（发酵工程专业论文）降解木糖渣生产丁醇的初步研究.pdf

山东大学硕士学位论文 摘要 随着化石燃料的不断减少，能源日益成为人们所关注的问题。化石燃料是非 可再生资源，却是现代工业文明的命脉，人们不得不寻找新能源来替代。纤维素作 为一种产量大、可再生的绿色资源，吸引了众多科研工作者。如果能够合理有效 地将纤维素转化为我们需要的能源可能成为缓解甚至解决能源问题的一条途径。 燃料乙醇被人们广泛接受的同时，也使人们看到了新能源的前景。随着人们 对纤维素酶研究越来越深入，可以将纤维素转化成可发酵糖，再转化成其它产物。 本实验室从土壤中筛选到一株分泌降解木质纤维素的完全酶系的斜卧青霉 ( p e n i c i l l i u md e c u m b e n s ) 菌株1 1 4 2 ，再通过理化诱变得到了抗葡萄糖阻遏突变株 j u a 1 0 ，能在产酶培养基上分泌大量纤维素酶。菌株j u - a 1 0 已经应用于纤维素酶 和生物乙醇的工业生产。 丁醇不但能作为工业的重要原料，也能作为液体燃料。丁醇是四碳化合物， 其燃烧释放的热值比乙醇更接近于石油，丁醇比乙醇更适合作为液体燃料。 本论文利用斜卧青霉突变株j u a 1 0 生产的纤维素酶酶液对木糖渣( 山东禹城 龙力生物有限公司提取玉米芯中的低聚木糖后产生的工业废渣) 进行糖化，并使 用丙酮丁醇梭菌发酵生产丁醇。 本论文的主要实验内容包括： 1 、应用斜卧青霉突变株j u a 1 0 酶液对木糖渣的糖化 首先获得斜卧青霉突变株j u a 1 0 酶液，再对木糖渣进行糖化。j u a 1 0 酶液 的酶系最适温度在4 0 5 0 ，实验室前期工作中对于纤维素材料的糖化也均在 5 0 下进行。由于丙酮丁醇梭菌的培养温度为3 7 。c ，所以我们分别选择3 7 和 5 0 c 对木糖渣进行糖化。结果发现，糖化前期5 0 的酶解效果要好于3 7 。c ，后期 则正好相反。对木糖渣和玉米芯粉糖化3 天后，3 7 下获得的还原糖浓度分别是 3 7 1e , l 和3 7 7e , l ，分别比5 0 。c 下获得的还原糖多9 7g l 和7 6g l 。所以最终 选择糖化温度为3 7 c 。此外，分别使用稀硫酸、稀n a o h 溶液和自来水在1 2 1 对木糖渣处理1h 后用于糖化实验。结果发现，稀酸预处理的木糖渣在糖化过程中 获得的还原糖最多，稀碱预处理的效果最差。最终选择采用稀硫酸或自来水进行 山东大学硕士学位论文 预处理。 2 、丙酮丁醇梭菌c i c c 8 0 1 6 和a t c c 5 5 0 2 5 发酵特性的研究 丙酮丁醇梭菌( c l o s t r i d i u ma c e t o b u t y l i c u m ) c i c c 8 0 1 6 购自中国工业微生物菌 种保藏中心；丙酮丁醇梭菌( c l o s t r i d i u ma c e t o b u t y l i c u m ) a t c c 5 5 0 2 5 由中国科学 院青岛能源所李福利研究员赠送。 确定了丙酮丁醇梭菌培养生产丁醇的时间为3 _ 4 天。以比较适合c i c c 8 0 1 6 生 长和生产的葡萄糖培养基p 2 为基础，分别对不同葡萄糖浓度和酵母粉浓度对其丁 醇产量的影响进行了比较。确定了葡萄糖浓度为2 5g l ，酵母粉浓度o 6 3g 几时， 可以得到较高的产量，其中丙酮产量为2 5 4e t ，丁醇产量为7 2 1g l 。丙酮丁醇 梭菌a t c c 5 5 0 2 5 在p 2 培养基中也可以良好地生长并生产丁醇。在葡萄糖为3 0 g t 、酵母粉为8 - 1 5g l 或者硫酸铵为8 班的条件下可获得的丙酮产量为4 班， 丁醇产量为1 4g l 。通过对比两株菌，丙酮丁醇梭菌a t c c 5 5 0 2 5 对糖的利用能力 更强，丁醇产量也更高。控制较低的初始p h 可以使丙酮丁醇梭菌在初期生产丙 酮、丁醇的产量有所增加，但是效果并不显著。 3 、纤维素同步糖化发酵生产丁醇的研究 丙酮丁醇梭菌具有较强的蛋白酶活性，可能水解纤维素酶蛋白用于菌体生长。 在丙酮丁醇梭菌c i c c 8 0 1 6 和a t c c 5 5 0 2 5 的培养物中添加纤维素酶，经过9 3h 的 培养，滤纸酶活分别保留了8 6 和6 9 ，表明同步糖化发酵生产丁醇是可行的。 丙酮丁醇梭菌a t c c 5 5 0 2 5 可以利用木糖渣糖化液中的纤维二糖。同时，木糖也可 以被利用。 利用丙酮丁醇梭菌c i c c 8 0 1 6 对木糖渣进行同步糖化发酵时发现，发酵3 天时 发酵液中丁酸浓度很高。在发酵过程中添加葡萄糖，能够提高丁醇的产量，但不 能使丁酸减少。如果采取少量多次或者流加的补糖方式，可能会达到比较好的结 果。丙酮丁醇梭菌a t c c 5 5 0 2 5 用于木糖渣糖化发酵时，同步糖化发酵的丁醇产量 高于木糖渣预糖化1 2h 时的产量。以滤纸为底物同步糖化发酵时，丁醇产量高于 以木糖渣为底物时的产量。利用5 0 乙醇预处理( 2 0 0 c ，2 0m i n ) 过的木糖渣同 步糖化发酵时，丁醇产量高于未处理木糖渣的产量。 关键词：斜卧青霉；木糖渣；丙酮丁醇梭菌；丁醇；厌氧 山东大学硕士学位论文 ab s t r a c t a st h ec o n s u m p t i o no ff o s s i lf u e l s ，t h ee n e r g yp r o b l e mh a sb e c o m et h ef o c u sa n d a t t r a c t e dm u c hm o r ea t t e n t i o nt h e s ey e a r s f o s s i lf u e l sa r et h el i f e b l o o do fi n d u s t r i a l c i v i l i z a t i o nb u ta r en o n r e n e w a b l e n e we n e r g i e sa r en e c e s s a r yt os u b s t i t u t ef o s s i lf u e l s c e l l u l o s e ，t h em o s ta b u n d a n tb i o p o l y m e ri nt h ew o r l d ，i sc o n s i d e r e dt ob eap r o m i s i n g r e s o u r c ef o re n e r g yp r o d u c t i o n t h eh i g h l y e f f i c i e n tc o n v e r s i o no fc e l l u l o s et of u e l s m i g h tr e l i e v eo re v e ns a v et h ee n e r g yp r o b l e mi nt h ef u t u r e c e l l u l o s i ce t h a n o lh a sb e e na c c e p t e dw i d e l yb ym o r ep e o p l ea n db r o u g h ts o m e h o p er e c e n t l y c e l l u l o s ec o u l db eh y d r o l y z e dt of e r m e n t a b l es u g a r sa n dt r a n s f o r m e dt o o t h e rp r o d u c t si nt h en e x ts t e p w eh a v ei s o l a t e dap e n i c i l l i u md e c u m b e n s114 - 2w i t ha c o m p l e t ec e l l u l o l y t i ce n z y m es y s t e mf r o ms o i l ac a t a b o l i t e r e p r e s s i o n r e s i s t a n tm u t a n t j u - a10w a sa l s oo b t a i n e du s i n gp h y s i c a la n dc h e m i c a lm u t a g e n e s i sf r o m11 4 2 j u a 1 0c o u l dp r o d u c eh i g h e ra m o u n t so fc e l l u l a s ea n d h a sb e e nu s e dt oc e l l u l a s ea n d c e l l u l o s i ce t h a n o lp r o d u c t i o n b u t a n o li sn o to n l ya l li m p o r t a n ti n d u s t r i a lm a t e r i a lb u ta l s oa ne x c e l l e n t a l t e r n a t i v ef u e l b u t a n o li saf o u rc a r b o na l c o h 0 1w i t hah i g h e re n e r g yc o n t e n t ，w h i c h m a d ei tab e t t e rb i o f u e lt h 锄e t h a n o l i nt h i sp a p e r , c e l l u l a s ep r o d u c e db y 尸d e c u m b e n sj u - a iow a su s e dt od e g r a d e c o r n c o br e s i d u e s ，aw a s t eo fx y l o o l i g o s a c c h a r i d ep r o d u c t i o ni ns h a n d o n gl o n g l i v e b i o t e c h n o l o g yc o m p a n y ，a n dt h e nb u t a n o lw a sp r o d u c e df r o mf e r m e n t a b l es u g a r sb y c l o s t r i d i u ma c e t o b u t y l i c u m t h em a i nr e s u l t so ft h et h e s i sa r ea sf o l l o w s 1 s a c c h a r i f i c a t i o no fc o r n c o br e s i d u e su s i n gc e l l u l a s ep r o d u c e db yr d e c u m b e n sj u a 1 0 pd e c u m b e n sj u a 1 0w a sc u l t u r e dt op r o d u c ec e l l u l a s ea n dt h eb r o t hw a sa p p l i e d t ot h es a c c h a r i f i c a t i o no fc o r n c o br e s i d u e s a st h eo p t i m u mt e m p e r a t u r eo fc e l l u l a s e p r o d u c e db y 户d e c u m b e n s j u - a 1 0w a sb e t w e e n4 0 ca n d5 0 。c w eu s u a l l yp e r f o r m e d i i i 山东大学硕士学位论文 t h es a c c h a r i f i c a t i o ne x p e r i m e n ta t5 0 。ci nt h ep r e v i o u sw o r k c o n s i d e r i n gt h et h e o p t i m u mg r o w t ht e m p e r a t u r eo f t h ec l o s t r i d i u mu s e di nt h i ss t u d yw a s3 7 。c ，b o t h3 7 c a n d5 0 w e r eu s e da n dt h er e s u l t sw e r ec o m p a r e d w h e ns a c c h a r i f i c a t i o nw a s p e r f o r m e da t5 0 ，m o r er e d u c i n gs u g a r sw e r er e l e a s e di nt h ep r i o rp e r i o db u tl e s si n t h el a g e rp e r i o dt h a nt h a ta t3 7 a f t e ra3d a y s s a c c h a r i f i c a t i o n 3 7 1g la n d3 7 7g lr e d u c i n gs u g a r sw e r ep r o d u c e da t37 f r o mc o m c o br e s id u e sa n dc o r n c o bp o w d e r r e s p e c t i v e l y ，w h i c hw e r e9 7g la n d7 6g lm o r et h a nt h a ta t5 0 。c s ow ec h o o s e3 7 c a st h et e m p e r a t u r eo fs i m u l t a n e o u ss a c c h a r i f i c a t i o na n df e r m e n t a t i o n w ea l s o p r e t r e a t e dc o r n c o br e s i d u e sw i t hd i l u t es u l f u r i ca c i d ，d i l u t en a o h s o l u t i o no rt a pw a t e r a t121 c o r n c o br e s i d u e sp r e t r e a t e dw i t hd i l u t es u l f u r i ca c i dr e l e a s e dt h em o s t 。w h i l e t h a tp r e t r e a t e dw i t hd i l u t en a o hs o l u t i o nr e l e a s e dt h el e a s tr e d u c i n gs u g a r sa f t e r s a c c h a r i f i c a t i o n s ow eu s e dd i l u t es u l f u r i ca c i do rt a pw a t e rt op r e t r e a tc o r n c o b r e s id u e s 2 f e r m e n t a t i o nc h a r a c t e r i s t i c so fc l o s t r i d i u ma c e t o b u t y l i c u mc i c c 8 0 1 6a n d a t c c 5 5 0 2 5 c l o s t r i d i u ma c e t o b u t y l i c u mc i c c 8 016w a sp u r c h a s e df r o mc h i n ac e n t e ro f i n d u s t r i a lc u l t u r ec o l l e c t i o n ；c l o s t r i d i u ma c e t o b u t y l i c u ma t c c 5 5 0 2 5w a s k i n d l y p r o v i d e db yd r l if u l i ( q i n g d a oi n s t i t u t eo fb i o m a s se n e r g ya n db i o p r o c e s s t e c h n o l o g y , c a s ) ca c e t o b u t y l i c u mw a sc u l t u r e df o rb u t a n o lp r o d u c t i o nf o r3t o4d a y s b a s e do n t h em e d i u mp 2w h i c hw a ss u i t a b l ef o r t h eg r o w t ho f c i c c 8 0 1 6 ，g l u c o s eo ry e a s t e x t r a c to fd i f f e r e n tc o n c e n t r a t io nw e r ec o m p a r e df o rt h e i re f f e c t so nb u t a n o lp r o d u c t io n w h e nt h em e d i u mc o n t a i n e d2 5g lg l u c o s ea n do 6 3g ly e a s te x t r a c t ，ah i g h v o l u m ep r o d u c t i o nw a so b t a i n e d ，i n c l u d i n g2 5 4g la c e t o n ea n d7 2 1g lb u t a n 0 1 c a c e t o b u t y l i c u r aa t c c 5 5 0 2 5c o u l da l s og r o ww e l la n dp r o d u c eb u t a n o lw h e nc u l t u r e d 、i t hp 2m e d i u m w h e n3 0g lg l u c o s e ，8 1 5g l y e a s t e x t r a c t o r8g l a m m o n i u m s u l f a t ew a si nt h em e d i u m ，4g la c e t o n ea n d14g lb u t a n o lw e r ed e t e c t e d b y c o m p a r i n gt h et w os t r a i n s ，ca c e t o b u t y l i c u ma t c c 5 5 0 2 5c o n s u m e dm o r es u g a r sa n d p r o d u c e dm o r eb u t a n o lt h a nca c e t o b u t y l i c u mc i c c 8 0 16 w h e nt h ei n i t i a lp hw a s i v 山东大学硕士学位论文 c o n t r o l l e da tal o wl e v e l ，ca c e t o b u t y l i c u mc o u l dp r o d u c em o r ea c e t o n ea n db u t a n o li n t h ep r i o rp e r i o d ，b u tt h ee f f e c tw a sn o to b v i o u s 3 c e l l u l o s i cb u t a n o lp r o d u c t i o nv i as i m u l t a n e o u ss a c c h a r i f i c a t i o na n d f e r m e n t a t i o n ( s s f ) a sca c e t o b u t y l i c u me x h i b i t e dah i g hp r o t e a s ea c t i v i t y ，c e l l u l a s em i g h tb e h y d r o l y z e dt os u p p o r tt h eg r o w t ho fb a c t e r i a w h e nc e l l u l a s ew a sa d d e dt ot h ec u l t u r e o f c a c e t o b u t y l i c u mc i c c 8 0 1 6a n da t c c 5 5 0 2 5 ，8 6 a n d6 9 f i l t e rp a p e ra c t i v i t i e s w e r ea s s a y e da f t e r9 3hr e s p e c t i v e l y , i n d i c a t i n gb u t a n o lp r o d u c t i o nv i as i m u l t a n e o u s s a c c h a r i f i c a t i o na n df e r m e n t a t i o nw a sf e a s i b l e ca c e t o b u t y l i c u ma t c c 5 5 0 2 5c o u l d p r o d u c eb u t a n o lf r o mc e l l o b i o s ed e t e c t e di nt h es a c c h a r i f i c a t i o ns l u r r yo fc o r n c o b r e s i d u e s a tt h es a m et i m e ，x y l o s ec o u l da l s ob eu s e d a h i g hb u t y r i ca c i dc o n c e n t r a t i o nw a sd e t e c t e da f t e r3d a y s s s fo f c o r n c o b r e s i d u e su s i n gc a c e t o b u 纱l i c u mc i c c 8 0 16 a d d i t i o no fg l u c o s ei nt h ef e r m e n t a t i o n p r o c e s sc a u s e da ni n c r e a s eo fb u t a n o l ，w h i l eb u t y r i ca c i ds h o w e dn od e c r e a s e g l u c o s e - l i m i t e df e db a t c hc u l t u r em i g h tb eh e l p f u lf o rb u t a n o lp r o d u c t i o n w h e nc a c e t o b u t y l i c u ma t c c 5 5 0 2 5w a su s e d ，b u t a n o lp r o d u c t i o no fc o r n c o br e s i d u e ss s f w a s h i g h e rt h a nt h a to fp r e s a c c h a r i f i c a t i o nf o r12h b u t a n o lp r o d u c t i o nw a sh i g h e rf o r f i l t e rp a p e rs s ft h a nc o r n c o br e s i d u e ss s f u s eo fp r e t r e a t e dc o r n c o br e s i d u e s ( 5 0 e t h a n o l ，2 0 0 ( 2f o r2 0m i n ) b r o u g h ta b o u tah i g h e rb u t a n o lp r o d u c t i o nt h a nu n t r e a t e d c o r n c o br e s i d u e s k e y w o r d s ：p e n i c i l l i u md e c u m b e n s ；c o r n c o br e s i d u e s ；c l o s t r i d i u m a c e t o b u t y l i c u m ；b u t o n a l ；a n a e r o b i c v 山东大学硕士学位论文 b t u c b h c d d n s e g f p a h p l c l ( d a r p m m i n s s f v i 符号说明及缩略词 b r i t i s ht h e r m a lu n i t英热单位( 英制) c e l l o b i o h y d r o l a s e 外切葡聚糖酶 c i r c u l a rd i c h r o i s m 圆二色谱 3 ，5 d i n i t r o s a l i c y l i ca c i d 3 ，5 二硝基水杨酸 e n d o g l u c a n a s e 内切葡聚糖酶 f i l t e rp a p e ra c t i v i t y 滤纸酶活 h i g hp e r f o r m a n a c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 高效液相色谱 k i l o d a l t o n 千道尔顿 r e v o l u t i o np e rm i n u t e转 分钟 s i m u l t a n e o u ss a c c h a r i f i e a t i o na n df e r m e n t a t i o n 同步糖化发酵 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：立监 日期：护只夕 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许 论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部 分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手 段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 磨， 论文作者签名：主监聊签名：塑鳖期： 山东大学硕士学位论文 第一章绪论 随着时代的发展，化石燃料的大量消耗。化石燃料逐渐减少，能源日益成为 人们关注的问题。同时，随着二氧化碳的逐步积累，导致全球气候逐渐变暖，利 用生物质资源生产燃料受到人们的关注和认可。我国化石燃料缺乏，大气污染严 重。同时，我国又是生物质资源大国，存在大量的农林畜产品废弃物、食品加工 废弃、餐饮废弃物和城市生活垃圾等生物质资源。加快发展生物质能等可再生能 源1 1 】已经被列为“十一五规划的战略目标和重点发展方向。 纤维素材料是地球上最丰富的生物质资源，占植物界碳含量的5 0 以上。 陆生植物每年生产干重为1 3 1 0 1 0 吨的木材，这相当于7 1 0 9 吨煤炭或者世界 能源总需求的三分之二。农业和其他领域可得到的纤维资源有1 8 1 0 1 0 吨年【1 1 。 一项研究结论表明美国每年来自农业和森林资源的生物质大概有1 3 亿吨干引2 1 。 然而，每年产生的大量的纤维素生物质并没有得到有效的利用，绝大部分的天然 纤维素材料在自然环境中被各种微生物分解转化，最终进入生态系统的碳循环， 造成了巨大的资源浪引3 “】。我国是一个农业大国，以农作物秸秆为代表的木质 纤维素类生物质资源十分丰富，年产量高达6 7 亿吨多吨，大部分焚烧于田间 地头，不仅浪费了资源还造成了环境的污染。若能采用适宜的技术，将这些秸秆 类生物质资源加以转化利用，不仅能够节粮代粮，降低燃料乙醇生产的原料成本， 还可以处理废物、消除公害、保护环境，对我国经济的可持续发展将产生深远的 影响【 。 1 1 纤维素酶系的组成及酶学性质 纤维素( c e l l u l o s e ) 是线性葡聚糖，通过b ( 14 4 )糖苷键联接的纤 维二糖残基( 图1 1 ) 可看作它的二糖单位。人和哺乳动物缺乏纤维素酶 ( c e l l u l a s e ) ，因此不能消化纤维素f 6 1 。许多微生物和原生动物能够利用纤维 素。 山东大学硕士学位论文 1 1 1 纤维素酶系的组成 图1 1 纤维二糖结构 纤维素酶系由三类功能不同但又互补的酶组成。这三类酶分别是内切 葡聚糖酶( e g ，c x 酶) ，外切葡聚糖酶( 纤维二糖水解酶) 和b 葡萄糖苷 酶( 纤维二糖酶) 。内切葡聚糖酶可作用于纤维素分子内的无定形区，随机 水解b 1 ，4 糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量的小分子纤维素。内 切型纤维素酶可为外切酶提供大量的反应末端，同时它也能水解小分子的 纤维素寡糖。外切葡聚糖酶( 纤维二糖水解酶) 作用于纤维素分子的末端， 依次从纤维素分子中切下纤维二糖，它可以作用于纤维素分子内的结晶区、无定 形区。b 一葡萄糖苷酶( 纤维二糖酶) 将纤维二糖水解成葡萄糖，也可以从短链葡 聚糖的非还原端切下葡萄糖【刀。 各种微生物的纤维素酶的分泌特性和组成特点各不相同，可分成以下两类： ( 1 ) 胞外复合酶系：好氧的丝状真菌，如常见的木霉、曲霉、青霉等能大 量合成纤维素酶并分泌到胞外，各种纤维素酶组分独立存在。其中，瑞氏木霉是 在研究和生产中应用最广泛的菌株，它所产的纤维素酶系至少包含2 个外切酶， 5 个内切酶和2 个b 一葡萄糖苷酶。 ( 2 ) 胞壁结合的复合酶系：许多厌氧细菌如梭菌属和瘤胃中的一些细菌产 生的纤维素酶基本不分泌到胞外，而是存在于细胞壁上或者游离在细胞周围，以 纤维小体的形式存在1 9 1 。如热纤梭菌的细胞壁上嵌合有一个1 9 7k d a 的非催化性 的脚手架蛋白。至少有9 个内切酶蛋白、4 个外切酶蛋白、5 个半纤维素酶蛋白、 2 山东大学硕士学位论文 1 个几丁质酶蛋白和1 个地衣多糖酶蛋白在脚手架蛋白上锚定着，形成了纤维小 体。与真菌所产纤维素酶不同，热纤梭菌所产纤维素酶复合物对晶体纤维素有很 高的降解活性，能完全分解利用由棉花等制成的微晶纤维素，被称为具有“真正 的纤维素酶活的微晶纤维素酶 【9 1 。 1 1 2 纤维素酶的酶学性质 ( 1 ) 纤维素酶的分子量 纤维素酶的来源广泛，不同来源的纤维素酶的分子量差异也较大，即使是同 一酶系中的三类酶也有较大差异。一般d 一葡萄糖苷酶的分子量最大，常大于7 0 k d a ，有的甚至高达4 0 0k d a ；外切纤维素酶的分子量一般在5 0 6 0k d a 左右；纤 维素内切酶的分子量一般低于5 0k d a ，最小的纤维素内切酶分子量为5 3k d a l l o j 。 ( 2 ) 纤维素酶的最适温度和最适p h 纤维素酶的最适温度范围一般在4 0 一6 0 ，在7 0 以上失活迅速。但某些 b 葡萄糖苷酶的最适温度稍高，在5 5 7 0 。由于许多生产工艺中需要较高的 温度，筛选耐热的新型纤维素酶或对已有纤维素酶进行改造以增强其耐热性一直 是纤维素酶研究的热点之一1 2 】。p o s t a 等就从t h e r m o b i f i d a f u s c a 中分离到了 最适温度为7 7 的纤维素内切酶，这种纤维素酶在6 0 保温2 4h 后其酶活仍保 留6 0 以上f 1 3 1 。 丝状真菌所产纤维素酶大多适应酸性或中性偏酸的环境，在碱性条件下酶活 力丧失。某些细菌产生的纤维素酶最适p h 可以为中性至偏碱性。 ( 3 ) 纤维素酶的分子结构 对纤维素酶分子结构和功能的研究是从2 0 世纪8 0 年代开始的。由于来源于 真菌的纤维素酶大多是糖蛋白，并具有高度柔性的连接蛋白，使研究者难以得到 完整的纤维素酶晶体。因此很长一段时期内仅对纤维素酶的结构域进行拆分，证 明了多数纤维素酶是由纤维素结合结构域( c b m ) ，连接蛋白( l i n k e r ) 和纤维 素催化结构域( c d ) 构成。 ( 4 ) 纤维素酶的催化机理 经典的理论认为糖苷水解酶催化糖基转移的机理，是涉及到两个氨基酸残基 酸碱催化的双置换反应，这实际与溶菌酶的作用机制相似【1 4 、1 5 】。纤维素酶对糖 山东大学硕士学位论文 苷键的水解主要通过酶的活性中心的天门冬氨酸或谷氨酸上的羧基完成【】6 1 刀。 酶活性中的两个羧基以不同的解离状态存在，一个为解离的、带负电荷的羧基， 另一个为非解离的、不带电荷的羧基。首先由带负电荷的羧基对p 1 ，4 糖苷键上 的一号碳原子进行亲核攻击，形成碳氧离子的过渡态，另一个非解离状态的羧基同 时对d 1 ，4 糖苷键上的氧原子进行亲电攻击，并形成氢键，使糖苷键上的c o 单键 不稳定而断裂。糖苷键断裂而得到的其中一个葡萄糖残基和酶活性中心的非解离 态的羧基以氢键相连，很容易从酶分子上脱离，得到自由的葡萄糖残基和酶活性 中心的羧基。另一个葡萄糖残基以共价键和酶活性中心的羧基相连，这种连接在 另一个自由羧基的亲核攻击下断裂，酶分子还原，并产生两个短的纤维素分子， 酶水解完成【1 8 】。 1 2 产溶剂的梭菌 梭状芽胞杆菌( c l o s t r i d i u m ) 能发酵生成一系列的溶剂，特别是丁醇、丙酮、 异丙醇和乙醇，此外还有丁酸。若使用的菌种及培养条件不同，产生的溶剂及比 例也不同。但是它们都同时生成c 0 2 、h 2 、丁酸和乙酸等副产物。丙酮、丁醇发 酵采用的菌有：丁酸梭菌( c b u l y l i c u m ) 、丁醇梭菌( c b u t a n o l o g e n u m ) 、淀糖丁丙 梭菌( c a m y l o s a c c h a r o - b u t y l p r o p y l i c u m ) 及两用梭菌( c l o a n u m ) 也能进行丁醇、 异丙醇发酵。荷兰资料中报道所用的两种拜氏梭菌( c b e i j e r i n c k i i ) 即为原称丁 酸梭菌( c b u l y l i c u m ) 9 1 。 1 2 1 丙酮丁醇梭菌 丙酮丁醇梭菌( c l o s t r i d i u ma c e t o b u t y l i c u m ) 广泛分布于土壤和谷物等种子 表面，是一种革兰染色阳性、细胞呈梭状、能产生丙酮和丁醇等溶剂的厌氧芽孢 杆菌。细胞大小( o 6 - - 一0 9 ) 岬( 2 4 4 7 ) 岬，常含细菌淀粉粒，以周生鞭毛运动， 芽孢卵圆形，次端生；表面菌落圆形、突起，直径3 - - 5m m ，边缘不规则，色灰 白，半透明，表面有光泽，严格厌氧，能分解蛋白质和糖类；生物素和对氨基苯 甲酸作生长因子。在玉米粉培养液中生长旺盛，产生大量的丙酮、丁醇和乙醇 ( 3 ：6 ：1 ，w w ) 等溶剂，是重要的工业发酵菌种。1 9 1 2 年w e z m a n n 分离获得了可 利用淀粉高效生产丙酮丁醇梭菌。后来，糖型生产菌糖乙酸丁醇菌 4 山东大学硕士学位论文 ( c s a c c h a r o a c e t o b u t y l i c u m ) 等优秀菌种被筛选出来。如c s a c c h a r o p e r b u t y l a c e t o n i c u mn 1 - 4 ( a t c c1 3 5 6 4 ) 被广泛应用m2 1 、2 2 1 。 丙酮丁醇梭菌具有强力的蛋白分解酶，它使不溶蛋白质变为可溶含氮化合 物，含氮化合物是菌体细胞最好的养料。玉米、黑麦、小麦、碗豆、干酪素等的 蛋白质，在发酵过程中很快就水解。总氮量的1 5 - - 一6 0 均变成可溶性的氮。可 发酵的糖包括：葡萄糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、 棉籽糖，松三糖、淀粉、糊精、肝糖、鼠李糖及水杨苷、乙酰基甲酸、甘露蜜醇、 葡萄糖酸钙等。此外碳水化合物发酵时可生成：醋酸、乙酰醋酸、乙醛、丁醛及 蚁酸【2 3 j 。 1 211 丙酮丁醇梭菌的发酵特征 丙酮丁醇梭菌在广义上说属于丁酸菌族丁酸菌是嫌气性的、有鞭毛能运动 的杆状菌。在产生孢子时成为纺锤状或者鼓槌状。丙酮丁醇梭菌除了上述一般丁 酸菌的通性外，还具有发酵产生丙酮、丁醇等中性产品的能力。在中性培养基中 发酵时，一般丁酸菌和丙酮丁醇梭菌均能产生丁酸和醋酸。在酸性培养基中发酵 时，当培养基的酸度增加到一定数值后，一般丁酸菌即停止发酵并且细菌的繁殖 也停止。但是丙酮丁醇梭菌在这种培养基中发酵时，酸性培养基的酸度达到最高 点后，由于其自身有脱酸能力，酸度反而下降，并且产生中性的产品丙酮、 丁醇、乙醇等。最后细菌逐渐衰亡并自溶。 1 2 1 2 丙酮丁醇梭菌发酵过程 丙酮丁醇梭菌的发酵过程大体可以分为三个阶段即前发酵期、主发酵期和后 发酵期，也可以以酸度曲线变化分为升酸期、减酸期和平衡期。 ( ) 前发酵期( 升酸期) 发酵起始，p h = 6 0 7 0 ，随着菌体数目迅速增加，合成和分解进行，丁酸和 乙酸大量产生，发酵液酸度急剧上升，称为升酸期。碳源消耗很快。溶剂产生很 少，主要发酵产物是乙酸、丁酸，h 2 和c 0 2 等。 ( 二) 主发酵期( 减酸期) 随着酸度迅速上升，发酵液的还原倾向增强，菌体将丁酸和乙酸还原成丙酮 和丁醇等溶剂，酸度下降。酸度会一直降到最大值的一半左右。这个过程是产生 溶剂的生化反应的关键时期，主要特征是酸度的下降，故称做减酸期。 山东大学硕士学位论文 ( 三) 后发酵期( 平衡期) 酸度降到一定水平之后，将维持在2 到3 5 之间，直到发酵结束。这个时期 菌体的繁殖生长与死亡达到平衡状态。此时所积累的酸主要是不挥发酸。由于发 酵液中营养消耗殆尽，加上溶剂积累带来的毒害，尤其是丁醇，使菌体开始自溶 或者生成孢子，发酵趋于停止。 丙酮丁醇梭菌菌种的主要发育阶段，在沙波什科夫实验室内将其划分为5 个类型，标准图形见图1 2 。 图1 2 菌种发育的标准类型 a 丙酮丁醇梭菌菌种发育3 - 6 小时的形状b 发酵6 1 2 小时的形状；c 发酵1 2 2 0 小时的丙酮丁醇梭菌；d 发酵1 8 3 0 小时丙酮丁醇梭菌形态；e 发酵终止阶段丙 酮丁醇梭菌形态。 1 2 2 丙酮丁醇代谢机理 对于丙酮丁醇发酵，其代谢途径见图1 3 。当p h 大于5 0 时，形成丙酮和 丁醇。开始发酵时，p h 在6 0 - - 7 0 ，随着发酵的进行，发酵液中有大量丁酸和 乙酸产生。这个阶段产生c 0 2 和h 2 ，发酵液p h 急剧下降，称为产酸期。当 酸性物质积累，使发酵液p h 下降到5 0 甚至4 0 左右，发酵液的还原倾向增强， 乙酸和丁酸等被还原成丙酮和丁醇，p h 适当回升，进入降酸别2 4 1 。 6 山东大学硕士学位论文 毳- 二您 二 丁 = 龃芦 攫棚k 4 u 且 l 匹 图1 3 丙酮丁醇代谢途径陋2 6 】 酶代号：a 一3 磷酸甘油醛脱氢酶b 一丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶；c - n a d h 铁氧还蛋白氧化还原酶；d n a d p h 铁氧还蛋白氧化还原酶；e _ n a d h 红素氧 还蛋白氧化还原酶；卜氢酶；g - 磷酸酰基转移酶；h 一乙酸激酶；i 硫激酶： i _ 羟基丁酰c o a 脱氢酶；l ( - 巴豆酸酶；l 丁酰c o a 脱氢酶；m 一磷酸丁酰 转移酶；卜丁酸激酶；沪乙醛脱氢酶；r 乙醇脱氢酶；( 卜一丁醛脱氢酶；卜 丁醇脱氢酶；s 一乙酰乙酰c o a ：乙酸丁酸：c o a 转移酶；t - 乙酰乙酸脱羧酶； u 一葡萄糖磷酸变位酶：v a d p 葡萄糖焦磷酸化酶；w 一淀粉糖合成酶；x 一淀 粉糖磷酸化酶。 7 山东大学硕士学位论文 1 3 丁醇作为液体燃料的优势及其在工业中的作用 二十世纪七十年代中期以来四次较大的“石油危机”，从一定程度上推动了燃 料乙醇工业在世界许多国家得以迅速发展。自巴西、美国率先于七十年代中期大 力推行燃料乙醇政策以来，加拿大、法国、西班牙、瑞典等国纷纷效仿，已形成 了一定的生产和使用规模。 1 3 1 丁醇作为液体燃料的优势 丁醇有很多显著的特点，使得它比乙醇更适合作为一种液体燃料。 1 、丁醇比乙醇有更高的热值。丁醇的热值是1 1 0 ，0 0 0 b t u ) j n 仑，乙醇的热值 是8 4 ，0 0 0b t u ) j h 仑。汽油的内能是1 1 5 ，0 0 0 b t u 加仑。 2 、丁醇的挥发能力是乙醇的1 6 ，汽油的1 1 3 5 。这使丁醇在使用时更加安 全。 3 、丁醇可以采用现有的燃料管路进行运输，而乙醇需要经由铁路、驳船和 货车运输。 4 、