（发酵工程专业论文）螺旋纤维床生物反应器固定化细胞降解壳聚糖的研究.pdf

浙江工业大学硕士学位论文 螺旋纤维床生物反应器固定化细胞 降解壳聚糖的研究 摘要 对绿色木霉8 6 7 的发酵产酶条件进行了优化研究，确定其最适产酶 培养基组分为( g l 。1 ) ：可溶性壳聚糖9 ，氨基葡萄糖5 ，蛋白胨8 5 ， k 2 h p 0 41 6 ，f a g l 2 2 1 - 1 2 0o 5 5 ，m g s 0 4 7 h 2 0o 3 ，f e s 0 4 6 1 - 1 2 0o 0 7 ， m n s 0 4 h 2 00 0 1 6 ，z n s 0 4 7 1 - 1 2 0o 0 1 4 ，c o c l 2 6 i t 2 00 0 3 7 。最适培养 条件为：培养基初始p h5 5 ，培养温度2 8 ，接种量6 ，摇瓶装量为 2 5 0m l 的三角瓶中装7 5m l 培养基。在最适条件下培养4 0h 后酶活可达最 大，为2 9 1u l ，比优化前提高2 9 9 。 对固定化绿色木霉产酶进行了研究，确定固定化的最优条件为( 摇 瓶) ：接种量1 0 7 个m l 、载体1 0 6g 5 0m l 培养基、静止时间2h 、培 养时间4 8 h 。 采用硫酸铵盐析、透析、超滤等方法对发酵液进行了初步分离纯 化。确定盐析的最佳浓度为6 0 。粗酶液经初步纯化后，比酶活提高 1 3 0 倍，酶活回收率达7 4 4 。对该酶进行部分酶学性质的研究表明： 酶的最适反应温度为5 5 。c 。在3 0 6 0 。c 具有较强的热稳定性。酶反应 的最适p h 为5 0 ，在p h4 5 6 0 范围内具有较好的稳定性。该酶的最 适作用底物为壳聚糖。c u 2 + 、f e 2 + 、z n 2 + 、m n 2 + 、脲对酶有一定的抑制 作用，k + 、c a ：+ 对酶有一定的激活作用，而m 9 2 + 、e d t a 对酶几乎没 i 浙江工业大学硕士学位论文 有影响。 螺旋纤维床生物反应器固定化细胞同时产酶降解壳聚糖的研究表 明，固定化的最适条件为：葡萄糖l o o g l 、接种量1 0 7 个m l 、通风 量2 0v v n l 、转速3 0 0 r m i n 。在选用1 的壳聚糖为唯一碳氮源的降解 培养基后，间歇降解8 批都很稳定，平均降解率达8 0 左右。培养基 加入量在1 0l d a y 条件下，连续降解7 天都较稳定，降解率达7 0 2 e 右。 关键词：绿色木霉；壳聚糖酶；发酵工艺；降解；螺旋纤维床生物反 应器 i i 浙江工业大学硕士学位论文 s t u d y o nd e g r a d a t i o no fc h i t o s a nb yi m m o b i l i z e dc e l l si n c o n v o l u t e df i b r o u sb e db i o r e a e t o r a b s t r a c t p r o d u c t i o no fc h i t o s a n a s eb yt r i c h o d e r m av i r i d ew a ss t u d i e d t h e o p t i m a lc o m p o s i t i o n s o ft h em e d i u mw e r ea sf o l l o w s ( g l - i ) ：s o l v e d c h i t o s a n9 0 g l u c o s a m i n e5 ，p e p t o n e8 5 ，k 2 h p 0 41 6 ，c a c l 2 2 h 2 00 5 5 ， m g s 0 4 7 h 2 00 3 ，f e s 0 4 6 h 2 0o 0 7 ，m n s 0 4 h 2 0 0 016 ，z n s 0 4 7 h 2 0 0 0 1 4 ，c o c l 2 6 h 2 0o 0 3 7 t h eo p t i m a lc u l t u r ec o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w s ： t h ei n i t i a lp h5 5 ，t e m p e r a t u r e2 8 ，i n o c u l u ms i z e6 ，7 5m lm e d i u mi n 2 5 0m ls h a k e nf l a s k i no p t i m i z e dc o n d i t i o n s ，t h ea c t i v i t yo fc h i t o s a n a s e r e a c h e d2 9 1u l a f t e r4 0h 2 9 9 h i g h e rt h a no r i g i n a lc o n d i t i o n s t h ei m m o b i l i z a t i o no ft r i c h o d e r m av i r i d e8 6 7w a sa l s os t u d i e d t h e o p t i m a li m m o b i l i z e dc o n d i t i o n sw e r e a sf o l l o w s ( f l a s k s ) ：i n o c u l u ms i z ew a s 10 7 m l ，s u p p o r tw e i g h tw a s0 6e g s 0m lm e d i u m ，s t a yt i m ew a s2h ， c u l u r et i m ew a s4 8h c h i t o s a n a s ew a ss i m p l yp u r i f i e db ys a l t i n go u t ，d i a l y s i s ，u l t r a f i l t r a t i o n t h e o p t i m a l c o n c e n t r a t i o no fa m m o n i u ms u l f a t ew a s6 0 ，a f t e r p u r i f i c a t i o n ，t h es p e c i f i ca c t i v i t yo fc h i t o s a n s ew a s1 3t i m e sh i g h e rt h a n t h eo r i g i n a lo n e a n dt h er e c o v e r yo fc h i t o s a n a s ew a s7 4 4 e x p e r i m e n t s s h o w e dt h a tt h eo p t i m a lr e a c t i o nt e m p e r a t u r ea n dp ho fc h i t o s a n a s ew e r e i l l 浙江工业大学硕士学位论文 5 5 * c a n d5 0 ，r e s p e c t i v e l y t h ee n z y m ew a ss t a b l eb e t w e e n3 0 - 6 0 a n d p h 4 5 6 0 t h eo p t i m a ls u b s t r a t ew a sc h i t o s a n c u 2 + ，f e 2 + ，z n 2 + ，m n 2 + a n d u r e ah a di n h i b i t i o ne f f e c t ，w h i l ek + ，c a 2 + h a da c t i v a t i o ne f f e c t i na d d i t i o n ， m 9 2 + ，e d t ah a d l i t t l ee f f e c to nc h i t o s a n s e d e g r a d a t i o no fc h i t o a nu s i n gc h i t o s a n s ep r o d u c e db yi m m o b i l i z e d t r i c h o d e r m av i r i d ei nc o n v o l u t e df i b r o u sb e db i o r e a c t o rw a ss t u d i e d e x p e r i m e n t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m a li m m o b i l i z e dc o n d i t i o n sw a sg l u c o s e l o o g l ，i n o c u l u m s i z e 1 0 7 m l ，a e r a t i o nr a t e 2 0v v n l ，r o t a t e s p e e d 3 0 0 r m i n u s i o n g1 c h i t o s a na st h eo n l yc a r b o na n dn i t r o g e ns o u r c e ，t h e d e g r a d a t i o nr a t ew a sv e r ys t a b l ei ne i g h tb a t c h t h em e a nd e g r a d a t i o nr a t e o ft h e s ee i g h tb a t c hw a s8 0 o nt h ec o n d i t i o no fa d d i n g10lc u l t u r e m e d i u mp e rd a y , t h ed e g r a d a t i o nr a t ew a ss t a b l ea n dr e a c h e d7 0 d u r i n g7 d a y s k e yw o r d s ：t r i c h o d e r m av i r i d e ；c h i t o s a n a s e ；f e r m e n t a t i o nt e c h n i c s ； d e g r a d a t i o n ；c o n v o l u t e df i b r o u sb e d b i o r e a c t o r 浙江工业大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工 作所取得的研究成果。除文中已经加以标注引用的内容外，本论文不包含其他个 人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得浙江工业大学或其它教育 机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均 已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。 作者签名：k 如 日期：狒，月矽日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。 本人授权浙江工业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文 本学位论文属于 l 、保密口，在 年解密后适用本授权书。 2 、不保密口。 ( 请在以上相应方框内打“，”) 作者签名：枷扎日期；夕1 年j ，月日 导师签名：目嗡参日期：巧i f 6 月垆日 浙江工业大学硬士学位论文 1 1 引言 第一章论文综述 甲壳素( c h i t i n ) 是一种天然氨基多糖高分子物质，广泛存在于微生物界( 菇等菌 类的细胞壁) 、植物界( 藻类) 及动物界【1 1 ( 虾、蟹等甲壳类动物和昆虫的外份骼) ，是 继纤维素之后的第二大再生资源。壳聚糖( c h i t o s a n ) y 名甲壳胺，是甲壳素脱乙酰 化产物，化学名称为( 1 ，4 m 氨基- 2 一脱氧- d 一葡聚糖，分子式为( c 谢1 3 n 哂) n ，属 天然含氨基的均态直链多糖，含有游离氨基，反应活性和溶解性能均比甲壳素强。 它无毒无味、耐热、耐碱、耐腐蚀、兼容性宽1 2 - 4 1 。具有优良的生物亲和性，它由 生物合成，也能被生物所降解，具有独特的生理特征，因此引起人们广泛关注 从1 9 7 7 年起，每隔几年召开一次关于甲壳素及壳聚糖的国际会议，极大地促进了 壳聚糖的研究。我国早在五十年代就对甲壳素的制备及其应用进行了研究，但直 到八十年代初，甲壳素的开发利用才引起专家学者的重视。 1 2 壳聚糖的结构 图i 1 壳聚塘分子结构示意图 如图l 1 所示，壳聚糖的单体分别是n - 乙酰氨基葡萄糖( g i c n a c ) 和氨基葡萄 糖c o i c n ) ，分子呈直链状，链上分布着许多n 乙酰氨基、羟基，它们形成了大量 的分子间和分子内氢键。壳聚糖分子间强烈的氢键作用，使其具有紧密的晶体结 构，因而它不溶于普通溶剂，只在某些酸性介质中溶解。壳聚糖的溶解性也与其结构 浙江工业大学硕士学位论文 有着很大关系，已有研究表明，壳聚糖存在a 、1 3 、_ r 三种晶体，为一同质多晶聚合 物。a - 甲壳素由两条分子链反平行( 锄虹p a r a i i e l ) 堆积，构成斜方晶胞( o r t h o r h o m b i c u n i tc e l l ) 。争甲壳素由两条分子链平行( p a r a l l e l ) 堆积，构成单斜晶f 咆( m o n o c l i n i cu n i t c e u ) 。p 甲壳素的分子链则是上下排列。a 甲壳素与争甲壳素在一定条件下可相互 转换，争甲壳素在6 m o l l 盐酸中会变成a 甲壳索，丽a - 甲壳素经化学处理可使分 子间氢健重组转变成b - 甲壳素。 在动物体中a 甲壳素通常与矿物质沉积在一起，形成坚硬的外壳，而p 和y 甲壳素与胶原蛋白相联结，表现出一定的硬度、柔韧性和流动性，并赋予支承体 许多生理功能，如电解质的控制和聚阴离子物质的运送等。目前应用价值最大和 研究最多的就是争壳聚糖了。 在p 壳聚糖晶体中，根据其是否含水，可分为水合型壳聚糖( h y d r a t e dc r y s t a l ) p 1 和无水型壳聚糖( 朗h y d b 璐c r y s t a l ) 旧；而在壳聚糖溶液中，根据壳聚糖分子中 重复单元长度的不同，可分为t y p ei 型f f l 和t y p en 型【s l 两种。 1 2 1 壳聚糖晶体的结构 壳聚糖晶体中，其结构单元是由二个单糖( n - 乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖) 通过0 ( 3 ) - 0 ( 5 ) 之间的氢键连接面成的壳二糖。在壳聚糖大分子链上分布着许多羟 基、氨基及- 乙酰氨基，它们会形成各种分子内和分子问的氢键，正是这些氢键 的存在和分子的规整性，使壳聚糖分子容易形成结晶区( 晶相区) 。 研究证实 7 j ，水合型壳聚糖具有复杂的双螺旋结构，其重复单元长度大约 1 0 3 4 a 两糖基之间的夹角t p ( c 2 - c i - 0 1 - c 4 ) 和以c 1 0 1 c 4 - c 3 ) 分别为1 4 5 9 。和 9 4 1 。，其中0 6 原子构象为构象( x ( 0 5 - c 5 - c 6 - 0 6 ) = 6 8 6 0 ) ，其晶格常数为 萨8 9 5 ( 4 ) ，b = 1 6 9 7 ( 6 ) ，d 纤维轴产1 0 3 4 a ，空间点阵为p 2 n 2 l 二1 2 ，在晶体结构上， 沿b 轴方向，两条聚合链以反平行方式由n ( 2 ) - 0 ( 6 ) 之回氢键( 2 。5 1 a 和2 9 9a ) 连接形成一平行于幻平面的网状结构，在a 轴方向上，由于分子间氢键的作用而 形成网格堆积。水分子就在两网格问同o 、n 形成分子间氢键。其结构如图1 - 2 所 示 2 浙江工业大学硕士学位论文 图1 2 水合型壳聚糖的结构 f g i - 2t h es t r u c t u r eo f h y d r a 删c r y s l a lc h i t o s a n 当水合型壳聚糖在水中加热至2 0 0 c 时，水合型壳聚糖就会变成无水型壳聚 糖，壳聚糖的这个变化过程是不可逆的。当脱水现象出现时，为填充水分子留下 的空间，壳聚糖两分子链之间的氢键断裂，两聚合链以相反方向向口轴旋转9 0 度， 从而形成与口c 面平行。并向b 轴堆积的网状结构。 1 2 2 溶液中壳聚糖的结构 由于壳聚糖不溶于水而溶于酸，因此壳聚糖的很多特性如抑菌性、生物可降解 性等只有在壳聚糖盐溶液中才体现出来。从而研究壳聚糖盐的结构及分子构象则 显得非常重要。在壳聚糖溶液中，根据晶格中重复单元长度的不同可分为两种：t y p e i 型0 0 3 1 a ) 和t y p ei i 型( 4 0 5 4a ) 。同无水型壳聚糖和水合型壳聚糖一样，壳聚糖 盐的t y p ei 型结构也是以壳二糖为单元的双螺旋结构，两条相邻的链通过n ( 2 ) - o ( o 之间的氢键( 2 8 4 a 和2 8 5 a ) 以反平行方式在6 轴方向上形成一z 型结构。 在壳聚糖盐t y p ei 晶胞结构单元中。两盐离子通过与n 2 ) 、o ( 6 ) 原子之间形成 静电作用和氢键而存在如果把盐离子看作是水分子的话，壳聚糖盐t y p ei 型结构 非常类似于水合壳聚褚，以壳聚糖的碘盐为例，l e r t w o r a s m r i k 出 7 1 认为，在酸性溶 液中，由于壳聚糖中氢键被破坏，两聚合分子链各自以相反方向旋转。重新排列 形成一z 型网状结构，与此同时，n 】喝+ 同r 相结合，形成一稳固的结构。 壳聚糖盐的t y p e 型同壳聚糖的其它结构不太一样，它的聚合分子链的重复 单元长度大约是其它结构的4 倍( 4 0 3 1 a ) ，t y p ei i 型壳聚糖每个链上有八个单糖， 根据聚合链上重复单元糖的不同，t y p ei i 型 9 1 壳聚糖又分为2 种：t y p eh a 和t y p e b t y p eh a 是以壳四糖为基本单元的2 倍螺旋结构，两条相邻的链通过n 2 0 6 之 浙江工业大学硕士学位论文 间的氢键以反平行方式在口轴方向上形成一网状结构，沿b 轴方向堆积的网状结 构，网格之间充满水分子及盐离子，而n ( 2 ) 、o ( 6 ) 及盐离子之间相互形成网格闯 氢键。 t y p ei i b 是以壳二糖为基本单元的4 倍螺旋结构，与t y p ei i a 型壳聚糖不同的是 聚合分子链中基本单元的不同。其结构如图1 3 所示。 目a w l - n m mb - j - n o l m 图1 - 3t y p ei l a 型和t y p ei i b 型壳聚糖的分子链构象 f j g 1 - 3t h e 蚰删m o f h y d r a t e dc r y s t a lc h i t o s a n 不同的酸溶解壳聚糖，所得壳聚糖的结构有所不同。不同的酸溶解壳聚糖的结 构如表1 1 。 表1 1 壳聚糖在不同酸溶液中的构象 t l i b 1 1t h es t r u c t u r eo f c h i t o s a ni nd i f f e r e n ta c i ds o l u t i o n a 在高温下制备b 在低温下制备 1 3 壳聚糖及低聚壳聚糖的性质 壳聚糖是一种大分子多糖，分子量通常在几十万左右，而低聚壳聚糖的分子链 4 浙江工业大学硕士学位论文 短、分子量小。研究结果表明【l o l ，壳聚糖的分子量对其物理、化学、生物性质均 有很大影响，只有当分子量降到一定程度时，壳聚糖许多特殊功能才表现出来。 甲壳低聚糖( c h i t o o f i g o s a c c h 碰d e s ) 是由甲壳素和壳聚糖经降解产生的一类低聚合度 的糖类化合物。从广义上来讲，是指分子量低于1 0 ，0 0 0 、水溶性好的低分子量的 甲壳素或壳聚糖；就狭义上而言，是指聚合度为1 1 0 的寡糖。对于甲壳低聚糖的 名称目前尚未实行标准化，有文献认为低聚壳聚糖可叫壳寡糖( c b i t o s a a o l i g o s a c c h a r i d e s ) 。同甲壳素和壳聚糖这种生物大分子相比，低聚壳聚糖具有许多 独特的功能性质，如水溶性、保湿性、抗菌性、抗肿瘤和免疫促进性掣】。 1 3 1 水溶性 壳聚糖是含氮多糖类天然生物活性物质，其大分子链结构上含有大量的- n h 2 和- o h ，以及少量的- n h c o c h s 。故游离- 2 含量增加，晶体结构受到破坏，仅 能溶于稀酸溶液。经降解后，分子链长度减短，分子量下降，分子内氢键作用减 弱，水溶液中各分子链间运动更加无序，有助于提高其水溶性。m w l 5 0 0 的壳寡 糖的水溶性高达9 8 8 8 ，而相应的壳聚糖水溶性仅为6 8 4 。 1 3 2 吸湿性与保湿性 甲壳素低聚糖和壳寡糖分子中存在着大量的o h 、n h 2 等强极性基团，不仅改 善了水溶性，而且使其具有了良好的吸湿保湿功能，有研究表明1 1 2 】；均分子量一 定的壳寡糖具有优于甘油和透明质酸的吸湿保湿功能，且在一定的分子量范围内， 随着分子量的降低，吸湿率能逐渐增大。分子量为1 5 0 0 时具有最大值，即吸湿和 保湿能力最大当分子量上升到3 0 0 0 时，吸湿和保温能力基本不变；当分子量为 5 0 0 0 时，各项指标仅为分子量3 0 0 0 时的一半。甲壳素低聚糖良好的吸湿保湿性能， 加之本身固有的良好的成膜性和生物兼容性，使其在化妆品工业中得到了广泛的 应用，其作用优于传统的吸湿剂和保湿剂。 1 3 3 抗菌抑菌作用 低聚壳聚糖的抗微生物活性主要有两种方式： 一是通过干扰细胞膜从而达到抑菌的作用。当浓度高时，低聚壳聚糖能在细胞 5 浙江工业大学硕士学位论文 的外面形成一层很密的保护层，从而阻碍细胞对营养物质的吸收1 1 3 l ；当浓度低时， 低聚壳聚糖能够与细胞壁上的负离子如脂多糖、蛋白质结合，使细胞稳定性变差， 从而导致细胞内营养物质的泄漏p 4 1 ，l i u ”1 认为能与细胞壁上负离子结合的正是 低聚壳聚糖中的一n h 3 + 离子。另外，低聚合度和低分子量的壳聚糖也能够渗透进 细胞膜，并与细胞质结合，从而阻碍m r n a 的转录，实现抑菌作用【l q 二是聚壳聚糖对细胞壁的破坏作用。在低聚糖存在的情况下。病原真菌的几丁 质酶活性会被壳聚糖激发出来；当低聚壳聚糖浓度很高时，真菌的几丁质酶被过分 表达，导致对其自身细胞壁几丁质的降解，从而损伤细胞壁【。 1 3 4 抗病毒作用 低聚壳聚糖的抗病毒活性主要表现在三个方面：一是壳聚糖对噬菌体传染的抑 制作用。高浓度的低聚糖能吸附在噬菌体的表面，阻碍噬菌体对营养物质的吸收， 从而阻止病毒噬菌体的复制【l 明；而低浓度的低聚糖与细胞膜的结合能干扰细胞膜 的一系列特性，导致细胞内营养物质的流失，从而降低噬菌体细胞的生存活力【研； 渗透进细胞膜的壳聚糖，能够破坏噬菌体中t 受体的结构，从而弱化噬菌体的传 染性刚。二是低聚壳聚糖对植物细胞病毒传染的抑制作用。植物与微生物一个很 大的区别是当外界环境变化时植物能够产生对自身起保护作用的敏感反应，低聚 糖能通过调整植物对病毒的这种敏感反应，从而防止植物发生系统性病毒传染， 这种作用与壳聚糖的制备及植物品种有关【2 j , 2 2 1 。低聚壳聚糖的存在，还能诱发植 物细胞产生一种胼胝质( c a l l o s e ) 物质的合成，胼胝质是一种能降低病毒传染性的 物质，胼胝质的生成，阻碍了病毒在植物管束及细胞间的传染 2 3 1 。三是低聚壳聚 糖对动物细胞病毒传染的抑制作用。在动物的免疫系统中，存在一类重要的细胞 如巨噬细胞、粒细胞，低聚糖能调节巨噬细胞、粒细胞在免疫反应中的作用，避 免动物细胞被病毒传染。这是因为巨噬细胞是一种抗原递呈( a n t i g e n - p r e s e n t ) 细 胞，它同t 细胞的结合能够诱发细胞内的免疫反应，并释放免疫反应中的介体， 如i n t e l e u k i n - 1 ，这些介体的生成，能够促使t 细胞的增生，从两抑制病毒的传染刚。 另外，低聚糖同细胞质的结合也能阻碍病毒早期m r n a 的转录和蛋白质的合成， 防止了病毒的复制与传染瞄l 。 6 浙扛工业大学硕士学位论文 1 4 壳聚糖和低聚壳聚糖的应用 作为性能优良的天然高分子材料，壳聚糖及其衍生物具有许多优良特性，如生 物兼容性、生物降解能力、无毒性、吸附性等。目前，壳聚糖资源的开发与应用 范围涉及工业、农业、生物医药、保健食品、日用化妆品、环保、印染以及功能 材料等诸多领域1 2 6 , 2 7 1 。 1 4 1 食品领域 壳聚糖的基本单位氨基葡萄糖与构成人体的重要物质一透明质酸的组成单元 n - 乙酰基氨基葡萄糖是结构类似物，与人体有很好的亲和性，不会对人体产生捧 斥作用。所以用于保健食品无毒、无副作用。壳寡糖能改善肠道微生物的区系分 布，刺激有益菌的生长。不仅有利于人体肠内双歧杆菌的增殖，同时可抑制肠内 有毒菌和腐败物质的生成，增加人体内纤维素的质和量，进而提高机体的免疫能 力和抗癌能力。寡糖在水溶液中容易形成牢固膜，此膜对气体有选择渗透性，特 别适合于作食品保藏剂。 1 4 2 农业 壳聚糖可用作粮食、蔬菜作物种子的表面处理剂，从而提高粮食和蔬菜产量子 提前发芽，促进作物生长，提高抗病能力，具有良好的抗病虫害功能。壳寡糖高 效的抑菌作用、无毒害等优势，能使水果、蔬菜、粮食增产1 0 - 3 0 ，因而可以应 用于生物农药产品，部分替代化学农药。用壳寡糖溶液对小麦拌种可以防止地下 霉菌对种子的危害，提高抗病能力和抗倒伏能力网。壳寡糖还可作为植物调节剂， 刺激植物的免疫系统反应，激活防御反应，产生具有抗病害的活性物质，抑制病 害的形成和增强植物对病虫害的防御。壳寡糖的诱抗活性与壳寡糖的聚合度及脱 乙酰度密切相关，低聚合度及高脱乙酰度的壳寡糖诱抗活性高 2 9 , 3 e 。 1 4 3 医药领域 几丁寡糖和壳寡糖可以提高机体免疫力。早在1 9 8 6 年，s u z u k i 等【3 1 1 就发现腹 腔注射5 0 m g k g 聚合度为4 - 7 的几丁寡糖可使b a l b c 小鼠腹腔渗出液细胞 7 浙江工业大学硕士学位论文 p e c ( 主要由多形核白细胞p m n 组成) 数量明显增多，且有更高的产生活性氧的能 力。壳寡糖是目前已知的自然界中唯一带正电荷的碱性多糖，由于其能吸附人体内 带负电荷的类脂类、脂肪、胆碱酸等，并能直接进入血液，作用于免疫细胞，因 而具有明显的调节人体免疫功能、提高人体防病抗病能力的作用。尤其对中老年 人多发的糖尿病、高血压及因免疫力降低而引起的其它疾病，具有较好的辅助治 疗作用【3 2 】。几丁寡糖和壳寡糖通过各种途径提高机体的抗瘤能力。o u c h i 等1 3 3 】研究 发现，3 个壳寡糖通过六亚基空闻通道与5 氟尿嘧啶( 5 一f u ) 共扼结合后，其抗肿瘤 作用强于5 - f u 。壳寡糖对小鼠s a r c i r n a - 1 8 0 癌细胞的抑制作用及对人肝癌细胞、 子宫内膜癌细胞、红自血病细胞、淋巴瘸细胞、小鼠肝癌腹水细胞也有明确的抑 制作用m 捌，丁寡糖和壳寡糖还可通过抑制细菌内胞壁质酶活性【3 6 】、提高迟发性 超敏反应、促进脾t 淋巴细胞释放巨噬细胞激活因子( m p 7 l 、刺激机体细胞产 生超氧阴离子p 柳等机制而产生对多种细菌的杀菌效应。已有人开始用壳聚糖作为 载体连接抗原分子，制作相关疫苗。但常用的壳聚糖分子量大、粘度高，无法在 生理p h 条件下溶解，限制了壳聚糖作为疫苗载体的应用。最近有研究表明壳寡糖 及其纳米粒的细胞毒性较低。壳寡糖形成纳米粒后，可显着增加a 5 4 9 细胞的摄取 作用。这就证明了壳寡塘纳米粒作为药物载体的可能性唧l 。 1 5 壳聚糖的降解 目前主要有化学法、糖转移法和酶解法三种途径来制备甲壳素低聚糖。其中， 化学法应用早，是主要的制备途径；但是目前国内外对糖转移法和酶解法的研究很 重视，得到了很大的发展。 1 5 化学法 化学法降解甲壳素通常采用酸水解和氧化降饵来实现。 酸水解法常用盐酸、乙酸、磷酸、氢氟酸等进行降解。甲壳素在酸性溶液中不 稳定，会发生长链的部分水解即糖曹键的断裂，从而形成分子量大小不等的片断， 充分水解则会产生大量单糖。酸在多糖水解过程中起催化作用。目前在应用的壳 聚糖酸解法很多( 表1 - 2 ) 8 浙扛工业大学硕士学位论文 分子量分布比较宽， 壳聚糖经酸和碱纯化，加入浓 h o r o w i 乜 ( 反应4 8 h 得聚合度小于 浓盐酸 盐酸降解后溶液在真空瓶中冷却， s t 等 l o 的壳聚糖盐酸盐，7 2 h 然后用乙醇洗涤、浓硫酸真空干燥 得单糖盐酸盐) 将过醋酸加入壳聚糖的乙酸溶可长期保存，特别适 过醋酸t o d a s h ii 咿 液中进行降解用与食品及化妆品 从表l - 2 来看，用酸降解壳聚糖试剂廉价易得，但产物复杂，壳寡糖的产量较 低，需要使用强酸，并且会造成严重的环境污染。 氧化降解法是近年来国内外研究比较多的壳聚糖降解方法；尤其是关于h 2 0 2 氧 化降解壳聚糖的研究1 4 5 闱，由于该方法具有反应速度快、产率高、反应物无毒等 优点，是一种比较理想的化学降解方法，正受到越来越多的关注通常取壳聚糖 按一定比例加入到体积分数为6 的h 2 0 2 溶液中，在6 0 反应6h ，反应液过滤 后，用体积分数为9 5 的乙醇沉淀出低聚糖，h 2 0 2 氧化法可制备相对分子质量 6 的低聚糖，若采用转糖基反应则是有效方法之一。u s u i 等删采用甲壳素酶的糖基转 移反应性能制得较好收率有生理活性的甲壳六糖和七糖，即使用来自诺卡氏放线菌 或木霉属具有高的糖基转移功能的甲壳质酶，催化过量的n 乙酰甲壳四糖或五糖 进行转糖基反应。酶催化四糖生成主要产物六糖( 2 l ) 和二糖( 6 3 ) ，催化五糖生成 七糖( 2 3 呦和三糖( 5 9 哟。在反应体系中添加硫酸铵能显着增加六糖的产量。研究 表明，具有糖基转移反应能力且能合成甲壳素低聚糖的酶主要有洛菌酶和精制的 甲壳素酶。糖基转移反应受温度、p h 值、底物浓度和反应时间等因素影响。此法 不仅能调节聚合度，还可以通过对基质的精心设计合成一些特殊结构的低聚蓿衍 生物。但此法只能用来制备甲壳质低聚糖，而不能制备壳低聚糖i 珊 1 5 3 壳聚糖的酶法降解 酶降解法是利用对壳聚糖具有水解作用的酶进行生物降解。目前，已发现有 近4 0 种酶可用于壳聚糖的降解反应，这些酶包括甲壳素酶、壳聚糖酶、溶菌酶以 及非专一性水解酶如脂肪酶、蛋白酶和其它壳聚糖酶等。 目前已发现其它糖酶、蛋白酶、脂肪酶等3 7 种酶对甲壳素和壳聚糖也有不同 程度的水解作用p a n t a l e o n e 等 5 1 1 就纤维素酶和一些其它酶在一定条件下对不同均 分子式量壳聚糖溶液的降解作用进行了研究；对于较低粘度的壳聚糖溶液，一些 聚糖酶( g y c a n a s e ) 对壳聚糖有显着的降解作用，其中纤维素酶t v ，a p 和果胶酶 的粘度降低比率( v d p ) 可达9 9 ，半纤维素酶的v d p 为9 3 ，淀粉酶( a m y l a s e ) 和葡聚糖酶( 如妯彻a 辨) 的v d p 为7 0 8 0 ；对于较高粘度的壳聚糖溶液，在试 验所用的3 8 种酶中，v d p 在6 0 1 0 0 的有1 7 种，v d p 在2 0 6 0 的有1 2 1 0 浙江工业大学硕士学位论文 种，还有9 种酶只有轻微的降解作用或完全没有降解作用( v d p 为o 1 5 ) 。其中 仍以聚糖酶的降解效率最高，木瓜蛋白酶和单宁酶( t a n n a s e ) t g 显示了较强的降解 能力。 a i b a 等人i s 2 研究用低成本的脂酶、纤维素酶和半纤维素酶制剂生产高聚合度 的低聚糖。研究发现：当使用脂酶、纤维素酶和半纤维素酶制剂时，乙酰化度2 2 的壳聚糖( 2 0 0 m g ) 经过一系列反应后，添加甲酵选择沉淀可获得五糖( 1 l 呦，六糖 ( 6 9 坳和七糖( 1 8 呦的混合物( 5 5 r a g ) 。通过凝胶过滤色谱分离后，纯的六糖和七糖 产量分别为3 5 m g 和5 m g 。乙酰度1 0 3 0 的壳聚糖用这些酶水解后，再用 乙酸酐进行n 乙酰化反应，用高效液相层析h p l c 可以在反应混合物中测到甲壳 低聚糖六糖和七糖的产率分别超过2 0 和l o ，因此认为，此法可以制备高产率 的壳寡糖。 1 5 3 2 专一性酶水解法 ( 1 ) 溶菌酶 溶菌酶( e c3 2 i 1 7 ) 能降解一些微生物细胞壁的糖蛋白，也能降解甲壳素和部 分n 乙酰化壳聚糖。在大多数的哺乳动物中，甲壳素的降解主要是由溶菌酶所引 起的，故有人把溶菌酶列为甲壳素的专一性酶。在入乳和人体血清中也含有丰富 的溶菌酶。由于溶菌酶能识别乙酰氨基葡萄糖序列，因此可以从甲壳素获得高聚 合度的低聚糖。不同来源的溶菌酶的催化反应侧重点不同；从鸡蛋蛋白中提取的 溶菌酶，其转糖苷能力强于水解能力；人唾液中的溶菌酶，裂解h 1 4 糖昔键的能 力较强，y 砖h i d a 等5 3 1 报道，溶菌酶适合于催化3 0 d a 的均态甲壳素水解产生高 聚合度的低聚糖，而甲壳素酶能有效水解7 0 d a 的均态壳聚糖生成高聚合度的低 聚糖。 k k l i 诅) 4 卅研究了溶菌酶降解甲壳素时脱乙酞化度对降解的影响，得到脱乙 酞度为5 0 时，降解率达到最高值，而对于脱乙酞度为9 7 的壳聚糖，基本不降 解。这表明溶菌酶在降解甲壳素和壳聚糖时，至少需要糖苷键上有g 1 e n a e 基团。 ( 2 ) 壳聚糖酶 壳聚糖酶主要存在于真菌细胞中。自然界中真菌和无脊椎动物( 主要结构成分 浙江工业大学硕士学位论文 为甲壳素) 的年产量估计高达数十亿吨【斓，它们的降解主要由细菌和真菌分泌的甲 壳素酶来完成，或者通过脱乙酰化作用形成壳聚糖。再由壳聚糖酶来降解。若控制 一定的条件，利用壳聚糖酶对壳聚糖大分子进行降解，则可方便得到聚合度低至 2 7 的水溶性壳聚糖。甚至单糖。 p c 描一嗣对芽孢杆菌产壳聚糖酶水解壳聚糖的能力进行了研究，得到了较低 分子量的降解产物；做i g u c h i d 7 用芽孢杆菌属s p 7 - m 株降解壳聚糖成功地得到了 二至五糖；s h i m a i 5 8 等人用膜过滤酶反应器来水解壳聚糖，可进行连续反应，滤 液用甲醇沉淀分离可得到五糖含量 9 2 3 的甲壳低聚糖。若再进行n 乙酰化，则 产物为n 乙酰化甲壳低聚糖。k m o i w a 等1 5 9 】报道用固定化酶控制酶解反应，以来 自芽孢杆菌( b a c i l l u s p u m i l u s ) 的固定化壳聚糖酶水解壳聚糖，可阻止目标产物的 进一步水解，制备高功能活性的甲壳低聚糖。在最佳反应条件下，五糖和六糖的 产率可达3 0 以上。由此可见。壳聚糖酶在制备壳寡糖( 特别是五糖) 方面，非 常有利用价值。 1 6 壳聚糖酶的慨述 1 9 7 3 年, m o n a g h a n 等 6 0 1 人在研究用水解酶对抗病原真菌的可能性时，通过对 2 0 0 多种微生物的研究。发现2 5 种真菌和1 5 种细菌的培养液能降解接合菌纲 ( z y g o m y c e t e s ) 的r h i z o p u sr h i z o p o d i f o r m i s 的细胞壁，但对其它纲的微生物细胞壁 无作用，于是就提出了一类新的酶壳聚糖酶，它是一种不同于几丁质酶的新酶， 这种酶对胶态几丁质不水解，但是能够降解完全脱乙酰化的壳聚糖，所以它被认为 是对线性的壳聚糖具有水解专一性的一种酶。并于1 9 8 4 年向国际酶学委员会申请 登记编号e c 3 2 1 9 9 。此后，经过将近3 0 年的一系列的研究，人们又相继从多种 微生物( 包括细菌、放线菌、真菌以及病毒等) 及单子叶和双子叶植物的不同组织 中发现有壳聚糖酶活性。不同产酶微生物来源及部分酶学性质如表l - 3 所示。 浙江工业大学硕士擘拉论文 表1 3 各类壳聚糖酶的性质【6 l l t a b 1 3t h ec l 嵋m c t 盯o f c b i t o s a n a s e 来源分子量k d产酶 最适p h最适等电除壳聚糖外的其 方式温废点p i它底物特异性 抽码z 鳓叩j 扫s p ，c s o - 2 2 7 诱导型 5 3 5 58 8 m u n o r r o u g l l7 6 组成型 5 o5 54 9 r h o d o t o r u l a g r a c i l i s i 0 0 组成型 4 54 5 n d p e n i c i l l i t o n t s l a n d i c u m3 0 诱导型4 5 4 54 2 6 0 p e n i c i l l i w n s p i n u l o s w n b i d n a5 0 5 5 n d b a c i l l u sl h3 1 组成型5 64 08 3 b a c i l l u ss p n o 7 m4 l 诱导型 6 0 5 0 n d b m n y l o l i q u e f a e l e n s t l t k 3 1 组成型n an a1 0 1 b a c t e r w ns p k 15 0 诱导型5 5 6 0n d 6 9 2 6 诱导型4 5 5 0n d 6 5 胶体几丁质 羧甲基纤维素 羧甲基纤维素 s t r e p t o m y e e s g r i s e u s 3 5 诱导塑 8 o 3 7 9 7 羧甲基纤维索 m y x o b a c t e rs p a l l 2 8 9 组成型 5 o 7 0n d 羧甲基纤维素 6 s 剜l 幽细埘昭能以l 1 0 0 组成型 4 54 5n d 罐口g l n 鹚即y 2 k 2 5n a 6 56 5 7 08 4 _ 卿嬲谢晌t g 硼啦 2 2 5n a4 53 0 7 3 1 0 85 5 4 0 8 4 m 豳u e b a e t e r c h t t o s c m o t a b t d u s 3 03 4 诱导型4 03 01 0 1乙二醇壳聚糖 0 l p s u e d o m a n a ss p h 1 43 5 诱导型 t 06 5n a b 埘k h o l i d i a g l a d i o l i c h b l 0 1 3 7组成型5 9 5 0 n a b a c i l u 口s u b f i l t sk h l2 8n a7 06 08 3 1 3 浙江工业大学硕士学位论文 b a c i u u s c e r e u ss i4 5 诱导型 6 5 0n a羧甲基纤维素 a o r y z l a m 2 0 0 6 b a c i l l u ss p k f b - c 1 0 8 b a c i l l u ss p c k 4 3 l 4 0 4 8 3 0 4 0 9 3 4 3 s t r e p t o m y e e ss p n 1 7 4 b a c i l l u ss u b t l l t 3 2 3 7 3 7 , 2 9 4 2 9 5 3 1 5 诱导型5 o 5 0 6 0 诱导型7 0n a n an a n an a n a6 5 n an a 诱导型9 5 诱导型4 0 n a 5 5 n a n a 5 0 3 7 n a5 05 0 诱导型4 5 4 0 6 5 组成型4 5 5 0 6 0 诱导型6 ，55 0 n a5 8n a n an a6 5 诱导型 5 5 n a5 7 4 o 5 5 胶体几丁质、 乙二醇几丁质 p - 1 3 葡聚糖 n d 羧甲基纤维素几 丁质 b i d 乙二醇几丁质、羧 甲基纤维素 9 2 n a 7 5 n a 注：表示g f ( 凝胶过滤) 法获得分子量, n a 表示无法获得确切资料, n d 表示未确定。 1 6 1 壳聚糖酶分类 1 e 1 1 根据酶对糖苷键的水解分类 不同微生物来源壳聚糖酶水解作用模式不同，其作用底物壳聚糖可看作是部 1 4 姒 m m 浙江工业大学硕士学位论文 分脱乙酰化或完全脱乙酰化的几丁质，壳聚糖分子中一般包含4 种糖苷键g i c n a c g i c n a c ，g l c n g i c n ，g l c n g i c n a c ，g i c 2 n a c g i c n ，各种糖苷键比例取决 于脱乙酰化程度。壳聚糖酶被认为是能作用于壳聚糖分子中g i c n g i c n 糖苷键，而 不能作用g i c n a c g l c n a c 糖苷键。因此根据其作用底物糖苷键的类型，壳聚糖酶 被分为3 类嘲：作用o l c n g l c n ，g i c n a c g l c n 的为i 类：只作用g i c n g l c n 的为n 类；作用o l c n - g l c n 和g l e n g i c n a c 的为i 类。其中第1 类的代表 p e n i c i l l i u mi s l a n d i c u m ，b a c i l l u s