素j m em e日m eh 多杀菌素k m em ee tm eh 多杀菌素l 多杀菌素m 多杀菌素n m em e e tm e m em e hm e hm ee tm ehm e h hm e e l m e m em eh m e m e 多杀菌素o m em ee tm em em em e h 5 e e e m m m e e e m m m e e e m m m e e e e m m m m 卜 e e e e h e e e e m m h m m 杀虫剂多杀菌素菌种选育及发酵工艺优化 1 3 2 多杀菌素的理化性质 多杀菌素为浅灰色的固体结晶，带有一种类似轻微陈腐泥土的气味，可溶 予有机溶剂，在极性的有机溶剂中比在非极性溶剂中的溶解度高，在水中的溶 解度很低，在水溶液中其p h 值为7 7 4 ，对金属和金属离子在2 8d 内相对稳定， 商业化产品的保质期为3 年。多杀菌素蒸汽压在3 x 1 0 - l o 阳左右，属于非挥发性 物质。 s p i n o s a d a 和d 的一些物理、化学性质见表1 型司。 表1 2 s p i n o s a d a 和d 的物理、化学性质 6 山东大学硕士学位论文 在温和酸性条件下( 浓盐酸，甲醇，回流2h ) ，s p i n o s a d a 和d 。容易分解 生成各自的1 3 位脱糖基假糖苷配基，在更为剧烈的条件下( 7 2r n o l l 硫酸，甲 醇，回流3h ) ，s p i n o s 刮a 会继续脱去2 位的鼠李糖，生成s p i n o s a d a 假糖苷配 基，而s p i r x 玲a dd 则因为分子内重排，未能得到s p i n o s a dd 假糖苷配基。 1 3 3 多杀菌素的稳定性 多杀菌素在环境中的降解可通过多种途径组合的方式进行，主要为光降解 和微生物降解，最终变成碳、氢、氧、氮等自然组分。在土壤中多杀菌素光降 解的半衰期为9 - 1 0 d ，而在水中多杀菌素光降解的半衰期则小于1d ，在叶面上 多杀菌素光降解的半衰期是1 6 - 1 6 d 。当然，半衰期的长短还取决于阳光的强弱。 在无光照条件下多杀菌素经有氧土壤代谢的半衰期为9 - 1 7d 。当多杀菌素被应用 于水中时，很少有水解的现象发生，该物质可以长期在水中存在，因为在p h 孓7 范围内它在水中是相对稳定的，p h9 时其半衰期至少要2 0 0 d 。在水中且有阳光 照射下，多杀菌素也会发生光分解的现象。另外多杀菌素的沥滤性能非常低， 因此只要使用适当，它也就不会对地下水构成威胁【1 6 1 。 7 杀虫剂多杀菌素菌种选育及发酵工艺优化 1 3 4 多杀菌素的结构与生物活性 多杀菌素的基本结构中，中间为十二元大环内酯结构，两端连接两个糖为 f o r o s a m i n e 和鼠李糖( 见图1 1 ) 。试验表明，f o r o s a n i n e 中的r 1 和r 2 为甲基 数不影响多杀菌素的生物活性。r 5 位甲基的变化几乎不影响其生物活性；但是， 如果内酯r 3 和r 4 部位的烷基改变，生物活性将大大降低。因此，两种糖对活 性起着关键的作用，除去其中任何一种糖都几乎导致活性的全部丧失。由此可 知，多杀菌素的其他组分也有一定的杀虫活性，但除多杀菌素a 和d 外，其他 组分含量很小。因此多杀菌素的杀虫活性几乎都是由多杀菌素a 和d 产生的。 1 3 。5 化学修饰对多杀菌素生物活性的影响 大量的田问试验表明，这种天然来源的多杀菌素效价己经很高，稳定性及 环境相容性也很好，不经过化学修饰就可以使用【1 7 1 1 8 1 。但对多杀菌素进行化学 修饰也有可能找到控制不同害虫更为有效的化合物。多杀菌素的分子结构非常 复杂，含有许多官能团，表明对多杀菌素进行修饰的可能性很大。在目前的研 究中，对多杀菌素的结构改造主要是对两个糖基的修饰。 表1 3 多杀菌素及其类似物的杀虫活性比较 修饰位点及对烟青虫的 修饰位点及对烟青虫的 母体化合物母体化合物 取代基l c ( r n 9 f l )取代基l c ( f 吼) 多杀菌素a 0 3 1 孓1 4 巾二氢多杀菌素a 4 , 7 - 多杀菌素d 0 5 1 3 - 1 4 - 环氧化多杀菌素a 1 4 4 n h c h 3多杀菌素b 0 41 孓n h o h 多杀菌素a 5 6 4 - n h 2多杀菌素co 82 甲基多杀菌素a 4 5 n 一乙酰基 多杀菌素a 3 42 - o h 多杀菌素h 3 | 2 4 - 酮基多杀菌素b5 7 2 o c - a h 5多杀菌素h 0 1 1 n c o n h c h 3多杀菌素b 4 63 o h 多杀菌素j 6 4 n 一乙基多杀菌素b0 4 3 一o c , 2 h 5 多杀菌素j 0 0 3 ， 8 山东大学硕士学位论文 到目前为止，已鉴定了4 0 0 多种天然的以及合成的多杀菌素类似物。对多 杀菌素类似物的杀虫活性评估可以通过给烟青虫( t b w ) 幼虫服用大剂量药液 来测定。表1 3 列出了部分多杀菌素对烟青虫幼虫的l c 值。对天然产物进行 化学修饰的研究中发现，大部分多杀菌素衍生物或类似物的活性都要比两种主 要的天然产物多杀菌素a 和d 活性低，改变氨基空间结构对活性几乎没有影响， 但破坏氨基碱性的化学修饰使多杀菌素的活性大大降低。此外，烯酮结构的破 坏也使多杀菌素的活性大大降低，还原或氧化可以导致其活性减少1 0 0 倍。但 还原5 ，昏双键或再引入一个双键对活性的影响不大。t h o m a s 1 研等利用人工神经 网络对多杀菌素进行了研究，结果表明，增加多杀菌素类化合物分子的亲脂性 和减少偶极矩能够提高分子的活性。 另外，对另一个六元糖f o r o s a 枷舱上的取代基进行改造，以及对四核环系 上的取代基进行改造，也将是下一步研究的热点，以期能够合成出新的类似物， 在生物活性和杀虫谱上能有更大的提高。 1 4 多杀菌素的作用机理 目前广泛使用的杀虫药剂多为神经毒剂，包括有机磷酸酯类、氨基甲酸酯 类、拟除虫菊酯类、烟碱类、沙蚕毒素类、多杀菌素类、甲脒类和阿维菌素类 g 杀虫剂多杀菌素菌种选育及发酵工艺优化 杀虫剂。有机磷类杀虫剂不仅抑制乙酰胆碱酯酶活性和乙酰胆碱受体功能，影 响乙酰胆碱的释放，而且还具有非胆碱能毒性，有些有机磷杀虫剂还能引发迟 发性神经毒性。新烟碱类杀虫剂是烟碱型乙酰胆碱受体( n a c h r ) 的激活剂， 作用于该类受体的a 亚基；由于对昆虫和哺乳动物n a c h r 的作用位点不同，它 对昆虫的毒性比对哺乳动物的毒性大得多。拟除虫菊酯类杀虫剂主要作用于神 经细胞钠通道，引起持续开放，导致传导阻滞；该类杀虫剂也可抑制钙通道， 还干扰谷氨酸递质和多巴胺神经元递质的释放。拟除虫菊酯类杀虫剂对昆虫的 选择毒性很可能是因为昆虫神经元的钠通道结构与哺乳动物的不同。阿维菌素 类杀虫剂主要作用于r - 氨基丁酸( g a b a ) 受体，它能促进g a b a 的释放，增 强g a b a 与g a b a 受体的结合，使氯离子内流增加，导致突触后膜超级化。由 于这类杀虫剂难以穿透脊椎动物的血脑屏障而与中枢神经系统的g a b a 受体结 合，故该类杀虫剂对脊椎动物的毒性远低于对昆虫的毒性1 2 0 。 多杀菌素没有抑菌活性，却有杀虫活性。多杀菌素的生物活性不同于一般 的大环内酯类化合物，其独特的化学结构决定了其独特的杀虫机理。在已知的 害虫防治产品中，多杀菌素的作用机制非常新颖和独特。实验证明它对昆虫存 在快速触杀和胃毒作用，以胃毒作用为主，对昆虫击倒力强，在作物上有很强 的渗透性【2 1 】。多杀菌素通过作用于昆虫的神经系鲥互2 3 i ，增加其自发活性，导 致非功能性的肌收缩、衰竭，并伴随颤抖和麻痹，显示出n a c h r 被持续激活引 起乙酞胆碱( a c h ) 延长释放反应【捌。多杀菌素同时也作用于g a g b 受体，有 改变g a b a 门控氯通道的功自口2 5 l 。多杀菌素与毗虫啉和其它的烟碱性受体类的 杀虫剂的作用位点是不相同的。用烟芽夜蛾( h d i o t h i s v i r e s c e n s ) 幼虫所做的试 验表明，与拟除虫菊醋类杀虫剂不同，多杀菌素类杀虫剂( 如s d n o s a d a ) 可缓 慢穿透幼虫的体表进入体内，但一旦进入虫体后则不被代谢陶。阿维菌素也是 一个天然产物，且同为大环内酯类，但其作用位点亦和多杀菌素不尽相同。如 此的作用模式可谓独一无二，迄今为止，尚未发现某类产品能以相同作用方式 影响昆虫的神经系统，而且尚无有关多杀菌素交叉抗性的报道。 山东大学硕士学位论文 1 5 多杀菌素的生物合成 1 5 1 多杀菌素合成涉及的基因 多杀菌素生物合成涉及到2 3 个基因，其中5 个聚酮合成酶基因( p k s ) 合 成大环内酯结构，4 个基因将大环内酯修饰为糖苷配基，5 个基因合成和添加鼠 李糖，3 个基因使鼠李糖甲基化，6 个基因合成和添加f o r o s a n i n e 。这些基因大 部分组织成簇，排列在长约8 0k b 的基因组中，但也有个别基因( 如n d p - 鼠李糖 合成基因) 例外，不在这一基因簇中。 多杀菌素生物合成基因组图如图1 ，型2 司。 图1 2 多杀菌素生物合成基因组图 l 鲫w q r tp v no 怕 9 a 6 釉”e he 粒j 暑j ，co 萎 k 2 c 1 0 3 副1 l 1 6s q 0mkiga cer 2 卜 _ _ _ _ 呻巾 争 _ _ _ 啼_ _ - _ _ _ _ l 1 5rpnljh f bd r 1 多杀菌素生物合成基因中各基因的功能见表1 4 1 2 8 i 。 表1 4 多杀菌素生物合成基因组中各基因的功能 基因大小功能 印，纠 s p n b s p n c 2 5 9 6 2 1 5 3 3 1 7 1 p k s p k s p k s 杀虫剂多杀菌素菌种选育及发酵工艺优化 s p n d s p n e s p n f s p n g s p n h s p n l s p n j s p n k s p n l s p n m s p n n s p n o s p n p s p n q s p n r s p n s o r f r l 0 r l l r 2 o r f l 1 5 o r f l 1 6 p k s p k s 聚酮交链形成? 鼠李糖转移酶 鼠李糖：d 甲基转移酶 鼠李糖：d 甲基转移酶 聚酮交链形成? 鼠李糖：d 甲基转移酶 聚酮交链形成? 聚酮交链形成? f o r o 岛m i n e ：3 - 酮基还原酶 i ：o r o s a n i n e = 2 。3 - 脱氢酶 f o r o s a - n i n e 转移酶 f o r o s a t l i 3 ，4 - 脱氢酶 f o m s a n i n e 转氨酶 f o r o 翰嘣n e ：二甲基转移转移酶 未知 外切脱氧核糖核酸酶 推定的氧化还原酶 推定的l y s r 调节因子 1 5 2 聚酮链的合成 多杀菌素属于大环内酯类化合物，其结构上属于聚酮类物质，其生物合成 也与聚酮类物质呈相似的规律【2 9 一。与一般的大环内酯类化合物相似，多杀菌素 的生物合成也是采用聚酮合成途径进行合成。多杀菌素的聚酮是通过在起始单 位丙酸上按a a p - a a a a a a a ( a 乙酞p - 丙酞) 的顺序添加1 0 个酞基缩 合而成，聚酮链延伸完成后环化形成大环内酯核，接着在核分子内c 3 - c 1 4 、 c 4 - c 1 2 及c 7 - c l 之间形成交联桥。 蚴 嫩 躺 湖 矧 骞 刚 骞 拟 榭 | 享 钾 蕈 弼 娥 黜 储 勉 猫 敬 山东大学硕士学位论文 1 5 3 三甲氧基鼠李糖的生物合成与连接 由葡萄糖1 磷酸经n d p - 4 - 酮& 脱氧d 葡萄糖合成鼠李糖，鼠李糖再接到 糖苷配基上，这是糖苷配基转换为多杀菌素必需的第一步。鼠李糖连接后，由 s 腺苷甲硫氨酸提供3 个甲基，按照2 ，3 和4 o h 基的顺序加到鼠李糖上。 1 5 4f o r o s a m i n e 的生物合成 f o r o s a m i r e 由n d p - 4 - 酮& 脱氧d 葡萄糖( 是上述合成三甲氧基鼠李糖的共 同中间物) 经一系列酶( 由印聪ms p n o , 唧研q ，s p n r 及妒心基因编码) 催化生成 n d p - f o 删n 岛再由f o r o s a n i n e 转移酶催化将n d p - 福乐糖胺连接到糖苷配基 上合成多杀菌素。 多杀菌素合成过程与其他大环内酯化合物比有其独特的一面：( 1 ) 其聚酮 内含有3 个环内分子间c - c 键，其形成和环的闭合明显是通过4 + 2 成环加成反 应和经醛缩合反应或米歇尔缩合反应进行的。( 2 ) l - 鼠李糖和d - f o r o s a - n i n e 是 在内酯化形成糖苷配基后分别连到9 位和1 7 位羟基上的，然后再对鼠李糖的 2 ，3 ，4 羟基进行甲基化。f o r o s a n i n e 的氮甲基上的两个甲基和三甲氧基鼠李糖的 甲氧基都来自s - 腺苷甲硫氨酸。 多杀菌素的合成全过程见图1 3 。 墨皇型兰查堕茎堕塑垄亘墨垄璧三茎垡些 图1 3 多杀菌素a 的合成途径 山东大学硕士学位论文 1 6 多杀菌素的生产咿2 i 1 6 1 多杀菌素的发酵生产菌种 ss p i n o s a 属刺糖多孢菌属，是一种好氧型革兰氏阳性放线菌，适宜生长温 度为1 5 - 3 7 。c ，对溶菌酶敏感，能在高渗条件下( 1 1 n a c i ) 生长。将菌株培养 在i s p 培养基1 上时，观察到圆形白色菌落，直径为8 - 1 0 m m ，中央隆起，反面 为黄褐色，没有明显的色素沉着，在某些培养基中可溶性褐色色素被释放到培 养基中。s p i n o s a 在大多数培养基( 如i s f 2 、a t c c l 7 2 、苹果酸钙等) 上都能 生长良好，并形成良好的气生菌丝体。它可产生一种伸展的基质菌丝体，此菌 丝体在液体发酵过程中分裂。但在琼脂培养基上培养该菌株时未观察到分裂现 象。气生菌丝分隔成以镰刀状和开环状排列的长孢子链。还观察到了螺旋状的 茵丝，但它们短而不完整。孢子链具有独特的珠状外观，有许多空隙，其长度 大大超过5 0 个孢子，未观察到之字特征、菌核、孢子囊或游动细胞。这一特征 说明孢子链是包在一个孢子壳中。这个孢子壳由非常独特的针状物覆盖，这些 针状物约1u m ，环绕在末端上孢子形状为椭圆形，平均大小约为1 1 x 1 5u m 。 气生孢子群颜色主要为浅粉黄色，在某些培养基上也产生白色孢子。s p i n o s a 产生过氧化氢酶、磷酸醋酶、脉酶和h 2 s ，不能产生类黑素色素。 ss p i n o s a 对头孢菌素( 3 0 p g ) 、青霉素( 1 0 单位) 和利福霉素( 5p g ) 有抗 性。& s p i n o s a 对下列抗生素敏感：杆菌肽( 1 0 单位) 、庆大霉素( 2 旧) 、新霉 素( 3 0 l a g ) 、夹竹桃霉素( 1 5 i x ：j ) 、链霉素( 1 0 p c j ) 、林肯霉素( 1 0 旧) 、四环 素( 3 0p g ) 、托普霉素( 1 0l a g ) 和万古霉素( 3 0p g ) 。 美国陶氏益农公司发酵生产采用的& s p i n o s a 主要选自菌株n r r l l 8 3 9 5 、 n r r l l 8 5 3 7 、n r r l l 8 5 3 8 、n r r l l 8 5 3 9 或能产生多杀菌素的突变株。菌株 n r r l l 8 3 9 5 是由分离采集自维尔京岛土样的菌株经化学突变而得到。菌株 n r r l l 8 5 3 7 、n r r l l 8 5 3 8 和n r r l l 8 5 3 9 则是由n r r l l 8 3 9 5 经化学诱变获得的。 1 6 2 多杀菌素的发酵生产 刺糖多孢菌的种子培养基为：酶解大豆水解液3 ，酵母膏o 3 ， 1 5 杀虫剂多杀菌素菌种选育及发酵工艺优化 m gs i 文7 h 2 0 0 2 ，葡萄糖0 5 ，麦芽糖0 4 ，去离子水1l ，1 2 1 灭菌3 0m i n 。 接种量为1 0 。用来生产多杀菌素的培养基可以是多种培养基中的任意一种。 但是从生产的经济、产率和产物易分离的角度看，优选出某些培养基。例如， 大规模发酵时优选的碳源为葡萄糖和麦芽糖，但也可以使用核糖、木糖、果糖、 半乳糖、甘露糖、甘露醇、可溶性淀粉、马铃薯糊精、油酸甲酯、油类等等。 优选的氮源为棉子糖、胨化牛奶和消化大豆粉，但也可以使用鱼粉、玉米浸液、 酵母膏、水解酪蛋白、牛肉膏等。可掺入培养基中的营养无机盐有能够产生下 列离子的常规可溶性盐：锌离子、钠离子、镁离子、铵离子、氯离子、碳酸根 离子、硫酸根离子、硝酸根离子等。培养基中还应含有微生物生长发育所需的 必需微量元素。这些微量元素一般作为杂质存在于培养基的其它成分中，其含 量足以满足微生物的生长需要。如有发泡问题，通常可将少量消泡剂加到大规 模发酵培养基中。但在产刺糖菌素培养过程中，常规消泡剂会抑制刺糖菌素的 产生。也可以在培养基中加入豆油抑制发泡。 1 6 3 多杀菌素的分离提取 发酵液中加入等体积的丙酮萃取，过滤，滤液用n a o h 调p h 至1 0 ，加入 1 2 发酵液体积的乙酸乙酯，分层后弃去水相，有机相减压浓缩到1 2 发酵液体 积，用1 2 发酵液体积的酒石酸( o 1m o l l ) 萃取，分层，减压蒸发除去水溶液 中可溶性的乙酸乙酯，利用反渗透操作浓缩水溶液，用n a o h 调节浓缩后水溶 液的p h 至1 m 1 1 ，过滤，分出沉淀物，水洗，真空干燥，得到多杀菌素成品。 1 7 多杀菌素的分析检测1 3 2 1 高效液相色谱仪( h p l c ) 是多杀菌素测定的常用方法，其各个组份都可用 h p l c 进行定性或定量分析。离心发酵液样品，去上清液。在生物量中加入甲醇， 使样品达到原有体积，混合后放置至少1 5m i n ，离心并用微孔纤维素膜过滤上 清液；也可以用丙酮或乙睛提取发酵液。测定时采用的h p l c 系统为：色谱柱 为c 1 8 柱，流动相为乙腈，甲醇水= 4 0 4 0 2 0 ( 含0 。0 5 0 0 7 , 酸铵) ，流速1 om 1 ，m n ， 检测波长为2 5 0n m 。多杀菌素的测定也可以采用吸光法，但较繁琐，且不很准 确。另外，l e e 等人还报道了用荧光免疫测定方法对多杀菌素a 组份进行测定。 1 6 山东大学硕士学位论文 1 8 多杀菌素的应用i l 1 8 。1 多杀菌素的杀虫谱 从1 9 9 0 年开始，在全球范围内广泛开展了多杀菌素的各项试验，大田防治 证明多杀菌素对鳞翅目( 菜青虫、小菜蛾、棉铃虫、斜纹夜蛾、甜菜夜蛾、烟芽 夜蛾、斜纹夜蛾，苹果卷叶蛾、桃潜叶蛾、菜螟、粘虫等) 、缨翅目害虫( 棕搁蓟 马、温室蓟马、花蓟马、稻蓟马等) 有较广的杀虫谱和较高的杀虫活性。对鳞翅 目昆虫而言，多杀菌素是目前己发现的杀虫剂中选择性最高的化合物之一。此 外，它还可以很好地防治双翅目( 潜叶蝇、蚊、蝇等) 、鞘翅目、膜翅目害虫中 某些大量吞食叶片的害虫种类。通常多杀菌素不能十分有效地防治刺吸式昆虫， 但其中有些类型仍在测试中。可见，多杀菌素属广谱杀虫剂。表1 5 列举了多杀 菌素新产品活性谱上标明的可用以防治的虫害对象。 表1 s 多杀菌素防治虫害的现有或即将推出的标签个例 普通名 剂量( g ，h r n 2 ) 普通名剂量( g ，h 一) 玉米螟2 孓5 0马铃薯叶甲 2 5 _ 8 0 谷实夜蛾4 0 - 1 0 0菜粉蝶5 口1 0 0 粉纹夜蛾5 阻1 0 0番茄蠢蛾5 口1 0 0 小菜蛾 1 5 - 5 0 花翅小卷蛾 2 5 - 5 0 亚热带粘虫5 m 1 0 0叶波纹须蛾2 5 _ 5 0 斑潜蝇 7 0 - 3 6 0棉锋虫5 阻1 0 0 棕黄蓟马7 阻1 0 0番茄天蛾4 m 1 0 0 草地贪夜蛾2 拿1 0 0苜蓿蓟马7 m 1 0 0 甜菜夜蛾5 m 1 0 0 1 8 2 多杀菌素的安全性 多杀菌素具有高杀虫活性的同时，对捕食性昆虫还表现出较低毒性。表1 6 中的数据表明，较之传统的氯氰菊酯，多杀菌素对一些重要的有益昆虫都显示 1 7 杀虫剂多杀菌素菌种选育及发酵工艺优化 出较低的杀虫活性，而在防治鳞翅目害虫时，多杀菌素和氯氰菊酯两者的活性 强度通常不相上下。过去实验室测试认为多杀菌素对蜜蜂有剧毒作用，但最近 的野外试验显示，在实际使用条件下多杀菌素对蜜蜂的影响很小。 表1 6 多杀菌素和氯氰菊酯对某些有益生物体的毒性 多杀菌素的另一个优点是对哺乳动物和鸟类相对低毒，对水生动物也只是 轻微的中等毒性，对哺乳动物低毒和鸟类相对低毒，水生动物也只是轻微的中 等毒性，见表1 7 。此外，哺乳动物慢性毒性试验表明多杀菌素无致癌、致畸、 致突变性或神经毒性。 表1 7 多杀菌素对哺乳动物、水生动物和鸟类的急性毒性 种类试验 结果 环保局类目 哺乳动物 大鼠( 雄，雌)急性经口l d 卯( m g l ) 小鼠急性经口l d 卯( m g l ) 兔急性经皮l d 卯( m g l ) 大鼠急性吸入l d ( r a g l ) 兔 眼刺激 兔 皮肤刺激 1 8 3 7 3 8 5 0 0 0警告( ) 5 0 0 0 5 0 0 0 ，5 轻微，2 d 内消失 无刺激 警告( ) 警告( ) 警告( ) 警告( ) 警告( ) 山东大学硕士学位论文 表1 8 列出了多杀菌素和历史上一些著名的杀虫剂对大鼠和烟芽夜蛾的 l d s o 值。对选择性的评价之一是脊椎动物选择性比率( v s r ) ，计算方法为将哺 乳动物l d s o 值除以昆虫l d s o 值。具体对多杀菌素的v s r 的计算方法采用烟芽 夜蛾点滴法和大鼠经口毒性的数据比率，结果表明对鳞翅目害虫而言，多杀菌 素是己发现的杀虫剂中选择性最高的化合物之一。多杀菌素类杀虫剂可望取代 氨基甲酸酯类和拟除虫菊酯类杀虫剂作为害虫防治的主要杀虫剂。在美国，多 杀菌素有可能取代马拉硫磷( m d d h i o n ) 成为防治地中海果蝇的重要药剂。 杀虫剂多杀菌素菌种选育及发酵工艺优化