（发酵工程专业论文）溶藻细菌770sh、802sh的分离、鉴定及溶藻特性的研究.pdf

溶藻细菌7 7 0 s h 、8 0 2 s h 的分离、鉴定及溶藻特性的研究 摘要 我国水体富营养化严重导致水华频发，研究水华的控制方法有着积极的意义i 在已 有的物理、化学及生物方法控制效果不够理想的情况下，利用溶藻细菌控制水华成 为新的研究方向。本研究从杭州及周边地区采集水样2 0 份，分离到细菌8 3 株，从 中筛选到具有溶藻特性的菌株8 株，其中7 7 0 s h 和8 0 2 s h 能溶解铜绿微囊藻等蓝藻、 莱茵衣藻等绿藻及小环藻。经1 6 sr d n a 鉴定，初步鉴定属芽孢杆菌，其中7 7 0 s h 为蜡样芽孢杆菌，8 0 2 s h 待鉴定。试验发现，两菌株均以间接方式，即分泌胞外活 性物质溶藻，7 7 0 s h 分泌的溶藻物质对热稳定，溶藻能力不受蛋白酶的影响，推测 为小分子量的非蛋白类物质。较高的溶藻物质浓度和藻的光暗循环培养，有利于溶 藻作用的实现。 关键词 溶藻细菌筛选溶藻特性 华巾农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 a bs t r a c t s i n c ee u t r o p h i c a t i o na n dm a s s i v ea c c u m u l a t i o n so fp l a n k t o n i cm i c r o a l g a ea sa l g a b l o o m si nw a t e r b o d i e sh a v ec a u s e ds e r i o u se n v i r o n m e n t a lp r o b l e m ，i ti si m p o r t a n tt of i n d a l le f f e c t i v em e t h o df o rc o n t r o l l i n gt h eg r o w t ho ft h eb l o o m - f o r m i n ga l a g e m e a s u r e sf o r c o n t r o l l i n gs u c hk i n do fa l g a ei n c l u d ep h y s i c a l ，c h e m i c a la n db i o l o g i cm e a n s ，b u tt h e f o r m e rt w od a m a g et h ea q u a c t i ce n v i r o n m e n ta n dr e q u i r eh i 曲一e n e r g yi n p u t s t h e a l t e r n a t i v ea p p r o a c hf o rt h ee l i m i n a t i o no fn u i s a n c ea l g a ei n v o l e st h ea p p l i c a t i o no f p h y t o p l a n k t o n l y r i cb a c t e r i a i nt h i ss t u d y , e i g h ts t r a i n so fp h y t o p l a n k t o n 。l y t i cb a c t e r i u m w a si s o l a t e df r o mt h ew a t e rs a m p l ec o l l e c t e di nh a n g z h o ua n da e r e aa r o u n di t t w o s t r a i n s ( 7 7 0 s h & 8 0 2 s h ) w i t hs i g n i f i c a n ta l g i c i d a l a c t i v i t i e s a g a i n s tc y a n o p h y t a m i c r o c y s t i sa e r u g i n o s a 、c h l o r o p h y t ac h l a m y d o m o n a sr e i n h a r d ia n dd i a t o mf r a g i l a r i a s p ，s h o w e daw i d ea l g i c i d a lr a n g ea g a i n s tv a r i o u s h a r m f u la l g a b l o o ms p e c i e s s e q u e n c e s a n a l y s i so f1 6 sr d n as h o w e dt h a t7 7 0 s ha n d8 0 2 s hw e r ec l o s e l yr e l a t e dt og e n u s b a c i l l u s b i o c h e m i c a la s s a y sr e v e a l e dt h a tb o t hs t r a i n sl y s e da l g a ei ni n d i r e c tp a t t e r na n d e x t r a c u l l u a rs u b s t a n c e sw a st h em a i na g i c i d a lf a c t o r h i g hc o n c e n t r a t i o no fe x t r a c e l l u a r s u b s t a n c e sa n dl i g h t d a r kc y c l e sa v a i l e dt ol y s et h ec y a n o b a c t e r i a lc e l l s k e y w o r d s p h y t o p l a n k t o n l y r i cb a c t e r i a ；i d e n t i f i c a t i o n ；a l g a e q y t i cc h a r a c t e r 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 否如需保密，解密时间 年月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意， 研究生签名：艾马离 时间：2 口口毋年月，苦日 溯黼挠艾骥 锄签名咖噜 签名日期：】_ 口口g 年6 月，8 日签名e 期： 年 月 e l 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 溶藻细菌7 7 0 s h 、8 0 2 s h 的分离、鉴定及溶藻特性的研究 1 前言 1 1 水华的形成及危害 1 1 1 水华的形成 随着社会经济的快速发展，人口急剧增长，工业化及农业现代化的速度加快。 加之环保技术发展相对滞后，造纸、纺织、印染、化肥等企业工业废水以及农业养 殖和化肥流失带来的农业污水的大量排放，导致区域大面积水体被污染，有害水华 随之而来，其发生频率逐年上升。中国是一个湖泊众多的国家，面积大于1 k m 2 的 天然湖泊数量超过超过2 3 0 0 个，湖泊总贮水量为7 0 7 7 多亿m 3 ，总面积接近 。 7 1 0 0 0 k m 2 ，占全国陆地总面积0 8 。近3 0 年来，随着国民经济的持续高速发展， 尤其是东部、南部地区经济建设的加速，对能源和资源的消耗不断增加，“三废 的 排放加剧，导致湖泊为主的淡水水体被大量污染，水环境不断恶化，水体富营养化 严重造成的水华危害日益严重。 水华是指淡水水体，通常为池塘、水库、湖泊、河流，受到污染，氮、磷等营 养物质大量增加，致使水体达到富营养化或严重富营养化状态，在适宜的理化条件 ( 温度、光照、p h 等) 下，某些藻类暴发性繁殖，生物量急剧增加的现象。水华通 常会引起明显的水色变化，并在水面形成绿色或其他颜色藻类漂浮物。水体的富营 养化为藻类的暴发性繁殖提供了必要的营养物质基础，是水华发生的直接因素，其 定义为水体因营养物质的过量输入导致水质恶化，水生生态受损。水体富营养化具 有三个特征：1 ) 氮、磷等营养物质源源不断地输入水体。它们通过不同的途径包括 自然界的物质循环，更重要的是由于人类活动的参与，如工业废水及城市污水的排 放，导致相当多的营养物质进入水体，为形成水体富营养化过程提供了物质来源。2 ) 在富营养化水体中，生物群落主要占优势地位的是生产者( 主要是指浮游藻类) ，而 消费者居于极不重要的地位。3 ) 营养物质不断向水体底层富集，形成一个富含营养 物质的沉积层( 王俊等，1 9 9 3 ) 。 水华的主要成因是水体富营养化，但水华的发生却是多种因素综合作用的结果， 主要包括环境因素和水华藻类的特性，前者是指各种环境因子，包括氮、磷、温度、 光照、酸碱度等，后者是指水华藻类特有与环境相适应的形态特征及生理生态、繁 华中农业大学2 0 0 8 届硕七学位论文 殖策略。目前关于水华发生成因的研究探讨主要集中于前者，多为对野外湖泊、河 流等水体的理化因子进行调查分析。昆明滇池水华频发，刘丽萍( 1 9 9 9 ) 对滇池水 华进行研究，结果表明滇池水体中高含量的n 和p 营养物在水华的形成起关键作用， 适宜的温度和充足的光照对水华的频发提供有力条件，滇池水体富营养化程度的加 剧及水温的升高，会促使水华爆发日趋严重。杨清心等( 1 9 9 6 ) 在1 9 9 0 年8 1 2 月 对太湖水华的9 次调查表明该湖泊水华主要由漂浮性蓝藻微囊藻组成，夏季东 南风使其漂移聚集是西北湖区形成严重水华的主要原因，这种漂移使藻类所含营养 物质逆吞吐流方向传输，形成“生物营养滤器 ，加速太湖尤其是西北湖区的富营养 化过程。野外水华生态调查表明水华的发生与环境因子有密切关系，除营养物质外， 温度、水温、光照等因素也对水华产生有影响。除野外调查外，实验室条件下对水 华藻类和各种环境因子的相互关系的研究也有报道。高学庆等( 1 9 9 4 ) 进行了铜绿 微囊藻营养动力学研究，表明微囊藻的增长率和生物量在实验所设置的磷浓度范围 内随着磷浓度的升高而增加，而在同时存在氨氮和硝态氮的条件下，藻类会优先利 用氨氮。衣藻水华中，水体中的氮、磷含量及比例是关键因素，有效氮磷比1 7 时， 可致水华优势藻为衣藻，当正磷酸盐浓度降至0 0 6 5 m g l 时，衣藻生长受到限制( 徐 敏等，2 0 0 1 ) 。现有的对水体富营养化的研究普遍认为恰当的氮磷比是导致藻类繁殖 旺盛的一个重要参数，比例在1 1 8 ：1 至1 5 5 ：1 之间可加剧水体富营养化。 目前对水华形成的机理已有基本的了解，但水华发生是多因素复合作用的结果， 因素之间也存在相互影响制约的关系，水体情况也不尽相同，故仍需要进一步更细 致的观察、试验和思考，以完全掌握水华形成的机制。 1 1 2 水华的危害 水华是淡水水体受到严重污染的表现，而水华形成的同时又会进一步加剧水体 污染，危害很严重。国家重点治理的“三湖 ( 太湖、巢湖、滇池) ，由于水体富营 养化及水华形式严峻，消耗巨资但效果不理想，其他湖泊如东湖、洞庭湖、洪湖、 鄱阳湖等也存在类似问题。水华的危害，主要体现在以下几方面： 1 ) 破坏淡水水体生态系统 水华发生时，形成水华的优势藻会暴发性增殖，生物量急剧增加，会造成水体 p h 值改变( 邢伟等，2 0 0 6 ) ，黏稠度增大，降低水体的透明度和溶解氧，改变浮游 2 溶藻细菌7 7 0 s h 、8 0 2 s h 的分离、鉴定及溶藻特性的研究 生物的生态系统群落结构。当藻生物量过大后，又会因必要生存条件的丧失而死亡， 被微生物分解时会大量消耗水中的溶解氧，造成水体大面积缺氧、无氧，另会产生 有害气体和毒素，致使鱼类大量死亡，破坏水体生态系统的多样性。 2 ) 损害水产养殖业 水华发生后，水华优势藻分泌大量粘液附着在水产养殖动物的鳃上，使其窒息 死亡，另可产生细胞内外毒素，水产养殖动物摄入或间接积累后会发生中毒死亡。 此外，水华优势藻大量增殖后死亡后会使水中溶解氧含量大幅下降，导致鱼类等窒 息死亡，严重损害水产养殖业的发展。 3 ) 影响水处理设施及工艺 水华发生后，水华优势藻会聚集，在滤池( 特别是慢滤池) 表面形成一层很密 实的覆盖物，阻止水的通过。( 由昭今，2 0 0 0 ) 。穿透滤池进入管网的藻类以及残留 在水中的生物可同化有机物( a o c ) 成为微生物繁殖的基质，促进细菌的增长，甚至 可能在管网中生长较大的有机体，如线虫和海绵动物等，这些动物很难消除，严重 时可堵塞水表，水龙头。细菌的再繁殖会加速了配水系统的腐蚀和结垢，使管网服 务年限缩短( 余冉等，2 0 0 1 ) 。此外藻类有致臭作用，可使水华水体带有难闻的鱼腥 味、草腥味，传统的净化工艺很难消除。 4 ) 危害人类健康 不少藻类在代谢过程中，会产生大量的生物毒素，引起鱼类等水生生物病变， 人类误食受到有毒藻类污染的鱼、虾、贝类等或者饮用含有生物毒素的水体，就会 中毒。自1 8 7 8 年f r a n c i s 首次发现泡沫节球藻( n o d u l a r i as p u m i g e n a ) 水华能引起家 畜和禽类中毒死亡以来，已证实有1 0 多种蓝藻能引起动物中毒甚至死亡。1 9 7 6 年 美国宾夕法尼亚的s e w i c k l e y 暴发一次水源性消化道疾病，约6 2 ( 达8 0 0 0 人) 的 人口受到影响，在排除了细菌病以后，认为饮用水水源中的蓝藻很可能是致病的原 因。1 9 8 3 年澳大利亚m a l p a s 水库受蓝藻污染，发现水华生物作为饮用水源的该水 库中，谷氨酞胺转移酶、丙氨酸转移酶及碱性磷酸酶明显升高。近年来又有大量关 于人类饮用或直接接触藻类污染的水体引起皮肤反应，结膜炎、鼻炎、呕吐、腹泻、 胃肠炎等的报道。 其中为研究者比较关注的藻类生物毒素为蓝藻毒素，是有毒蓝藻细胞破裂后向 水体中释放的多种不同类型的藻毒素( k e n e f i c k 等，1 9 9 3 ) 。研究表明，世界各地 2 5 7 0 的蓝藻水华可产生毒素，尤其是其中的微囊藻属( m i c r o c y s t i s ) 、鱼腥藻属 3 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 ( a n a b a e n a ) 、束丝藻属( a p h a n i z o m e n o n ) 、颤藻属( o s c i l l a t o r i a ) 和节球藻属 ( n o d u l a r i a ) ，是淡水中常见的有潜在危害的藻类。蓝藻毒素多为次生代谢产物，分 为四种( c a r m i c h a e l ：1 9 9 2 ) 神经毒素( n e u r o t o s i n s ) 、肝毒素( h e p a t o t o x i n s ) 、脂多 糖( 1 i p o p o l y s a c c h a r i d e s 。l p s ) 、非专性毒素( n o n s p e c i f i ct o x i n s ) 肝毒素在水华蓝藻 中最常见，主要有微囊藻毒素( m i c r o e y s t i n ，m c ) 、节球藻毒素( n o d u l a r i n ) 和简胞 藻毒素( c y l i n d r o s p e r m o p s i n ) 三种，其中微囊藻毒素分布范围较广，对人类将抗危 害较大。微囊藻毒素是一组七肽单环肝毒素，相对分子量在1 0 0 0 左右( p a r k ，2 0 0 1 ) ， 基本结构是由7 个氨基酸残集组成的环状多肽；多肽组成中氨基酸种类可变，使该 类毒素包含多种不同异构体( 已发现6 0 余种) ，毒性较大的为l r 、r r 和y r 。微 囊藻毒素具有明显的肝细胞毒性，动物经腹腔注射后出现急性中毒现象，症状主要 表现为肝脏肿胀、淤血、肝体比重增加；超微结构观察发现肝细胞骨架破坏，肝脏 出血坏死，并最终引起其死亡。1 9 9 6 年巴西一透析中心，因透析液遭微囊藻毒素污 染，导致1 3 0 名病人中1 1 6 人出现异常症状，并有2 6 人最终死亡( p o u r i a 等，1 9 8 8 ) 我国对蓝藻毒素曾作过相关调查，结果表明南北几个省市的各种水体均有不同程度 的微囊藻毒素污染，其中以沟塘水、河水、水库水较为严重。u w n y 等( 1 9 9 6 ) 认 为微囊藻毒素是引起我国南方肝癌高发的主要危险因素之一。世界卫生组织制定了 引用水中蓝藻毒素的控制标准为1l ag l ( s e 扬才等，2 0 0 4 ) 。 1 2 水华优势藻 水华中占优势地位的藻种，为形成水华的主要藻种。夏季高温条件下，淡水水 体中，水华优势藻多为蓝藻，这与蓝藻的生理生态特点是密切相关的，其中铜绿微 囊藻因能产生肝毒素铜绿微囊藻毒素，紫外抗性，二氧化碳浓缩机制，光饱和点低 光抑制点高及垂直迁移机制等生理特点而经常出现，为研究者关注，常被作为溶藻 细菌筛选指示物。在高n 、p 浓度下，f e 成为浮游生物大量繁殖的限制因素，但蓝 藻可有效竞争低浓度的f e 。另外蓝藻具有二氧化碳浓缩机制( 宋立荣等，2 0 0 1 ) ， 在低浓度的c 0 2 介质中，蓝藻可以通过高效地主动吸收浓缩外源无机碳，在细胞内 积累比介质高几百到几千倍的c 0 2 浓度，由此能够在其所栖息的环境中最大限度地 竞争利用有限的无机碳源，保持持续温度的生长。二氧化碳浓缩机制的有效运转， 还极大地抑制细胞的光呼吸现象，有效地减少了不必要的生物能量耗损。此外，在 4 溶藻细菌7 7 0 s h 、8 0 2 s h 的分离、鉴定及溶藻特性的研究 富营养水体中，因水体较浑浊，会衰减太阳辐射，影响其中的初级生产者的光合同 化作用。但蓝藻具有特殊的三套色素系统，除了叶绿素类色素系统和类胡萝b 色素 系统外，还具有藻胆色素系统，能在弱光下更有效的捕获光能，使蓝藻在低光环境 下也能很好地生长，正常进行放氧光合作用( 李小龙，2 0 0 6 ) 。水华蓝藻还可吸收过 量的、氮、碳等营养，以特殊形式储存在细胞内，一旦周围环境无法满足其营养需 求时，体内储存的营养仍能供给个体增长和种群繁殖，若环境变化不适宜其生长， 还可以形成厚壁孢子、藻殖段或非专性结构的休眠体沉入底泥，待环境适宜时再度 萌发。 1 3 水华控制的现状 1 3 1 水华控制中的物理方法 水华治理的物理方法是利用某些设备、器材在水体中设置特定的安全隔离区， 分离水华水体中的水华藻类或利用机械装置来进行除藻的方法。 1 ) 微滤法 主要是采用微滤机去除水中藻类和浮游动物。微滤机是一种截留细小悬浮物的 筛网过滤装置，多采用孔眼2 0 - 4 0um 的滤网，它对藻类的去除率在4 0 7 0 。这种 方法因操作困难和去除藻类效果不理想，很少被采用。 2 ) 直接过滤 德国的w a h n b a c k 工厂采用独特的三层滤料设计，其直接过滤除藻效率达9 9 9 ( 王占生，2 0 0 1 ) 。直接过滤存在的缺陷在于其没有常规流程中的沉淀所提供的缓冲 作用，因而容易出现水质事故。 3 ) 瀑气除藻 美国w a c h u s e t t 水库的试验表明，瀑气池的除藻效率达9 0 以上。但是，瀑气 除藻产生藻渣难以处理和藻腥味等二次污染。特别是对于北方城市地表水水源来讲， 藻类高发期主要集中在每年5 1 0 月，若将沉淀池改为瀑气池，虽然能实现除藻目的， 但工程投资大。 治理藻类水华的物理方法还包括围隔栅栏、沉箱法、迁移法、回收法、超声波 法、光隔离法、光照射法、电解法等，这些方法简单、不引进二次污染、可防止外 5 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 域生物入侵的优点，适于应急使用，但仅适于浓度较高的水华水体。水华藻类生物 量的去除率受现场影响大，且不能消除有毒藻类死亡后释放出的有毒物质。另外要 求有专门的仪器设备，这样投入成本高且不宜大面积推广。 1 3 2 水华控制中的化学方法 水华治理的化学方法是利用化学产品或者矿物质来抑制、杀死或去除水华生物 的方法。化学方法是目前采用最多、发展最快的一类方法( 俞志明等，1 9 9 3 ) 。化学 方法归纳起来又有以下三大类：直投杀藻、絮凝沉淀和矿物絮凝。 1 ) 直投杀藻 直投杀藻是利用化学试剂直接投放进入水体杀死水华生物的水华治理方法，操 作简单、用量少，是杀灭水华藻类常用的方法之一。2 0 世纪6 0 年代，美国先后尝 试4 7 0 0 多种化学药剂进行海洋水华生物的灭杀试验( a n d e r s o n ，1 9 9 7 ) ，结果只有 很少的药剂有效。且有效药剂存在使用剂量过大和对水生动物非特异性杀灭的不足。 2 0 世纪9 0 年代以来，中国不少科学家也进行了药剂治理水华的研究( 韩应琳，1 9 9 5 ； 田宝珍等，2 0 0 1 ；张珩等，2 0 0 3 a 2 0 0 3 b ) 。硫酸铜是海洋湖沼中最古老的杀菌试剂， 也成为治理水华研究中所最早选用的试剂之一。据报道，硫酸铜杀死裸甲藻的浓度 仅为百万分之一，甚至更少。但铜具有毒性，对其它的动植物有影响，破坏近岸生 态系统，其控制水华是暂时的，不经济。于是人们将注意力转移至一些在水体中易 分解、残量少、污染轻的的氧化物，如高锰酸钾、次氯酸钠、氯气、二氧化氯、过 氧化氢、臭氧、过碳酸钠等，利用这些氧化物的氧化作用破坏藻细胞从而达到去除 水华生物的作用。此外，目前研究较多的是有机除藻剂。可划分为人工化学物质和 天然提取物质两大类。由于前者往往破坏生态环境，故后者是研究者关注的重点， 主要有有机羧酸和有机胺。有机除藻剂具有药力持久，对非水华生物的影响小等优 点，但是速效性差，易受潮、流及扩散等因素的影响，灭杀效果不彻底。 2 ) 絮凝沉淀 絮凝沉淀是通过添加一定量的絮凝剂，使水华生物凝聚、沉淀而去除的方法。 絮凝剂主要有无机絮凝剂和有机高分子絮凝剂，普遍使用的无机絮凝剂有铝和铁的 化合物，主要是利用铝盐和铁盐在水下形成胶体粒子。对水华藻类产生凝聚作用从 而去除藻类。该作用与水体的p h 值有关，一般胶体粒子表面电荷越少，凝聚作用 6 溶藻细菌7 7 0 s h 、8 0 2 s h 的分离、鉴定及溶藻特性的研究 越强。如用水合氧化铝制成不同晶形的氧化铝溶胶聚合体，则对水华生物有极强的 凝聚作用。加入该聚合体l m i n 后，水华藻类失去游动能力；3 0 m i n 后，9 0 的细胞 被凝聚沉淀。铁盐也有类似性质。相对而言，有机高分子絮凝剂在水华治理中的应 用较少。 曹西华等( 2 0 0 1 ) 认为具有一定链长的有机高分子絮凝剂，如高密度电荷阳离 子聚电解质一聚丙烯酞胺一丙烯酸b 羟基丙酯基三甲基氯化铵，以及一些阳离子天 然改性高分子絮凝剂，如羟丙基三甲基氯化铵基壳聚糖和n ，n ，n 一三甲基壳聚糖季 铵盐在水华防治上有应用潜力很大。此外，无机絮凝剂对去除细微悬浮胶体粒子较 为有效，但生成絮体大小有限，而有机高分子絮凝剂具有良好的絮体化机能，两者 若能混合使用，取长补短可收到更好的凝聚效果( 陈立丰等，1 9 9 7 ) 。如果这一原理 适用于水华治理中，则将为开发絮凝剂治理水华提供了一个新方向( 曹西华等， 2 0 0 1 ) 。凝剂沉淀法是利用化学手段消除水华生物的又一重要途径。该方法在水华生 物密集时极为有效，它消除水华生物所需时间短，对非水华生物影响也较直投杀藻 小，同时可消除水体其他悬浮物，但存在二次污染和成本高的缺点。7 0 年代以来， 人们利用天然矿物作为凝聚剂凝聚水华生物。 3 ) 矿物絮凝 利用粘土治理水华具有很多优点：对生物和环境无害，有促进生态系统的物质 循环和净化作用；粘土资源丰富，且是底栖生物和鱼贝类幼仔的饵料，操作简便易 行，可以大范围使用。利用粘土矿物絮凝水华生物，抑制有害水华的发生是目前比 较合理的水华治理方法( a n d e r s o n ，1 9 9 7 ) 。我国从上世纪八十年代末开始进行粘土矿 物治理水华方面的生理生态效应及作用机理研究。陈慈美等( 1 9 8 9 ) 在试验室模拟 探讨了蒙脱土- - c a ( o h ) 2 对河口区水华生物的抑制效应及其机制，结果表明，适量 的蒙脱土- - c a ( o h ) 2 对抑制浮游藻种爆发性增殖有明显的效应。俞志明等( 1 9 9 4 a ) 对粘土矿物治理水华展开了一系列的工作，探讨了粘土颗粒絮凝水华生物细胞的能 力及其影响因子，分析了粘土颗粒对水华生物絮凝作用机制，并通过试验发现高岭 土中的某些种类具有比蒙脱土更高的絮凝水华生物的能力。除粘土外，具有相似性 质的其它矿物也可用作水华生物的凝聚剂，如硅酸和硅酸盐凝聚可沉淀水华生物， 水铝英石和腐殖酸可强力凝聚水华生物。 4 ) 以上化学方法的改进 许多研究者对各种化学方法进行了改进。尹平河等( 2 0 0 1 ) 为了充分发挥c u s 0 4 7 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 杀藻的效率，克服药效时间短等缺点，将具有一定可溶性的掺铜玻璃微粒( t b ) 用 于对水华藻的去除试验。结果表明，在水体中t b 可缓释并维持微量c u 2 + 浓度去除 水华藻，药效时间得以延续。作者进一步在t b 中添加一定量的a 9 2 0 ，发现a 9 2 0 的引入可以减少除藻材料中c u s 0 4 的用量。梁想等( 2 0 0 1 ) 制备了海带、洋栖菜、 甲壳素、壳聚糖等生物载体，探讨了其吸附水溶液中的c u 2 + 后对水华生物的杀灭和 控制作用。结果表明，海带和壳聚糖对c u 2 + 的吸附能力较强，脱附的c u 2 + 对海洋原 甲藻有较强的抑制和杀灭作用。 利用粘土微粒絮凝水华生物控制水华是目前常用的方法。但粘土溶胶性能差， 须大量撒播，带来了粘土絮凝剂大量悬浮，及海底淤渣量过大的问题。针对该不足， 国内外许多学者进行了大量的粘土改性研究。俞志明等( 1 9 9 4 b ) 建立了粘土表面改 性对絮凝作用影响的理论模型，认为改变粘土颗粒的表面性质是提高絮凝能力的主 要途径，提出在粘土中引入p a c s ( 聚羟基氯化铝) 的改性方法。研究结果表明改 性后粘土对微型原甲藻( p r o r o c e n t r u mm i n i m u m ) 的去除率达9 0 以上时所需粘土 的用量由原来2 9 ，l 降至0 8 9 l , 对虾池混合藻的总去除率可达9 1 4 ，对新月菱形 藻、裸甲藻、三角褐指藻等单藻的去除率分别达到了9 5 2 ，8 2 9 ，9 5 1 ( 李全生等， 1 9 9 8 ) 。孙晓霞等( 1 9 9 9 ) 根据该理论模型，提出在粘土中引入m a h ( 混合金属层 状氢氧化物正电胶体) 的改性方法，用，结果表明改性粘土对水华异湾藻( h e t e r o s i g m a a k a s h i w o ) 和新月菱形藻( n i t z c h i a c l o s t e r i u m ) 的絮凝去除作用都得到了提高。同时， 俞志明等( 1 9 9 9 ) 利用“插入技术，以蒙脱土为材料制各了阳离子粘土。对水华 异弯藻( h a k a s h i w o ) 的絮凝去除作用增强了5 1 0 倍。曹西华等( 2 0 0 3 ) ) 发现有机 改性粘土提高絮凝能力，且无明显的生态负效应，比无机改性粘土更好的应用前景。 1 3 3 水华控制中的生物方法 物理和化学方法在特定的条件下有一定的作用，但耗时、耗能、经济成本高， 难彻底解决水华问题，基于现代生态环保理念，研究者将目光投向了水华的生物防 治技术。水华控制中的生物方法是利用藻类的天敌及其产生的抑藻物质抑制藻类生 长、繁殖，控制藻类数量、防治富营养化带来的危害。生物方法治理水华具有方法 简单、不易引起污染等优点，按作用方式分为以下几种类型。 1 ) 利用摄食作用去除水华藻类 8 溶藻细菌7 7 0 s h 、8 0 2 s h 的分离、鉴定及溶藻特性的研究 淡水藻类，通常为浮游动物和一些滤食性动物的直接饵料，也是其它水生动物 的直接或间接食物。可根据食物链的关系，引入摄食水华藻类的其它动物( 如纤毛 虫) ，通过捕食抑制或消灭水华生物。t a k e d a 等( 1 9 9 4 ) 在水华水体中放入滤食性动 物m y t i l u se d u l i sg a l l o p r o v i n c i a l i s ，发现该贻贝体内能有效地保留大于4l am 的食物 颗粒，且颗粒体内滞留速率随浮游植物浓度正相关，可通过贻贝的滞留作用去除水 华水体中的浮游植物，另其排泄物含有大量未被吸收的有机质，能快速沉积于海底， 为底栖海参s t i c h o p u s j a p o n i c u s 所利用。 但该方法存在藻毒素在食物链中富集，不适合用于有毒藻类水华的治理。 2 ) 利用拮抗作用抑制水华藻类 大型植物对微藻以及不同微藻间水体中存有拮抗作用，通过竞争营养盐、光照， 或分泌化学物质来抑制微藻的生长( h a s l e r 等，1 9 4 9 ；v a nd o n k 等，1 9 9 3 ；h o g e t s u 等，1 9 6 0 ；s u z u k i 等，1 9 9 8 ；l e e 等，2 0 0 0 ；j e o n g 等，2 0 0 0 ；俞子文等，1 9 9 9 ) 。c h o 等( 1 9 9 9 ) 将2 7 种海草的甲醇提取物用于抑藻试验，发现海草i s h i g e f o l i a c e a 和 s a r g a s s u ms a g a m i a n u m 的提取液能抑制微藻i s o c h r y s i sg a l b a n a 的生长。j e o n g 等 ( 2 0 0 0 ) 发现海草c o r a l l i n a p i l u l i f e r a ，u l v a p e r t u s a ，l s h i g e f o l i a c e 和e n d a r a c h n e b i n g h a m i a e 的甲醇提取物能抑制有害微藻c o c h l o d i n i u m p o l y k r i k o i d e s 的生长。其中， 海草c p i l u l i f e r a 的水溶物、干粉和干细胞组织都能抑制微藻c p o l y k r i k o i d e s 的生长， 且抑藻活性物质稳定性好，沸水、光照或强碱处理后仍不丢失抑藻活性。 俞子文等( 1 9 9 9 ) 研究表明水葫芦( e i c h h o m i ac r a s s i p e s ) 可通过向水体中分泌某 些化学物质限制藻类的生长。叶居新等( 1 9 9 9 ) 研究表明，植培石营蒲( a c o r u s t a t a r i n o w i i ) 的水培养藻类，可破坏藻类的叶绿素，降低其光合速率、细胞还原t t c 能力，荧光显微镜下观察藻细胞从鲜红色变为淡蓝色。说明石葛蒲对藻类克制效果，。 石营蒲抑制藻类的途径除对光和矿质营养竞争外，主要是其根系向水体中分泌的化 学抑藻物质的作用。k i m 等( 2 0 0 0 ) 发现水葫芦( w a t e rh y a c i n t h s ) 的根、茎、叶通 过吸附、沉降、呼吸等作用降低藻密度。还有不少研究人员报道了大麦秸杆对藻类 生长的抑制作用，腐烂的大麦秸杆提取液较低浓度就对藻类有较强抑制作用( w e l c h 等，1 9 9 0 ；r i d g e 等，1 9 9 6 ；g i b s o n e t 等，1 9 9 0 ；m a r t i n 等，1 9 9 9 ) 。p i l l i n g e r ( 1 9 9 2 ) 推断 真菌对大麦杆的降解程中产生了抑藻物质，r i d g e 等( 1 9 9 6 ) 则认为氧化的木质素是 抑藻因子。利用植物的拮抗作用控制微藻仅限于淡水生态系统( j e o n g 等，2 0 0 0 ；j i n 等，2 0 0 3 ) 。 9 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 s u z u k i 等( 1 9 9 8 ) 的研究表明l i t h o p h y l l u ms p p 的乙醇萃取相抑制水华异湾藻 ( h e t e r o s i g m aa k a s h i w oh a d a ) 等微藻的生长。n a k a i 等( 2 0 0 0 ) 发现两种大型藻 ( c a b o m b ac a r o l i n i a n a ，m y r i o p h y l l u ms p i c a t u m ) 对蓝藻( m i c r o c y s i sa e r u g i n o s a ， a n a b a e n a f l a s a q u a e ，p h o r m i d i u m t e n u e ) 生长有抑制作用，其中穗花狐尾藻 ( m y r i o p h y l l u ms p i c a t u m ) 通过释放活性物质抑制微藻生长；抑藻物质的分离提纯表 明为水溶性多酚类物质。j i n 等( 2 0 0 3 ) 报道了大型藻孔石药( u l v a p e r t u s a ) 在与水 华异湾藻( h e t e r o s i g m a a k a s h i w o ) 和塔玛亚历山大藻( a d e x a n d i u mt a m a r e n s e ) 共培 养时能抑制这两种海洋微藻的生长，而且证明抑藻作用是因为大型藻孔石药( u l v a p e r t u s a ) 在生长过程中产生了抑藻物质所致。另外也有微藻间的作用关系研究， k a j i w a r a 等( 1 9 9 2 ) 研究发现长崎裸甲藻( g y m n o d i n i u mn a g a s a k j e n s e ) 能分泌挥发 性物质，浓度在5 m g m l 时就使微藻h e t e r o s i g r m a a k a s h i w o ，c h a u o n e l 肠m a r i n a 和 c h a t t o n e l l aa n 砌u a 细胞破裂。p r a t t ( 1 9 6 6 ) 进行了中肋骨条藻( s k e 跆t o n e m ac o s t a t u m ) 和金黄滑盘藻( o l i s t h o d i s c u sl u t e u s ) 的互作试验，发现前者的滤液促进后者增殖， 而后者的滤液却障碍前者的增殖。张冬鹏等( 2 0 0 0 ) 研究表明甲藻链状亚历山大藻 ( a l e x a n d r i u mc a t e n e l l a ) 和锥状施克里普藻( s c d p p s 据l l at r o c h o i d e a ) 的存在能促进 硅藻拟菱形藻( p s e u d o n i t z s c h i as p ) 的增殖，而后者能抑制前两种甲藻的生长。 n a g a y a m a 等( 2 0 0 3 ) 发现褐藻e c k l o n i ak u r o m e 的乳酸乙脂萃取物对水华生物 ( k a r e n i am i k i n o t o i ，c o c h l o d i n i u mp o l y k r i k o i d e 和c h a t t o n e l l aa l l 咖u a ) 有灭杀作用， 粗产物以1 5 0 m g l 浓度作用藻细胞，3 0 m i n 内使前两种微藻细胞密度降至初始密度 的2 以下。显微观察，藻细胞首先丧失运动性，随后细胞膨大，最后溶解破碎。对 于微藻c a n 咖u a ，即使在5 0 0 m g m l 作用3 h ，该细胞的心态也不发生变化。但 1 0 0 m g m l 作用2 4 h 可使该藻细胞溶解消失。 利用拮抗作用，调节水体中的微藻种类和数量，可能达到预防水华的目的。 3 ) 利用微生物抑制有害藻类的生长 一些真菌可释放抗生素类物质抑制藻类生长，如青霉菌分泌的青霉素对藻类有 很强的毒性，浓度达到0 0 2pi m i ，时，就足以抑制组囊藻( a n a c y s t i sn i d u l a n s ) 的 生长( k u m a r ，1 9 6 4 ) 。j e r k i n s 等( 1 9 9 8 ) 从一种还未鉴定的丝状真菌中提取了三种 能抑制海洋微藻生长的物质。v a n d o n k 等( 1 9 8 3 ) 发现浮游接根壶菌z y g o r h i z i d i u m p l a n k t o n i c u m 对美丽星杆藻( a s t e r i o n e l l a f o r m o s a ) 有寄生溶藻作用。适宜的环境条 件下可使该藻引起的水华消失。 1 0 溶藻细菌7 7 0 s h 、8 0 2 s h 的分离、鉴定及溶藻特性的研究 病毒或病毒类粒子( v l p s ) 广泛存在于各种水环境中。p r o c t o r 等( 1 9 9 0 ) 认为 病毒或病毒粒子( vl p s ) 通过溶解藻细胞导致微藻群落的消亡，是海洋生态系统潜 在的调节因子。目前，关于海水中病毒溶藻有不少报道( b r a t b a k 等，1 9 9 3 ；c o t t r e l l 等，1 9 9 5 ；p r o c t o r 等。1 9 9 0 ) 。f u h r m a n ( 1 9 9 9 ) 指出，病毒在海水表层的浓度高达 1 0 1 0 c e l l l 时，造成宿主蓝藻的高致死率，可能在浮游生物群落演替中有重要作用。 淡水环境中亦有不少病毒能抑制蓝藻生长( c a n n o n 等，1 9 7 1 ；d e f t 等，1 9 7 1 ；p a d a n 等， 1 9 6 7 ) 。1 9 8 5 年以来每年夏季，美国纽约罗德岛( r h l d ei s l a n d ) 附近的海湾都发生 金藻( a u r e o c o c c u s a n o p h a g e f f e r e n s ) 水华，高峰期时能达到1 0 9 c e l l m l ，但总会突 然消失。研究发现水华的消失，是由于藻细胞中出现了大量的病毒，该病毒能在藻 细胞中繁殖，很快将整片水华藻类溶解。有些病毒或v l p s 有宿主专一性，可特异 性地感染亲缘关系近邻的藻类( m u l l e r 等，1 9 9 3 ) 。n a g a s a k 等( 1 9 9 9 ) 的研究也发 现水华异湾藻病毒( h e t e r o s i g m a a k a s h i w o v i r u s , h a v ) 的纯系0 1 ( h a v 0 1 ) 能专一去 除水华异湾藻h9 3 6 1 6 。 在水生生态系统中，细菌对藻类的影响主要体现在，一方面细菌吸收藻类产生 的有机物质，并为藻类的生长提供营养盐和必要的生长因子，从而调节藻类的生长； 另一方面，细菌也可以通过直接和间接作用抑制藻类的生长，甚至裂解藻细胞。 1 3 4 溶藻细菌的研究进展 溶藻细菌( a l g a e l y s i n gb a c t e r i a ) 是指：通过直接或间接方式，抑制藻类生长杀 死藻类、溶解藻细胞的细菌。它们作为水生生态系统生物种群结构和功能的重要组 成部分，对维持藻的生物量平衡具有非常重要的作用。溶藻细菌一般从湖泊水体直 接分离，具有很好的生态安全性，适合在水华发生初期使用，短期内即可控制藻类 生物量，势必成为水华生物防治的一个重要手段。溶藻细菌的作用方式一般可分为 下列2 种情况：一，直接溶藻，即直接进攻宿主，细菌与藻细胞直接接触，甚至侵 入藻细胞内；二，间接溶藻，细菌同藻竞争有限营养或通过分泌胞外物质而溶藻。 1 ) 直接溶藻 粘细菌是最早被报道的溶藻细菌。s h i l o ( 1 9 7 0 ) 将几株分离至水塘的粘细菌用 于微藻抑制试验，结果表明测试的1 0 种蓝藻中有8 种被溶解，其中包括单细胞的组 囊藻( a n a c y s t i sn i d u l a n s ，c o c c o c h l o r i s p e n y o c y s t i s ) 和丝状的念珠藻( n o s t o cs p ) ， 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 织线藻( p l e c t o n e m ab o r y a n u m ) ，颤藻( o s c i l l a l o r i a p r o l i f e r a ) ，钝顶螺旋藻( s p i r u l i n a p l a t e n s i s ) 及螺旋藻( s t e n u i s ) 。电子显微镜下观察发现粘细菌快速滑向宿主细胞， 并用极尖( p o l 孤t i p ) 紧紧与细胞联接，宿主细胞在2 0 r a i n 后被溶解。随后，细菌转 向附近的细胞并将其溶解。作者推测细菌与藻细胞接触时可能分泌了某些纤维素酶 消化宿主的细胞壁达到溶藻目的。d a f t 等( 1 9 7 5 ) 从废水中分离出9 株粘细菌，能 溶解鱼腥藻( a n a b a e n a ) ，束丝藻( a p h a n i z o m e n o n ) ，微囊藻( m i c r o c y s t i s ) 及颤藻 ( o s c i l l a t o r i a ) 等不少种属的藻细胞。李勤生等( 1 9 8 1 ) 也报道过粘细菌同蓝藻细 胞相互接触，导致藻细胞溶解的试验研究。m i t s u t a n i 等( 1 9 9 2 ) 研究表明噬胞菌 c y t o p h a g as p a s y 的培养物对硅藻( s k e d e t o n e m ac o s t a t u m a ) 的生长有抑制作用， 但无菌滤液则无抑制作用。i m a i 等( 1 9 9 3