（发酵工程专业论文）螺旋藻蛋白酶解产物的制备及其生物学功能评价.pdf

摘要对于疾病，人们越来越倾向于预防而不是治疗，并逐渐认识到健康和营养的关系，想通过功能性保健食品抵销空气、水和食品中的污染物、致病菌和化学制品所带来的危害，维持和提高健康状态。螺旋藻作为迄今为止发现的营养最丰富、最全面的绿色天然食品，并且其富含多种营养成份及生物活性物质如藻蓝蛋白能产生很多生理效应，对螺旋藻的研究和应用也因而受到了越来越多的关注。目前世界各地都出现了很多螺旋藻的生产企业，但是，螺旋藻有不良的藻腥味，制成食品会严重影响产品的口感和可接受性。生物活性肽作为一种蛋白资源的利用方式。不仅具有营养性小肽易消化吸收的营养特点，还具有抗过敏性、降低胆固醇、增强免疫力、促进肠道菌群平衡等诸多生理功能，开发和研究生物活性肽类食品在国际保健品行业中已成为一个焦点。本试验分别以超声波法、反复冻融法、高压均质法和反复冻融超声波法破碎螺旋藻细胞提取食品级螺旋藻胞内混合蛋白，采用凯氏定氮法和吸光度法测定蛋白含量，对各方法的各种影响因素进行了正交优化，确定了反复冻融超声波法为本试验中螺旋藻胞内蛋自的最适提取方法，其粗蛋自提取率为8 3 5 ，提取条件为底物浓度1 0 ，冻融时间4 小时，反复冻融5 次，超声功率1 0 0 0 w ，超声时间9 m i n ，间隔时间2 5 r a i n 。提取的蛋白经1 0 0 0 0 d a 超滤去除小分子杂质冷冻干燥制成干粉后，分别用碱性蛋白酶水解和模拟胃肠道蛋白酶水解，水解时研究了各因素对结果的影响，得到碱性蛋白酶对螺旋藻蛋白的最佳水解条件为：p h 7 0 ，酶底物比2 2 ，反应时间1 6 0 r a i n ，反应温度5 0 ，耗碱3 2 8 5 0 m l ，水解度与h t o t 之比为1 2 0 2 0 ，试验后t c a n s i 为2 7 7 3 ：而模拟胃肠道蛋自酶水解中胃蛋白酶水解的最适条件为：p h2 0 ，酶解温度3 7 ，加酶量2 o ，底物浓度3 ，水解时间1 8 0 m i n ；胰酶水解的最适条件为；p h7 0 ，酶解温度3 7，加酶量5 ，底物浓度3 ，水解时间2 4 0 r a i n 。模拟胃肠道水解后水解度为2 4 7 9 ，t c a - n s i 为3 4 6 6 。得到的水解液最后用1 0 0 0 0 d a 超滤去除大分子物质，旋转蒸发并冷冻干燥后制得水解肽粉。然后将所制得的螺旋藻蛋白及其水解肽粉灌胃正常小鼠，取其粪便，采用选择性培养基t p y 培养基、m 1 7 培养基、v r b d a 培养基、叠氮钠结晶紫七叶苷培养基、麦康凯培养基对肠道内双歧杆菌、乳酸杆菌、肠杆菌、肠球菌和肠道致病菌进行培养和鉴定计数，统计结果表明螺旋藻蛋白及其水解肽对小鼠肠道双歧杆菌、乳酸杆菌增殖有一定的影响作用，同时还能抑制致病菌、肠杆菌的增殖，对肠球菌的作用不很明显。灌胃后整个肠道的定植抗力即e b 值要显著增大。而在对大鼠喂养高脂饲料的同时，灌胃其螺旋藻蛋白及其水解肽观察对血脂水平影响的试验结果表明在高脂饲料的同时灌胃螺旋藻粉及其蛋白可极显著( p o 0 1 ) 降低商脂大鼠血浆中t c 、t g 、l d l c水平，并极显著提高h d l c 值：而灌胃螺旋藻蛋白的碱性蛋白酶水解肽和模拟肠道水解肽显著( p o 0 5 ) 降低商脂大鼠血浆中t c 、t g 、l d l c 水平，并显著提高h d l c 值。本试验采用不同方法提取螺旋藻胞内蛋白，用碱性蛋白酶和模拟胃肠道蛋白酶对螺旋藻胞内蛋白水解，获得其相应水解肽并采用动物实验评价了其对小鼠胃肠道区系的影响和在高血脂饮食时对大鼠血脂水平的影响这两个生物学功能，为螺旋藻及其蛋白的深加工利用提供了基础和理论依据。关键词：螺旋藻蛋白水解肠道微生物区系血脂a b s t r a c tt h e r ei sag r o w i n gp r e f e r e n c ef o rp r e v e n t i o nr a t h e rt h a nt r e a t m e n tf o rd i s e a s ea n dp e o p l er e a l i z et h a tt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nh e a l t ha n dn u t r i t i o ni si m p o r t m e n t p e o p l ew a n tt oi n t a k ef u n c t i o n a lh e a l t hf o o d sw h i c hw o u l do f f s e th a z a r d sb r o u g h ta b o u tb yt h ea i r , w a t e ra n df o o dp o l l u t a n t s ，p a t h o g e n so rc h e m i c a lp r o d u c t i o n st om a i n t a i no ri m p r o v et h e i rh e a l t hs t a t e s p i r u l i n a , o n eo ft h er i c h e s ta n dm o s tc o m p r e h e n s i v en u t r i e n tg r e e nn a t u r a lf o o d s ，h a sar i c hv a r i e t yo fn u t r i e n t sa n db i o a c t i v es u b s t a n c e s ，s u c ha sp h y c o c y a n i n t h e r ei sag r o w i n ga t t e n t i o no ns p i r u l i n ar e s e a r c ha n da p p l i c a t i o n al o to fs p i r u l i n ap r o d u c t i o ne n t e r p r i s e sh a v eb e e nf o u n d e da l lo v e rt h ew o r l dn o w b u ts p i r u l i n ah a sab a ds m e l l ，i t sd i r e c tf o o dp r o d u c t sw i l ls e r i o u s l ya f f e c ti t s t a s t ea n da c c e p t a b i l i t y b i o a e t i v ep e p t i d e s ，a saw a yo fp r o t e i nu t i l i z a t i o np a t t e r n s ，n o to n l yh a v et h ed i g e s t i b l en u t r i e n ta b s o r p t i o nc h a r a c t e r i s t i c s ，b u ta l s ow i t ha n t i a l l e r g i c ，l o w e rc h o l e s t e r o l ，e n h a n c ei m m u n i t y , p r o m o t ei n t e s t i n a lf l o r ab a l a n c eo rm a n yo t h e rp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n s d e v e l o pb i o a c t i v ep e p t i d e sf o o dp r o d u c t i o nh a sb e c o m eaf o c a lp o i n ti nt h ei n t e r n a t i o n a lh e a l t hc a r ep r o d u c t si n d u s t r y i nt h i se x p e r i m e n tw eh a v eu s e du l t r a s o n i cw a v e ，r e p e a t e df r e e z i n ga n dt h a w i n g ，h i g hp r e s s u r eh o m o g e n i z a t i o na n dr e p e a t e df r e e z i n g - t h a w i n g u l t r a s o n i cw a v ef o u rm e t h o d st ob r e a ks p i r u l i n ac e l l si n + o r d e rf o rn l ee x t r a c t i o no ff o o d g r a d es p i r u l i n ap l a t e n s i sp r o t e i n a n dw ee v a l u a t e dt h ep r o t e i nc o n t e n tb yu s i n gb o t hk j e l d a h lm e t h o da n ds p e e t r o p h o t o m e t e rm e t h o du n d e ro r t h o g o n a lo p t i m i z a t i o n t h er e s u l td e t e r m i n e dt h a tr e p e a t e df r e e z i n g t h a w i n g u l t r a s o n i cw a v ew a st h eo p t i m a lm e t h o d i t sc r u d ep r o t e i ne x t r a c t i o nr a t ew a s8 3 5 a n de x t r a c t i o nc o n d i t i o n sw e r e ：10 s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n ，4h o u r sf r e e z i n gt i m e ，r e p e a t e df r e e z i n ga n dt h a w i n g5t i m e s ，u l t r a s o n i cp o w e r10 0 0 w , u l t r a s o n i ct i m e9 m i n ，i n t e r v a l2 5 r a i n t h e nw ep u r i f i e dp r o t e i ns o l u t i o nb yu l t r a f i l t r a t i o na n dm a d ei ti n t od r yp o w d e rb yv a c u u mf r e e z i n g a f t e rt h a tw eu s e da l k a l i n ep r o t e a s ea n ds i m u l a t e dg a s t r o i n t e s t i n a lp r o t e a s eh y d r o l y s i si tr e s p e c t i v e l yw h e nw ee x a m i n e di t s e f f e c t i n gf a c t o r sa n dc o n d i t i o n s ，t h eo p t i m a lc o n d i t i o n sf o ra l k a l i n ep r o t e a s ew e r e ：p h 7 0 ，e n z y m et os u b s t r a t er a t i o2 2 ，r e a c t i o nt i m e1 6 0 r a i n , t e m p e r a t u r e5 0 ，a l k a l ic o n s u m p t i o n3 2 8 5 0 m l ，d e g r e eo fh y d r o l y s i st oh t o tr a t i ow a s1 2 0 2 0 ，t c a - n s lw a s2 7 7 3 ；w h i l et h eo p t i m a lc o n d i t i o n sf o rp e p s i nh y d r o l y s i sw e r e ：p h 2 0 ，h y d r o l y s i st e m p e r a t u r e3 7 ( 2 ，e n z y m ea m o u n t2 o ，s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n3 ，r e a c t i o nt i m e18 0 m i n ；t h eo p t i m a lc o n d i t i o n sf o rt r y p s i nh y d r o l y s i sw e r e ：p h7 0 ，h y d r o l y s i st e m p e r a t u r e3 7 ( 2 ，e n z y m ep l u s5 ，s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n3 ，r e a c t i o nt i m e2 4 0 m i n t h ed e g r e eo fh y d r o l y s i sw a s2 4 7 9 a n dt c a - n s iw a s3 4 6 6 a f t e rh y d r o l y s i sb ys i m u l a t i o no ft h eg a s t r o i n t e s t i n a lt r a c t f o rb i o l o g i c a lf u n c t i o ne v a l u a t i o n ，w el a v a g e ds p i r u l i n ap r o t e i na n di t sh y d r o l y s i sp e p t i d e st on o r m a lm i c e ，o b t a i nm i c ef a e c e s ，u s et p ym e d i u m ，m17m e d i u m ，v r b d am e d i u m ，s o d i u ma z i d e - c r y s t a lv i o l e t - a e s c i n a t eg l y c o s i d e sm e d i u ma n dm i c h a e lk a n gk a im e d i u mt os e l e c t i v ec u l t u r ea n di d e n t i f i e dt h ec o u n to fi n t e s t i n a lb i f i d o b a c t e r i u m ，l a c t o b a c i l l u s ，e n t e r o b a c t e r ，e n t e r o c o c c ia n di n t e s t i n a le n t e r ob a c t e r i a t h er e s u l t ss h o w e dt h a ts p i r u l i n ap r o t e i na n di t sh y d r o l y s i sp e p t i d e sh a v ee f f e c ti np r o m o t ei n t e s t i n a lb i f i d o b a c t e r i u ma n dl a c t o b a c i l l u sp r o l i f e r a t i o n ，w h i l ei n h i b i tp a t h o g e n sa n de n t e r o b a c t e rp r o l i f e r a t i o n ，b u td o e s n th a v ev e r yc l e a re f f e c ti ne n t e r o c o c c ip r o l i f e r a t i o n a n dw ec a na l s of o u n dt h ei n t e s t i n a lr e s i s t a n c ew h i c hc o u l du s ee bv a l u ei n s t e a dw a gs i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d i nt h ee x p e r i m e n tt ol i p i dl e v e l s ，w el a v a g e ds p i r u l i n ap r o t e i na n di t sh y d r o l y s i sp e p t i d e st or a t sw h i l ef e dt h e mo nh i g hf a td i e t t h er e s u l t ss h o w e dt h a to r a la d m i n i s t r a t i o no fs p i r u l i n ap o w d e ra n di t sp r o t e i nc o u l ds i g n i f i c a n t ( p o o1 ) l o w e rf a tr a tp l a s m at c ，t gl d l - cl e v e la n ds i g n i f i c a n t l yi n c r e a s et h eh d l cv a l u e ；w h i l et h es a m ew e r eo r a la d m i n i s t r a t i o no fa l k a l i n eh y d r o l y s i ss p i r u l i n ap e p t i d e sa n da n a l o g i n t e s t i n a lh y d r o l y s i ss p i r u l i n ap e p t i d e s ( p 4 0 。目前，藻蓝蛋白的分离纯化工艺还处于实验室阶段，存在生产成本高、工艺流程烦琐、产品收率低和稳定性差等缺陷，其售价较高，例如高度提纯的用于光敏剂的藻蓝蛋白，1 9 9 6 年价格为1 1 0 美元毫克，1 9 9 8 年价格上涨到1 4 7 2美元毫克，近年价格波动在1 5 0 美元毫克一1 8 0 美元毫克区间，相当于黄金的1 万倍。近年来，国内外在藻胆蛋白的提取与纯化方面作了大量研究，所报道的技术工艺因所选材料和研究目的不同而各具特色。但从总体上说，绝大多数的工艺技术方法都包括细胞破碎、蛋白分离和柱层析纯化这三个重要步骤。细胞破碎：藻蓝蛋白属于胞内蛋白质，首先要破碎细胞的细胞壁、细胞膜使其溶出，细胞破碎程度越高，藻蓝蛋白的得率也越高。目前用于藻蓝蛋白提取分离过程中的细胞破碎方法，主要有反复冻融法、化学试剂处理法、高压均质法、溶胀法和超声波法。林红卫等【2 3 1 用o 3m m o l l 的十二烷基苯磺酸钠提取钝顶螺旋藻中的藻蓝蛋白，提取率达到了9 8 。张以芳等【2 4 】用氯化钾溶菌酶法或冻融法破碎螺旋藻细胞壁和盐析来提取藻蓝蛋白，实验表明酶法破壁适应于大量藻蓝蛋白制备，冻融法只适应于小量制备。曲文娟等1 2 5 l 以钝顶螺旋藻为原料，采用脉冲超声辅助提取技术提取藻蓝蛋白。韦萍等【2 6 1 将极大螺旋藻用高渗液低温浸泡、经硫酸铵沉淀、透析后，经过改进的羟基磷灰石柱层析得到试剂级的藻蓝蛋白。6第一章前言粗提物中的蛋白分离：盐析法、结晶法、等电点沉淀法、双水相萃取、反胶团萃取分离法。刘杨等【2 7 】用冷冻融化法提取钝顶螺旋藻中的藻胆蛋白，采用等电点沉淀法富集分离藻蓝蛋白。g a n a p a t h i p a t i l 等【2 8 , 2 9 1 设计了一个简单而高效的操作方法，该方法包括两个步骤：双水相萃取和离子交换层析。结果是从螺旋藻中得到的c p c 粗提物，其纯度是1 1 8 ，经过双水相萃取步骤之后，其纯度是5 2 2 ，继续过离子交换层析，纯度从5 2 2 上升到6 6 9 。刘杨等【3 0 1 研究了c t a b 正戊醇正辛烷反胶团溶液萃取分离螺旋藻藻蓝蛋白，藻蓝蛋白在该反胶团体系中的萃取效率和分配系数均较高。粗蛋白纯化柱层析纯化：常用的柱层析纯化方法有离子交换柱层析和凝胶过滤柱层析。离子交换柱层析通常采用d e a e 纤维素( s e p h a c e l ) 、x 连接琼脂( q s e p h a r o s e ) 和羟基磷灰石( h a ) 柱层析等。凝胶过滤柱层析通常采用葡聚糖( s e p h a d e x ) 和x 一链葡聚糖( s e p h a c r y l )柱层析等。实际应用中要根据不同的藻的来源、样品前处理方法及产品的纯度要求采用不同的纯化策略。王勇等【3 1 】用盐泽螺旋藻变种经硫酸铵盐析、羟基磷灰石( h a ) 、d e a e s e p h a d e x a 2 5 和s e p h a d e x g 2 0 0 柱层析可分离纯化出纯度为1 4 4 7 的藻蓝蛋白，硫酸铵盐析与多次柱层析结合。胡一兵等【3 2 】用新鲜藻丝为原料和分段梯度盐析分离纯化藻蓝蛋白，经羟基磷灰石层析，能使提取的p c 纯度大于普遍认可的标准。1 2 生物活性肽概述1 2 1 生物活性肽生物活性肽的定义及其理化特性1 。2 1 1 生物活性肽的定义肽是由2 个以上的氨基酸分子通过肽键联结而成的发挥生理作用的构成活性蛋白质的结构片段，从生物学角度讲，肽链长度在5 0 个以上的氨基酸称为蛋白质，超过l o 个氨基酸的称为多肽，少于1 0 个氨基酸的称为寡肽。一般按其发挥的功能分为营养性小肽( n u t r i t i o n a ls m a l lp e p t i d e ) 和功能性小肽( f u n c t i o n a ls m a l lp e p t i d e ) 两种。功能性小肽，常称之为生物活性肽( b i o l o g i c a l l ya c t i v ep e p t i d e s ，b a p ) ，是一类具有生物学功能的分子量小于6 0 0 0 道尔顿的多肽。它是由2 0 种编码氨基酸以不同组成和排列方式构成的从二肽到复杂的线性、环形结构的不同肽类的总称，是对生物机体的生命活动有益或具有生物活性的肽类化合物，它们是机体完成各种复杂的生理活动所必不可少的活性物质。生物活性肽不仅具有营养性小肽易消化吸收、抗原性底、溶解性和稳定性较好的营养7第一章前言特点，还具有抗过敏性、降低胆固醇、降低血压、增强免疫力等诸多生理功能，依据生理功能可分为类阿片肽( o p i o i d p e p t i d e ) 、免疫肽( 1 m m u n o p e p t i d e s ) 、酩蛋白磷酸肽( c a s e i n p h o s p h op e p t i d e s ，c p p s ) 、抗血栓肽( a n t i t h r i m b o t i cp e p t i d e s ) 、抗菌肽( a n t i m i c r o b i o |p e p t i d e s ) 、降压肽( a n t i h y p e r t e n s i v ep e p t i d e s ) 等几种，目前已成为国内外研究开发的热点。1 2 2 生物活性肽的生理学意义1 2 2 1 生物活性肽的吸收机制蛋白质是构成动物机体的主要成分。在蛋白质营养研究中，氨基酸代谢曾经一直是研究的重点，传统营养学理论认为，动物利用蛋白质的必经途径和主要形式是氨基酸。即蛋白质先经体内的蛋白酶和肽酶水解为游离氨基酸后才能被机体直接吸收利用，而成为肽段的部分还需经过再次降解为游离的氨基酸方能被吸收利用。虽然早在1 0 0 多年前，人们己注意到了肽的吸收和运转，但蛋白质必须水解成游离氨基酸后才能被吸收的观点，延误了对其它吸收方式的认识。a g a r 等首先观察到肠道能完整地转运双甘肽，后来n e w c y 和s m i t h提出了令人信服的肽可被完整转运的证据，但肽类转运的生理意义，并未得到普遍认识。直到8 0 年代，随着生物技术手段的日新月异，直接和间接的证据不断积累，肽类能够被完整吸收的观点才被人们所重视。即蛋白质经消化道酶促水解后，大多是以2 7 个氨基酸组成的寡肽形式被消化吸收的，以游离氨基酸形式吸收的比例很小而且g r i m b l e 等在1 9 8 6 、1 9 8 7 年，r e s s 在1 9 8 8 年，试验观察到二、三肽蛋白水解物吸收快于4 l o 肽蛋白水解物，摄入大于三肽以上的寡肽，肠道内胰蛋白酶、肽酶对其进一步水解似乎是吸收的主要限速因子【3 3 1 。这些研究为人类进一步开发蛋白质资源和研究利用生物活性肽奠定了理论基础。据研究，肽的吸收是按逆浓度梯度进行的。而小肽的转运机制，目前还不十分清楚，其转运系统可能有以下3 种【3 4 j ：第一种是依赖氢离子浓度或钙离子浓度的主动运转过程，需要消耗a t p 。这种运转方式在缺氧或添加代谢抑制剂的情况下会被抑制。第二种是具有p h 依赖性的非耗能性钠离子氢离子交换转运系统。第三种是谷胱甘肽( g s h ) 转运系统，由于谷胱甘肽在生物膜内具有抗氧化作用，因而g s h 转运系统可能具有特殊的生理意义，但目前其机制尚不十分清楚。此外，肽在机体肠道细胞内还存在许多独立的肽酶反应1 3 纠。同时研究者也发现，小肽与游离氨基酸在动物体内具有相互独立的转运机制，二者互不干扰，这有助于减轻由于游离氨基酸相互竞争共同吸收位点而产生的吸收抑制，进而影响体内的蛋白质代谢。如当赖氨酸和精氨酸以游离形式存在时，两者相互竞争吸收位点，而赖氨酸以肽的形式存在时，精氨酸对其吸收则无影响。r第一章前言多肽比游离氨基酸更易、更快、更直接被机体吸收和利用。与氨基酸相比生物活性肽吸收机制具有以下特点；1 ) 不需消化，直接吸收，防止了在体内的二次水解并且吸收速度快，以完整的形式直接进入小肠，被小肠所吸收，进入人体循环系统，发挥其功能。2 )具有1 0 0 吸收的特点。吸收时，没有任何废物及代谢物，不增加人体负担，能被人体全部利用。3 ) 吸收时，不需耗费人体能量，不会增加胃肠功能负担。4 ) 起载体作用，它可将人体摄入的各种营养物质运载输送到人体各细胞、组织、器官中。它是一个依赖矿浓度、c e + 浓度、电导和耗能的独立过程。由于肽与氨基酸吸收机制完全不同且相互独立，因此避免了二者之间的吸收竞争。并且多肽显示出比氨基酸混合物和蛋白质更高的转移率与利用率。这种吸收特性在人体生理活动中具有重要应用，如为一些特殊状况下的人群补充营养，当人体由于疾病或其它因素对某种氨基酸不能很好的吸收时，可通过添加含有此种氨基酸的寡肽来提供氨基酸，寡肽的这种吸收优势具有很大的潜在营养作用。1 2 2 2 生物活性肽的生物功能特性功能性短肽不但吸收机制优胜于氨基酸，而且还具有多种氨基酸不可比拟的功能活性。有研究表明，肽的生物活性与分子量大小有关，能在体内起功能活性作用的肽往往是相对分子质量在1 0 0 0 以下的肽。小分子肽在体内消化吸收快，蛋白质利用率高；具有低抗原性，不会产生过敏反应；具有高溶解性、低粘度、高流动性和热稳定性等优良物理特性；同时生成了一系列具有特殊活性的肽段，如有镇静、安神作用的酪啡肽、可抑制血管紧张转换素酶( a c e ) 活性的降血压肽、具有载体功能的矿质元素吸收促进肽、抵御细菌和病毒感染的抗菌肽等。生物活性肽的的生理功能如下；1 调节体内的水分、电解质平衡；2 为免疫系统制造对抗细菌和感染的抗体，提高免疫功能；3 促进伤口愈合：4 在体内制造酵素，有助于将食物转化为能量；5 修复细胞，改善细胞代谢，防止细胞变性，能起到防癌的作用；6 促进蛋白质、酶、酵素的合成与调控；7 沟通细胞间、器官间信息的重要化学信使；8 预防心脑血管疾病；9 调节内分泌与神经系统；1 0 改善消化系统、治疗慢性胃肠道疾病；9第一章前言1 1 改善糖尿病、风湿、类风湿等疾病：1 2 抗病毒感染、抗衰老，消除体内多余的自由基；1 3 促进造血功能，治疗贫血，防止血小板聚集，能提高血红细胞的载氧能力。1 2 3 生物活性肽的制备方法天然存在的生物活性肽，如肽类抗生素、激素、生物毒素等，在生物体内含量甚微，提取困难，有些分子较大的还存在抗原性，可引发免疫反应，所以很难大规模、低成本的生产，很难实现产业化。现在越来越多的研究表明，有些生物活性肽是以非活性的状态存在于蛋白质的氨基酸长链中的。这些活性肽一旦通过蛋白酶的作用被释放出来，就可能发挥出许多生物活性，如抗高血压活性、促生长活性、抑制肿瘤的活性、抗氧化活性等。而随着各种功能肽生理活性的不断明确，科研人员及企业对活性肽的制备都表现出极大的兴趣，研究出了不同制备生物活性肽的方法，不同的方法适合不同的目的，也各有其优缺点。生物活性肽的制备，主要有以下五种途径【3 6 1 ：( 1 ) 从天然生物体提取：利用溶剂从天然生物体直接提取，但天然生物体中活性肽含量低，因此此法难以实现大规模工业化生产，而且其生产成本高，同时也受到资源限制。但从生物体中提取活性肽进行研究是可行的，这将为其他方法( 合成、酶解等) 提供理论参考。( 2 ) 化学合成：化学法用c n b r - 作用于m e t - x ，n t c b 作用于l y s - x ，i b a 作用于t r y - x ，甲醇作用于a s p p r o 。化学合成法广泛应用于生产高价值的短或中长药理级肽，其缺点是成本高、副反应物多，且在化学合成中可能会产生对健康和环境有害等问题，严重制约着其发展。( 3 ) 重组d n a 技术合成：随着基因工程技术的发展，利用d n a 重组等技术，将表达活性肽的基因整合到某些微生物或动物体内，通过生物体直接表达出所需肽类，其产量、纯度将会大大提高；或利用细胞培养技术大批量培养重组细胞生产活性肽，这样既节约成本，又提高了产量，利用生物工程技术生产活性肽是一种很有前景的方法。该法现在的趋势是仅限于多肽和蛋白的生产，但许多生物活性肽，特别是一些有感官效应和营养特性的肽都是短肽，所以在这方面用重组d n a 法是很有限的。而且利用d n a 重组技术人工表达活性肽要求实验条件苛刻、成本高、投资大，尚不具备普及性。另一个限制是世界某些地方的消费者反对使用由遗传改性生物所生产的食品。( 4 ) 酶法合成法：酶法合成肽与化学法相比有许多优点，如反应条件温和、消旋率小、氨基酸侧链通常不必保护和立体专一性强等。在有机溶剂中酶可催化合成含非蛋白氨基酸的肽，而基因重组方法却无法实现。但酶合成法反应副产物多，最适酶的缺乏及产率过低1 0第一章前言等因素制约着其发展。( 5 ) 酶法水解蛋白质制备：在食物蛋白质多肽链内部可能普遍存在着功能区，蕴藏着许多生物活性肽，它们在母体蛋白质序列内不具生物活性，但通过体内或体外蛋白酶水解释放出来后即可在体内发挥特定的生理功能。在人类的日常膳食中其实就蕴藏着许多生物活性肽，但因膳食摄入量有限及消化道的水解效果不完全，不能释放出相当浓度并具特定生理功能的活性肽。因此，选择适当的蛋白酶体外水解蛋白质，就有可能将这些生物活性肽释放出来，按工业化规模制备出具备特定生理功能的活性肽。该法可生产大量短肽，成本比化学合成法低，所用的底物、各种酶或酶制剂及反应条件多接近体内生理条件。从根本上说，使用蛋白酶进行简单的水解是获取有较好功能性而不损害其营养价值的活性肽的理想方法。该法具有安全性高、条件温和、易于控制、容易进行工业化生产、成本低、原料来源广等优点。因此，选择合适的蛋白酶水解蛋白质制备活性肽，必将成为当前工业化生产生物活性肽的主要手段f 3 7 1 。b r a n t l 等在1 9 7 9 年首先报道了从喂食牛乳酪蛋白酶解物的豚鼠小肠中发现了具有阿片样活性的小肽。此后又有大量具有重要生物活性的短肽通过对动植物源蛋白进行适度蛋白酶水解释放并鉴别出来，如乳蛋白，蛋类蛋白肽，小麦蛋白水解物，h o k i 鱼骨架蛋白等等。由于这些蛋白资源十分丰富和廉价，通过水解获得的生物活性肽不仅价格便宜、安全性好、工艺简单，而且容易进行工业化生产。所以这类研究越来越受到科学家和各国政府的关注。1 2 4 海洋蛋白源的生物活性肽海洋生物生存的环境由于与陆地生物完全不同，如高压、低温、高温和高盐等极端环境，为了适应这些极端的海洋生物环境，海洋生物蛋白质无论氨基酸的组成还是氨基酸的序列都与陆地生物蛋白有很大的不同，同时，海洋生物蛋白资源无论在种类和数量上都远远大于陆地蛋白资源，并且未得到很好的开发。种类繁多的海洋蛋白氨基酸序列中，潜在着许多具有生物活性的氨基酸序列，用特异的蛋白酶水解，就释放出有活性的肽段。目前对从海洋蛋白酶解产物中分离具有生物活性的功能肽是一个研究热点，受到国内外研究者的普遍关注。螺旋藻及藻蓝蛋白因其营养丰富，更具有极高的开发应用前景，近年来己从海藻的酶解物中发现了的具有新的氨基酸序列的降压肽【3 8 1 。研究表明藻胆蛋白通过蛋白酶酶解，生物功能性价值可得到明显提高。海洋占地球表面积的7 1 ，生物量约占地球生物总量的8 7 ，是地球上最大的资源能源宝库，丰富的资源有待于人们研究利用。海洋生物生活在一个具有一定水压、较高盐度、较小温差、有限溶氧、有限光照的海水化学缓冲体系中。与环境因子( 物理的、化学的、生l l第一章前言物的) 联系更为密切。由于生活环境的特殊性，海洋生物在新陈代谢、生存繁殖方式、适应机制等许多方面具有显著的特性，机体内含有许多结构特殊的生命活性物质和代谢产物。海洋天然产物的特异结构和药理作用是陆源生物所无法比拟的。迄今，人们己从各类海洋生物中分离获得1 4 5 0 0 余种具有各种结构类型的海洋天然产物，近l 2 具有各种生物活性；更重要的是超过0 1 的化合物结构新颖独特，活性显著，已成为先导化合物或新药来源。目前国际上已投入应用的海洋药物的经典例子有头孢霉素( c e p h a l o s p o r i n s ) 、阿糖腺苷( v i d a r a bi n e a r aa ) 、阿糖胞苷( c y t a r a b i n e a r ac ) 等。头孢霉素是一类广谱抗生素，其母体化合物的生物来源是意大利撒丁岛海洋沉积淤泥中的真菌c e p h a l o s p r i u ma c r e m o n i m n ( 现称a c r e m o n i u mc h r y s o g e n u m ) 。抗病毒药物阿糖腺苷和抗癌药物阿糖胞苷的原型化合物是分离自加勒比海海绵c r y p t o t c t h i a e r y p t a 的核苷类化合物s p o n g o t h y m i d i n e 和s p o n g o u r i d i n e 。海洋天然活性多肽是海洋天然产物研究的重要组成部分，它们显示出多种多样的生理活性，如抗肿瘤活性，抗菌性，抗病毒活性，抗氧化性及其它活性。其中一些海洋天然活性多肽可作为先导化合物用于新药研究，一些已作为药品投入市场。例如近年海洋药物开发成功的典型例子镇痛药物z i c o n o t i d e ，该药已成功通过i i i 期临床研究，于2 0 0 0 年6 月获得美国f d a 证书。z i c o n o t i d e 的生源是印度一太平洋竽螺c o n u s ，其前体化合物是源于竽螺的肽类毒素惫c o n t o x i n ，就是一种线性短肽，可通过人工合成获得药源，显示了广阔的应用前景。1 2 5 生物活性肽的应用前景目前。开发和研究生物活性肽类食品在国际保健品行业中已成为一个焦点。大量研究证明，当人体内缺乏一些调节生理功能的肽时，会导致人体机能的改变。因此从营养学的角度出发在食物结构调整以满足人体必需氨基酸需要的同时，适当补充某些生物活性肽对增强防病抗病能力、延缓衰老都具有深远意义。近年来的研究结果表明，短肽类物质可以以完整肽段的形式被机体吸收，进入循环系统与靶位点结合，从而发挥其生理功能，而不必分解为单个氨基酸。这就为免疫活性肽的研究和开发应用提供了分子生物学方面的依据。免疫分子生物学研究指出，能够引起机体免疫排斥反应的物质的相对分子质量通常在1 00 0 0 以上，相对分子质量小的小分子，不具备免疫原性，进入机体后不被机体识别，一般不能诱发免疫排斥反应。通过活性肽类的研究，促进了人类对肽类物质的应用，营养学家、生物医学家不断开发出各种各样的肽类产品，以满足人类健康事业的需要。目前对肽类物质的应用主要在以下三个方面：功能性食品：具有一定功能的肽类食品，目前是国际上研究的热点。同本、1 2第一章前言美国、欧洲已捷足先登，推出具有各种各样功能的食品和食品添加剂，形成了一个具有极大商业前景的产业。肽类试剂：纯度非常高，主要应用在科学试验和生化检测上，价格十分昂贵。肽类药物。生物活性肽分子结构复杂程度不一，可从简单的二肽到环形大分子多肽，而且这些多肽可通过磷酸化、糖基化或酰基化而被修饰。依据其功能，生物活性肽大致可分为生理活性肽、调味肽、抗氧化肽和营养肽等，但因一些肽具有多种生理活性，因此这种分类只是相对的。生物活性肽的研制作为国际上新兴的生物高科技产业领域，是具有极大市场潜力的朝阳产业，已受到各国科学家和政府的高度重视。尤其是美国、日本等国对活性肽的研发水平较高，不仅有众多产品上市，而且还将肽的产业化和普及进行了规范，并制定了相关法律。我国对活性肽的研究开展较晚，始于上世纪八十年代，但近年来呈现迅猛发展势头。1 3 肠道微生物群落研究概况1 3 1 肠道微生物群落概述及研究进展及意义黄帝内经日：脾胃为后天之本。意思是要有健康的体魄先要有健康的胃肠道，且胃肠道的完整性足以影响宿主的健康状况。人和动物肠道栖息着相当多的且极复杂的微生物，是体内表面积最大也是体内代谢最重要的器官，当食物经摄入后均需经过胃肠道菌群的消化分解和吸收，代谢为营养物质和活性物质并发挥滋养全身的作用，使人体能维持生命活动，近年来随着各种分子技术在肠道微生物群落研究中的广泛应用，人和动物肠道中定植的微生物群落的结构与功能正逐步得到揭示。一般认为这个复杂的群落包含5 0 01 0 0 0 种菌，总数达1 0 h 1 0 m ，是人自身细胞总数的1 0 倍，而其包含的基因数目是人基因组的1 0 0倍。美国斯坦福大学医学院的d a v i dr e l m a n 等f 3 9 1 ，利用一种评估海底环境中细菌生态系统的丰度的新型技术焦磷酸测序法( p y r o s e q u e n c i n g ，首先要提取大量待检测细菌的d n a片段，这些片段一般编码某些常见分子，在根据片段上的变异情况，对细菌进行分类) ，对人体肠道内菌落数量进行统计，认为体肠道内的细菌种类远超人们想象。至少有5 6 0 0 个细菌群落。这个世界上几乎密度最高的微生物群落与人的健康和疾病状况息息相关，肠道中微生物在代谢方面肠道菌群能降解发酵食物中不可消化性食物残渣和内生性黏液素，提供宿主维生素等营养物质，产生短链脂肪酸，不仅提供肠道上皮细胞能量来源。更降低肠道p h第一章前言值以预防致病原菌过度生长、产生维生素k 、帮助离子吸收。在营养性方面，调控上皮细胞增生作用及分化作用、帮助免疫系统发展及维持恒定。美国u ts o u t h w e s t e mm e d i c a lc e n t e r 组成的科研小组在一项小鼠试验中发现【4 0 】，肠壁上的一种单分子，经肠道菌代谢物激活之后，在控制体重上起着至关重要的作用，直接决定动物的胖瘦。保护性方面，形成屏障壁以排除外的病原菌，减少已存在肠道的病原菌的增加或毒性及致癌物的产生【4 i j ，而且共生微生物群中的不平衡被认为对于炎症性肠病的发病起到了促进作用。2 0 0 8 年1 2 月发表在自然上的一项研究表明【4 2 】，由一种常见的哺乳动物共生细菌脆弱拟杆菌( b a c t e r o i d e sf r a g i l i s ) 产生的一种因子能够防止小鼠的肠道炎症。法国国家健康与医学研究所研究发现 4 3 1 ，人体肠道菌群中一种细菌的缺失会导致人患上克罗恩氏病。上海交通大学药学院贾伟教授等】从系统生物学的角度阐释了肠道微生态系统作为潜在的药物治疗靶点的可能性，并重点提出了基于肠道菌群的药物治疗策略和可能的干预模式。目前越来越多的研究者认识到肠道微生态研究的重要意义。l e d e r b e r g 提出对现代人的遗传描述应该包括人自身( h o m os a p i e n s ) 的基因组和人体微生物群基因组( m i c r o b i o m e ) 4 s l ；b a c k h e d 认为肠道菌群可以视为一个代谢器官。因为它弥补人类在进化中不具备的生理能力d o ：n i c h o l s o n 更是明确指出：人是由人体真核细胞核共生在体内的微生物群落共同构成的“超级生物体( s u p e r o r g a n i s m ) ，菌群对宿主的代谢网络有着重要的影响作用【47 。在正常情况下，肠道菌群具有特定的定位、定性和定量结构，种群间处于一种有利于机体的动态平衡状态。人体消化道部分包含食道、胃、十二指肠、空肠、回肠、结肠、直肠( 大肠) 。胃中只有少量的微生物( 平均1 0 3 c f u m l ) ，胃内酸度高，含大量消化酶，不适合细菌成长，所以胃内菌数量很少，耐酸性微生物主要为革兰氏阳性的链球菌和真菌。十二指肠由于有胆汁及胰液等，不利于微生物生长与存活，只有极少数的微生物存在( 约1 0 c f u m l ) 。而小肠是个过渡区，虽然p h 值稍偏碱，但含有消化酶，蠕动强烈。肠液流量大，足以将细菌在繁殖前冲洗到远端回肠和结肠，所以，小肠菌量在胃和结肠之间逐渐增多；在空肠与回肠片段，随着肠道的远端前进，不仅菌量增加至1 0 4 1 0 8 c f u m l 外，菌落数也更显多样性，除了乳酸菌，越接近大肠，双歧杆菌逐渐增加，革兰氏阴性绝对厌氧菌属如杆菌、梭杼菌也出现于此段肠道中。在健康成年人大肠