（发酵工程专业论文）无溶剂体系酶法甘油解菜籽油合成甘油二酯的研究.pdf

捅要 甘油二酯( d i a c y l g l y c e r o l ，d g ) 是一类甘油三酯( t r i a c y l g l y c e r o l ，t g ) 中一个脂肪 酸被羟基取代的结构脂质。d g 是天然植物油脂的微量成分及体内脂肪代谢的内源中问 产物，它是公认安全( g r a s ) 的食品成分。近年来发现，膳食d g 具有减少内脏脂肪、 抑制体重增加、降低血脂等作用，因而受到广大学者的关注。本文研究了无溶剂体系中 酶促甘油解合成d g 的间歇工艺、固定床连续工艺并对其进行优化，同时对间歇反应中 提高固定化酶( l i p o z y m er mi m ) 的使用寿命作了初步研究。 首先研究了硅胶吸附甘油在无溶剂酶促甘油解合成甘油二酯中的作用。通过分别使 用游离甘油和吸附甘油反应做对比实验，比较间歇反应中反应前后酶活的变化的情况， 结果发现，硅胶吸附甘油的确能降低该反应体系中因机械搅拌等作用造成的酶活损失； 研究硅胶甘油不同混合比例下，反应前后酶活损失、产物组成、酶的生产力( 产物中 1 ，3 - 甘油二酯重量单位酶活) 等变化，结果发现，当选用硅胶甘油( 重量比，下同) 为 1 ：1 时，酶活损失小、产物中d g 的含量高、酶的生产力高，与未采用硅胶吸附相比， 酶活损失降低3 0 、d g 的含量达4 0 、酶的生产力可提高2 3 倍。在反应温度为6 0 ， 菜籽油甘油摩尔比为1 ：2 ，固定化酶( 酶活1 3 4 u g ) 添加量( 对菜籽油重量比，下同) 为6 ，体系平衡水活度a w 为0 3 3 ，搅拌速度为3 5 0r p m ，反应时间为1 2h 的条件下， 重复多次的使用l i p o z y m er mi m ，当酶的生产力下降5 0 时，酶可重复使用2 0 次。 通过单因素实验，确定了无溶剂体系酶法甘油解合成甘油二酯间歇反应的各主要因 素的最适范围如下：底物菜籽油甘油摩尔比为1 ：1 5 2 ；温度为：6 0 ；体系平衡水 活度为：0 1 l 左右；固定化酶( 酶活2 1 1 u g ) 添加量：8 ；反应时间：2 4h 左右。 在单因素的基础上，根据p l a c k e t 2 b u r m a n 实验设计方案，确定影响无溶剂体系酶法 甘油解合成甘油二酯中影响反应的3 个主要因素分别为：体系平衡水活度、反应温度、 反应时间。 采用响应面分析法，根据b o x 2 b e h n k e n 实验设计对影响实验的3 个主因素进行优化。 非主因素底物摩尔比、酶添加量分别控制在1 ：2 和8 ，运用s a sr s r e g 程序对所得数据 进行回归分析，各因素经回归拟合后，得到在此3 因素中，酶催化甘油解合成d g 的最佳 条件为：温度5 9 7 ，体系平衡水活度0 0 9 ，反应时间2 5 9h 。 根据单因素实验、主因素筛选、响应面优化实验结果得出，无溶剂体系酶法甘油解 合成甘油二酯间歇反应最优工艺条件为： 底物菜籽油坩油摩尔比1 ：2 ，酶添加量8 ，温度5 9 7 ，体系平衡水活度0 0 9 ， 反应时间2 5 9h 。反应重复三次，产物中甘油二酯的含量均达到6 5 以上，其中1 3 甘油二酯的含量为3 2 。 采用固定床柱式反应器，湿法装柱、逆流循环反应。研究了反应底物流加速率、底 物摩尔比、反应温度、甘油含水量、循环反应时间等参数，确定固定床柱式反应器 连续甘油解生产甘油二酯的最适工艺条件如下： 垩塑查兰堡主兰些堡苎 底物菜籽油甘油摩尔比为1 ：2 ；甘油含水量：5 ；底物流加速率1 1 6 m l m i n ；反 应温度：7 0 ；反应循环1 0 个空柱体积时，产物中甘油二酯的含量可高达5 9 。在此 反应条件下，当连续甘油解反应2 2 9 个空柱体积时，流出的单位空柱体积反应液中甘油 二酯的生成率为反应开始时的5 0 。 关键词：无溶剂体系：菜籽油；甘油二酯；硅胶；固定床：l i p o z y m er mi m a b s t r a c t a b s t r a c t d i a c y l g l y c e r o lf d g 、i sak i n do fs t r u c t u r e dl i p i dt h a tah y d r o x y lr e p l a c e sa c y li nt h e s n l ，2 ，3p o s i t i o no ft r i a c y l g l y c e r o l ( t g ) d i a c y l g l y c e r o li san a t u r a lm i n o rc o m p o n e n to f p l a n to i l sa n dt h ee n d o g e n e t i ci n t e r m e d i a t em e t a b o l i t eo fl i p i d i na d d i t i o n ，i th a sb e e n g e n e r a l l yr e c o g n i z e da ss a f e ( g r a s ) b yf d a m a n yr e s e a r c h e sh a v es h o w nt h a td i e t a r y d i a c y l g l y c e r o lc a r lr e d u c ev i s c e r a lf a t sa n df l o o dl i p i da n ds u p p r e s st h ei n c r e a s eo fb o d y w e i g h t a sar e s u l t ，i th a sa t t r a c t e dt h ei n t e r e s tf o r mm o r ea n dm o r er e s e a r c h e r s t h ep a p e r s t u d i e dt h eb a t c ha n dp a c k e d b e dp r o c e s s e so fs y n t h e s i so fd i a c y l g l y c e r o lb yg l y c e r o l y s i si n t h es o l v e n t f r e es y s t e m a tt h es a m et i m e ，t h es t u d ya l s o i n v e s t i g a t e dt h eu s el i f e o f l i p o z y m er mi m i nt h eb a t c hp r o c e s s f i r s t l y , w es t u d i e dt h ee f f e c to fa b s o r b i n gg l y c e r o lw i t l ls i l i c ag e li nt h ee n z y m a t i cs y n t h e s i s o fd i a c y l g l y c e r o lb yg i y c e r o l y s i si nt h es o l v e n t f r e es y s t e m t h ep a r a l l e le x p e r i m e n t su s e d f r e ea n da b s o r b e dg l y c e r o lr e s p e c t i v e l yi nt h eb a t c hp r o c e s s t h er e s u l ts h o w e dt h a tu s i n g a b s o r b e dg l y c e r o lc o u l dr e d u c et h el o s so f t h ee n z y m e a c t i v i t yd u et ot h em e c h a n i ca g i t a t i o n t h er e s u l ta l s os h o w e dt h a tt h el o s so f e n z y m e a c t i v i t yc o u l d r e a c ht h el o w e s tl e v e l ，w h i l et h e p r o d u c tc o n t e n ta n dt h ee n z y m ep r o d u c t i v i t yr e a c ht h eh i g e s tl e v e l s ，u n d e rt h ew e i g h tr a t i oo f s i l i c ag e lt og l y c e r o lo f1 ：1 c o m p a r e dw i t ht h o s eo fu s i n gf r e eg l y c e r o l ，t h em e t h o do f u s i n ga b s o r b e dg l y c e r o lc o u l dr e d u c et h ee n z y m ea c t i v i t yl o s sb y3 0 ，a n di n c r e s st h e e f f l z y l n ep r o d u c t i v i t yb y2 3t i m e s u n d e rt h ec o n d i t i o n so f t h er e a c t i o nt e m p e r a u r ea t6 0 t h em o l a rr a t i oo fr a p e s e e do i lt og l y c e r o lo f1 ：2 t h el i p a s el o a d e da m o u n to f6 w t ( v st h e o i lw e i g h t ) ，t h ea wo f 0 3 3 ，t h ea g i t a t i o nr a t eo f 3 5 0r p m ，a n dt h er e a c t i o nt i m eo f1 2h o u r s ， t h el i p o z y m er mi mc o u l db e r e p e a t e d l yu s e df o r2 0t i m e sb e f o r et h et h ee n z y m e p r o d u c t i v i t yl o w i n gd o w nt o5 0 l e v e lo f t h eo r i g i n b yt h es i n g l e f a c t o re x p e r i m e n t s ，t h eb e s tv a l u e so rr a n g e so ft h em a j o rt e c h n o l o g i c a l f a c t o r si nt h eb a t c hr e a c t i o nh a v eb e e ni d e n t i f i e da sf o l l o w s ：t h em o l a rr a t i oo fr a p e s e e dt o g l y c e r o lo f1 ：1 5 2 ，t h el i p a s el o a d e da m o u n to f8 w t , t h ea wo fa b o u t0 11 ，t h er e a c t i o n t e m p e r a t u r ea t6 0 a n dt h er e a c t i o nt i m eo f a b o u t2 4h o u r s o nt h eb a s i so ft h es i n g l e - f a c t o re x p e r i m e n t a lr e s u l t s ，w ea d o p t e dt h ed e s i g np r i n c i p l e so f p l a c k e t 2 b u r m a n ，a n df o u n dt h e3m a j o ra f f e c t i n gf a c t o r s i ng l y c e r o l y s i ss y n t h e s i so f d i a c y l g l y c e r o lw e r et h ea w jt h er e a c t i o nt e m p e m t u r ea n dt 1 1 er e a c t i o nt i m e w ea d o p t e dt h em e t h o do fr e s p o n s es u r f a c ea n a l y s i sa n dt h eb o x - b e h n k e ne x p e r i m e n t a l p r i n c i p l e st oo p t i m i z et h e3m a j o rr e a c t i o np a r a m e t e r sm e n t i o n e da b o v e ，w h i l ef i x i n gt h e m o l a rr a t i oa n dt h el i p a s el o a d e da m o u n ta t 1 ：2a n d8 w t r e s p e c t i v e l y t h e n , w ed e t e r m i n e dt h eo p t i m u ml e v e l so f t h e3m a j o rf a c t o r sw i t ht h ee x p e r i m e n t so f3f a c t o r sa n d 3l e v e l s t h ee x p e r i m e n td a t aw e r er e g r e s s e da n df i n e dw i t hs a sr s r e g s o f t w a r e ，t h e nt h eo p t i m u m c o n d i t i o no fg l y c e r o l y s i ss y n t h e s i so f d i a e y l g l y c e r o lw i me n z y m a t i cm e t h o dw e r eo b t a i n e da s f o l l o w s ：t h er e a c t i o nt e m p e r a t u r eo f5 9 7 ，t h ea wo f 0 0 9 ，a n dt h er e a c t i o nt i m eo f 江南大学硕士学位论文 2 5 9 h o u r s t h e o p t i m u n ac o n d i t i o n so f g l y c e r o l y s i ss y n t h e s i so f d i a c y l g l y c e r o lc o u l db es u m m a r i z e d a sf o l l o w s ：t h em o l a rr a t i oo f r a p e s e e dt og l y c e r o lo f1 ：2 ，t h el i p a s el o a d e da m o u n to f8 w t ， t h er e a c t i o nt e m p e r a t u r ea t5 9 7 c ，t h ea wo f0 0 9 ，a n dt h er e a c t i o nt i m eo f2 5 9h o u r s ， u n d e rt h o s eo p t i m u mc o n d i t i o n s ，t h ea m o u n to fd i a c y l g l y c e r o lr e a c h e du pt o6 5 ，a n d a m o n gt h e mt h e1 ，3 - d i a c y l 西y c e r o lw a s3 2 i nt h ef i n a lp r o d u c t w ea l s ou s e dt h e p a c k e d b e d r e a c t o rf o rt h es a m e g l y c e r o l y s i ss y n t h e s i s o f d i a c y l g l y c e r o lp r o c e s s t h ef o l l o w i n go p e r a t i n gp a r a m e t e r sw e r es t u d i e d ：t h es u b s t r a t e sf l o w r a t e ，t h em o l a rr a t i oo fs u b s t r a t e s ，t h er e a c t i o nt e m p e r a t u r e ，t h ew a t e ra m o u n tc o n t a i n e di n t h eg l y c e r o la n dt h ec i r c u l a t i o nt i m eo ft h er e a c t i o n t h eo p t i m u mp r o c e s sc o n d i t i o n so ft h e r e a c t i o nw e r ea sf o l l o w s ：t h em o l a rr a t i oo fr a p e s e e dt og l y c e r o lo f1 ：2 ，t h ew a t e ra m o u n t c o n t a i n e di nt h e 百y c e r 0 1o f5 ，t h es u b s t r a t e sf l o wr a t eo f1 16 m l m i n ，t h et e m p e r a t u r ea t 7 0 u n d e rt h e s ec o n d i t i o n sa n dw h e n 也er e a c t i o nc i r c u l a t i o n1 0b e dv o l u m e t h ea m o u n t o fd i a c y l g l y c e r o lr e a c h e du pt o5 9 i nt h ep r o d u c t w h e nt h eg l y c e r o l y s i sr e a c t i o nw a s r e p e a t e d2 2 9b e dv o l u m e ，t h ea m o u n to fd i a c y l g l y c e r o li no n eb e dv o l u m ew a sl o w e dd o w n t o5 0 l e v e lo f t h eo r i g i n k e yw o r d s ：s o l v e n t f r e es y s t e m ；r a p e s e e do i l ：d i a c y l g l y c e r o l s i l i c ag e l ；p a c k e d b e d ； l i p o z y m er m i m i v 独创性声明 妫6 7 7 6 9 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名：至盎塾日期：知。6 年3 月g 日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：至超 导师签名： 日期：二卯占年事月，艿日 第一章绪论 第一章绪论 1 1 甘油二酯概述 甘油二酯是由丙三醇( 甘油) 与二个脂肪酸酯化后得到的产物，简称双甘酯或二甘 酯( d i a c y l g l y e e r o l ，d g ) ，其分子结构式如下： h - o c o r 彳h d c o r h o h 或i h 0 r c 珏：0 c o rc h 2 0 h 其中c o r 、c o r7 为饱和或不饱和脂肪酰基。 其1 ，2 - d g 、1 ，3 - d g 两种同分异构体在自然界中的比例为3 ：7 。甘油二酯既是各种食 用油的天然成分，也是油脂代谢的中间产物，但其在烹调油中的含量极少，一般不到 1 0 。近年来研究发现【i 】，甘油二酯具有降低血脂、减少内脏脂肪和抑制体重等作用， 是一类有开发和应用前景的产品。 1 2 甘油二酯抑制脂肪蓄积机理与安全性 1 2 1 甘油二酯抑制脂肪蓄积机理 与一般的油比较，摄取主成分为甘油二酯的油后，人的体重和体内脂肪量能明显减 少。甘油二酯油与普通油相比，从能量上考虑，两者都在9 k c a l g 左右，并没有太大差 别，相同脂肪酸组成的甘油二酯( d g ) 和甘油三酯( t g ) 热量相差只有2 左右【2 】。动 物实验表明，两者的吸收率也没有太大的差别。因此，d g 减少身体脂肪积蓄的原因， 只能从消耗能量的差异来考虑。体重和体内脂肪量降低是由消耗能量比摄取能量高所引 起的。 普通油脂中主要含有甘油三酯( t g ) ，在肠道中，两端脂肪酸由于脂肪酶作用，被 酶解为2 单甘酯( m g ) 与游离脂肪酸( f a ) ，并在小肠上皮细胞被吸收。在小肠上皮 细胞中，f a 与2 - m g 再次被迅速合成为t g ( 中性脂肪) ，作为血中中性脂肪在全身运 动，那些未被作为能量利用的中性脂肪便作为体内脂肪而蓄积( 见图1 1 ) 。 而从动物研究实验可知【3 】，d g 大多都被分解为不能再合成脂肪的i - m g 与脂肪酸， 由于1 - m g 与2 - m g 中脂肪酸与甘油结合的位置不同，因此作为中性脂肪合成原料有很 大差别，在小肠内向中性脂肪再次合成极其迟缓。细胞内游离脂肪酸浓度变高，并通过 b 氧化途径最终被分解为水和二氧化碳释放，因此d g 在小肠脂质分解和能量利用率提 高。同时使食用d g 后血液中的中性脂肪难以上升，这样，若持续食用d g ，便可减少 体内脂肪积累。 目前研究将l ，3 - d g 抑制脂肪蓄积机理总结为以下5 个方面f 4 】： ( 1 ) 1 ，3 d g 与t g 在结构上的差异引起其功能上的不同，而与f a 组成及热量值无关； ( 2 ) 代谢路径不同：1 。3 d g 在小肠水解为1 - m g 和f a ，1 - m g 不能重新酯化为t g ，而 直接由门静脉进入肝脏氧化分解； ( 3 ) 部分脂肪酸经a 磷酸甘油途径合成t g ，此t g 不形成乳糜微粒，而是储存在小肠 江南大学硕士学位论文 粘膜上皮细胞中； ( 4 )由( 2 ) 、( 3 ) 引起的淋巴乳糜微粒合成减少，因此血液中运输的t g 、总胆固醇 ( t c ) 减少，于是抑制血脂升高，另一方面血液转运的t g 减少，身体各部分组 织获得的t g 也相应减少，因此起到减肥、减少脂肪肝的功能； ( 5 ) 通过抑s b j l e p t i n 基因表达，正向调节肝中与脂肪氧化相关的a c o 、a c s 基因表达， 加速b 一氧化，而负调节脂肪酸、脂肪合成相关的酶基因表达，抑制脂肪的合成 蓄积。 图1 1 脂类代谢示意图 r i g1 1a b i r d g e dg e n e r a l v i e wo f l i p i dm e t a b o l i s m 1 2 2 甘油二酯的安全性 1 2 2 1 成分组成 如前所述，不论动物油还是植物油，均含有一定量d g ，d g 是人类长年摄取食用 油成分之一。现今d g 油产品也是以天然大豆油和菜籽油为原料，采用酶法酯交换反应 生产。( 成分组成见下表1 1 ) 2 第一章绪论 表1 1 甘油二酯为主成分油脂的组成与物理性质 t a b1 1t h ec o m p o s i t i o na n dp h y s i c a lc h a r a c t e r so f t h ed i a e y l g i y e e r o lo i l 脂肪酸组成物性 棕榈酸：3 o 一3 5 硬脂酸：1 o 一1 5 油酸：3 8 - 4 0 亚油酸：4 7 - - 4 9 亚麻酸：8 o - 9 0 饱和脂肪酸：4 0 - 5 0 单不饱和脂肪酸：3 8 - - 4 0 多不饱和脂肪酸：5 5 - 5 8 熔点：0 x 2 发火点：3 4 0 - 3 6 0 ( 2 发烟点：2 1 5 - 2 2 5 油脂组成 单甘酯：0 4 - - 1 o 双甘酯：8 2 - 8 7 三甘酯：1 2 - 1 8 1 2 2 2 安全认证 d g 为主要成分功能性油，在日本已获得厚生劳动省安全性与有效性审查，确认与 普通食用油比较，具有“抑制体内脂肪积累和体内胆固醇上升，防身体肥胖”等特性， 并在1 9 8 5 年5 月2 0 日，被认定为“特定的保健用食品”。 在美国，这种d g 为主要成分的功能性油，也通过脂质营养学，致变性，急性毒性， 亚急性毒性，慢性毒性等毒理学的科学试验与安全评价，获得美国f d a 食品安全审查， 被认为安全可靠食品( g r a s ) 。 1 3 甘油二酯的生产方法 1 3 1 化学生产方法 目前。工业甘油二酯主要是通过甘油解硬化油生产单甘酯，从副产物分离得到的。 该反应一般采用碱性催化剂，在2 0 0 2 5 0 及惰性气体的保护下进行。反应产物中 含有约4 0 的单甘酯和约4 0 5 0 的双甘酯，其余为甘油和三甘酯( 硬化油) 。将此反应 产物进行纯化后，不仅可得到含量9 0 以上的高纯单甘酯，同时还可得到含量8 5 9 0 的双甘酯。 1 3 2 酶法合成甘油二酯 利用生物酶的选择性催化，可以获得特定结构的双甘酯。例如，在油脂和甘油的混 合物中加入特殊的脂肪酶，在6 0 8 0 进行反应，然后滤去脂肪酶，可得到浓度约 6 0 的1 ，3 一d g 嘲用脂肪酶作催化剂时，尽管反应时间较长( 一般在1 0h 以上) ，但由 于避免了高温操作，所以产品质量较好。 1 3 2 1 直接酯化法 以酰基供体和甘油为原料，控制两者的比例，在微水相的条件下，利用1 ，3 专一性 脂肪酶催化合成甘油二酯。其反应式如下： 吼0 h r c o o h 十q - i o h i c h 2 0 h 1 ，3 - l i p a s e c n 2 0 0 r i c h o h l c h 2 0 0 r 江南大学硕士学位论文 利用脂肪酶的催化作用，使甘油与脂肪酸发生酯化反应可得到单甘酯、双甘酯和 三甘酯的混合物。例如，角田昭等1 7 l 研究了利用碱性脂肪酶在脱水条件下进行的酯化反 应。其反应配比为：甘油li i i ol 对油酸1 7m ol ，反应条件为：反应温度4 0 。反应时间 4 8h ，酯化率达到9 6 ，双甘酯含量为6 0 。为了进一步缩短反应时问，宇治田吾朗等嗍 开发了两步反应工艺。甘油与脂肪酸发生酯化反应时，有水产生，因此脱水有利于反应的 进行。在两步反应工艺中，第一步反应利用过量的甘油吸收产生的水，然后通过相分离除 去，第二步反应则利用减压脱水。由于脱水效果好，该工艺大大缩短了 脂肪酸 过量甘油 脂肪酶 脂肪酶 甘油 脂肪酶 自 甘油二酯产品 图1 2 两步反应法生产双甘酯的流程 f i g1 2 t h es y n t h e s i so f d i a c y l g l y e e r o lb yt w o s t e p s 酯化反应时间。如图卜2 所示。通过两步反应后，酯化率达到8 2 以上，产品中双甘酯 含量可达8 2 以上。 直接酯化法的突出优点就是反应可以一步完成，产物纯度高，分离容易，相对来讲 反应时间较短，酶反应器利用率高。但是反应原料需要分别制备，费用较高，不一定适 合大规模生产。 1 3 2 2 转酯化法 主要利用脂肪酸组成不同的t g ，m g ( 脂肪酸甲酸) 之间发生酰基转移生产l ，3 - d g 。 其反应式如下： q h 2 0 0 r 2 i c h o h + i c h 2 0 h s u g i v e am a s a k a t s u 等【9 】通过添加c 2 2 4 的短链脂肪酸或不饱和脂肪酸的甘油一酯， 与普通油脂混合生产l ，3 - d g ，反应时间短，产品纯度高，适合食品医药化工业应用。酯 交换反应实际上包括水解和酯化反应两步反应。要优化酯交换反应必须在水解和酯化反 4 第一章绪论 应之间建立一个动态的平衡，这通常来讲是不容易的。因为水含量高有利于水解反应， 而水含量低有利于酯化反应。当反应以甘油一酯为原料，成本太高，而单纯以甘油三酯 为原料又存在转化率低，反应时间长等缺点，因此不适合生产1 ，3 d g 。 1 3 2 3 甘油解法 从现有的资料来看，甘油解应是生产甘油二酯最经济的方法，也是目前工业上最具 应用前景的方法。其反应式如下： c h 2 0 hc h 2 0 0 r i b h 。h + 醢o r ? i c h 2 0 hc h 2 0 0 r 1 a t a s t i 等( 1 0 】曾用l i p a s e 3 a 催化大豆油、菜籽油甘油解生产富含1 ，3 - d g 的油脂。产品 中1 ，3 - d g 占4 0 ( w w ) 以上，甘油一酯小于5 ，另有人采用l i p a s e l 0 0 一l 催化棕榈油甘 油解得到含1 ，3 - d g4 5 6 的油脂【l l 】。i n s t i t u t od ec a t a l i s i e 等1 习研究了微水相体系中三油 酸甘油酯的甘油解反应。当以固定化l i p a s e p s 为催化剂，甘油三酯，甘油( w w ) = 1 ：8 ， 温度4 吐5 0 时，转化率较高，d g 产率随反应时问延长而增加，7 天达到最高7 6 。甘 油解法虽然成本低，但是产物的纯度不高，而且反应速度慢，一般需要1 0h p j - 能反应完 全，产率较低。 1 4 甘油二酯的应用 甘油二酯具有安全、营养、加工适性好、人体相容性高等诸多优点，是一类多功能 添加剂。它不仅是良好的食品乳化剂，在医学保健方面，对预防和治疗动脉硬化、脂肪 肝也有重要意义，同时，大多数植物油甘油二酯在常温下呈液态，可制成性能优良的油 性化妆品。因此，甘油二酯在食品、医药、化工( 化妆品) 行业有广泛的应用。 1 4 1 甘油二酯在食品的应用 1 4 1 1 在焙烤制品中的应用 脂肪在焙烤食品中不仅起营养作用，而且具有润滑作用。脂肪分散到生面团中， 可防止面筋过度形成，从而使面团焙烤时保持其特有的形状和结构。其中的二硬脂酸基 油酯能够增加面包组织弹性和体积，改善面包风味，增加油润口感，减缓硬化速度，延 长储存期。 起酥油在食品中的应用是很普遍的，食用甘油二酯组成的起酥油应用于饼干、甜饼 及发酵型焙烤食品，制成的面团持油性好，辊压、分割容易。不仅改善了营养价值，而 且赋予食品良好的口感、特殊的风味。产品的稳定性增加，制得的甜点在纸膜上放置一 夜几乎不留油痕。 1 4 1 2 在速溶饮品中的应用 对速溶饮品如奶油咖啡饮料、速溶奶茶、乳化果汁、乳粉、酸乳饮料等，良好的分 散性是至关重要的，因为这不仅与外观质量密切相关而且影响到产品口感、风味的传递。 b u t t e r b a u s h 等【1 3 1 用甘油二酯、卵磷脂及其它添加剂研制出一种促溶剂。该产品能加速固 5 熙_ 詈篙_ 蚤 江南大学硕士学位论文 体饮品的溶解，改善产品的质量，使产品更加润滑、丰满、并具有期望的泡沫，赋予产 品清新、厚实的感觉，增加产品风味，而无须增加总干物质含量。 1 4 1 3 在食品保鲜中的应用 延长鲜肉的保藏期是经济而重要的。为实现此目标，人们采用了各种措施，包括冷 藏、涂层、气调包装、使用防腐剂等多种方法。然而这些方法各有缺点，如干耗、失重、 褪色、肉失去自然状态等。美国人c h r i s t i a n h e i n e 等1 1 6 1 人报道了一种用甘油酯混和物 ( d g 5 - 5 0 ，m g 3 5 - 7 5 ) 在1 1 6 1 2 下浸泡保藏鲜肉的方法。该法能降低干耗、防止 褪色、不改变肉的自然状态。保鲜剂中甘油二酯主要由不饱和脂肪酸组成，因此凝固点 低，储存温度下呈液态，具有处理容易，操作经济的优点。 此外，甘油二酯也可用于谷物食品中。y a n g 等【”】人报道，用富含甘油二酯的油脂 涂层的预蒸煮米饭，可大大延长即食米饭的货架期，不仅米饭的组织完好、外观晶莹透 亮、而且保持了大米的自然香气。 1 4 1 4 在低热量食品中的应用 肥胖作为全球性课题，已严重威胁到了人类的健康。肥胖与饮食情况密切相关，能 量学说认为当能量摄入过多而消耗不足时就会导致肥胖。近年来研究表明甘油二酯食用 后在体内很少蓄积。在食品中用甘油二酯替代普通油脂，不仅不影响食欲，而且可以抑 制体重增加。因此，可利用甘油二酯生产具有减肥作用的功能食品，如生产低热量的人 造奶油、糖果、巧克力、焙烤制品、涂抹黄油、蛋黄酱、冰淇淋等等食品，也可作为家 庭烹调油、食品工业生产用油的替代品。 1 4 2 甘油二酯在医药中的应用 研究表明【阚，甘油二酯能够降低人和小鼠血清甘油三酯，因此可以用于预防和治疗 高脂血症以及与高脂血症密切相关的心脑血管疾病，如动脉硬化、冠心病，中风、脑血 栓等。另据报道【1 7 1 ，有人用含c p l o 和饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸组成的l ，3 一甘油二 酯制成肠道吸收营养剂，用于加强吸收功能不全、胆汁分泌不足及术后患者的营养。另 外甘油二酯对胆汁酸的分泌有抑制作用，可用来防治腹泻及其它疾病引起的次级腹泻症 状。其中1 ，3 一甘油二酯的r ( 1 ) 、r ( 3 ) 最好为c 1 b 珊的不饱和脂肪酸。 通过调整脂肪酸组成及脂肪酸的结合位置，甘油二酯可表现出不同的理化特性。如 二月桂酸甘油酯，它在常温下成固态，储存容易，在体温条件下迅速融化，吸收快，而 且化学性质稳定( 不褪色、不易分解、不与其它成份反应) ，生物相溶性好，使用安全， 加之变定性良好，充填时紧密、无针孔和空洞，适合大规模生产，因此是制药工业理想 的栓剂。w a t e r b u t g h “1 羽发现甘油二酯在生产粉剂、片剂药物时，可作为药物活性成 分的分散介质，喷雾干燥时还可对活性成分起保护作用。由于甘油二酯的代谢途径特殊， 因此该药品服用后能迅速吸收，药效快，能够降低药量，减轻肝脏负担。除了用作乳剂、 粉剂的辅助成分之外，甘油二酯还可直接与药品结合，加速药品吸收，控制药物释放。 1 4 3 甘油二酯在化工中的应用 化工行业中，1 ，3 - 甘油二酯是极有吸引力的合成起始原料。如它可用于树脂、磷脂、 糖酯、酯蛋白、重构脂质等多种化合物的合成，也可用于生物工业合成酶激活剂、抑制 6 第一章绪论 剂【1 9 】等。在化妆品工业中d g 除用作乳化剂、稳定剂、润湿剂外，还能使皮肤湿润、柔 软。这种油性化妆品具有很好的皮肤扩展和粘附性，保湿效果也不错。另外，利用双甘 酯还可以制造除臭剂。此外，根据双甘酯的性质，它还可用于可食涂料、消泡剂、皮革 加脂剂等。 。 1 5 国内外研究进展 1 5 1 国内研究进展 目前国内酶催化甘油解方法多见于生产单甘酯，甘油二酯主要作为生产单甘酯的副 产物。其中最有代表性的，是无锡轻工业大学夏咏梅【捌对甘油解生产单甘酯的系统研究， 并着重讨论了温度对反应的影响；蒋惠亮【2 l 】对有机溶剂相中酶催化油脂甘油解生产棕榈 酸单甘酯进行了研究；吴可克 2 2 j 以1 6 1 9 脂肪酶研究了在有机相正己烷中用玉米油甘油解 生产双、单甘酯的影响因素。同时报道了中间产物的检测和终产物的分析方法；华南理 工大学杨博等田】人将甲醇和菜籽油混合后流加进入装填固定化脂肪酶的填充床式反应 器中进行反应，将反应产物分离得6 2 8 甘油二酯，同时获得副产物脂肪酸低级醇酯， 产物经分子蒸馏进一步纯化可得到甘油二酯含量大于8 5 的甘油二酯。该种生产方法很 好的解决了通常甘油二酯生产中底物粘度过大的问题；邱寿宽等阱l 对无溶剂体系酶促豆 油甘油解生产甘二酯的影响因素作了初步的研究，甘油二酯得率为5 1 7 ；孟祥河、邹 冬芽等磷】研究了无溶剂体系酶催化油酸、甘油生产1 ，3 甘油二酯，并对产物的检测方法 进行了深入的讨论。 1 5 2 国外研究进展 s m k l m 等 2 6 1 在无溶剂体系中，采用癸酸和甘油作为反应基质，在固定化酶催化下 合成中链脂肪；t s u n e oy a m a n e 等【2 7 】利用荧光假单胞菌脂肪酶水解牛油和甘油，通过二 次程序降温，高效合成甘油二酯：x x u 等 2 s l 研究了菜籽油和癸酸转酯化反应中反应温 度、底物比、酶添加量，反应时间等对合成甘油二酯的影响；l a g e re l f i n a n - b o i j e s s o n 等 网在酶催化采籽油甘油解合成单甘酯的反应中，采用硅胶吸附甘油解决了甘油在有机相 中低溶解度的问题；j a n n ib r o g a a r dk r i s t e n s e n 等 3 0 1 研究比较了7 种不同的脂肪酶( 催化 专一性不同、载体性质不同) 催化甘油解合成甘油二酯的差异，甘油二酯的产率为 6 0 6 5 ；t a k a a k iw a t a n a b e 等【3 1 】研究了在固定床生物反应器中酶催化脂肪酸和甘油合成 甘油二酯反应中，反应滞留时间和真空脱水等对合成甘油二酯的影响。 1 6 立题背景及研究内容 1 6 1 立题背景 甘油二酯是一种多功能性添加剂，但因为它生产量小、价格昂贵，远远不能满足市 场需求，因而在很大程度上限制了其应用就国内而言，目前尚无专业生产厂家，甘油 二酯只作为单甘酯的副产物。因此，开发甘油二酯的生产技术是极具应用前景的，尤其 是采用具有专一性的酶法生产技术，不但产率高，纯度高，节省能源，而且环境友好( 不 使用有机溶剂及金属化合物) ，既能满足工业需求，又符合环境要求，还可提高农产品 的附加值，可谓一举数得。 7 江南大学硕士学位论文 根据酶反应中采用的介质的不同，酶法又可分为水相反应和非水相反应。非水相反 应近年来发展较快，该反应能够实现水不溶性产物的转化，扩大底物范围，同时具有副 反应少、产物容易回收等优点。但酶在非水相体系中的催化活性明显要比在水相中低， 其次酶蛋白不溶于有机溶剂，反应需要剧烈搅拌以消除传质障碍，而剧烈搅拌产生的剪 切力也会使酶失活。尽管有人采用添加表面活性剂的方法来解决传质问题，但形成的胶 束界面内外传质效率也同样令人怀疑。而且，采用有机溶剂法生产甘二酯的致命弱点， 就是有机溶剂的毒性在食品和医药中是消费者难以接受的。此外，由于采用有机溶剂， 需额外增加设备以除去有机溶剂，既增加成本又有安全隐患，而且对环境不利。 鉴于以上问题，许多学者对无溶剂体系作了可贵的探索。反应中不添加任何有机 溶剂，而油相原料既是反应物又充当反应介质。体系中只含有微量水分以维持酶催化活 力所需。此体系具有反应效率高、产品回收容易、生产安全、费用低、环境友好等优点。 但无溶剂体系只适合低熔点的原料，这在一定程度上限制了其应用范围，但对于植物油 脂的酶催化反应应该是可行的，本实验主要对此体系中采用1 ，3 专一性固定化酶催化 菜籽油甘油解合成甘油二酯的反应进行深入探讨。 1 6 2 研究内容 ( 1 ) 研究无溶剂体系酶法甘油解合成甘油二酯的间歇反应中，采用硅胶吸附甘油解决 反应底物互不相容问题，和减少机械搅拌等造成酶活的损失，提高酶的使用寿命； ( 2 ) 通过单因素反应来确定无溶剂体系酶法甘油解合成甘油二酯的间歇反应中底物 比、酶添加量、反应温度、反应时间、体系平衡水分水活度等因素的变化趋势， 初步确定各因素的最适范围； ( 3 )由p l a c k e t 2 b u r m a n 实验设计来筛选无溶剂体系酶法甘油解反应中对甘油二酯生 成影响较大的几个因素； ( 4 ) 运用响应面分析法对( 3 ) 中确定的反应主要影响因素进行优化，得到无溶剂体 系酶法甘油解合成甘油二酯间歇反应的最佳工艺条件；最适反应底物比、酶添加 量、反应温度、体系平衡水活度、反应时间等； ( 5 ) 研究固定床柱式反应器中，无溶剂体系酶法连续甘油解合成甘油二酯的工艺条 件，并进行优化；同时探讨了固定床反应中固定化酶的稳定性。 s 第二章硅胶吸附甘油在无溶剂酶法甘油解合成甘油二酯中的作用研究 第二章硅胶吸附甘油在无溶剂酶法甘油解合成 甘油二酯中的作用研究 2 1 引言 无溶剂体系酶催化甘油解合成甘油二酯