（发酵工程专业论文）木瓜凝乳蛋白酶的化学修饰研究.pdf

摘要摘要木瓜凝乳蛋白酶( c h y m o p a p a i n ，e c 3 4 2 2 6 ，c p ) 是木瓜乳中含量最高、水解和凝乳活性最强的一种巯基蛋白酶。该酶除了在食品工业具有广泛的应用外，还具有非常重要的医药价值，其中以注射治疗椎间盘突出症的l 临床应用最为确切和成功。然而由于该酶体内半衰期短且易引发免疫反应而降低了该酶的临床应用效果。为此，作者开展了木瓜凝乳蛋白酶化学修饰的研究。本研究首先从商品木瓜蛋白酶粗品中分离纯化出木瓜凝乳蛋白酶纯品，再用活化的无免疫原性的单甲氧基聚乙二醇( m p e g 一5 0 0 0 ) 为修饰剂，对c p 进行了共价修饰。通过实验筛选出最佳的修饰反应条件，进一步对修饰产物进行了检测与分析，并对c p 在修饰前后的主要酶学、药物生物学性质等进行了比较研究。本研究以未激活的木瓜蛋白复合酶为上样酶液，以磷酸盐缓冲液为洗脱液进行离子强度和p h 的线性双梯度洗脱。经c m c 离子交换柱层析、超滤等纯化步骤，获得了产物均一、比活力为3 3 8 9 1 w m g 、酶活力回收率达6 8 9 、蛋白回收率达6 4 1 的c p 纯酶，经s d s p a g e 电泳检验达电泳纯。在m p e g 化学修饰的研究中，需对不同修饰产物的抗原性进行免疫学检测。抗原抗体的特异性结合是免疫学检测技术的基础，为此，开展了c p 多克隆抗体制备及分析、检测的研究。结果表明，抑活抗原比未处理原酶具有更好的免疫原性。以抑活的c p 为抗原，采用多次皮下注射和一次静脉冲击免疫相结合的方式制备出的c p 抗体，经w 色s t e mb l o t t i n g 法鉴定和e l i s a 法检测，其抗血清效价为1 0 6 。同时，用e l i s a 法预先测定出用于各修饰酶抗原性检测的抗原、抗体的最佳工作浓度分别为l ：4 0 0 和1 ：5 0 0 。本研究制备出两种m p e g 活化产物：m p e g l 和m p e g 2 ，这两种m p e g 衍生物对蛋白酶的修饰效果不同。通过m p e g l 、m p e g 2 对c p 修饰效果的比较得出，由于空间位阻效应较大，c p 经m p e g 2 修饰后对大分子底物的接近及催化能力明显减弱，因而在实际临床应用中不利于药效的发挥，因此，选用m p e g l 为c p 的修饰剂。通过实验，进一步筛选出m p e g l 修饰c p 的最佳修饰反应条件：即在a t e e底物保护下，每1 0 m g 酶蛋白与0 8 9m p e g l 在p h 值为9 o 的硼酸缓冲液中4 0 c反应l h ，可得抗原抗体结合力完全消失，而酶活力可达3 6 4 0 的修饰酶。毛细管电泳分析结果表明：在本研究筛选出的修饰反应条件下，m p e g - 对c p 的共价修饰产物为多组分体系，最大产物峰为平均每分子c p 偶联3 4 个m p e g l 链的低修饰度产物峰。紫外吸收光谱和荧光发射光谱分析表明：该m p e g l华南理：【大学博士学位论文修饰酶的结构有轻度改变。收集此低修饰度产物进一步作酶学及药物生物学性质等方面的研究。米氏常数计算结果显示，c p 经m p e g l 修饰后，k m ”9 ( 酪蛋白为底物) 有所增加，表明m p e g l 修饰酶与底物的亲和力有所减弱，但与c p 相比，m p e g i 修饰酶的p h 稳定性、热稳定性以及抗胰蛋白酶的水解能力均有所增强，体内半衰期延长，表明m p e g l 修饰酶具有更好的应用前景。综上所述，通过对木瓜凝乳蛋白酶的m p e g 化学修饰，消除了天然酶的免疫原性、延长了酶的体内半衰期、增强了酶的p h 稳定性、热稳定性以及抗胰蛋白酶的水解能力，同时修饰酶活力仍可保持在3 6 一4 0 ，这一研究结果将为今后更好地研究、开发与应用木瓜凝乳蛋白酶打下良好的基础。关键词：木瓜凝乳蛋白酶；单甲氧基聚乙二醇( m p e g ) ；化学修饰；检测分析i i竺! 堡坚!a b s t r a c tc h y m o p a p a i ni st h em o s ta b u n d a n tc y s t e i n ep r o t e i n a s ew i t ht h eh i g h e s tp r o t e o l y t i ca n d 血l kc l o t t i n ga c t i v i t i e si nt h ep a p a y al a t e x b e s i d e sw i d e l ye m p l o y e di nt h ef o o di n d u s t r i e s ，i ta l s oh a sv e r yi m p o r t a n tm e d i c a la p p l i c a t i o n ，i nw h i c ht h et r e a t m e m to fp r o l a p s e di n t e r v e r t e b r a ld i s ci st h em o s te f f e c t i v e ，d e e pa n ds u c c e s s f u l h o w e v e r ，b e c a u s eo fi t ss h o r th a l f - l i f ei nv i v oa n da n t i g e n i c i t y ，i t sm e d i c a le f f i c a c yw a sr e d u c e dg r e a t l y t h e r e f o r e ，t h ec h e m i c a lm o d m c a t i o no fc pw i t hm p e gw a sr e s e a r c h e d i nt h i ss t u d y ，t h ec pw a sp u r i f i e df r o mc o m m e r c i a ls p r a y d r i e d1 a t e x ，a n dt h e nt h ep u r ec pw a sm o d i f i e dw “ha c t i v a t e dm o n o m e t h o x y p 0 1 y e t h y l e n e9 1 y c o l ( m p e g5 0 0 0 ) b yt h ee x p e r i m e n t s ，t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sf o rc h e m i c a lm o d i f i c a t i o nw e r es e l e c t e d ，t h em p e g m o d i f i e dc pw a sd e t e r n i n e da n da n a l y z e d ，a n dt h em a i np r o p e r t i e so ft h ec pb e f b r ea n da f t e rt h em o d i f i c a t i o nw e r ea l s os t u d i e db yc o m p a r i s o n i nt h er e s e a r c h ，t h ei n a c t i v a t e dc r u de n z y m ew a sa p p l i e do nc m ci o ne x c h a n g ec h r o m a t o g f a p h y ，a n dt h e nt h r o u g ht h eu l t r a - f i l t r a t i o n ，v a c u u mf r e e z ed r y i n g ，t h ep u r ec pw a so b t a i n e dw i t has p e c i f i ca c t i v i t yo f3 3 8 9 1 u m g ，a n dt h er e c o v e r yo fa c t i v i t yo f6 8 9 ，t h er e c o v e r yo fp r o t e i no f6 4 1 t h es d s p a g eo ft h ep u r i f i e dc ps h o w e das i n 9 1 eb a n d i ti sn e c e s s a r yt od e t e n n i n ea n t i g e n i c i t yo fv a r i o u sm o d i f i c a “o np r o d u c t sb yi m m u n o l o g i c a lt e c h n i q u e sd u r i n gt h er e s e a r c ho nt h ec h e m i c a lm o d i f i c a t i o no fm p e gs o ，t h ep r e p a r a t i o no fp d l y c l o n a la n t i b o d yo fc pa n di t s 主】n m u n o l o g j c a ld e t e r m i n ew e r es t u d i e d t h ea n t i s e r u mo fc pw a so b t a i n e db yu s i n gi n a c t i v a t e dc pa n db yh y p o d e r m i ci n j e c t i o n sc o m b i n i n gw i t hi n t r a v e n o u si n j e c t i o n t h ea n t i s e r u mt i t r eo fc pw a sl o ob ye l i s a w h i l et h eo p t i m u md i l u t i o no fa n t i g e na n da n t i b o d yw e r ed e t e r m i n e db ye l i s a ，t h eo p t i m u md i l u t i o n so fa n t i g e na n da n t i s e r u mw e r el ：4 0 0a n d1 ：5 0 0 ，r e s p e c t i v e l y t w ot y p e so fm p e gd e r i v a t i v e ，w h i c hh a db e e na c t i v a t e db yc y a n u r i cc h l o r i d e ，j u s tm p e g l a n dm p e g 2w e r ep r e p a r e d ，w h i c ho w n e dd i f f c r e n tm o d i f i c a t i o ne f f e c t s t h ec o m d a r i s o nf e s u l t so nm o d i f i c a t i o ne f f e c to fm p e g la n dm p e g 2s h o w e dt h a tt h ea f n n i t ya n dt h ec a t a l y t i ca c t i v i t yo ft h em p e g 2 一m o d i f i e dc pf b rm a c r o m o l e c u l a rs u b s t r a t ew a sr e d u c e d t h e n ，t h ea c t i v a t e dm p e g lw a sc h o s e nf o ro p t i m u mm o d i f i e r t h eb e s tc o n d i t i o n sf o rc h e m i c a lm o d i f i c a t i o nw i t ha c t i v a t e dm p e g lw e r ea si i i华南理工大学博士学位论文f o i l o w s ：u n d e rt h ep r o t e c t i o no ft h es u b s t r a t ea t e e ，p e rl o m go fc pw a sm o d i f i e dw i t ho 8 9a c t i v a t e dm p e g ii nt h e0 1 m o l ，lp h 9 ob o r a t eb u f f e ra t4 。cf o rl h s ot h ea n t i g e n i c i t yo fm p e g l m o d i f i e dc pw a sc o m p l e t e l yr e m o v e d ，w h i l ea b o u t3 6 4 0 o fn a t i v ee n z y m ea c t i v i t yw e r es t i l lr e t a i n e d t h ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( c e ) s h o w e dt h a ti nt h eb e s tc o n d j t i o n ，t h em p e g l - m o d i f i e dp r o d u c tw a sah e t e r o g e n e i t y ，a n dt h ep 0 0 1 ym o d i f i e dc p ( 3 4m p e g lc h a i n sp e rm o l e c u l ec p ) w a st h em o s tp r o d u c tp e a k t h eu va n dt h en u o r e s c e n c es p e c t r as h o w e dt h a tt h es t r u c t u r eo fm o d i f i e dc pw a sl i g h t l yv a r i e d t h e nt h ep 0 0 1 ym o d i f i e dc pw a sc 0 1 l e t e df o rf u r t h e rr c s e a r c ho ni t sp r o p e r t i e s t h ep r o p e r t i e so fm p e g l 一m o d i f i e dc ps h o w e dt h a tt h ek m 8 9 9v a l u eo ft h em o d i f i e dc pw a si n c r e a s e d ，t h i sm e a n st h a tt h ea f f i n i t yo ft h em o d i 靠e dc pf o rs u b s t r a t eh a dr e d u c e d h o w e v e r ，t h et h e r m o l a b i l “y p hs t a b i l i t ya n dt h es t a b i l i t ya g a i n s tt y p s i no ft h em o d i f i e dc pw e r ei n c r e a s e di nc o m p a r i s o nw i t ht h en a t i v ec p i tm e a n st h em o d i f i e dc pw a s m o f es u i t a b l ef o rc l i n i c a la p p l i c a t i o n s t h ed h a r m a c o k i n e t i cs h o w e dt h a tt h eh a l f - l i f eo ft h em o d i f ：i e dc pi nv i v ow a s1 6 3t i m e so ft h a o ft h en a t i v ec p i tm e a n st h em o d i f i e dc ph a st h eb e t t e rc l i n i c a lv a l u e i nc o n c l u s i o n ，t h ec h e m i c a lm o d i f i c a t i o no fc pm i 曲tc o m p l e t e l yr e m o v ei t sa n t i g e n i c i t y ，p r o l o n gi t sh a l f - l i f ci nv i v oa n di m p r o v ei t st h e r m a l ，p hs t a b i l i t y ，a n dt h es t a b i l i t ya g a i n s tt r y p s i nc a nb ea l s oi n c r e a s e d ，w h i l ei tw a sr e t a i n e do f3 6 4 0 o ft h eo r i g i n a la c t i v i t y a l lo ft h e s ew i l ls u p p l yag o o db a s ef o rt h eb e t t e rs t u d ya n dc l i n i c a la p p l i c a t i o o fc p k e yw o r d s ：c h y m o p a p a i n ；m p e g ；c h e m i c a lm o d i f i c a t i o n ；d e t e r m i n ea n da n a l y s i 8华南理工大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：舒薇日期：2 0 0 5 年1 月6 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华南理工大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密口，在年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密口。( 请在以上相应方框内打“”)作者签名：导师签名：日期：日期：年月口年月日第一章绪论第一章绪论1 1 木瓜蛋白酶粗品及组成番木瓜( c 口r f c d p 印d ) dl ) 是番木瓜科双子叶草本植物，该植物盛产于高温潮湿的热带和亚热带地区。原产地美洲、非洲，我国广东、广西、海南、云南、福建、四川、台湾等地均有栽培。番木瓜别名多，又名万寿果、乳瓜、番瓜、木冬瓜等，其成熟果实肉厚、质滑，不仅味道清甜可口，而且营养丰富。据中药大词典载明：番木瓜含有生物碱、蛋白酶、凝乳酶、黄素、胡萝h 索、隐黄索环氧化物、番茄烃、异硫氰酸苄脂和番木瓜甙、多种维生素和矿物质等，素有“岭南佳果”之称。其未成熟的果实尤其在皮下含有丰富的乳汁，其中含用丰富的酶类，因此常作药用h ，2 3 】。如近代药学和临床研究表明 4 5 】，番木瓜性平、味甘、无毒，具有消食健胃、滋补催乳、舒筋通络、驱虫、强心和消肿之功效，可以用于治疗脾胃虚弱、食欲不振k 】、乳汁稀少、风湿关节疼痛、肢体麻木和十二指肠溃疡疾病【l 一】。从番木瓜中提取的一种生物碱，具有抗癌作用。将其注入癌组织，能使癌肿明显缩小等。在番木瓜树的未成熟的果实、树干、根和种子等部位广泛存在着木瓜蛋白酶类，其中以未成熟的果实浆液中含量最为丰富，但随着番木瓜的成熟，白色浆液越来越少，因此一般从未成熟番木瓜中收集乳汁进行加工提纯 2 3 ”。由番木瓜未成熟果实划割收集到的白色浆液，直接干燥或经简单处理即得木瓜蛋白酶粗酶。该酶为白色或乳白色的粉末，具有刺激性气味。研究发现，木瓜蛋白酶粗品是一个多酶复合体系，其蛋白质电泳带大多在5条以上，其中主要有4 种巯基蛋白酶：木瓜蛋白酶( p a p a i n ，e c 3 4 2 2 2 ) 、木瓜凝乳蛋白酶( c h y m o p a p a i n ，e c3 4 - 2 2 6 ) 、木瓜凝乳蛋白酶m ( c h y m o p a p a i n m ，e c 3 4 2 2 2 5 ) 、木瓜蛋白酶q ( p a p a y ap r o t e i n a s e q ，e c 3 ，4 ，2 2 ，3 0 ) 吲。此外复合酶中还含有大量的溶菌酶( l y s o z y m e ，e c 3 2 1 1 7 ) 【9 l ”。木瓜蛋白酶复合酶中的四种巯基蛋白酶同属于木瓜蛋白酶家族( p 叩a i nf a m i l v ) ，具有相似的结构和性质( 见表l 1 ) ，这四种蛋白酶的氨基酸序列 1 。7 1 8 l( 图1 一1 ) 对比结果显示：这四种巯基蛋白酶具有很高的同源性，其中木瓜凝乳蛋白酶m 、木瓜蛋白酶q 与木瓜蛋白酶的同源性最高，分别达6 8 和7 0 ；而c p与木瓜蛋白酶的同源性也达到6 0 。这四种酶相同的氨基酸序列多位于肽链的n端和c 端，而在催化位点起作用的氨基酸残基以及参与二硫键结合的c y s 位点及数目的相似使这四种巯基蛋白酶形成了全局性的结构相似性 1 ”。华南理工大学博士学位论文木瓜蛋白酶是最早被发现、研究和得以广泛应用的酶，1 9 6 2 年d r e n t h 等就测得了木瓜蛋白酶的x - 衍射结构。因此，在木瓜蛋白酶类的结构性质研究中，一般以此酶作为参照。而木瓜凝乳蛋白酶( 简写c p ，下同) 则是在1 9 4 1 年由j a n s e n 和b a l l s 【1 9 1 首次发现、提取并命名。c p 有很强的水解蛋白质、小( 多) 肽的能力，它的切割位点很多，但最优先分解稽氨酸、苯丙氨酸的肽键，此外也具有水解酰胺键和酯键的特点以及具有凝乳活性。因其在复合酶中含量最为丰富、具有极强的水解和凝乳双活性且天然、安全，已成为人们研究开发的热点2 2 0 ，2 ”。木瓜凝乳蛋白酶m 因等电点与c p 相近，在分离纯化过程中其组分常常和c p混杂在一起。该酶仅有一个活性巯基，且具有较窄的底物特异性，所以在根长一段时间内被认为是c p 的一个亚型，在众多研究中被忽视2 2 ，2 引。木瓜蛋白酶q 等电点较高，在分离纯化过程中最后被洗脱下来，因此也最容易从木瓜蛋白酶复合酶中分离出来。木瓜蛋白酶类在结构上的相似性决定了它们在性质上也具有很大的相似性。研究表明，木瓜蛋白酶、c p 和木瓜蛋白酶q 三种酶具有较宽的底物特异性，而木瓜凝乳蛋白酶m 对偶氮酪蛋自、b z a r g n h p h n 0 2 稻其他木瓜蛋白酶类的合成底物均无活性，对蛋白质的活性也很有限。这主要是因为，其他三种酶的s l 特性口袋中高度保守性的g 1 y 1 5 6 和g 1 y 1 9 8 ，在木瓜凝乳蛋白酶m 中被g l u 和a r g 置换。研究表明，在p h 5 7 范围内，c p 和木瓜蛋白酶对偶氮酪蛋白和白蛋白的作用相似，而在更高的p h 下，木瓜蛋白酶的活性较高，表1 1 木瓜复合酶中四种巯基蛋白酶结构、性质的比较t a b l e1 lc o m p a r i s o no fs t r u c t u r ea n dc h a r a c t e ro ff o u rc y s t e i n ep r o t e i n a s e s木瓜凝乳木瓜凝乳木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶q蛋白酶蛋白酶m系统命名e c 3 4 2 2 ，2e c 3 4 2 2 6e c 3 ，4 2 2 2 5e c3 4 2 2 3 0氨基酸个数2 1 22 1 8 2 2 6 2 2 72 1 62 1 6分子量2 3 5 0 0 【1 l 】2 6 0 0 0 1 2 】2 4 5 0 0 1 3 】2 4 9 0 0 【1 4 】氨基酸同源性( )1 0 0 5 9 4 6 7 9 6 9 8 等电点1 5 ，2 6 j8 7 51 0 1 1 0 6l o 。61 1 4活性巯基数目，总巯基1 ，72 ，8l 71 ，7数( m o l m 0 1 分子)占乳汁可溶蛋白的含5 4 5 2 8 2 0 量比例( ) 1 4 】2第一章绪论赫静器辫麝铀辩铀黼黼臻锄罐锄l 擎雹警警鬻羹程箕纛警彳雾警l 黟s 耀擎襄i 馐秸纛￥羊雾￥瓤黔i 遴警自滞馨蕺蒸霉 擎害驴聱掌p 蹙霪囊器攀蠢矗蓑霉壤警掌争警l1 0霉蒜酝氧耪霉攀黧羹嚣警臻羲譬凄棼k 擎磬豢蠢鬟鬟霉糕菇霉裁霉垂穗霉錾鬻赣瓢精霉粼释嚣鑫鼙嚣辅尊参鬟黼鬻嚣鬈戴霉嚣聋髓嚣摊奄8 s e 站3 e 攀蠢驴蓦纛警譬警l 嚣l l 鬟薹鐾警器瓣b 箨皇警霪慧錾冀纛霉s g 棼霪e 攀轰爹翼纛擎轰零擎l 自蜃菱搠蓑差鬟蕈罄鬟錾掌霎乳嚣嚣羲墨l 鼙霉￥g 鼙霉嚣攀纛彰嚣鬻铲轰警擎黪瞎瓣嚣羹慕r 骖裂氧擎霉瓢器羲黧瓣鸯莓s 棼嚣嚣璧攀纛f 鬟警萋巍掌￥匿曝妻簿蒸l 警t 露舞氧k 霉氢s 譬舀+蠡鑫壶# 扩鬻磊氧餐氧警舞訇 擎鼙l 耩警黧撵蕈警争警霉霉萼奄耩絮羲糍蔷鬟纂蔫鬻葬争警矗k 雇警擎矗薯瓣蓐饕纛羹露嚣譬擎警嚣纛蒺譬g 1 霉藏毳嚣唾警鬻；孽s 零s 氧罐警警磊囊冀攀l 襄耘薰纛篝饕势警l 舞蓑薅臻零霉璃蠢辩糕￥警碡亨薯s b 饕警警矗鞋冀黎1 甓鞋警霪藏鹫攀争鬻鼋潇羲彝擎蒸嚣纛蕈彝嚣|，l|糟麟瓣i 蝻豁p棼擎警纛纛慕蔫i 赣事藕罄警皤擎擎群器露纛氧黔譬嚣曩纛箨臻擎孽纂警擎瓢纂彝龚霹潲镰| 蕈冀接荐l 擎警势p 露鼙鼙争薹警羲垂霪霉警器黼甓彰纛器蓦鼙麓玉t 群纛l 磊嚣黛霉警攀擎警聱嚣霉蒸譬纂霉擎饕豁警篝臻鼙l 擎霉尊静鞲蓐茹参莪警嚣蓄素障繁蟹蠢警；i 譬溯群蓦棼霪毛k 壤纛薹矗耩黛囊 孽蓉警掌_ 孽蠢霪赢舔纛帮雾建瓣擎蓑鑫霉l 雾慧i 睡睁扩臻争黼羹l4 攀霉_ 警_ 蒸蠢警擎攀耱霉葚警蒸扩瓤譬巍善| 纛瓣聱擎鑫霉擎事嚣巍臻餐嚣雾l 嗨k 警纛嚣鼙警擎静l毒l+ l|l l 彝：| _ #l l l 赫l 4黼黼挫臻麟瓣喀臻嚣 霉耩冀警霸睡i 纛_ 镛 | 纛纛警霸警臻驴* * 鞫蕈l 纛善嚣群蒜薰黎霉繁鞴攀i 搽掣l 鬟羹羹鬟豢霉6 赣器蓐争b 臻糕警静囊羲擎警i 警藉y 罐篝蠢档臻薰蒋￥薹k 誊羲瓣攀繁霉糕攀臻糕蒜擎l 瓣零鬟鬻舞争嚣麟蒜嚣绱i 薹_ 嚣擎静熊舞警零藕警番謦臻鬻鬻臻碜蓑嚣譬墨瓢薹霉婚攀! 髂隧糕罄蔫蠢攀墨羹薹篝羹盏霉霉麓罄臻鬻豢毛静裁纛警譬磊警霉警髂誊霉豁精羲瓣擎薹| k 蘸瓣羹鬻棼挚冀- 喽器纛蛰譬鬟羹瓤蒜冀i 曩苍簿霉ll|ll 槲，l 瓣i婚警$9l 释擎群警霉黎蠡鬻警黎s 嘴势掣鬟瓣| 雅穗争6 ￥移臻鼍鬻薰嚣霪鬻警势警警精e 豢鞲争嚣聱霉攀攀掣羹霉鑫警攀挚l 鬟瓣臻臻掌器擎鬻鬟翥霉粼爹擎嚣零扩巍蒜l 彝墓撼戮整鲫豢蠛凝虢警翻精鞭“l 骥溯糍豢谶瀛舔簇“豢潦麓廖秘瓣羧零譬霉蠢，耋盎瓤豢瓣赫l 燃尊尊鐾垂瓤卑；擎爹雄攀穗l ；糕饕赫礴鞭囔藏擎每臻。藿c - 扩l 蠢镰謦蠢萱羹擎群蠢攀t 鲁馨蠹谁略雾精篝纛i - 髯纛# 蝴现在，在工业上被广泛使用的木瓜蛋白酶为木瓜蛋白酶粗品，这对大多数要求不高的工业应用已能满足要求，而精制的木瓜蛋白酶纯品成本高、价格贵，只有在医药应用研究中才被使用。木瓜蛋白酶广泛应用于食品工业【2 4 1 。如用于啤酒澄清、改善口感、防冻及延长啤酒的保质期1 ；肉类加工中用作肉类嫩化剂；在饼干生产中加入适量的本瓜蛋白酶，能使生产出的饼干更加薄脆。在美国，木瓜蛋白酶几乎应用于全部的肉类加工业；在法国用于加工鱼类的木瓜蛋白酶约占该国木瓜蛋白酶需求量的一半邺，26 1 。在日化工业中，木瓜蛋白酶可用于生产含酶化妆品和含酶牙膏。特别是用木3謦瓣黼鼹皤华南理工大学博士学位论文瓜蛋白酶制成的一种减肥香皂，在目前国内市场上非常畅销，它能增加和改善皮肤表皮细胞的新陈代谢，使皮肤具有良好的弹性。轻纺方面，常用于绢丝脱胶和羊毛防缩，由于木瓜蛋白酶只溶解丝胶而对纤维蛋白全无作用，所以能令丝织物等滑爽柔软j 。木瓜蛋白酶是高效蛋白水解酶，在临床应用上可用来治疗消化不良、处理坏死组织、消炎、止痛和治疗湿疹等，此外还可用作驱除肠内寄生虫的药物。此外木瓜蛋白酶复合酶还可用于明胶制造、蚕茧脱胶、皮革脱毛等工业。1 2 木瓜凝乳蛋白酶1 2 1 木瓜凝乳蛋白酶的命名与亚型术瓜凝乳蛋白酶( c p ) 是木瓜乳汁中含量最高、水解和凝乳活性箍强的一种酶1 9 ，2 7 ，2 引，但由于其类型复杂，也是四种巯基蛋白酶中最后一种获得x 衍射的酶。c p 最早于1 9 4 1 年由j a n s e n 等【1 9 】在制备c p 晶体时首先发现，由于其来源于木瓜且具有较高的凝乳活性，因此将其命名为类似于c h y m o t r i p s i n ( 胰凝乳蛋白酶) 的c h y m o p a p a i n ( 木瓜凝乳蛋白酶) 2 ”。1 9 6 7 年，k u n i m i t s u 等3 0 1 用离子交换柱分离c p 时，根据洗脱的先后顺序把木瓜凝乳蛋白酶分为两类一a 类和b 类；1 9 8 2 年，b r o c k l e h u r s t 等报道了c p 存在四个组分，1 9 8 5 年他们进一步用极缓的n a c l 梯度洗脱出5 个活性峰；1 9 8 9 年，s i l v i a 等3 1 1 对c p 的4 种亚型进行了园二色谱( c d ) 分析研究。目前，随着分子克隆技术的发展，已发现c p 存在不同亚型，它们之间仅有一或两个氨基酸的不同2 7 1 。据e m b l ，g e n b a n k ，d d j b 等数据库提供的数据己知，目前至少有9 种亚型，它们分别由不同的基因编码。其中6 种亚型的多肽链由2 1 8 个氨基酸组成，2 种由2 2 7 个氨基酸组成，1 种由2 2 6 个氨基酸组成。9 种亚型的氨基酸序列如图l 一2 。比较结果显示，在这9 种亚型中，只有亚型i i 、亚型i i i 和亚型v 中个别位点的氨基酸与其他亚型的不同。与其它三种半胱氨酸蛋白酶类似，木瓜凝乳蛋白酶肽链的n 末端有信号肽段和肽原段。信号肽指导木瓜凝乳蛋白酶向番木瓜乳汁中分泌：而肽原段不仅可以辅助酶肽链的折叠，还可作为木瓜凝乳蛋白酶的抑制剂，防止木瓜凝乳蛋白酶不合时宜地分解植物体内的其它蛋白p 。圳。4l o2 03 04 05 06 0li tlc b y 证oiy p q s i d 博鬟a 装6 a v t p v 菽n 奄g 氯c g s c 臀a f s f l a t v e g l n 翳i v t g n l l e l s e q e l v d c d k h sc h m ol ly p q s l d 曹r a k 6 a v t p 非n q g a e g s e w a f s f i a t v e g l 腻l v t g n l l e l s e q e l v n e d k h sc h y m o iy p q s i n 胃r a k 6 a v t p v k n 胬g a e g s c 鬻a f s f i 矗t v e g l n k i v t g n l l e 乙s e q e l v 秘e d x 珏sc h y m o ，p q s 重d 髯r a 蹒矗v t p v l 【：n 酾a e 6 s c w a f s r i a t v e g i n k l v t g n l l e l s e a e l v b e d k h sc h y m ovy p q s r n _ r a 】g 斛t p y k 瀚g 忿g s e 祛f s t i a t y e g i 胍l ￥t g n l l e l s 鞠e l ￥d e d k h sc h y m o y p q s i d 胥r a k 6 v t p v k m q g a c g s e w a f s t i a t v e g r n k i v t g n l b e l s e o e l v d c d k h se 酶o y p q s i o * r a k g a m p v k n q g a c g s c w a e s t i a f v e gr n k i v t g n l l e l s e q e l v d c d k h sc h y o 诅y p q s i d 鬻r a k g a v t p v k n q 6 a e g s e l a f s t i a t v b g i n k l v t g n l l e o s e q e l v d c d k h sc h y m o y p i n l r a l 【g a v t p v x n 如a s c 霄a f s t i a f v e g l 勰l v l g l l l b 8 璐e e l v b e d k h s7 08 e9 0l o q1 1 01 2 0llll#lc h y o 【y g e k g g y 舛l s l 日y v a n n g y h t s k v ￥p ￥q a k q y k c r a t p k 聪p k y 甏i t g y k 盯p s n c e t s黼y 日of ie 醛g ￥够骼l 口y y a n 黔v h 嚣v y p y q a k q 豫c r 档p 台p k ￥i c ：薹l g ￥r ￥盼n c e r se h y & o i l iy g e k g g ￥q l t s lq _ y v a n n g v h t s k y ￥p e 键a = q y x c r a t 驱p g p k v l 【= l g y k r v p s n c e t sc h y 自o wy 6 c k g g ￥q l t s l q y v a n n h 镐k v y f ￥q = i j ( k i c c r a r d k 瞄p 种k 1 y k r v p s k c e t sc h y m ovy g c k g g ￥q l l s k q y v a n n g v i t s k v y p e q a k q _ j ! k e r a t d & p 略p k v k i l g y k r v p s n e e t sc h y o y g c k g ；g ￥甜f s e q y v a n n 勰h 鹳k v ￥p y q k 甜k c r t b k p g p 勰艇t g y k r v p s n e e t se h y _ n y g e k 6 g y 奄t f s l 尊￥v a n n v h l s e x 譬p ￥日a k 鲟y k e r a l d k p 蟊p k v k t t g y k r v p s n c e t sc b y t o 疆y g e k g g y 舯t s l q y v a n 黼v h t s 剁砰y 鼢孵k e r a l k 隧p 料k l l 6 聊y p s n c e t sc h 鞠o y g c k g g y 甜t s l q y v a n n g v h l s 莪v y p 疆 k q y k c r a l d k p g p k 张r t g y 聃v p s n c e t s1 3 。1 4 01 5 0l 抽= =l ? o1 8 0l蔓4c l l y oif l g 乙 n q p o s v k v e a g 强p 鞠糍s g v e n s 聪g t x b d h a ￥獭￥g ￥6 嚣d g k n y l i i k n se h ，o f l g l a n 日p l s f l v e a g g k p f 鼹￥x s g v f d g e 要k l n 俄v l a v 6 ￥骞l s p 6 k l 盯i i i k n sc 硒m o mf l g l a n q p e 髂l ￥黼6 6 k p 心l y l i s 甜f 鼯g 鼗。殛k d h a v 料6 y 6 嚣6 臻聪lii k n sc ；l l y m o f l 6 a l a n q p t s v t v e 瞄g k p 髓l 勰s e v 期g e e 6 t 觏醐躺t a ￥g y g f 粼k 料lh k n sc h y _ ovf l 6 a 乙a n q p l s 尊l v 甚赢鸯蛋蓐p f 菇l 擎琏s 6 v f 封6 塞e g 薯k l 疆壤瘫聱藿舞警舀x 6 l s 扫畦笨n y ii r k 馘sc h o f l g a l i l 口p l s v e g g p f 日l ￥x s 鑫v 问g p e g t 麟嬲t a v g 粥l s b g k n y i ：i i k n sc l l y m o f l g a l a n q p l s v l v e a 8 6 = i c p 燃￥毪g g v l ；： d g p c 聪麟麟i a y g y g t s d 6 k n y 【_ ii k n se 时m o 诣f l g a l 解解l s v l v e 绱艨p 袖腿k s g ￥f d g p e g t x l 粥a v ：f v g y g t s d g x k y iii k n se h y 盈o p l g a l a n 辞p 毛s ￥l v e a c 6 k p p q l ￥嚣s 6 v f 雎g p c g t k e 囊鞋轰辈! 毽v 露x 嚣t s 国g k n y i i i k k sl 孽o、3 0 02 l 昏2 1 8ll# g p n w g e k 6 鞭r o x r q s g n s q g t c g ￥y k s s ￥y p f k g f a_ g p n l g e x 6 删r l k r q s 6 k s q 6 e 6 v ￥k s s ￥p f k 6 飘冁p n e l c _ g y 貅l k r 8 n g g _ r e g v y k s s y y p f k g f & k d2 2 7l g f h t ￥i_ 6 p n w 6 e k g 硼r l k r 嗡6 n s 口g l e 0 ￥y k s s y y p f k 台f a k b l g f l i t y iw g p n 髯6 e e 6 警h r l k r q s g n s q 甜e g v y k s s y y p f 稿f a k b l f 韩t y i警6 p 臁g e k 6 张r k r q s 聃s 始t 蕊v y k s s ￥y p f l 【g f 们p n 赆e 麟硼r b k r q s g n s 蝣t c j s v y k s s 盯p f k g f a- g p n 孵e 醛张r e 姻s 6 n s 赋r 隅v y k s s y y p f k 6 f a霄g p n 熏6 嚣鬣g ￥睡鬟l 雌q s g n s q g 零c g v y k s s y y p f 最g f a酾y 商o i ：c a a 6 6 3 8 谭m b l ，c h y m i i i ：c ： _ b 3 8 3 1 4 但黼b u ，弛y m o m ：c a 骞3 8 3 1 5 ( e 鹾乩)幽炉o l v ：e 矗器3 8 鲫鲫f m b l xo y 脚vi c 躺3 s 3 1 7 ( e m b 酞c b 姗。班：i y l ( b m b l ) c h y m o ：s 0 4 乏2 2 馍m 嚣”，c h ，8 i 口_ | l ：期9 7 辱。忸觚b l xc 姆捆o ：p 1 4 0 8 0 ( 窟m b l ) 图l 。2 9 种不同亚型酶本瓜凝乳蛋白酶氨基酸序列比软筘i g 1 - 2a l i g n 唯e n to ft h ep r o 心i ns e q “e n c eso fe h y m o p a p a i ns5“娥锄州“鲫栅搠港i雕m基囊t羹囊：赞盟、添洳酾瀚獭翩獭渤华南理工人学博士学位论文1 2 2 木瓜凝乳蛋白酶的立体结构1 9 9 6 年m a e s 等通过测定c p 的x 一衍射结构等研究获得并揭示了c p 的立体结构3 8 ，3 9 1 ( 如图1 3 ) 。从图可见，c p 的多肽链折叠形成两个大小相当而形状不同的结构域一l 域和r 域。l 域主要是螺旋结构，由残基l o l l l 、2 1 1 2 1 8构成；r 域主要是反向平行的b 一折叠结构，由残基l 9 、1 1 2 2 1 0 构成。而活性部位就位于这两个结构域的交界面上，其活性中心c y s 2 5 就位于由2 4 4 2 残基构成的旺一螺旋的开头【3 8 l 。c p 比木瓜蛋白酶多出的4 个残基( 1 6 9 位1 7 2 位) 位于连接两个反平行b 一折叠的环上。图1 3 木瓜凝乳蛋白酶立体结构f i g 1 3c h y m o p a p a i ns t r u c t u r e园二色谱表明，木瓜蛋白酶、木瓜蛋白酶q 属于c 【+ p 类，其中木瓜蛋白酶c端结构域为全螺旋结构，n 端结构域为全p 折叠结构 4 ；而c p 属于n ，9 类，表明c p 二级结构中含有更多的螺旋和p 折叠，并且二级结构的折叠方式也是不同的 ，见图1 4 。c 口分子内共有8 个半胱氨酸残基，其中c y s 2 2 和c y s 6 3 、c y s 5 6 和c y s 9 5 、c y s l 5 3 和c y s 2 0 4 分别形成3 个二硫键，而c y s 2 5 、c y s l l 7 为活性自由巯基。根据木瓜蛋白酶的三维模型，c y s l l 7 很可能在分子表面，在