（发酵工程专业论文）竹黄菌发酵产竹红菌素的研究.pdf

摘要 摘要 竹黄是我国民间药用真菌，其主要生物活性成分为竹红菌素。本文筛选到一株产竹 红菌素的竹黄菌株并对其进行了鉴定，然后围绕其色素组成成分鉴定、固态发酵产色素 条件和产色素的生理特征展开了研究，得到了如下主要结果： 1 ) 采用p d a 平板筛选到一株产竹红菌素的竹黄菌株，命名为s u p e r h 1 6 8 。通过 分子生物学鉴定，确认该菌株隶属于竹黄属( s h i r a i a ) 。r d n a 聚类分析表明，该菌株与 g e n b a n k 中已经提交的竹黄菌( s h i r a i ab a m b u s i c o l a ) 序列相似度分别为9 1 ( 1 8 sr d n a ) 和8 8 ( i t s 5 8 sr d n a ) 。在无性世代的菌丝上发现了较小的分生孢子器( 3 5 岬 1 0 - - - 2 0i m a ) 和分生孢子( 一般 1i n n ) ，之前的文献中未曾有报道。对发酵菌丝的组成 成分研究表明，其营养组分与子座差异较大，但竹红菌素含量接近。 2 ) 利用制备反相高效液相色谱法，对竹黄菌株s u p e r - h 1 6 8 固态条件下所产的色 素进行了分离，发现固态发酵条件下所获得的色素有6 个主要组分，采用n m r ( 1 hn m r 及”cn m r ) 及质谱法对其中的4 种组分进行了鉴定。结果表明，这4 种组分分别为竹 红菌甲素( h a ) 、竹红菌乙素( h b ) 、竹红菌丙素( h c ) 和痂囊腔菌素c ( e c ) 。其中 e c 为首次从竹黄中分离到。 3 ) 竹黄菌株s u p e r h 1 6 8 生长需要较充足的营养条件，在营养贫乏的固态基质( 如 米糠、甘蔗渣、锯末、竹屑、秸秆、橘皮和玉米芯等) 上几乎不生长。色素产生需要合 适的基质，主要是淀粉含量高的些谷物( 如大米、小米、小麦、黑米、玉米、高粱和 荞麦等) 及某些副产品( 如麸皮) 。利用大豆及豆粕作为基质时，菌体生长良好，但无 色素生成。色素的产生与基质的淀粉蛋白比值( s p ) 有很大关系，只有当s p 大于1 4 时才会产生色素。此外，色素各组分百分含量还受到发酵基质的影响，其中h a 是色素 的主要组分( 通常超过4 0 ) ，以小米和高粱为基质时菌株不产h b 。研究表明，发酵基 质中淀粉酶活力和蛋白酶活力均比较低。淀粉酶活力和还原糖含量变化非常一致，在一 定时间内可以反映菌体量的变化。但两种酶与菌体产色素无直接关系。 4 ) 以玉米渣作为固态发酵基质，采用2 5 0m l 三角瓶进行固态发酵实验。首先通过 单因素法对固态基质产色素条件进行了初步优化，然后通过响应面设计对培养基进一步 优化，最后获得的优化培养基为：玉米渣( 粒径1 0 一- , 1 2m m ) 2 5g 、麸皮5g 、初始含 水量5 0 、初始p h7 0 ，n a n 0 30 2 6 1g 、z n s 0 4 7 h 2 00 0 5 4g 、葡萄糖1 5g ，培养温 度3 0 ，相对湿度为8 0 9 0 ，发酵周期18d 。在此条件下色素产量为1 4 0 8m g g 干基，约为优化前的2 倍。实验还发现氮源的种类和添加量对色素的产生有着极为明显 的影响。在一定范围内，无机氮源中的n a n 0 3 及有机氮源中的牛肉膏、酵母膏有利于 色素的产生，而无机氮源中的尿素和某些铵盐( ( n 地) 2 s 0 4 、n h 4 c 1 和n h 4 n 0 3 等) 及有机 氮源中蛋白胨对色素的合成具有强烈抑制作用。金属离子对色素的合成也有一定影响： z n 2 + 、n 矿及k + 利于色素产生，m n 2 + 则有抑制作用。根据固态发酵过程数据，构建了菌 体生长、色素合成和底物( 残糖) 消耗动力学模型。 5 ) 采用液态发酵的方法，对菌体产色素过程中的生理特征进行了研究，发现菌体 摘要 在产色素时氧化水平较高( 丙二醛含量升高) ，这表明菌体在产色素时受到了色素的氧 化胁迫作用。总抗氧化力变化比较小，说明菌体启动了抗氧化机制维持了胞内及胞外氧 化还原水平的平衡。研究发现，在发酵2 4h 左右加入终浓度4 0l m a o l l 的过氧化氢可 以促进色素的产生，一定强度的光照( 4 0i x e m 2 s ) 也可以促进平板培养和液态发酵条 件下色素的合成。上述结果说明色素对菌体的氧化胁迫作用可促进色素的分泌，属于一 种正反馈机制。 关键词：竹红菌素：结构；固态发酵；优化；氧化胁迫；竹黄 u a b s t r a c t a b s t r a c t s t r o m a t ao fs h i r a i ab a m b u s i c o l aw e r eu s e da sf o l kd r u gi nc h i n a , a n dt h em a i na c t i v e c h e m i c a l so ft h e mw e r eh y p o c r e u i n s i nt h i ss t u d y , ah y p o c r e l l i n - p r o d u c i n gs t r a i nw a s i s o l a t e da n di d e n t i f i e da ss h i r a i as p t h em a i nc o m p o n e n t so ft h ep i g m e n t sw e r ei s o l a t e da n d i d e n t i f i e d p i g m e n t - p r o d u c i n g c o n d i t i o n so fs o l i d - s t a t ef e r m e n t a t i o na n d p h y s i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c so ft h es t r a i nw e r ea l s oi n v e s t i g a t e d t h er e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 ) ah y p o c r e l l i n - p r o d u c i n gs t r a i nn a m e ds u p e r - h 16 8w a si s o l a t e du s i n gp d a p l a t e s ，a n d i d e n t i f i e dw i t hm o l e c u l a rb i o l o g i c a lm e t h o d s ( 18 sr d n aa n di t s 5 8 sr d n a ) a c c o r d i n gt o t h er e s u l t so f c l u s t e ra n a l y s i s ( 9 1 a n d8 8 s u p p o r t e d 谢t 1 1sb a m b u s i c o l a ，r e s p e c t i v e l y ) ，t h e s t r a i nw a sp r o v e dt ob e l o n gt ot h eg e n u ss h i r a i a s m a l lp y c n i d i a ( 3 - 5 i lxl0 2 0 岬) a n d c o n i d i a ( 9 9 ) ；其他实验试剂均购自上海医 药集团公司，普通试剂为分析纯；高效液相色谱( h p l c ) 试剂均为色谱纯，购自江苏 汉邦科技有限公司。 2 2 4 培养基 p d a 培养基( g l ) ：土豆2 0 0 ，葡萄糖2 0 ，琼脂2 0 ，p h 自然。 江南大学博士学位论文 p d a 斜面培养基( g l ) ：土豆1 0 0 ，葡萄糖1 0 ，琼脂2 0 ，p h 自然。 液态发酵产色素培养基( g l ) ：葡萄糖2 7 ，牛肉膏3 ，k 2 h _ p 0 41 ， k c lo 5 ， m g s 0 4 7 h 2 00 5 ，f e s 0 4 7 h 2 00 0 1 ，调p h6 0 。 固态发酵产色素培养基：大米3 0g ，无机盐溶液2 5m l ( 其中1 l 中含k 2 h p 0 41g 、 k c l0 5g 、m g s 0 4 7 h 2 0o 5g 、f e s 0 4 7 h 2 00 0 1g ) ，1 2 1 灭菌3 0m i n 。 2 2 5 孢子悬液的制备 将培养7d 的p d a 斜面用无菌水( 含o 1 t w e e n 8 0 ) 将孢子洗下并配制成1 0 6 个m l 的孢子悬液。本实验接种量均为1m l 。 2 3 方法 2 3 1 菌株的筛选 新鲜竹黄子座( 包括与之相连的一段枝干) 首先用0 1 h g c l 2 消毒3m i n 后用小刀 切成很小的组织碎块( 大约2 x 2m m ) ，用3 次氯酸钠溶液浸泡3 5m i n ，再在7 0 乙 醇中研磨3 0s ，无菌水冲洗后晾干，置p d a 平板上于2 6 培养并挑选产红色素的菌落， 提取色素后分析其是否为花醌类色素。 2 3 2 菌株的生物学特征研究 2 3 2 1 形态特征 菌株的菌丝、分生孢子和分生孢子器用光学显微镜( 石碳酸棉蓝染色) 和扫描电 镜观察并拍照。作为对比，对野生竹黄子座中的分生孢子和茵丝也进行了观察。 2 3 2 2 培养温度对菌落形态及产色素的影响 将接种孢子块的p d a 平板分别在2 2 、2 4 、2 6 、2 8 、3 0 、3 2 、3 4 条件下培养3d ， 观察菌落形态和色素的产生情况。 2 3 2 3 生孢时间研究 将接种孢子块的p d a 平板在3 0 条件下进行培养，从第2d 起对菌丝进行显微观 察并拍照。 2 3 2 4 湿度对竹黄菌株s u p e r h 1 6 8 的影响 将接种孢子块的p d a 平板分别在相对湿度为5 0 、6 0 、7 0 、8 0 、9 0 条件下 培养4d ，观察菌落形态和色素产生情况。 2 3 2 5 发酵培养方式的选择 液态发酵条件：采用2 5 0m l 三角瓶，装液量5 0m l ，接种量1m l 孢子悬液，于 3 0 * c ，1 5 0r p m 下培养7 2h 。固态发酵条件：接种量lm l 孢子悬液，拌匀后于3 0 。c 黑 暗培养2 1d 。 2 3 3 分子生物学鉴定 竹黄菌株用摇瓶( 5 0m l 2 5 0m l ) 发酵4 8h ( 2 6 。c ，1 5 0r p m ) ，1 0 ，0 0 0g 冷冻离心 1 0m i n ，收集新鲜菌丝体。 2 3 3 1d n a 的提取 总d n a 提取方法按照y l i m a t t i l a 等( 19 9 6 ) 和p a a v a n e n h u h t a l a 等( 19 9 9 ) 所提 供的方法进行【9 3 , 9 4 1 。 1 2 第二章产竹红菌素竹黄菌株的筛选及组成成分分析 2 3 3 2r d n a 扩增及序列分析 1 8 sr d n a 以及i t s 5 8 sr d n a 采用通用引物扩增。二者的引物序列分别是n s l ( 5 - g t a g tc a t a tg c t t gt c t c 3 ) n s 8 ( 5 - t c c g ca g g t tc a c c ta c g g a - 3 ) 和 i t s 5 ( 5 - g g a a gt a a a a g t c g ta a c a ag g 一3 ) i t s 4 ( 5 - t c c t cc g c t ta t t g a t a t g c 37 ) 一引。其中i t s 5 i t s 4 扩增片段包括部分1 8 sr d n a ，i t s l 和i t s 2 ，5 8 sr d n a 全长及2 8 sr d n a 一部分。1 8 sr d n a 和i t s 5 8 sr d n a 用u l t r a c l e a np c r c l e a n u pk i t 纯 化，并由上海生工测序。所得1 8 sr d n a 和i t s 5 8 sr d n a 序列通过b l a s t ( h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v b l a s t ) 寻找相似序列以进行同源分析。多序列比对采用 c l u s t a lw ( v1 8 3 ) ，用b i o e d i t ( v7 0 1 ) 进行序列调整。进化树用m e g a 软件( v3 1 ) 采用邻位相连法( n e i g h b o r - j o i n i n g ，n j ) 构建( k i m u r a2 - p a r a m e t e rd i s t a n c ec a l c u l a t i o n ) ， 1 0 0 0 次b o o t s t r a p 检验。以l e w i ai n f e c t o r i a 和d o t h i d e ai n s c u l p t a 作为构树外群。 2 3 4 色素制备 在大米固态发酵培养基中接入1m l 孢子悬液，在2 5 0m l 三角瓶中拌匀后于2 6 c 黑暗培养1 8d ，6 0 。c 烘干，研成粉木并过8 0 目筛，用丙酮提取其中的色素。提取液经 真空旋转蒸发获得黑色粘稠浸膏用于检测。 2 3 5h a 鉴定 h a 是竹红菌素代表性成分。通过颜色反应可以快速检测到花醌类化合物的存在， 但是否为竹红菌素还需要进一步确认。将色素浸膏复溶于甲醇并进行r p h p l c 检测， 以h a 标准品作为对照，对比其保留时间。子座中的色素也一起并行处理进行分析。h p l c 系统采用反相c 1 8 分析柱( h e d e r a o d s 2 ，2 5 0m m x 4 61 1 1 1 1 1 ，5r t m ) 。流动相为c h l o h ： 水( 7 2 ：2 8 ) ，进样量5 0 此，流速1m l m i n ，柱温3 0 。c ，于3 0 0n l n 检测光吸收。将与 h a 标准品保留时间相同的峰进行收集，并用e s i m s ( 离子模式，e s i ；电子能量，7 0 e v ： 离子源温度，2 0 0 。c ；接口温度，2 8 0 。c ) 和d a d 连续波长扫描( 2 0 0 - - 6 5 0n m ) 分析。 2 3 6 发酵茵丝与子座组分比较 2 3 6 1 常规成分分析 包括水分、灰分、粗脂肪、粗蛋白、粗纤维、还原糖等。上述指标测定参考文献 9 6 】 进行。 2 3 6 2 总氨基酸分析 总氨基酸测定采用氨基酸自动分析仪测定。因被酸水解，色氨酸未能检出。 2 3 6 3 脂肪酸成分分析 脂肪酸组分采用气相色谱法进行测定。 2 3 6 4 无机元素分析 无机元素采用火焰原子吸收法测定。 2 3 6 5 色素含量测定 竹红菌素总量按照文献【9 7 】进行测定：将竹红菌甲素标准品溶解于丙酮中配制成不 同的浓度梯度于4 6 5n l t i 下比色，建立标准曲线后测定样品中的色素含量。 2 3 6 6 甘露醇含量测定 扛m 大学博学位论i 参考药典2 0 0 5 版测定。 2 367 麦角固醇含量测定 按照文献 9 8 1 的方法进行。 2 4 结果 2 4 1 产菲琨类色素茵株的筛选 2 4 1 1 产红色素的菌株形态特征 根据菌落形态特征，实验共筛选出4 5 3 株不同菌株，其中产红色素的菌株有1 3 株， 其中一株所产色素颜色反应呈阳性( 筛出序号为1 6 8 ，命名为s u p e r h 1 6 8 。见图2 - 1 及表2 1 ) 。 表2 - 1 产红色素的菌株( 4 d ，2 6 ) t a b2 - ir e d p i m e m p r o d u c i n gs u a i m i s o l a t e d f r o m t h e m a t e r i a l s ( 4 d 2 6 x 2 ) 编号 筛选序号茁落特征 i 2 1苗落直径4 2e m 苗落背面紫红色。气生菌丝向色樯醢。颜色反应阴性 26 7 菌落直径21c m ，苗落背面红色气生卣丝白色，密集。颜色反向阴性 31 0 3 苗落直径3 0c m 苗落背面浅红色，气生苗丝黄白色，密集。颜色反麻阴性 4 1 6 8 茁落直径3 8c m ，苗落背面裸红色，气生凿丝白色，较稀蒇。颜色反麻目i 性 52 1 2 苗落直径3 3g i l l 苗落背面红褐色气生菌丝白色密集。颜色反应阴性 6 2 15 菌落直径2 8c m ，菌落背面红色气生苗丝白色，驶稀疏。颜色反席阴性 7 2 7 9 苗落直径2 9c m ，菌落背面檄红，气生苗丝白色，密集。颜色反麻阴性 83 2 4 茁落直径3 3 c m 苗落背面中心处徽红色气生茁丝白色中心密集，突起。颜色反应阴性 93 5 7 菌落直往4 | 0c m 茁落背面紫褐色。气生苗丝白色密集。颤色反应明性 1 03 7 2 苗落直径3 , 4c m ，苗落背面血红色，气生茁丝白色，密集。颜色反麻阴性 l i3 9 6 菌落直径l2c m 菌落背面浅红色，气生苗丝白色，密集。颜色反应阴性 1 24 0 2 苗落直径19c m ，茁落背面微红，中心较深，气生苗丝白色，密集。颜色反应阴性 1 34 1 l 菌落直径2 4c m ，苗落背面 戋红色，有黄色同心蹦，气生茁丝黄自色，密集。颜色反麻阴性 表示刚性反应菌株，命名为s u p e r - h 1 6 8 24i 2 菌株s u p e r - h 1 6 8 的形态及色素鉴定 菌株在p d a 平板上的形态及分泌色素所产生的颜色反应如图2 1 所示。 翮 图2 - l 产竹红菌素茵株s h i r a i as ps u p e r - h 1 6 8 ( a 茵落形态：b 色素麒色反应( 1f c c i “2 h c i ，3 n a o h ) ：c 色素可见光谱扫描围龇丙酮) ) f i g 2 - 1 t h eh y p o e r e l l i n - p r o d u e i n g s t r a i n s h i r a i as ps u p e r - h 1 6 8 a c l o n y m o r p h o l o g y ；b c o l o rr e a c t i o n ( 1f e c l 3 ，2 h c i ，3 n a o h ) ：c t h e v i s i b l ea b s o r b i n g e o f t h e t o t a l # g m e n b f i n a e e t o r e ) ) 1 4 第二章产竹“菌素竹黄菌株的筛选及组成成丹分析 在2 6 条件下培养4d 后，菌落直径平均为3 8c m ，气生菌丝白色绒毛状，中心较 高且密，基内菌丝分泌红色素，可将培养基染为红色。该色素易溶解在氯仿、丙酮及乙 醇中，不溶于水，芤醌类色素颜色特征反应阳性( 图2 - 1 ) 。菌体所产色素在4 6 5n m 附 近有最大光吸收。 2 4 2 菌株s u p e r - h 1 6 8 的生耪学特征 2 4 2 i 形态结构 野生竹黄及其菌丝、分生孢子形态见图2 - 2 ；菌株s u p e r - h 1 6 8 的形态结构见图2 - 3 。 图2 - 2 野生竹黄子座形态结构 ( a 野生竹黄子座；b 子座中的茸筮( 2 5 0 0 ) ：c 子座中的舟生孢子( 1 6 0 0 x ) ) r i g 2 - 2 t h e m o r p h o l 删s u l l c u i f e o f t h es t r o m a 扭o r s b a m b 淞i c o l a ( as u o m a t a o f s b w n b u s t c o l a ；b m y c e f i a i n t h es t r o m a t a ( 2 5 0 0 x ) ；c c o n i d i a i n t h es 。f f o m a t a ( 1 6 0 0 x ) ) 田2 - 3 竹黄茼株s u p e r - h 1 6 8 结构现察 ( a 有隔菌丝( 2 4 0 0 ) ；b 正在释被孢子的分生孢子嚣( 1 0 0 0 x ) ；c 分生袍子嚣( 2 4 0 0 ) ；d 分生孢干 嚣中的小分生袍子( 1 0 , 伽0 x ) ) f 遮2 - 3 m o r p h o l o g i c , a ls h u c l u r eo f t h es t r o m a t a o f s b a m b u s l c o a a n d t h es ”m n $ h i r a t as ps u p e r - h 1 6 8 ( a s e p t a l m y c e l i a ( 2 4 0 0 x ) ；bp y c n l d i i l mr e l e a s i n gc o n i d i a ( 1 0 0 0 ) ；cp y c n i d i , m o n t h e m y c e l i n m ( 2 4 0 0 ) ：d c o n i d h i n t h e p y c n i d i u m ( 1 0 0 0 0 ) 1 南大学博学位论文 竹黄菌株s u p e r - h 1 6 8 的菌丝有隔，其上生有分生孢子器，为近椭圆形，大小为3 5 岫1 0 2 0g t a ，成熟后释放出大量分生孢于，易结块，呈黑色。分生孢子极小，近 圆形，直径通常小于1g m 。 2 422 培养温度对菌落形态及产色素的影响 培养温度对菌株形态和产色素的影响如表2 - 2 所示。在2 2 3 8 范围内，色素产 量和菌落直径有一个类似的变化过程，均是从低到高再降低。当温度高于3 0 的时候 其色素产量下降较快，在3 8 时不再产色素。 表2 q 温度对茵落彤态厦产色素的影响( 3d ) t a b2 - 2e f f e c t o f k m 耻m m o n m e m o 巾h o l o g y 卸dp i g m e n t p r o d u c t i o n o f m es t r a i n ( 3d ) 温度( )直径( c m )菌落形态 产量( m 平板) 2 22 0 菌落白色绒毛状，中央突起、较密集、边缘整齐，白色 o8 6 2 4 2 5 菌落白色绒毛状，中央突起、较密集、边缘整齐，白色 i2 3 2 63 苗落白色绒毛状中央突起、较密集、边缘整齐，白色 2 0 6 2 83 6 苗落白色绒毛状，中央突起、较密集、边缘整齐，白色 21 3 3 03 9 苗落白色绒毛状，中央突起、较密集、边缘整齐，白色 2 3 l 3 234 菌落白色绒毛状，中央突起、较密集、边缘整齐，白色 l9 3 ， 茁落白色。气生菌丝较密集，不太发达，中央成簇状突 h1 起，边缘整齐，白色 1w ，。 菌落白色。气生菌丝不太发达，贴附于培养基中央菌 丝突起，菌丝呈棉绒状 7 ，。 菌落白色，气生菌丝不太发达，贴附于培养基中央营 ， 丝突起，菌丝呈棉绒状 2 423 生孢时问研究 竹黄菌株s u p e r h 1 6 8 可以产生大量的分生孢予器和小分生孢于可用孢子悬液接 种，故有必要研究其产孢时间。因孢子很小故可以通过观察分生孢子器的数量进行估 计。通过连续观察，发现在第3d 的菌丝上已经可以看到分生孢子器，到第7d 时，分 生孢子器几乎已经布满所有菌丝( 图2 4 ) 。 目2 - 4 茵丝上的分生孢子器( 7d ；a4 0 0 x ：b l o t 3 0 ) f i g2 q e y e n i d i ao n m e m y c e i i a ( 7d ；a4 0 0 ：b 1 0 0 0 ) 2 424 湿度对竹黄菌株s u p e r - h 1 6 8 的影响 空气湿度对竹黄菌株s u p e r - h 1 6 8 形态和产色素的影响如表2 - 3 所示。 第二章产竹红菌素竹黄菌株的筛选及组成成分分析 t 表2 3 湿度对菌落形态及产色素的影响( 3d ) t a b 2 3e f f e c to fm o i s t u r eo nt h ec o l o n ym o r p h o l o g ya n dp i g m e n tp r o d u c t i o n ( 3d ) 湿度( )直径( 啪)菌落形态 ，赢、 5 03 3 菌落白色绒毛状，中央突起、密集、边缘整齐，白色 1 4 2 6 0 3 6 菌落白色绒毛状，中央突起、较密集、边缘整齐，白色 1 8 5 7 0 3 8 菌落白色绒毛状，中央突起、较密集、边缘整齐，白色 1 9 2 8 03 9 菌落白色绒毛状，中央突起、较密集、边缘整齐，白色 2 2 9 03 9 菌落白色绒毛状，中央突起、较密集、边缘整齐，白色 2 2 湿度对菌体生长及产色素有一定影响。在实验范围内，湿度对菌落形态无明显影响， 在相对湿度为8 0 - - - 9 0 时色素产量较高。 2 4 2 5 发酵培养方式的选择 固态发酵及液态发酵实验结果表明，前者发酵周期虽长，但色素产量较高，其色素 含量可以达到4 2 - 4 8m g g 干基，且后续提取简便，便于操作；液态发酵周期虽然较 短，但产量比较低，大约为1 5 1 4 1 9 1 0m g l ，仅相当于4 0g 左右的固态发酵物，且 色素存在于发酵液中和菌丝体上，需要大量有机溶剂萃取，操作繁琐且杂质较多。以产 色素而言，固态发酵易于产物积累和提取，成本低，总体优于液态发酵。 2 4 3r d n a 序列测定及聚类分析 通过p c r 扩增得到的1 8 sr d n a 全长为1 7 6 9b p ，i t s 5 8 sr d n a 全长为5 7 2b p ， 均已被g e n b a n k 接收，登录号分别为e u 2 6 7 7 9 2 和e u 2 6 7 7 9 3 ( 见附录1 及附录2 ) 。通 过与g e n b a n k 中的序列进行b l a s t 比对，发现1 8 sr d n a 与g e n b a n k 数据库中竹黄( s b a m b u s i c o l a ，u 0 4 2 3 3 ) 有9 8 的相似度，i t s 5 8 s 与竹黄菌株( s h i r a i as p ) m l 2 0 0 4 ( a y 4 2 5 9 6 6 ) 有9 9 的相似度。通过n j 树分析发现，该菌株的1 8 sr d n a 与g e n b a n k 数据库中的两条竹黄( s b a m b u s i c o l a ) 序列( a y 5 4 3 5 8 8 ，a b l 0 5 7 9 8 ) 聚在同一分枝上， 且相似度达9 1 ：i t s 5 8 sr d n a 序列与登录号为a y 5 3 6 3 7 4 和a y 5 3 6 3 7 2 的竹黄菌 假b a m b u s i c o l a ) 聚在一枝上，其相似度为8 8 ( 图2 5 ，图2 6 ) 。综合上述分析，菌株 s u p e r h 1 6 8 属于竹黄属，但与已报道的竹黄无性型形态学差别较大。 s rrl e p t o s p h a e t i am a c u l a n s ( u 0 4 2 3 3 ) 5 3 l l l e p t o s p h a e t i am a c u l a n s ( u 0 4 2 3 8 ) 叫踌l 砌a 唧，a 咖s sa g a 嘲娜嘲8 2 3 ) k = ：二于嚣：三= 淼 9 9 、s h i n a i ab a m b u s i c o l a ( a b l0 5 7 9 8 ) 卜一 0 0 0 5 l e w i ai n f e c t o t f ：a ( u 4 3 4 6 5 ) d o t h i d e ai n s c u l p t a ( u 4 2 4 7 4 ) 图2 51 8 sr d n a 邻接树 f i g 2 - 5n e i g h b o r - j o i n i n gt r e eo f18 sr d n a 1 7 江南大学博士学位论文 2 4 4h a 鉴定 2 0 1 6 9 1 2 暑 爹e 4 图2 - 6i t s 5 8 sr d n a 邻接树 f i g 2 - 6n e i g h b o r - j o i n i n gt r e eo f l t s - 5 8 sr d n a t 抽( m m b 1 8 璩 ： 8 4 9暑薹亭 第二章产竹红菌素竹黄菌株的筛选及组成成分分析 o5l o1 5 2 s 3 03 55如5 5砷 舒7 07 5帅 r i m m i n ) c 。 m _ l s c a n e s - 3 7 3 e 4 5 4 6 5 4 4 5 4 7 6 1 3 l哟! h l + 1s c a r l _ e 8 + 5 8 3 e 5 5 7 0 4 8 1 75 2 9 7r 掣 2 2 5 03 0 03 5 04 o o4 5 05 0 05 5 06 0 06 5 07 0 07 5 0 毫 2 8 e 图2 7 f i _ a 的鉴定 似发酵色素：b 竹黄子座色素：ch a 标准品； dh a 质谱图；eh a 紫外可见连续波长扫描图谱) f i g 2 - 7i d e n t i f i c a t i o no fh a ( a p i g m e n t s p r o d u c e db ys o l i d s t a t ef e r m e n t a t i o n ；bp i g m e n t so f t h es t r o m a t ao f s b a m b u s i c o l a ； ch as t a n d a r d ；ds p e c t r u mo fe s i - m so fh a ；et h eu l t r a v i o l e t - v i s i b l ea b s o r b i n gc u r v eo fh a ) 从r p h p l c 分析可见，菌株s u p e r h 1 6 8 发酵所产色素中有6 个主要组分( 图2 7 a ) ，且其颜色均能由红变绿，显示了花醌类色素的特征颜色反应。其中h a 标准品的保 留时间为5 1 1 0 9m i n ，与5 1 1 1 5m i n ( 菌株s u p e r h 1 6 8 发酵所产色素) ，5 1 1 2 5m i n ( 子 座色素主峰) 接近。故可以初步判定该位置的峰为h a ( 图2 7a ，b ，c ) 。e s i m s 分析 1 9 ：2 ：1 8 4 9 昌甚_ l 掌 3 2 2 1 1 5 江南大学博士学位论文 显示，在e s + 图谱中，其r r d z 为5 4 7 ( m z 5 6 9 m + n a 】十，5 2 9 【m + i - - h 2 0 + ，4 8 7 【m + i - - 4 c h 3 】+ ) ；在e s 图谱中，其m z 为5 4 5 ( 图2 7d ) 。故该物质分子量为5 4 6 ，与已报 道的h a 分子量一致。紫外可见连续波长扫描表明，该物质显示了h a 的特征光吸收， 在4 6 3 6n n l 处有最大吸收峰( 图2 7e ) 。从而确认该物质为h a 【3 2 。 2 4 5 发酵茵丝组分分析及与子座的比较 2 4 5 1 常规成分分析 由表2 - 4 可见，发酵菌丝中的水分、粗脂肪、粗纤维、粗蛋白的含量低于天然子座， 而粗灰分、还原糖含量则高于子座，其中还原糖约是子座的5 倍。 表2 - 4 发酵茵丝及天然子座中常规成分分析 t a b 2 - 4c o n v e n t i o n a lc o m p o s i t i o n so f f e r m e n t e dm y c e l i aa n dt h es t r o m a t a 2 4 5 2 总氨基酸分析 氨基酸分析结果表明，发酵菌丝和子座氨基酸种类一致，但含量差别很大( 表2 5 ) 。 菌丝体中各种氨基酸含量均低于天然竹黄子座，子座氨基酸总量为菌丝体的2 8 4 倍。 表2 - 5 发酵菌丝和竹黄子座总氨基酸含量分析 t a b 2 - 5t o t a la m i n oa c i d sa n a l y s i so f t h ef e r m e n t e dm y c e l i aa n dt h es t r o m a t a 2 4 5 3 脂肪酸分析 脂肪酸分析结果表明，发酵菌丝和天然子座的脂肪酸种类相近，而不同来源的同种 脂肪酸含量有所不同。其中，菌丝体硬脂酸( 7 1 6 ) 、油酸( 3 0 7 5 ) 的相对含量明显 高于天然子座( 分别为4 8 9 、2 5 1 6 ) ，而肉豆蔻酸( o 1 6 ) 、亚麻酸( 1 2 1 ) 、亚 油酸( 4 1 8 5 ) 的相对含量与天然子座接近。棕榈酸( 1 5 8 9 ) 、棕桐油酸( o 5 6 ) 的 相对含量明显低于天然子座。另外，在发酵菌丝中还检测到了十四烯酸( 0 0 5 4 ) ，而 第二章产竹红菌素竹黄菌株的筛选及组成成分分析 天然子座中未能检测到。 表2 - 6 发酵菌丝和天然子座的脂肪酸含量分析 t a b 2 - 6f a t t ya c i d sa n a l y s i so f t h ef e r m e n t e dm y c e l i aa n dt h es t r o m a t a 名称 子座( 相对含量，)发酵菌丝( 相对含量，) 注：“”表示未检出 2 4 5 4 无机元素分析 无机元素分析结果如表2 7 所示。可以看出，发酵菌丝中的大量元素n a 含量特别 高，是天然子座中的6 3 4 8 倍，而元素k 的含量远远低于子座，约是其含量的1 8 。发 酵菌丝中的微量元素f e 、c u 、s e 的含量高于天然子座，有害元素c d 的含量与子座相 近，p b 和h g 的含量低于子座，二者均未检出a s 。 表2 7 发酵茵丝和天然子座常见无机元素含量 t l b 2 7c o n t e n t so fi n o r g a n i ce l e m e n t si nt h ef e r m e n t e dm y c e l i aa n dt h es t r o m a t a 垒整 王壅! 竖焦!垄醛堕丝! 些咝! a l7 7 2 45 7 4 l c d0 0 2 20 0 2 2 p b0 0 1 5o 0 1 1 h g 0 0 0 3 20 0 0 21 z n 1 9 9 11 7 5 7 f e7 5 5 2 9 1 3 9 n a3 6 9 32 3 4 4 2 3 k1 2 3 2 0 5 42 2 1 7 7 6 c u1 2 3 2 1 4 6 7 m g 4 4 8 6 32 3 0 3 2 c a6 6 4 7 57 3 9 3 1 s e 0 0 7 20 1 3 a s 注：“”表示朱检出 2 4 5 5 生物活性成分分析 发酵菌丝和子座的生物活性成分分析见表2 8 。从表中可见，发酵菌丝的竹红菌素 总含量( 3 5 8m g g ) 与子座含量( 4 2 3m g g ) 接近。 表2 - 8 发酵茵丝与天然子座的活性成分含量 t a b 2 - 8c o n t e n t so fb i o a c t i v ei n g r e d i e n t si nt h ef e r m e n t e dm y c e l i aa n dt h es t r o m a t a 垒签王壅! 婴咝!蕉壁堕丝! 翌丝! 竹红菌素 4 2 3 3 5 8 麦角同醇669464 甘露醇4590 5 2 2 l 江南大学博士学位论文 2 5 讨论 菌种的筛选一般包括初筛和复筛。初筛的手段尽可能快速、简便；复筛则是确认符 合工作目的的菌株，需要精确测定其生产指标或者产物。在本实验中，根据菌株能够产 红色素这一特征，首先从产红色素菌株筛选入手，共获得了1 3 株产红色素的菌株，然 后通过花醌类色素的特异反应进行复筛，获得了一株产茈醌类色素的竹黄菌株 s u p e r - h 1 6 8 。本文筛选菌株的主要依据是花醌类色素的性质及特异颜色反应。花醌类 色素可溶于大多数有机溶剂，易溶于氯仿，能溶于丙酮，不溶于水，且与三氯化铁呈阳 性反应( 由红色变为紫红色) ，加入碱液，则由红色变为鲜绿色【2 9 1 。上述反应均表明化 合物中有酚基的存在。目前有少数几种羟基醌如竹红菌素、金丝桃素、尾孢素、枝孢素、 痂囊腔菌素及弗莱菌素等具有遇碱变绿的特征。在本实验中，首先通过颜色反应初步鉴 定菌株产花醌类色素。因菲醌类色素有多种，对所产色素是否为竹红菌素还需进一步鉴 定。因竹红菌素中主要的活性成分为h a ，故可通过鉴定h a 的方法确认竹红菌素的存 在。通过标准品比对，质谱分析及连续波长扫描，最终确认竹黄菌株s u p e r - h 1 6 8 所产 色素中含有h a ，且为其主要成分。研究还发现，人工培养条件下竹黄菌株s u p e r h 1 6 8 所产色素组分较为复杂，其主要组分为6 种，而竹黄子座中的色素仅3 个主要组分。二 者所产色素成分中均是h a 占优，子座中h a 含量较高( 7 0 以上，数据未显示) 。 竹黄菌株s u p e r h 1 6 8 的菌丝上生有分生孢子器( 3 - 5 岬1 0 - - 一2 0l a m ) 及小分生 孢子，后者个体极小( 9 8 为止。各样品均制备1 0m g 以上，以用于n m r 分析。 3 3 3 色素成分的鉴定 3 3 3 1n m r 分析 江南大学博士学位论文 用氘代氯仿将待测样品溶于5m l t l 标准的n m r 管中，加入少量t m s 作为基准参照 物进行测定。 3 3 3 2 质谱分析 采用q t o f m i c r o 四极杆飞行时间串联质谱仪进行分析，离子模式，e s i + 。质谱条 件：毛细管电压3 0 0 0 v ，锥孔电压4 0 v ，离子源温度1 0 0 ，去溶剂气温度2 5 0 ，去 溶剂气体流速5 0 0m ，扫描范围1 5 0 - - 一7 0 0d a 。 3 4 结果 3 4 1 色素提取工艺的确定 3 4 1 1 提取溶剂的选择 在实验所选取的溶剂中，氯仿的提取效果最好，一次提取率可以达到9 6 ，其次是 丙酮和乙酸乙酯( 分别为9 2 2 1 和7 7 5 8 ) 。实验所用醇类中以乙醇效果为最好( 提取 率为7 0 3 4 ) ，提取效果最差的是石油醚( 提取率仅为3 8 ) 。 表3 1 不同溶剂对色素的提取效果的影响 t a b 3 - 1 e f f e c to f d i f f e r e n ts o l v e n t so np i g m e n te x t r a c t i o n 温度2 0 3 0 * ( 24 0 c5 0 6 0 c 提取率( ) 9 2 2 19 3 6 79 3 8 19 3 9 29 4 2 7 从表中可以看出，提取率在3 0 c 之后差别不大，为了降低能源消耗，方便操作，可 以选择3 0 作为提取温度。 3 4 1 3 提取颗粒大小的选择 表3 3 不同颗粒大小对色素的提取效果的影响 t a b 3 - 3e f f e c to fd i f f e r e n tp r a c t i c a ls i z e so np i g m e n te x t r a c t i o n 颗粒大小对色素的提取影响较为明显。在表中可以看出，当粒径为0 3 0 4n u n ( 4 0 - - 一6 0 目) 时提取率最高。粒径越大，色素提取率越低。在1 4 - 、1 8m m 时，提取到 的色素仅总色素的1 2 左右。粒径在4 0 目以下时，色素提取率均能达到9 0 以上。因 此可以选择4 0 目分样筛进行分选。 第三章竹黄菌株s u p e r h 1 6 8 固态发酵色素成分分离鉴定 提取率( ) 8 8 0 7 9 2 6 89 4 1 99 4 4 79 4 8 9 色素在丙酮中溶解速度比较快，2 0r a i n 的提取率即可达到8 8 0 7 ，4 0 埘 提取率增幅减小，为了节约时间，提取时间可以确定为4 0r a i n 。 3 4 1 5 提取体积的确定 表3 - 5 不同丙酮体积对色素的提取效果比较 t a b 3 - 5e f f e c to fd i f f e r e n ta c e