（发酵工程专业论文）磁性固定化α乙酰乳酸脱羧酶.pdf

摘要 摘要 磁性微球作为一种新型的高分子功能材料在近几十年得到了充分地发展。特别是磁 性微球在固定化酶领域的应用，解决了自由酶易于失活、分离困难、工业上难以应用等 难题，使酶催化得以快捷、有效地用于工业大规模生产。制备催化能力强、稳定性好的 磁性固定化酶，磁性微球外所包聚合物是关键。经过查阅文献发现聚乙烯醇对酶和蛋白 质具有较高的结合能力。 采用分散聚合法，在f c 3 0 4 磁流体存在下，通过p v a 分子单体共聚制备磁性微球， 并运用交联法以其作载体固定a l d c ，该类微球未见文献报导。同时运用了x r d 、t e m 、 i rs p e r m 等多种手段对其进行了表征，主要内容如下： 通过比较磁性微球的磁响应性及粒径，考察了磁性微球制备的反应温度、搅拌速度、 p v a 用量和盐酸用量等操作因素对磁性微球性质的影响情况。结果表明，在7 0 的操作 温度，7 5 0 r p m 的搅拌速度，5 m l9 p v a 和0 ，5 m l3 7 盐酸条件下制备出粒径在 2 5 x 1 0 2 5 x 1 0 。m 之间，具有良好磁响应性，表面富含羟基和羧基等官能团的磁性p v a 微球。 研究了固定化条件对磁性固定化酶活性及蛋白载量的影响，确定并比较了自由酶和 固定化酶的最适应用条件和稳定性等理化性质。采用交联法制备磁性p v a 微球固定化 a l d c 时最佳固定化条件为p h ：6 0 ，c o ( 戊二醛) ：0 9 8 ，给酶量：1 0 m i 0 0 5 9 微球， 此时所制磁性固定化酶有较高的催化活性。 将自由酶和磁性固定化a l d c 在啤酒发酵过程中进行实验室范围的应用，固定化酶 能有效地控制双乙酰含量，对双乙酰在发酵过程中的降解已基本达到自由酶对其降解的 效果，同时固定化酶还兼具较好的热稳定性、存放稳定性和操作稳定性；其再生性好， 使用效率高，可用于连续生产，降低生产成本；还可以在外加磁场作用下快速分离，适 于大规模连续化操作。 因此，我们认为磁性p v a 微球是种可用于制备固定化酶的优良载体，将a l d c 固 定在磁性p v a 微球上对a l d c 的工业化应用具有很大的现实意义及实用价值。 关键词：a l d c ，磁性微球，聚乙烯醇，固定化酶 a b s t r a c t a b s tr a c t m a g n e t i cm i c r o s p h e r e sh a v ed e v e l o p e ds e v e r a ld o z e n so fy e a r s 雒an e wp i e c eo fb i g m o l e c u l ef u n c t i o nm a t e r i a l e s p e c i a l l y ，i ta p p l i e di nt h ei m m o b i l i z e de n z y m et h a ts o l v e dt h e d i f f i c u l tp r o b l e m ss u c ha st h ef r e ee n z y m et e n dt ol o s ei t sa c t i v i t ya n dw a sh a r dt ob e s e p a r a t e da n d u s e di ni n d u s t r y t h em a g n e t i ci m m o b i l i z e de n z y m ec a l lb eq u i c k l ya n d e f f e c t i v e l yu s e di nl a r g e s c a l ei n d u s t r i a lp r o d u c t i o n t op r o d u c et h e ma g n e t i ci m m o b i l i z e d e n z y m ew i t hh i l g ha c t i v i t ya n ds t a b i l i t y ，t h ep o l y m e rt h a tw r a p p e d t h em a g n e t i cm i c r o s p h e r e s w a st h ek e y b yc o n s u l t i n gt h el i t e r a t u r e ，w ef o u n dt h ep o l y v i n y la l c o h o lh a v eh i 乒c a p a c i t y o fb i n d i n ge n z y m ea n dp r o t e i n m a g n e t i cm i c r o s p h e r e sw e r ep r e p a r e dw i t hf e 3 0 4a sm a g n e t i t ea n dp v ab yd i s p e r s i o n a n dc o p o l y m e r i z a t i o n ，a n di m m o b i l i z e da l d co nt h e mb yt h ec r o s s l i n k i n gm e t h o d r e s p e c t i v e l y t h ek i n d so fm a g n e t i ci m m o b i l i z e de n z y m e sw e r en o tr e p o r t e d a tt h es a m e t i m e ，w eu s e dx r d ，t e m ，i rs p e c t r aw h i c hp r o v i d e de x p e r i m e n t a lb a s i s t h em a j o rw o r ki s s u m m a r i z e da st h ef o l l o w i n g ： a c c o r d i n g t ot h ee x p e r i m e n t s ，t e m p e r a t u r e ，s t i r r i n gr a t e ，p v aa m o u n ta n dh aa m o u n t w e r ee s t i m a t e dt h r o u g hc o m p a r i n gt h em a g n e t i cr e s p o n s i v e n e s sa n dt h ed i a m e t e ro fm a g n e t i c p o l y m e rm i c r o s p h e r e t h er e s u l t ss h o w n t h a to p t i m u mt e m p e r a t u r e ，o p t i m u ms t i r r i n gr a t e ， o p t i m u mp v a a n do p t i m u mh c lo ft h ep r e p a r a t i o no ft h em a g n e t i cp o l y m e rm i c r o s p h e r e w e r e7 0 c ，7 5 0 r p m ，5 m l9 a n d5 m l 3 7 ，r e s p e c t i v e l y t h em a g n e t i cp o l y m e rm i c r o s p h e r e w i t h 2 5 x l o 二 - 5 x l o z mi nd i a m e t e rh a dg o o dm a g n e t i cr e s p o n s i v e n e s sa n dt h e f u n c t i o n a l 訇的u p so nt h es u r f a c e t h ei n f l u e n c e so nt h ea c t i v i t yo fm a g n e t i ci m m o b i l i z e da l d ca n db i n d i n gp r o t e i n c a p a c i t yw i t hv a r y i n gi m m o b i l i z a t i o nc o n d i t i o n sw e r ei n v e s t i g a t e d a n dw ec o m p a r e da n d c o n f i r mt h eo p t i m u mr e a c t i o nc o n d i t i o n s ，s t a b i l i t ye t c o ft h ef r e ee n z y m ea n dm a g n e t i c i m m o b i l i z e de n z y m e t h eo p t i m u mp r e p a r a t i o nc o n d i t i o no fi m m o b i l i z e da l d co nm a g n e t i c p v c m i c r o s p h e r eb yc r o s s l i n k i n gm e t h o dw a sp h ：6 0 ，c o ( g h t a r a l d e h y d e ) ：0 9 8 ，t h e a m o u n to fa l d c ：1 o m u o 0 5 9m i c r o s p h e r e a tt h i st i m et h em a g n e t i ci m m o b i l i z e da l d c h a v ep r e f e r a b l ea c t i v i t y f r e ee n z y m ea n dm a g n e t i ci m m o b i l i z e da l d ca r cu s e di nb e e rp r o d u c t i o ni nl a b o r a t o r y ， m a g n e t i ci m m o b i l i z e da l d c c a l lc o n t r o lt h ec o n t e n to f2 ，3 b u t a n e d i o n ea sb e t t e ra sf r e e e n z y m e a n dt h ei m m o b i l i z e da l d c h a v eg o o ds t a b i l i t y , a n dc a nb es e p a r a t e de a s i l yf r o m t h er e a c t i o ns y s t e ma n du s e dr e p e a t e d l y ，t h e nr e d u c et h ep r o d u c t i o nc o s t s ，s oi tm o r es u i t a b l e f o rm a n u f a c t u r e s ow ec o n c l u d e dt h a tt h em a g n e t i cp v cm i c r o s p h e r e si sak i n do fe x c e l l e n tc a r r i e rf o r i m m o b i l i z i n ge n z y m ea n dt h em a g n e t i ci m m o b i l i z e da l d c h a sg r e a tp r a c t i c a ls i g n a l i t ya n d a p p l i e dv a l u ef o ri n d u s t r i a la p p l i c a t i o n k e y w o r d s ：a l d c ，m a g n e t i cm i c r o s p h e r e ，p o i y v i n y ia i c o h o l ，i m o b i ii z e de n z y m e 关于硕士学位论文使用授权的说明 论文题i i ： 磁丝固定丝竖= 圣酰乳酸避逡醒 本学位论文作者完全了解大连轻工业学院有关保留、使用学位论文的 规定，大连轻工业学院有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印 件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇 编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 是否保密( ，保密期至伽了年参月7 日为止。 学生签名：j 氢蚣导师签名：圣魉里查驾 伽7 年厶月7 日 第一章文献综述 1 1 磁性微球技术 1 1 1 磁性微球简介 第一章文献综述 磁性微球( m a g n e t i cm i c r o s p h e r e s ) ，是指将无机磁性粒子与有机高分子材料结合形 成的一种复合微球，是一种新型的功能高分子材料。它具有许多优良的特性，如粒径小， 表面积大，易于吸附；具有顺磁性，无外加磁场时在溶液中分散均匀稳定，加磁场则可 简单快速分离；具有高分子微球的特性，可通过共聚和表面改性，赋予其表面多种反应 性功能基团( n h 2 ，o h ，c o o h ，s h 等) ；具有良好的生物相容性。因此，磁性微球 在细胞分离、固定化酶、靶向药物和免疫测定等生物医学领域有着广泛的应用前景【1 5 】。 近2 0 年来，磁性微球的研究非常活跃，已从最简单的高分子包裹磁性材料发展到多 种类型的组成方式。本文根据磁性微球的结构类型将其分成三类( 见图1 1 ) 。但是，组成 磁性微球的基本材料仍然是磁性物质和高分子材料。磁性物质包括f e 3 0 4 、丫一f e 2 0 3 、p t 、 n i 、c o 等，其中f e 3 0 4 使用最多；目前，有的学者采用c o f e 3 0 4 、n i f e 等新型磁性材料 制各磁流体，为研制优质的磁核提供了依据1 6 - 7 。高分子材料包括合成高分子材料和天 然高分子材料。合成高分子材料常用的有苯乙烯共聚物、聚酯类、聚酰胺类高分子；天 然高分子材料常用的有明胶、白蛋白、纤维素和各种聚糖。此外，近年来有人为了电磁 方面的应用，研究了一些导电性的磁性微球，聚吡咯、聚苯胺等导电聚合物也可用来制 备磁性微球。 o m 1 )( b 2 ) 亡= j 高分子材料 ( c ) 图卜1 磁性微球的类型 f i g 1 1t y p eo f t h em a g n e t i cm i e r o s p h e r e s 赫 第一章文献综述 磁性微球的性质不仅与组成材料的性质有关，还与制备方法有关。因此，制备方法 的研究十分重要。通常不同类型的磁性微球其制备方法也有所不剐8 1 。 1 1 2 磁性微球的制备方法 1 1 2 1 包埋法 包埋法是制备磁性微球最早的一类方法，即将磁性微球分散于天然或合成高分子溶 液中，通过雾化、沉积和蒸发等手段得到磁性微球。如e m i r 等将悬浮有f e 3 0 4 的油相 倒入含有壳聚糖的水相，搅拌后在室温下用外加磁场加以分离，所制磁性壳聚糖微球粒 径分布范围为1 0 0 2 5 0 , u m l 9 1 。 一般而言，包埋法得到的磁性微球其磁性粒子与外壳层的结合主要通过范德华力 ( 包括氢键) 、磁粒表面的金属离子与高分子链的鳌合作用以及磁性粒子表面功能基与高 分子壳层功能基形成的共价键。这种方法简单易行，但所得的粒子粒径分布宽，形状不 规则，粒径不易控制，壳层中难免混杂一些诸如乳化剂之类杂质，用于免疫测定、细胞 分离等领域会受到很大限制。同时该方法仅限于某些可溶的聚合物，且需要分离设备【2 1 0 1 。 1 1 2 2 单体聚合法 由于包埋法存在诸多缺陷，能制得粒径分布较窄、规整球形的单体聚合法应运而生。 单体聚合法是在磁性粒子和有机单体存在的条件下，根据不同的聚合方式加入引发剂、 表面活性剂、稳定剂等物质聚合制各磁性微球的方法。目前应用于合成磁性微球的单体 聚合法主要有：悬浮聚合、分散聚合、乳液聚合( 包括无皂乳液聚合、种子聚合) 等。单 体聚合法成功的关键在于确保单体的聚合反应在磁粒表面顺利进行。 ( 1 ) 悬浮聚合：首先将单体、引发剂、无机物、水等通过均化器分散均匀，然后在 适当的条件下聚合。王胜林等将粒径为8 - - - 1 2 n m 的f e 3 0 4 磁性粒子经表面处理后分散到苯 乙烯中，形成苯乙烯磁流体，再加入引发剂和交联剂，经过高速剪切乳化后形成较稳定 的微悬浮液进行微悬浮聚合。得到粒径主要分布在o 7 - - 2 m m 的磁性微球【1 1 l 。悬浮聚合 法具有微球粒径分布宽的缺点，因此目前研究较多的为乳液聚合法和分散聚合法。 ( 2 ) 乳液聚合：乳液聚合是目前应用较多的一种制备磁性微球的方法，它还包括无 皂乳液聚合、种子乳液聚合等方法。v l a d i m i r 等利用种子聚合法，制备出粒径在5 7 r i m 左 右的甲基丙烯酸和羟乙基甲基丙烯酸磁性微球，并研究了分散介质、单体、种子粒子及 2 第一章文献综述 p h 调节剂等因素对聚合行为和磁性微球的影响【1 2 i 。 ( 3 ) 分散聚合：利用一般的乳液聚合技术难以得到粒径大于珈m 的磁性微球，而当 磁性微球用于细胞分离、固定化酶等领域时，为了能在磁场下快速分离，大多希望使用 粒径大于耻m 的磁性微球。分散聚合法对于合成大粒径、单分散性的磁性微球具有得天 独厚的优势，同时该方法是向微球表面引入功能基最为方便的方法。分散聚合是指一种 由溶于有机溶剂( 或水) 的单体通过聚合生成不溶于该溶剂的聚合物且形成胶态稳定的分 散体系的聚合方式。孙宗华等利用分散聚合法，以水乙醇为分散介质，合成了含有一 c o o h 、- o h 、c h o 等不同表面功能基的核壳型磁性复合胶乳微球，并研究了分散介 质、引发剂、聚合单体、种子粒子等因素对复合微球形成的影响【”d 5 1 。 1 1 2 3 原位法 原位法又被称为浸渍澍1 们、渗磁法【1 7 1 或化学转化法【1 0 1 。u g d s t a d 等报道了以原位法 来制备磁性微球，并用该方法开发了系列商品化产品d y n a b c a d s 。该方法首先制得单分 散的致密或多孔聚合物微球，此微球根据不同的需要含有可与铁盐形成配位键或离子键 的基团( 如各种含n 基团、环氧基、o h 、o o o h 、s 0 3 h 等) ，随后可根据聚合物微球所 具有的不同功能基以不同的方法来制备磁性微球。如含n h 2 、n h 、c o o h 等基团时， 可直接加入适当比例的二价和三价铁盐溶液，使聚合物微球在铁盐溶液中溶胀、渗透， 升高p h 值，可得到铁的氢氧化物，最后升温至适当的温度，即可得到含有f e 3 0 4 微粒的 磁性微球。当含有n 0 2 、o n 0 2 等氧化性基团或h n h 2 等还原性基团时，可分别只加入 二价铁盐或三价铁盐，控制适当的p h 值和温度，即可得到含有f e 3 0 , 。微粒的磁性微球。 该方法和上述方法比较而言，具有以下几个优势：( 1 ) 在磁化过程中，单分散聚合物微球 的粒径和粒径分布不变，因此最终所得的磁性微球具有良好的单分散性；( 2 ) 具有超顺磁 性的无机微粒均匀地分散在整个聚合物微球中，且每个微球含有相同浓度的磁性微粒， 从而保证所有磁性微球在磁场下具有一致的磁响应性；( 3 ) 可以制备各种粒径的致密或多 孔磁性微球( 最佳为0 5 - - - 2 毗m ) ，且可制备含磁量大于3 0 的高含磁量微球【引。 1 1 3 磁性微球的应用 磁性微球的高分子外壳的表面多样性使它可以通过各种化学反应与生物性物质中 的配基偶联，从而识别相应的抗原或抗体、核酸等，最后在外加磁场中进行分离。正是 由于磁性微球的顺磁性，使它在磁场中定向移动，达到分离或靶向的目的。因此自7 0 年 代中期以来，磁性微球不但在细胞分离、亲合色谱、核酸研究、固定化酶等领域得到广 3 第一章文献综述 泛的研究，而且在有机和生化合成、环境食品微生物检测等方面的应用研究也日益增多。 1 1 3 1 固定化酶 将酶固定在磁性载体上则有诸多的优势。这是因为酶固定在磁性微球上后，其热稳 定性、存放稳定性和操作稳定性都得到提高；固定化酶再生性好，使用效率高；可用于 连续生产，降低生产成本；可在外加磁场作用下快速分离，适于大规模连续化操作。a k g o 用羰基二咪唑活化的磁性p v a 微球来固定转化酶，过程如下： b + o q 钳一卜矿d 唧。 一晒 a r i c a 等将环六亚甲基二胺( h m d a ) 连接在聚异丙烯酸甲酯( p m m 磁性微球表面， 用c d i 或c n b r 激活后用于共价结合葡萄糖淀粉酶。r i t t i c h 采用三氯三嗪法将脱氧核糖核 酸酶固定在磁性纤维素微球和磁性聚( h e m a - e d m a ) 微球上，用来降解染色体和质体 d n a 。b f l k o v ：i z 等用磁性p ( h e m a - e d m a ) 微球的酰肼衍生物固定半乳糖氧化酶，被定 向固定的酶表现出很高的存储活性和对环境的低敏感性。磁性载体的性质对固定化酶的 应用十分重要，它必须满足一定的条件：无毒；可生物相容：能够提供足够大的 表面积，使酶反应顺利进行，降低酶反应基质和产物的分散限制；具有一定的机械强 度。 1 1 3 2 细胞分离 有效的细胞分离是临床免疫应用最基本最重要的一步。在磁性微球表面接上具有生 物活性的吸附剂或配基，然后与目标细胞结合，加上外磁场将细胞分离、分类，即磁性 细胞分离，是种有效的细胞分离方法。此法具有操作简单快速、分离纯度高、保留细 胞活性、成本低等优点。细胞的标记与分离是磁性微球最早的应用研究之一，自7 0 年代 以来便有众多的学者致力于该领域的研究【1 8 - 2 0 。如，m o l d a y 等将平均粒径为4 0 姗的磁 性微球用于脾脏细胞中b 细胞的分离：r e m b a u m 等将磁性聚戊二醛微球标记分离人血红 细胞，可分离除去超过9 5 的未标记细胞。w i l s o n 等认为，现有的磁性分离技术存在一 个缺点，即一次操作只能分离一种目标产物，如要在同一溶液中逐个分离多个目标产物， 不仅昂贵、耗时，而且往往达不到最佳分离效果。例如在进行骨髓移植时，需要完全分 4 第一章文献综述 离其中的各种细胞，此时加入具有不同磁矩，偶联有不同受体的磁性微球，使其和骨髓 中的各种细胞选择性地产生特异性吸附。然后施加外磁场，通过控制磁场梯度赋予不同 磁矩的磁性微球以不同的运动速率，从而达到同时分离多个目标产物的目的。该技术可 极大地提高分离效率。 p a r t i n g t o n 等提出了一种新的免疫磁分离方法双参数法( d u a lp a r a m e t e rs o r t i n g ) 。 该方法先用5 0 n m 的磁性微球m i c r o b e a d s 和m i a i m a c s 系统对细胞进行正选择，在此基 础上不需分离除去m i c r o b e a d s ，直接用更大粒径的磁性微球d y n a b e a d s 和d y n a lm p c 系 统直接进行正负选择。因为仅吸附有m i c r o b e a d s 的细胞在弱磁场的d y n a lm p c 系统中 不被吸引，因此该技术充分利用了不同粒径磁性微球在不同磁场强度下引力的不同，从 而达到简化实验操作的目的。作者用该技术对多种淋巴细胞进行了分离，并将其用于含 量少( 1 - - - 2 ) 的细胞，如幼鼠肝脏中造血干细胞的分离。 1 1 3 3 磁性靶向给药 磁性靶向给药是以磁性微球为载体，将药物包封在其中，吸附在高分子层或偶联在 表面，口服或注入体内，利用外加磁场引导载药微球到病患处集中并缓慢释放，定向作 用于靶组织。定向给药可使靶区药物浓度高于正常组织，减少药剂量和药物毒副作用， 提高药效。g h a s s a b i a ns 等将地塞米松和f e 3 0 4 包埋于白蛋白微球中，用于治疗淋巴细胞 肿瘤。h a f e l iu o 等用磁性聚乳酸放射性微球靶向治疗肿瘤细胞，进行了体外和体内放 射效果研究。由于药物载体会与药物一起进入人体内，而药物载体必须不能对人体造成 伤害。故用于靶向药物的磁性微球必须满足一定要求：( 1 ) 具有生物降解性；( 2 ) 粒径小 于1 1 4 l c z m ，以免阻塞血管，利于微球在靶区均匀分布；( 3 ) 具有一定的缓释性：( 4 ) 具有最 大的生物相容性和最小的抗原性；( 5 ) 载药微球及其降解产物无毒或毒性极低【2 l - 2 6 1 。 1 1 3 4 有机和生物化学合成 近几年来，组合化学因能快速合成巨大的化合物库，用以满足生物学测试的要求， 因此得以迅猛发展，从而使固相有机合成技术得以复兴。而以磁性微球为载体的固相有 机合成技术，不仅可充分发挥固相合成的优势，而且在反应完成后，可迅速地将目标产 物从剩余反应物、副产物及溶剂中方便地分离出来，且不影响产物的性质与纯度。r a n a 等用悬浮聚合法制备了4 5 1 2 取m 的p s 功能性磁性微球，并将其用作固相有机合成载体 和磺胺类药物的纯化。b e r m e r 等将硅烷化的磁性微球用于d n a 、r n a 和多肽的合成。 s u c h o l e i k i 等分别制备了具有高浓度悬垂功能基和具有亲水性表面的复合磁性微球，并将 5 第一章文献综述 该复合磁性微球用于寡核苷酸、多肽、寡糖、多糖的合成。该微球外层为低度交联的p s 壳体，内部为含有f c 3 0 4 磁粒的高度交联p s 核。内外交联度的不同，既保证了在各种有 机溶剂中的充分溶胀性，又可确保磁粒不损失【2 7 2 8 1 。 1 1 3 5 环境食品微生物检测 以磁性微球为基础的免疫磁性分离技术不但广泛应用于医学、生物学的各个领域， 而且在环境和食品卫生检测方面的应用也初见端倪。沙门氏菌是引起食物中毒最常见的 菌属之一。s k j e r v e 等报道了用免疫磁性分离技术从乳及乳制品、肉类和蔬菜中分离出沙 门氏菌，其检测限为每克l x l 0 2 个细菌。免疫磁分离技术可快速将目标微生物从样品中 分离出来，如果和其它检验方法，如酶联免疫吸附分析，多聚酶链式反应，荧光免疫分 析，电子化学发光相结合，则可数倍地提高分离效率和检测极限。b r u b n o 等利用以免疫 磁性微球为固相载体的e c l 技术探测土壤中的b a n t h r a c i s 孢子。目前，磁性微球的研究 多限于实验室阶段和初步的应用研究，但其中仍有一些成功应用的例子。如挪威的d y n a l 公司开发了一系列的商品化磁性微球d y n a b e a d s 。该公司的系列产品已经成功的应用于 微生物学、免疫学、分子生物学、癌症研究等领域，同时还在美、英、德、日、澳等国 建立了分支机构。另据报道，澳大利亚联邦科学与工业研究组织研制成功粒径1 0 0 # m 的磁性离子交换树脂珠粒，用于除去饮用水中的有机物1 2 9 3 1 j 。该产品即将实现商业化。 1 1 3 6 其它 磁性微球还广泛应用于其它领域【3 2 - 3 3 1 。利用核酸分子间的碱基配对作用，在核酸的 相关研究中己广泛使用了磁性微球。j u r g e n 等将磁性p v a 微球用于d n a 的分离纯化、核 酸的测序。他们针对目标d n a 合成了一段被称为l a c z 的寡聚核苷酸探针，连上生物素， 通过生物素与磁性微球上的抗生蛋白链菌素偶连，制成l a c zb e a d 。这样，针对探针的 目的d n a 便可特异性地与探针结合，从而将目的d n a 自杂交液中提取出来，省去了原 有斑点杂交法有机提取与沉淀浓缩步骤，整个杂交纯化过程可实行自动化操作例。若将 连有核酸分子的磁性微球制成色谱柱，可进行核酸分子的连续化纯化。 利用磁性微球作为动力工具可对细胞受力情况和分子结构进行研究。采用磁性微球 以磁力作为细胞受力的模型有多种优点。首先，力的大小不随时间而变，永久磁铁的磁 场梯度在较大范围内均匀一致，因此绝大部分细胞同时受力均匀。网状力方向便于确定， 并可随磁铁位置的变换而变化。磁力大小可定量，可以通过改变磁场梯度大小或改变每 个细胞上的磁性微球数量而改变。此外，如果变更磁性微球上的配体，则可针对各种不 6 第一章文献综述 同受体对细胞受力进行研究，从而得到较为科学的结论【3 5 l 。g l o g a u c r 等用胶原包被磁 性微球，通过细胞表面整合蛋白受体直接对细胞骨架施力，通过测定单位体积内磁性微 球、磁性微球的直径分布及每个细胞上磁性微球的分布情况便可知作用于每个细胞上的 磁力大小，从而为研究细胞膜受力情况提供一种理想的模式，进一步研究细胞内及细胞 之间信号传导机制p 6 j 。此外，磁性微球在磁共振成像、手性分离、固相合成、亲和色谱、 核酸杂交等方面都大有用武之地。 1 1 4 磁性微球研究现状 磁性微球的结构及性质的特殊性使其兼具高分子聚合物和无机物的特点，因此其应 用越来越受到人们的重视，许多研究人员都在这一领域付诸了大量努力，取得了一定的 成果。 1 磁性微球的新的制备方法：因为现行的磁性微球的制备方法还存在着许多不尽如 人意的地方，所以人们积极地在原有制备方法的基础上加以改进或寻找新的制备方法。 磁性微球在生物医学领域的应用较广，如用作诊断试剂等，但该领域对磁性微球的要求 较高，不仅要求其单分散性好，并且应无非特异性凝聚因素。而乳液聚合制备的磁性微 球无法满足这些要求，因此人们开发了无皂乳液聚合技术。无皂乳液聚合是指在不含乳 化剂或仅含微量乳化剂的条件下进行的聚合反应。 k o n d o 等人在共沉淀法合成超细磁流体的基础上，采用两步无皂乳液聚合技术，制 备出热敏性的磁性聚苯乙烯n 异丙基丙烯酞胺甲基丙烯酸微球。在运用扫描电子显微 镜( s c a n n i n ge l e c t r o n i cm i c r o s c o p e ，简称s e m ) 和透射电子显微镜( t r a n s m i s s i o ne l e c t r o n i c m i c r o s c o p e ，简称t e m ) 观察胶乳微粒的形态和分布，动态光散射法测定流体动力学直 径，超显微电泳分析测定电位，热重法分析磁含量的基础上，他们认为磁性胶乳微粒 的流体动力学直径随磁流体单体重量比的提高而明显减小。 由于k o n d o 等采用的两步法较复杂，因此h w e e 等人采用一步无皂乳液聚合技术，在 磁流体存在的条件下，合成出平均粒径为3 0 n m 的磁性微球，并对平均粒径及粒径分布、 表面羟基含量、磁含量、酸碱稳定性进行了测定。他们发现用丙烯酸钠代替甲基丙烯酸 不但能提高磁性微球的单分散性，还能提高其表面羟基含量。 在改进原有制备方法的同时，人们还在积极探索新的方法。静天玉等用超声法将磁 流体和蚯蚓纤溶酶同时包入脂质体中，形成一种具有磁导向性的溶栓药物磁性蚯蚓纤 溶酶脂质体，a v i v i 用两种新型声化学方法合成了磁性蛋白微球，一种以水为溶剂，另一 7 第一章文献综述 种以蔡烷为溶剂，并对其性质进行了讨论。r e m b a u m 等开发了一种可制备单分散性好、 纯净度高的磁性微球的方法无容器环境法”。所谓“无容器环境法”是指与乳液聚合、 分散聚合等方法相比，在制备过程中单体液滴不与容器壁相接触。其原理是在一个充满 惰性气体或高真空狭长容器中，喷射分散有磁粉的单体液滴，在单体液滴下落的过程中， 用紫外线或丫射线引发聚合。这是一个简单的一步制备方法，可合成粒径范围为0 0 1 - - 1 0 毗m 的磁性微球。该方法制备的磁性微球具有以下几个特点：( 1 ) 制备过程中可不使用 溶剂、催化剂、悬浮剂、乳化剂等会对微球造成污染的各种添加剂，从而得到的是纯净 的干燥微球，且不需要任何纯化后处理技术，可直接收集使用：( 2 ) 单分散性好，粒径偏 差不超过5 ；( 3 ) 反应时间短，聚合时间根据单体的不同而控制在3 0 m i n 左右；( 4 ) 适用 于任何一种亲油性或亲水性单体，只要能以液态方式存在即可。 2 新型磁性微球：为了更好地使磁性微球满足不同领域的需求，许多新型磁性微球 相继问世。在临床检测诊断领域，快速、准确、价廉地做出正确判断要求磁性微球进一 步功能化。张军华等采用分散聚合法合成了表面带轻基、内核为f e 3 0 4 的磁性高分子粒子， 再用酯化法在粒子表面共价结合有机光导分子酞菁，得到了同时具有光导性和磁响应性 的磁性微球。所得的磁性微球既可在磁场条件下实现快速分离和纯化，又可在临床检测 诊断中进行光导性检测来获取生物活性分子间的相互作用信息。靶向制药方面：由于现 有的微粒载药系统和合成大分子载体系统存在不同程度的毒副作用和生物降解性问题， 限制了其临床应用。1 0 多年来，国内外一些学者根据红细胞的生物相容性、生物降解性 以及适于体内循环的粒径等特性致力于红细胞载体的研究，取得了可喜的进展。他们将 药物、磁性材料与红细胞相结合后送入体内，在外加磁场的引导下可有效地聚集在指定 部位。r o a t h 等制备出磁性免疫红细胞载体，在红细胞的表面键合抗体后注入骨髓中， 使其附在癌细胞上，在超导外磁场的作用下，可快速有效地去除骨髓中的癌细胞，这对 骨髓移植的广泛应用意义重大。 邱广亮等人借鉴稀土掺杂或键合高分子聚合物而制得各种功能材料的方法，首次将 稀土离子在聚合过程中掺入反应体系，制备出内含磁性氧化铁晶粒，表面携带稀土离子 的复合微球。电镜、红外光谱、原子吸收光谱分析结果表明该微球粒径分布均匀，表面 稀土离子分布可控，具有较强的磁响应性。稀土元素因其电子结构的特殊性而具有光、 电、磁等特性，己广泛应用于发光材料、荧光材料、激光材料、防护材料和光学塑料等 领域。它与磁性微球的结合必将开拓出系列新的功能材料。董星龙等采用直流电弧等 离子体法制备出表面包覆碳膜的磁性金属纳米颗粒，称为“纳米胶囊”。这种磁性纳米胶 囊具有较好的磁性和粒子表面硬度，作为磁记录材料具有广阔的应用前景。徐志刚等采 8 第一章文献综述 用燃烧法合成了c o f e 2 0 4 纳米材料，由于其可见光区较大的磁光偏转角、稳定的化学性 质、温和的饱和磁化场、较大的矫顽力而可能成为极有竞争力的新一代磁光记录材料。 3 磁性微球的新的用途：随着磁性微球制备方法的发展更新和性能的进一步完善， 它在许多领域也具备了新的用途。w a r s h a w s h y 发现p o 1 0 0 ，n i p o 1 0 0 c o ( v o 1 0 0 为 p o l y ( n ，n ，n t r i m e t h y l - n ( m a n dp - v i n y l b e n z y l ) a m m o n i u mc h l o r i d e ) ) 在4 0 - - 8 0 r i m 有能量 吸收，而在2 5 - 3 0 n m 有能量吸收的物质可以把太阳能转化成热能，这表明磁性微球有成 为光电池的可能性。k a s s i m i 等将免疫磁性分离和一步逆向转录聚合酶链式反应相结合， 用于脑心肌炎病毒的临床检测。但德忠等首次将荧光免疫、光纤传感、磁分离及流动注 射四大技术组合在一起，设计了一套仪器系统，初步用于荧光物质及人血清白蛋白的测 定。最近s t r i c k 等用磁性微球定量研究了d n a 的超螺旋行为。他们将d n a 分子的一端固 定在多位点的磁性微球上，另一端则固定于多位点的玻璃表面，用一个旋转磁场来诱使 磁性微球旋转，可双向缠绕或解开d n a ：5 - 子。通过磁场增大或减弱磁性微球作用于d n a 分子上的张力，这样d n a 分子的超螺旋程度可以被定量地监控。通过被d n a 链拴住的 粒子运动分析可以允许测定作用于d n a 分子上的张力。他们研究了d n a 分子上从0 0 1 1 0 0 p n 的作用力。结果表明这是一种十分有效的测定1 0 - 1 2 数量级力的方法。w i l s o n 等 对常规磁性分离技术进行了改进。例如在进行骨髓移植时，需要完全分离其中的各种细 胞。此时如加入具有不同磁矩、偶联有不同受体的磁性微球，使其和骨髓中的各种细胞 选择性地产生特异性吸附。然后施加外磁场，通过控制磁场梯度赋予不同磁矩的磁性微 球不同的运动速率，从而达到同时分离多个目标产物的目的。该技术可极大地提高分离 效率。w a n g 等将d n a 固定于磁性微球上，通过施加外加磁场控制鸟嘌呤核苷酸的氧化 过程，为制备新型生物电极提供了保证。 磁性微球在某些领域的应用已经付诸实践，实现了商业化。如s e r o n o 公司已将其全 部免疫分析试剂盒改为磁性通用抗体酶联免疫测试系统，美国c i b ac o m i n g 公司所生产 化学发光免疫分析试剂盒也全都采用微颗粒磁化固相抗体【9 1 。伦敦的儿童医院、挪威工 科大学和美国喷气推进研究所己成功地利用纳米级f e 3 0 4 聚苯乙烯微球进行人体骨髓液 癌细胞的分离。这些都说明了磁性微球这一新型功能材料的强大生命力。 9 第一章文献综述 1 2 酶的固定化 1 2 1 酶的固定化方法 酶催化与一般的化学催化相比，具有应用范围广、催化效率高、选择性专一、反应 条件温和等优点。所以，酶是高活性、高选择性、低能耗的生物催化剂，但是酶制剂的 大规模工业应用还受到许多限制：酶在水溶液中一般很不稳定，如对热、强酸、强碱、 有机溶剂等都不稳定，易失活、分离回收困难、不能重复使用等，这些不足大大限制了 酶促反应的广泛应用。上世纪6 0 年代出现的固定化酶技术克服了自由酶的上述不足， 并且酶可以回收及重复使用，从而成为生物技术中最为活跃的研究领域之一f 3 7 1 。 所谓固定化酶是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后 的酶可以回收重复利用。1 9 5 3 年g r u b h o f e l 和s o h l e i t h 首先将羧肽酶、淀粉和糖化酶、胃 蛋白酶和核糖酸酶等用重氮化聚氨基聚苯乙烯树脂进行固定，从2 0 世纪6 0 年代起，固定 化酶的研究迅速发展。酶的固定化方法主要有四种：包埋法( e n t r a p m e n t ) 、吸附法 ( a d s o r p t i o n ) 、共价法( c o v a l e n tb i n d i n g ) 、交联法( c r o s s 1 i n k i n g ) 3 8 - 4 3 。 1 2 1 1 包埋法 包埋固定化法是把酶定位于聚合物材料的格子结构或微胶囊结构中。这样可以防止 酶蛋白释放，但是底物仍能渗入 格子内与酶相接触。此法较为简便，酶分子仅仅是被包埋起来，生物活性破坏少， 但此法对大分子底物不适用。 1 凝胶包埋法 凝胶包埋法是将酶包埋在交联的水不溶性凝胶的空隙中的方法。交联聚丙烯酰胺凝 胶包埋法是首先被采用的包埋技术。b e m f e l d 和w a n 用此法固定了胰蛋白酶、木瓜蛋白 酶、卢淀粉酶。用此方法后来又固定了过氧化氪酶、胰凝乳蛋白酶、厣葡萄糖苷酶。近 年，又有人使用天然材料如藻酸盐和卡拉胶进行包埋。 2 微胶囊包埋法 将酶包埋于半透性聚合体膜内，形成直径为l 1 0 毗m 的微囊。这种固定化酶是以物 理方法包埋在膜内的，只要底物和产物分子大小能够通过半透膜，底物和产物分子就能 够以自由扩散的方式通过膜。 1 0 第一章文献综述 1 2 1 2 吸附法 吸附固定是最简单的方法。酶与载体之间的亲和力是范德华力、离子键和氢键，此 方法又可分为物理吸附法和离子吸附法。 1 物理吸附法 使用对蛋白质具有高度吸附能力的非水溶性载体，如活性碳、几丁质、多孔玻璃等 作为吸附剂，将酶吸附到表面上使酶固定化。这种方法操作简单，反应条件温和，载体 可反复使用，但结合不牢固，酶易脱落。 2 离子吸附法 利用酶蛋白在解离状态下可用电荷引力而固着于带有与酶蛋白电荷相异的离子交 换剂( 水不溶性载体) 上的固定化方法。此法操作简单，固定较为牢固，在工业上用途广。 常用的载体有阴离子交换剂( 如：d e a e ( - - 氨基乙基) 纤维素、t e a e ( 蛋乙氨基乙 基) - 纤维素、d e a e - 葡聚糖凝胶) 和阳离子交换剂( 如：教甲基纤维素( c m c ) h s ) 。 1 2 1 3 共价法 酶蛋白分子上的官能团和固相支持物表面上的反应基团之间形成共价键连接的方 法。其优点是酶与载体之间的连接很牢固，稳定性好，但反应条件激烈，操作复杂，控 制条件苛刻。目前，已建立的方法包括： 1 重氮法 这是共价键法中使用最多的一种，如下式所示，将具有氨基的不溶性载体，乙稀盐 酸和亚硝酸钠处理，成为重氮化物，再与酶分子偶联。酶蛋白中的游离氨基，组氨酸中 的咪唑基，酪氨酸中的酚基，可与其结合。 i o n 一【r n = n 】c l - + 【酶卜r n = n 【酶】 2 肽键法 此法是将有功能基团的载体与酶蛋白中赖氨酸的争氪基或n 末端的口氨基作用形成 肽键，成为固定化酶。 3 烷基化法和芳基化法 以卤素为功能基团的载体与酶蛋白的氨基或巯基发生烷基化或芳基化反应，形成固 定化酶。 1 2 1 4 交联法 使酶与带两个以上的多官能团试剂进行交联反应，生成不溶于水的二维交联聚集 第一章文献综述 体，交联形成的固定化酶称为交联酶。与共价结合法一样，都是靠化学结合的方法使酶 固定化。其区别在于交联法使用了交联剂，常用的交联