（发酵工程专业论文）环糊精糖基转移酶产生菌的筛选及环糊精在农业生产中的应用研究.pdf

山东大学硕士学位论文 摘要 环糊精及其衍生物以其独特的包合性能已被广泛应用到医药、食品、化工、 环境等诸多领域，但在农业生产中的应用还处于起始阶段。为解决环糊精糖基转 移酶产生菌菌株筛选效率低的难题，本研究建立了一种从土壤中快速筛选环糊精 糖基转移酶产生菌菌株的方法。为了进一步探索环糊精在提高农药溶解度及其药 效方面的可行性，本试验以农药毒死蜱为实验对象，采用多种方法制备了环糊精 1 3 - c d 及其衍生物与毒死蜱的固体包合物，对包合物进行了表征，分析了包合物 对杀虫药效的影响。本文主要研究结果如下： 1 建立了一种从土壤中快速筛选环糊精糖基转移酶产生菌菌株的方法。本 研究从土壤中初步筛选出了1 4 9 个产胞外淀粉水解酶的菌株，利用高效阴离子交 换色谱检测出了微生物发酵液中的环糊精成分，从而确定了产生菌菌株；本研究 检测了其中1 1 个产生菌菌株，6 株主要产c d 6 ，5 株主要产c d 7 。同时，在鉴 定的过程中，定量检测了各种环糊精包括大环糊精( c d 大于8 ) 的含量。 2 研究了环糊精与农药包合物的制备方法，确定了最佳反应条件。本研究 分别利用研磨法、超声波法和饱和水溶液法制备了环糊精i b - c d 、h p 一1 3 一c d 和 m e p c d 与农药毒死蜱的包合物，其中饱和水溶液法包合效果最好。使用该方 法环糊精 3 - c d 、h p d c d 和m e d c d 与农药毒死蜱的包合率分别为4 5 8 、 5 2 0 和6 5 o 。采用正交试验得到 b - c d 包合毒死蜱的最佳反应条件：投料比 为l ：1 ( 摩尔比) ，包合时间为3 h ，包合温度为6 0 。 3 利用紫外光谱法定量研究了1 3 - c d 及其衍生物对毒死蜱的包结行为。结 果表明1 3 - c d 及其衍生物与毒死蜱均形成了包结比为1 ：l 的包结物，形成的包 合物的稳定常数分别为1 0 3 3 3 3 m o l l ( 1 3 c d ) ，k = 3 4 3 8m o l l ( h p b c d ) ， k = 4 6 1 6 3m o l l ( m e 一1 3 c d ) 。由包合物稳定常数大小可知1 3 c d 与毒死蜱包合物 的稳定性最差，而h p 1 3 c d 、m e 1 3 c d 都能与毒死蜱形成较稳定的包合物。 利用a c j = - r i n k 计算出重要的热力学参数a g 分别为：8 6 9 k j m o l ( 1 3 - c d ) 、 2 0 1 8 4 k j m o i ( h p 1 3 c d ) 及1 5 2 1 k j m o l ( m e 1 3 c d ) ，包合反应的吉布斯函数 g 均为负。 4 利用紫外光谱法对液体包合物进行了鉴定。当固定客体毒死蜱浓度时， 随着主体b c d 、l i p 1 3 c d 、m e 1 3 一c d 浓度的增大，整个体系的吸收峰没有明 显的位移，但其最大吸收峰处的吸光值逐渐增大。说明口一c d 及其衍生物对毒死 蜱产生了识别作用，毒死蜱进入c d 的空腔，形成了包合物。 。 v i i l 东大学硕士学位论文 5 利用红外吸收光谱和差示热分析法分别对p c d 、f i p d c d 和m e d c d 与 毒死蜱固体包合物进行了表征。差示热分析可知，三种包合物仅存在主体分子的 脱水峰，毒死蜱原来的吸收峰消失；红外吸收光谱证明三种包合物中毒死蜱的特 征吸收峰消失，主要表现为主体分子图谱。结果表明：i b - c d 、f i p b c d 和m e d c d 与毒死蜱均形成了1 ：1 的稳定包合物。 6 包合物的室内杀虫毒力试验结果为：i b - c d 、h p d c d 和m e d c d 与毒 死蜱包合物致死中浓度l c 5 0 分别1 6 1p g m l 、1 0 8p g m l 和1 2 3f t g m l 。 本研究首次利用高效阴离子交换色谱检测了产c g t a s e 菌株发酵液中的环糊 精成分，尤其是大环糊精的组成。建立了一种从土壤中快速筛选环糊精糖基转移 酶产生菌菌株的新方法，利用该方法还可以检测环糊精糖基转移酶在不同阶段产 生环糊精的能力大小。本研究发现通过环糊精与毒死蜱的包合作用可以增加毒死 蜱在水中的溶解度，提高其药效。该研究为农药的水基化推广奠定了基础。 关键词：p 一环糊精；环糊精糖基转移酶；毒死蜱；包合；表征 i i i 东大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h ec y c l o d e x t r i n ( c d ) a n di t sd e r i v a t i v e sh a v eb e e nw i d e l ya p p l i e di nm e d i c a l i n d u s t r y , f o o di n d u s t r y , c h e m i c a li n d u s t r y , e n v i r o n m e n ta n dm a n yo t h e ra r e a sf o ri t s u n i q u ei n c l u s i o np e r f o r m a n c e h o w e v e r , t h ea p p l i c a t i o ni na g r i c u l t u r a lp r o d u c t i o ni s s t i l li nt h ei n i t i a ls t a g e i no r d e rt or e s o l v et h e p r o b l e mt h a tt h ee f f i c i e n c yo fs c r e e n i n g s t r a i ni sl o wi nt h ep r o d u c t i o np r o c e s so ft h ec d ，t h i ss t u d ye s t a b l i s h e dan e wm e t h o d w h i c hc o u l ds c r e e ng l y c o s y l t r a n s f e r a s e ( c g t a s e ) - p r o d u c i n gs t r a i nf r o mt h es o i l q u i c k l ya n da c c u r a t e l y i no r d e rt oe x p l o r et h ep o s s i b i l i t yo ft h ea p p l i c a t i o no f t h e c di n a g r i c u l t u r e t h ei n c l u s i o no f1 3 - c da n di t sd e r i v a t i v e sa n dp e s t i c i d e c h l o r p y r i f o s w e r em a d eb y m a n yw a y s ，t h e i n c l u s i o ns o l i dc o m p l e xw a s c h a r a c t e r i z a t e d ，a n dt h ei n s e c t i c i d ee f f i c a c ye x p e r i m e n t sw a sc a r r i e do u t t h er e s u l t s m e s es t u d i e sa r ea sf o l l o w s ： 1 am e t h o dt h a tc a l lq u i c k l ys e l e c tt h ec g t a s e p r o d u c i n gb a c t e r i aw a ss e tu p 14 9e x t r a c e l l u l a ra m y l a s e p r o d u c i n gs t r a i n sh a v e b e e ns c r e e n e df r o mt h es o i lt h ec d c o m p o s i t i o n w a sd e t e c t e d u s i n g t h e h i g h p e r f o r m a n c ea n i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y ( i - i p a e c ) a n dt h ec g t a s e p r o d u c i n gb a c t e r i aw a sd e t e r m i n e d i n t h es t u d y , 11c g t a s e - p r o d u c i n gb a c t e r i as t r a i n sw e r ed e t e c t e da n d6s t r a i n sm a i n l y p r o d u c e dt h ec d 6a n d5s t r a i n sc d 7 m e a n w h i l e ，t h ec o n t e n to ft h ed i f f e r e n tc d i n c l u d i n gt h el a r g er i n g ( c d 8 ) w a sd e t e r m i n e dd u r i n gt h ep r o c e s s 2 t h ep r e p a r a t i o nm e t h o d so ft h ei n c l u s i o nc o m p l e xo fi b - c d ，h p - p c d ， m p - c da n dt h ep e s t i c i d ec h l o r p y i f o sw e r es t u d i e d , r e s p e c t i v e l y a n dt h eb e s t c o n d i t i o n sw e r ed e t e r m i n e d t h ei n c l u s i o nr a t eo ft h es a t u r a t e da q u e o u ss o l u t i o nw a s t h eb e s t a m o n gt h eg r i n d i n gm e t h o d ，u l t r a s o n i cm e t h o da n ds a t u r a t e da q u e o u s s o l u t i o n t h ei n c l u s i o nr a t eo ft h es a t u r a t e da q u e o u ss o l u t i o nw a s4 5 8 ，5 2 a n d 6 5 f o rt h ei n c l u s i o nc o m p l e xo f1 3 - c d ，h p - p c d ，m p c da n dt h ep e s t i c i d e c h l o r p y i f o s ，r e s p e t i v e l y t h eb e s to p t i m a lr e a c t i o nc o n d i t i o n so fi n c l u s i o nc o m p l e x o f i b - c da n dc h l o r p y i f o sb yo r t h o g o n a lw a s ：f e e dr a t i oo f1 ：1 ( m o l er a t i o ) ，i n c l u s i o nt i m e w a s3 h ，i n c l u s i o nt e m p e r a t u r ei s6 0 c 3 t h ei n c l u s i o nb e h a v i o ro ff l - c y c l o d e x t r i na n di t sd e r i v a t i v e sw i t hc h l o r p y r i f o s w e r eq u a n t i t a t i v e l ys t u d i e du s i l l gu vs p e c t r u m t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h er a t i oo f i n c l u s i o nw a s1 ：1 ，t h es t a b i l i t yc o n s t a n t so fi n c l u s i o nc o m p l e x e sw e r ek = 3 3 3 3 m o l l ( p c d ) 、k = 3 4 3 8m o l l ( h p - p - c d ) 和k = 4 61 6 3m o l l ( m e 一1 3 一c d ) i ts h o w e dt h a t t h es t a b i l i t yo f1 3 - c di n c l u s i o nc o m p l e xw i t hc h l o r p y r i f o sw a st h ew o r s t ，h p - d c d 、 v 山东大学硕士学位论文 m e d c di n c l u s i o nc o m p l e xw e r es t a b l e t h ei m p o r t a n tt h e r m o d y n a m i cp a r a m e t e r s gw e r e c a l c u l a t e db y g = - r i n k , t h a tw e r e - 8 6 9 k j m o l ( 1 3 - c d ) 、 - 2 0 18 4 k j m o i ( h p p c d ) 、一15 21k j m o l ( m e - p - c d ) i ts h o w e dt h a ti n c l u s i o n r e a c t i o n sw e r es p o n t a n e o u sp r o c e s s ，a n dt h e i ri n c l u s i o nc o n s t a n td e c r e a s e sw i t h i n c r e a s i n gt e m p e r a t u r e ，i n d i c a t i n gt h a ti n c l u s i o ni sa l le x o t h e r m i cp r o c e s s 4 t h e l i q u i d i n c l u s i o n c o m p l e x e s o f1 3 - c d ，h p - p c d ，m p - c da n d c h l o r p y r i f o s w e r ec h a r a c t e r i z e d b y u vs p e c t r o s c o p y , r e s p e c t i v e l y w h e n c o n c e n t r a t i o n so fo b j e c tc h l o r p y r i f o sw a sf i x e d ，w i t hi n c r e a s i n go ft h ec o n c e n t r a t i o n o ft h em a i n ，t h ee n t i r es y s t e mo fa b s o r p t i o nt h e mw a sn oo b v i o u ss h i f t ，h o w e v e r , t h em a x i m u ma b s o r p t i o np e a ka tt h ea b s o r b a n c eg r a d u a l l yi n c r e a s e d i ts h o w e dt h a t c h l o r p y r i f o sh a v e b e e nr e c o g n i z e db y1 3 - c da n d i t sd e r i v a t i v e s 5 t h es o l i di n c l u s i o nc o m p l e x e so f1 3 - c d ，h p p - c d ，m p - c da n d e h l o r p y r i f o sw e r ec h a r a c t e r i z e db yi n f r a r e da b s o r p t i o ns p e c t r o s c o p ya n dd i f f e r e n t i a l t h e r m a la n a l y s i s ，r e s p e c t i v e l y d s cs h o w e dt h a tt h r e ei n c l u s i o no n l ya p p e a r e d d e h y d r a t i o np e a ko fm a i ne l e m e n t s ，o r i g i n a la b s o r p t i o np e a k so fc h l o r p y r i f o s d i s a p p e a r e d i n f r a r e da b s o r p t i o ns p e c t r ac e r t i f i e d t h ec h a r a c t e r i s t i ca b s o r p t i o np e a k s o fc h l o r p y r i f o sd i s a p p e a r e di nt h r e ek i n d so fi n c l u s i o n ，m a i n l ya st h em a i n m o l e c u l a rm a p i tc o n f i r m e dt h a t1 3 - c y c l o d e x t r i n ，h p p c da n dm p c da n d c h l o r p y r i f o sh a v ef o r m e das t a b l e1 ：1i n c l u s i o nc o m p l e x 6 t h er e s u l t so fi n d o o ri n s e c t i c i d et o x i c i t yo fi n c l u s i o ns h o w e dt h a t ：t h em e d i a n l e t h a lc o n c e n t r a t i o nl c 5 0o fi n c l u s i o nc o m p l e xo f 3 - c d ，h p - p - c d ，m - p c da n d c h l o r p y r i f o sw e r e1 6 1 p g m l ，1 0 8 r t g m la n d1 2 3 嵋n l l ，r e s p e c t i v e l y t h ec o m p o s i t i o no ft h ec de s p e c i a l l yt h el a r g er i n gc dw e r ef i r s t l yd e t e c t e d u s i n gt h eh p a e c an o v e lm e t h o dt h a tc a nd e t e c tt h ec d - p r o d u c i n ga b i l i t yo f t h e c g t a s ed u r i n gt h ed i f f e r e n ts t a g e sw a ss e tu p t h ei n c l u s i o no ft h ec da n d c h l o r p y r i f o sc a ni n c r e a s et h es o l u b i l i t yo ft h ec h l o r p y r i f o sa n di t se f f i c a c y t h e r e s e a e hw a st h eb a s i st ot h ee x t e n s i o no ft h ei n c l u s i o no ft h ec da n dp e s t i c i d e s k e y w o r d s ：1 3 - c y c l o d e x t r i n ；c y c l o d e x t r i ng l u c a n o t r a n s f e r a s e ； i n c l u s i o n ； c h l o p y r i f o s ；c h a r a c t e r i z a t i o n 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明 的法律责任由本人承担。 论文作者签名： 蚤医二丛 e t 期：塑2 ：! ! ：三7 关于学位论文使用授权的声明 本人同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的印刷件和 电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 一：避名挚蝉 山不大宇帧士掌位论文 第一章前言 引言 环糊精( c y c l o d e x t r i n s ，c d s ) 也称环聚葡萄糖，是由环糊精葡萄糖基转移酶 ( c y c l o d e x t r i ng l y c o s y l t r a n s f e r a s e ，c g t a s e ) 作用于淀粉所形成，它由多个d 一吡 喃葡萄糖单元彼此间通过a 1 、4 糖苷键连接而成的一类环状低聚糖【1 2 1 。目前 人们常用的环糊精主要有三种，分别是由6 、7 、8 个葡萄糖单元以q 一1 ，4 糖苷 键连接而成小、b 、t - c d 3 1 。其中p - c d 生产成本相对较低，因此被人们广泛研 究和使用。葡萄糖个数大于9 的c d s 一般称为大环糊精( l a r g er i n gc y c l o d e x t r i n ) ， 环的大小与结构是由聚合度的大小决定的，聚合度较大的大环糊精可以折叠成为 两个疏水空腔，因此其结构稳定性较差，并且伴随客体分子和溶剂的变化而变化， 目前对其的研究尚处于初始阶段【4 ，5 1 。 环糊精是一种具有水溶性、非还原性、不易被酸水解等特点的白色结晶或无 定型粉末，无毒，可食用，具有多孔性。环糊精与弱极性有机物或官能团能形成 主- 客体包合物，可以起到保护、稳定、增溶客体分子和选择定向分子等作用。 目前，环糊精作为辅料或添加剂己广泛应用于药品、食品、化妆品及农用化学品 剂型制备。研究工作也从单一研究其在增强药物溶解性能，提高生物利用度，改 善药物稳定性等作用方面，发展到研究包合物制备、鉴定、质量标准、构型和作 用机理等。 环糊精于18 9 1 年由v i l l i e r s 首次发现，2 0 世纪上半叶环糊精研究得到了较快发 展，为当今环糊精研究与生产奠定了基础。2 0 世纪初s c h a r d i n g e r 成功分离出一株 产环糊精糖基转移酶的菌株b a c i l l u sm a c e r a n s ，1 9 3 5 年f r e n d e n b e r g 对环糊精结构 进行了表征【6 】。2 0 世纪中后期环糊精得到较为广泛的研究和应用。1 9 8 7 年诺贝尔 化学奖授予了在主一客体化学和超分子化学方面做出突出贡献的l e h n 等三位化 学家，更是促进了环糊精化学的发展。我国的环糊精研究起步较晚，2 0 世纪7 0 、 8 0 年代初，中国科学院兰州化学物理研究所、微生物研究所、江苏食品发酵研究 所及上海医药工业研究所先后开展了环糊精研究生产。淡家林等人于8 0 年代初利 用软化芽孢杆菌和嗜碱芽孢杆菌作用于淀粉开始生产环糊精的研究。2 0 世纪末我 国大批环糊精生产企业开始投产。目前世界上环糊精的年总产量超过1 0 0 0 吨，p 环糊精的价格从1 9 7 0 年的2 0 0 0 美元l 【g 降到今天的3 5 美元 毋7 一。 由于i - c d 水溶性小的特点限制了其更广泛的应用，1 3 - c d 衍生物因具有更 加优越的理化性质和包结行为而备受关注。2 0 世纪9 0 年初人们开始对p c d 进 山东大学硕士学位论文 行各种结构修饰并对其衍生物进行了各方面的应用研究，主要包括烷基化、羟烷 基化、分支化等。伴随各种性能优越的环糊精衍生物的不断出现和规模化生产， 为环糊精的应用提供了更为广阔的前景。环糊精衍生物( c y c l o d e x t r i nd e r i v a t i v e s ) 又称为改性环糊精( m o d i f i e dc y c l o d e x t r i n ) 是指在环糊精大环基本骨架不变情况下 引入修饰基团，得到具有不同性质或功能产物，具有比母体环糊精更优良的特性， 能解决许多技术难题【9 , 1 0 。改性环糊精特别是甲基和羟丙基改性环糊精水溶性 好、毒性低、价格相对较低、应用广泛，因此对天然环糊精进行改性具有很高的 理论研究和应用价值。 目前，环糊精及其衍生物已被广泛用于医药、食品、环保、农业等领域，仅 已上市的环糊精药品就达三十种余种，但是环糊精农药包合物产品还未见上市。 同时，由于近年来山东及黄淮海地区花生种植深受蛴螬等地下害虫的危害，大量 有机农药的使用，导致害虫抗药性不断增强，大量有机溶剂流失到田间，给农业 生产、农产品品质及环境保护均带来了严重的负面影响。毒死蜱是目前用于杀灭 大田蛴螬的中等毒性杀虫剂，其水溶性较差。为使毒死蛑能够得到水基化推广和 应用，同时提高其生物利用度和药效，本试验计划利用d 环糊精及其衍生物作为 主体分子对农药毒死蜱进行包合并制备出包合物。在此基础上，我们对包合物进 行表征研究，筛选得到最佳包合方法和条件，从而为毒死蜱水基化推广应用奠定 了基础。 环糊精是由环糊精葡萄糖基转移酶( c y c l o m a l t o d e x t r i ng l u c a n o t r a n s f e r a s e ， c g t a s e ) 作用于淀粉后使葡萄糖基发生转移反应而获得，该转移酶能进行环化、 偶合、歧化、水解等4 种反应，酶的催化产物除a 、3 - 及丫- 环糊精外，还含有葡 萄糖、麦芽糖、麦芽三糖及其他线形糊精等多种物质。由于环糊精的分离工艺比 较复杂，因而寻找利用淀粉产生特定环糊精的微生物菌株非常重要。但是用常规 传统的分离方法筛选这种菌株需要耗费很大时间和精力，本研究计划建立一种利 用高效阴离子色谱快速、直接地检测了微生物发酵液中的环糊精成分，尤其是大 环糊精的组成的新方法。本试验将为确定环糊精糖基转移酶在不同阶段产生的环 糊精种类，及不同细菌产生的不同环糊精的能力提供了新的思路和方法，近而推 动环糊精生产工业快速向前发展。 1 环糊精及其衍生物介绍 1 1 环糊精的结构与性质 环糊精是一类上下开口中空、截锥状大环化合物，具有外亲水，内疏水的立 2 东大学硕士学位论文 体空腔结构，可以包结许多客体分子形成包合物。其中p c d 结构如图1 1 所示。 环糊精分子中的d 毗喃葡萄糖单元均采取未被扭曲的椅式构象，内腔大小由葡萄 糖分子多少决定，不同种类的环糊精空洞大小不同。c 2 和c 3 位上的仲羟基位于 锥形圆筒外侧大口端，c 6 位上的伯羟基位于小口端，而指向锥体内部的c 3 和c 2 上的未成键孤对电子的糖苷氧原子指向分子中心，使环糊精空腔内部产生高电子 云密度，致使分子中心呈疏水性而表面呈亲水性，c 1 、c 4 及c 5 形成腔内笼型疏 水区。这种特殊空腔结构能通过分子间作用力，如范德华力、氢键或疏水作用， 包容各种有机、无机分子或离子( 即客体) ，形成超分子。将形状和大小合适的疏 水物质的分子或基团嵌入笼中形成包合物而改变被包化合物的理化特性，并借其 特殊的结构而增加被包化合物的“极性”，从而增加了一些脂溶性化合物在水中 的溶解性 1 1 - 1 2 。 常见的洳、d 一、y - c d 为白色结晶粉末，空间结构如图1 2 所示，2 0 0 c 左右时 开始分解。由于环糊精分子中相邻葡萄糖分子c 2 和c 3 位上的羟基易形成分子内 氢键，使得分子具有相当的刚性，多个葡萄分子间形成的分子氢键网络致使0 【- 、 p 、y - c d 在水中溶剂度较低。环糊精的部分物理常数见表1 1 。其中d c d 在水中 易于结晶和提纯，它在水中的溶解度比较低，在室温为1 8 5 9 1 0 0 m l 。c d s 的水溶 解度是温度的函数，c d s 的水溶解度随温度的上升而增高， 3 - c d 在水中不同温度 的溶解度见表1 2 。 秀魏螨貉 秀蠢貉 荔氯社d 图1 - 1b - c d 的结构图1 2a - 、p 、y - c d 的结构 f i g u r e1 - 1s t r u c t u r eo f l 3 - c df i g u r e1 - 2 s t r u c t u r eo f 甜，p ，y - c d a c d 的一个吡喃葡萄糖单元处于扭曲状态，6 个吡喃葡萄糖单元之间只生成 4 个氢键，分子具有一定的柔性，因此溶解度大于d c d 。而丫c d 的非共面结构使 之更具柔性，是3 个c d s 中水溶解度最大的。c d s 一般不溶解于有机溶剂。 c d s 在碱性乃至强碱性溶液中都是稳定的，但是在酸性溶液中部分可水解产 3 山东大学硕士学位论文 生葡萄糖和系列非环麦芽糖。由于没有还原末端，c d s 对酸的稳定性比线状糊精 高2 5 倍，可见环状分子配糖键的开裂是一个慢过程，而且初始阶段的水解速度 比终了阶段要慢的多。引入修饰基团后能提高c d s 的热稳定性【1 3 。1 5 】。 表1 1 环糊精的部分物理常数 t a b 1 1s o m ep h y s i c a lp a r a m e t e r so fc d 表1 - 2p c d 在水中不同温度的溶解度 t a b 卜2b c di nw a t e rs o l u b i l i t ya td i f f e r e n tt e m p e r a t u r e s 温度( )2 02 53 04 05 06 07 08 0 9 0 溶解度( ) 1 6 4 1 8 52 2 83 4 95 2 77 2 91 2 0 31 9 6 62 0 0 0 1 2 环糊精衍生物的结构与性质 为了改善提高环糊精的性质和应用范围，人们开始对其6 一环糊精进行改造。 p 环糊精衍生物是p 一环糊精经不同化学修饰后获得的一系列新型化合物。p 一环糊 精衍生物种类繁多，主要分为甲基化或烷基化衍生物、羟烷基化衍生物、分枝化 衍生物、磺烷基醚化衍生物等几大类。按取代基的性质大体可分为水溶性、疏水 性及离子性三种。水溶性环糊精衍生物产品有支链环糊精，甲基化环糊精，羟乙 基环糊精，羟丙基环糊精，低分子量p 环糊精聚合物( 分子量为3 0 0 - , 6 0 0 0 ) 等；疏 水性环糊精衍生物产品有乙基环糊精，乙酞基环糊精等；离子性环糊精衍生物产 品有含阳离子产品及阴离子产品，阴离子产品如硫酸酯环糊精和磷酸酯环糊精等 1 6 1 o 羟丙基p 环糊精( h p p c d ) 是p c d 中葡萄糖残基上的羟基发生醚化反应 引入羟丙基的产物，其葡萄糖残基上c 2 位羟基的氢原子被羟丙基所取代，使环 糊精的分子间氢键遭到破坏，增加了其水溶性。通常以平均取代度来表示或衡量 产物中羟丙基的取代情况。平均取代度最大为2 1 ，最小为小数。其中以2 i i p d c d 研究最为广泛。 h p b c d 呈非晶型粉末状，由于羟丙基具有亲水性，使得h p p c d 具有水溶 4 l l j 东大学硕士学位论文 性和亲水性的性质，属于亲水性p c d 衍生物的一种。表面活性较小，易与生物 环境相溶，l i p p c d 的水溶性较大，h p p c d 水溶性大于5 0 d 1 0 0 m l 。不同的平均 取代度产物，吸湿性和增溶效果也不同。随着取代度的增加，比旋光度和表面张 力均呈下降趋势。羟丙基基团可能增加了空腔体积，或者与客体分子形成新的氢 键增加了复合物的稳定性，使得羟丙基环糊精形成复合物的能力上升。药物与 h p p c d 包结后，能显著改善药物的理化性质，具有增加药物的溶解度和溶出速 度，提高药物的稳定性，对药物进行缓释和控释，提高药物的生物利用度等优点。 目前已经有很多p c d 及h p p c d 与药物的包结物上市。 甲基p 环糊精( m e p c d ) 在水中溶解度很高，p c d 的溶解度是随温度升 高而增加，但m e p c d 溶解度是随温度升高却急剧下降。m e p c d 具有低吸湿性 和高表面活性的特性，包结特性良好，包结物在水中的溶解度也显著增大。由于 环糊精分子空腔外表面引入甲基基团后，其原有的结构与性质都得到了改变，三 甲基1 3 环糊精上i z l 变得更窄，而下e l 则变得更宽。空间位阻增大，环糊精结构 扭曲程度增加。 乙基化一1 3 一环糊精产品难溶于水，具有表面活性，能包结亲水性分子，可利 用此特性使亲水性药物的水溶性降低，控制药物的释放速率，可用于缓释水溶性 药物。 1 3 环糊精衍生物的形成机理及分类 环糊精可进行很多种类的化学反应，分子中0 h 、c h 、c 一0 和c c 键均 可断裂，但人们的兴趣在于保持环糊精大环结构不变的化学反应。修饰环糊精 ( m e d i f i e d c y c l o d e x t r i n ) 指在保持大环基本骨架不变的情况下引入一个或多个取代 基。通过修饰可以达到以下目的：( 1 ) 引入基团增加水溶性，特别是包合物或 超分子复合体的水中溶解度；( 2 ) 进行三维空间修饰，扩大结合空腔或者提供 有特定几何形成的空间，以与底物或客体分子有适宜的匹配；( 3 ) 引入特殊基 团，构筑有特殊功能的超分子和自集成超分子聚集体； ( 4 ) 融入高分子结构， 获得有特殊性质的新材料。其中用引入取代基的化学修饰方法连同由酶法修饰加 以改进生成的均分支环糊精一并叫作第二代产物；而由葡萄糖修饰的杂分支环糊 精称为第三代环糊精。化学法修饰的c d s 主要是四大类，包括： ( 1 ) 酯衍生物：其中取代基以酯键与吡喃葡萄糖单元的c 2 ，c 3 ，c 6 位连接。 具有实际意义的是有机酯的引入，如磺酸酯、氨基甲酸酯等，其中氨基甲酸酯 c d s 化学稳定性高，用于制备加盖( c a p p i n g ) c d s 或硅胶衍生物。c d s 的无机酸酯 5 l f j 东大学硕士学位论文 研究的较少，主要是硝酸酯、硫酸酯和磷酸酯【j 7 1 。 ( 2 ) 醚衍生物：取代基与c d s 的c 2 ，c 3 ，c 6 位以氧原子连接来修饰c d s 。研 究最多的是甲基、乙基与羟丙基醚，均已规模化生产并得已广泛应用。二甲基 p c d 在l o o m l 水中溶解度超过5 5 9 ；h p - 1 3 - c d 在室温下溶解度超过5 0 9 1 0 0 m l ， 甚至可以高达7 5 1 0 0 m l 以上【1 8 】。 ( 3 ) 去氧环糊精：在去氧c d s 中有2 种类别，一类作为最终产物包括o 和- n h 及氢原子代替o h 基的衍生物，另一类是作为中间体可以进一步衍生化的有c l ( b r ，d 和环氧基修饰的c d s 衍生物【1 9 1 。 ( 4 ) 特殊功能化的修饰环糊精：通过上述中间体，或直接以酯、醚键连接功 能基团的修饰c d s 对于理论研究和扩展应用都有十分重要的意义。c d s - - 聚体是 通过各种桥基和不同桥联方式结合而成，由于结合位点的增加，以及可以通过调 节联接基团以达到适宜的几何匹配，就能够克服c d s 在模拟抗体的特异结合以及 酶的特异结合与催化时遇到的结合常数过低、柔性过大的问题 2 0 2 1 1 。 1 4 环糊精及其衍生物的应用 环糊精具有疏水空洞和相对柔性独特结构，在碱性溶液甚至在固体状态下均 能作为主体分子包合无机、有机、中性、离子型化合物及稀有气体在内的多种客 体分子，从而形成稳定的包合物，从而使客体分子的溶解性能、化学性能、挥发 性、电化学性能、亲水性以及光化学性能等许多性质上都发生了改变，包结物的 稳定程度也将随着客体分子的极性、立体结构和构象等因素的不同而表现出一系 列的差异性。 当客体分子大小与c d 内腔不相匹配时，c d 可以通过对客体分子部分基团 或侧链作用而产生一定的识别效果。影响包合物的稳定能力的重要因素除了c d 与客体分子自身的性能特点以外，还与c d 和客体分子在包结复合时的温度以及 所处的介质组成等有关。温度越高，介质中的有机溶剂成分越多，则c d 与客体 分子所形成的包结复合物稳定性就越弱2 2 2 3 1 。产生包合物的作用力主要有四种： ( 1 ) 环糊精空腔与客体分子上的疏水部位之间的范德华力作用；( 2 ) 环糊精羟 基与客体分子上极性基团之间氢键的作用：( 3 ) 包结复合物形成过程中，环糊精 空腔内处于高能状态的水分子的释放；( 4 ) 环糊精环骨架的张力能的释放。 其中，由于d c d 具有溶解度低、容易结晶、分离和提纯、生产成本低、空 腔大小适中等特点，因此争c d 应用最为广泛。同时，i b - c d 具有溶解度低的特点 也限制了其某些方面的应用。l i p 1 3 c d 破坏- r 1 3 c d 的分子内氢键，并且是无定形 6 山东大学硕士学位论文 物质，结晶性降低，在水中的溶解度大大提升，克服了p c d 在水中溶解度低的 缺陷，形成复合物的能力也有所上升。但取代度过高可能会产生空间位阻减少进 入空腔的客体分子。合适的取代度和取代基分布是羟丙基环糊精达到最佳复合效 果的重要因素。 p c d 及其衍生物包结客体分子形成包合物从而有效地改善客体分子的物理 化学性质，主要体现在以下几个方面： ( 1 ) 稳定光敏、易氧化物质的性质；( 2 ) 修饰客体分子的化学反应特性； ( 3 ) 固定易挥发物质或液体物质；( 4 ) 提高被包结物质的溶解度和稳定性； ( 5 ) 保护客体分子不被微生物降解；( 6 ) 掩蔽难闻的气味与色泽。 在包合物中，药物失去了原有的结晶性而以分子状态进入环糊精的空穴中 由于环糊精分子含有多个亲水性的醇羟基，故能使药物的溶解度和溶解速度增 加，从而提高了药物的生物利用度，因此近年来，利用某些亲水性环糊精对疏水 性药物进行包合以增加其水溶性及药物稳定性是人们主要研究兴趣所在。同时镧 成包合物后，在一定程度上切断药物分子与周围环境的接触，避免受光、热、氧 以及水解条件的影响。 目前，c d 及其衍生物的理论研究和应用开发涉及到很多领域，如药物、电 化学、食物和环保等。c d 包合物已经从试验阶段正式进入工业化生产阶段，今 后随着工业生产环糊精的增长，价格质量等方面都会有较大的改善，其应用会更 加广泛。天然环糊精由于自身的缺点所限制的应用，将由环糊精衍生物去拓宽， 相比较而言，环糊精衍生物的应用前景将更为广阔。具体主要用于以下几个方面： ( 1 ) 在医药领域环糊精可以通过包合药物来提高其溶解度和稳定性，以增 强其生物利用度，缓解药物对肠胃的刺激，消除某些药物的异味，减少药物的毒 副作用，控制药物释放，延长药物作用期，提高疗效。l i p p c d 被认为是最有用 的c d s 衍生物之一，是最有前途的药物载体，是美国f d a 批准的第一个可供静脉 注射1 3 一c d 的衍生物。因此，利用l i p 1 3 一c d 作为分子微胶囊材料，可以应用于基因 工程、生物工程、新药制备等许多方面，由此可以得到一系列具有高效、高附加 值的新药。 ( 2 ) 在农业上环糊精能使杀虫剂等药物稳定化，并提高了生物利用度。如 见光易分解的天然或人造杀虫、杀菌药物用环糊精包结后，性能十分稳定。农田 除草剂与植物生长调节剂均可用环糊精来稳定。 ( 3 ) 在食品工业上，可用环糊精去除异味，改善食品组织结构，提高抗氧 7 山东大学硕士学f ) ：论文 力，使产品口感醇厚、细腻，并延长产品货架期、降低成本。食品、果蔬中的苦 涩味、鱼腥味、蒜臭味、羊膻味、大葱味、豆腥味以及咖啡、可可、巧克力中的 苦味均可用它去除。 ( 4 ) 在日用品工业方面，环糊精可用来制造牙粉，在洗衣粉中用作消泡剂， 并可制造芳香洗衣粉、蚊香及洗浴用品。烟草业可以用它来保持香和增加品质、 可制作卷烟的过滤嘴吸附剂。 ( 5 ) 在环境保护方面，环糊精及其衍生物能在特定