（发酵工程专业论文）酵母葡聚糖的研制.pdf

爹i ， ， p 。i-_。- 髫髫： i i l lll ；i r lri rf uli l lu f y 17 9 7 4 5 0 天津科技大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成 果。除文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包括任何其他个人或集体已经发表或 撰写的成果内容。对本文研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：劲蜊 日期：妒莎年月矽日 专利权声明 本人郑重声明：所呈交的论文涉及的创造性发明的专利权及使用权完全归天津科技 大学所有。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：孬b 彬田 j 日期：莎仃谚年月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权天 津科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密 i ( 请在方框内打“寸，) ，在 年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密li ( 请在方框内打“”) 。 作者签名：裥 导师签名： 水解温度( a ) 水解时间( c ) 。硫酸浓度对试验结果影响显著，水解 温度对葡萄糖含量影响比较显著，水解时间对测定结果影响不显著。如表3 - 1 所示， 正交实验结果推定最适水解条件为b 2 a 2 c 2 ，而在正交实验中出现的最佳条件为 b 2 a 2 c 3 。按照优化条件进行验证实验，结果是葡萄糖含量为7 7 7 8 ，高于正交实验 中出现的最大值7 3 6 6 ，因此最终确定优化组合为：b 2 a 2 c 2 ，即硫酸浓度2 7 m o l l ， 水解温度为1 0 0 ，时间为3 o h 。 矗； 们 )一如瓣秘幕 3 结果与讨论 表3 l 酵母水溶性葡聚糖收率正交实验结果 t a b l e3 - 1t h eo r t h o g o n a lr e s u l to f y i e l do f s o l u b l ey e a s tg l u c a n 实验号 水解温度 硫酸浓度水解时间 葡萄糖含量 a b c ( ) 5 8 5 5 7 0 6 2 6 5 2 6 1 2 0 7 5 5 3 5 7 2 3 6 6 3 2 4 6 3 8 9 7 3 6 6 6 8 7 9 5 6 4 2 6 5 8 5 6 3 7 6 t = 5 8 3 3 2 表3 - 2 方差分析 t a b l e3 - 2t h e a n a l y s i so f v a r i a n c e 注：查表得f o 1 - - 9 0 0 ，f o 0 5 = 19 0 0f s f f o 1 ，f e f o 0 5 。 2 3 2 3 。 3 。 2 蚴 鲫 洲 姒 l 2 3 l 2 3 。 。 。 2 2 2 - 3 一 们伽 锕 2 3 4 5 6 7 8 9 h b b r 天津科技大学硕士学位论文 3 1 5 不同酸处理方法的比较 本试验分别用t f a 和h 2 s 0 4 水解酵母不溶性葡聚糖，通过对水解温度、浓度、 时间三个因素对葡聚糖测定结果影响的分析，得出了适宜的水解条件：t f a ：7 5 ， 9 5 ，1 5 h ih 2 s 0 4 - 2 7m o l l ，1 0 0 ，3 o h 。将两种酸水解的方法和文献中记载的 方法进行比较，结果见表3 3 。 表3 3 不同酸处理方法对酵母不溶性葡聚糖测定结果的影响 t a b l e3 - 3e f f e c to fd i f f e r e n ta c i dt r e a t m e n to nd e t e r m i n a t i o no f y e a s ti n s o l u b l eg l u c a n 注：1 。为t f a 水解条件：7 5 ，9 5 ( 2 ，1 5 h ；2 b h 2 s 0 4 水解条件：2 7m o l l ，1 0 0 ( 2 ， 3 o h ；3 。水解条件i 则：7 2 h 2 s 0 4 ，3 0 ，3 0h l2m o l lh 2 s 0 4 ，1 0 0 c ，4 0h 对三种酸处理方法的重现性进行了考察，方法1 、2 、3 的r s d 分别为1 7 7 、1 0 2 和2 0 4 ，可见其有较好的重现性。通过2 7 m o l lh 2 s 0 4 一步水解法和n a t h a l i e d a l l i e s 跚j 等采用的两步水解法的比较可以看出，本试验选出的方法具有操作简单，耗 时少，重现性好的优点，文献记载的方法操作比较复杂，尤其是第一步用浓硫酸进行 处理的时候，必须保证浓硫酸和样品全面充分的接触，操作比较困难。如果操作过程 中出现了结块的现象，将最终导致测定结果偏低。h 2 s 0 4 和t f a 进行比较可以发现， 硫酸水解具有重现性好，单糖损失少，成本低，操作容易等优点。t f a 水解时在操作 上有一点很难控制，即t f a 水解后如果不挥发彻底，残留的t f a 对葸酮硫酸测定葡 萄糖会有干扰。因此，经过比较可以得出，用2 7 m o l l 的h 2 s 0 4 在1 0 0 条件下水解 3 h 是最理想的酸处理方法。 3 1 6 小结 ( 1 ) 分别对t f a 和h 2 s 0 4 水解条件进行优化后，确定适用于酵母不溶性葡聚糖酸 水解时的水解条件：2 7m o l l 的h 2 s 0 4 ，1 0 0 水解3 o h 。t f a 酸水解后测得酵母不 溶性葡聚糖的含量为6 8 0 8 ，h 2 s 0 4 酸水解后测得酵母不溶性葡聚糖的含量为 7 7 7 8 。 ( 2 ) 用t f a 进行样品酸水解，步骤多，可控性较差，尤其是t f a 的残留对蒽酮 硫酸比色法有很大的干扰。用h 2 s 0 4 水解酵母不溶性葡聚糖操作简单，重现性好，弥 补了上述缺点。 3 结果与讨论 3 2 酵母葡聚糖提取工艺的优化 对碱法、高压法和高压碱法三种提取工艺提取得到的酵母葡聚糖样品进行成分分 析，三种工艺的提取率、提取酵母葡聚糖的纯度和结构作为判断提取工艺优劣的主要 指标。 3 2 1 不同提取工艺样品多糖含量 按照分析方法2 2 1 ，对碱法、高压一碱法和高压法三种提取工艺的提取物样品分 别进行多糖含量的测定，条件：h 2 s 0 4 ：2 7m o l l ，1 0 0 ，3 o h 。结果见图3 - 4 。 毋 v 棚 钿 勰 嫡 葡聚糖提取工艺 图3 - 4 三种提取工艺提取物多糖含量比较 f i g 3 - 4p o l y s a c c h a r i dc o n t e n to f t h et h r e ee x t r a c t i o n s 从图3 _ 4 不同提取物多糖含量的测定结果，我们可以看出，三种提取工艺提取的 酵母葡聚糖纯度差别明显，碱法提取工艺和高压法提取工艺提取物的多糖含量均处于 一个较低的水平，低于6 0 ；而高压碱提取工艺的提取物纯度较高，达到9 0 以上， 远远超出另外两种方法提取的样品。碱法工艺主要通过两次3 的强碱进行热提取， 这样长时间的高温碱性环境会造成酵母葡聚糖的损失，导致含量降低；高压法工艺在 高压处理后会加入碱性蛋白酶去除蛋白质，而蛋白酶的添加量和作用时间直接影响到 蛋白质的残留量，蛋白质高残留量是导致提取物的多糖含量低的可能原因之一。 3 2 2 不同提取工艺样品蛋白质含量 酵母细胞壁中蛋白质多是和多糖类以共价键方式形成多糖类一蛋白质复合物。蛋 白质随着酵母菌种类、生长条件和生长阶段不同，含量变化显著。随着纯细胞壁制备 技术的提高和细胞壁成分分级法的进展，能准确地测出细胞壁中蛋白质的含量。例如： 已了解在面包酵母细胞壁中含有6 刁的蛋白质。 提取物中蛋白质的含量是影响酵母葡聚糖纯度的主要因素。通常去除蛋白质的方 法是酶处理和碱处理，高压法提取工艺选择添加碱性蛋白酶的方法除去蛋白质，碱法 天津科技大学硕士学位论文 和高压碱法提取工艺选择用碱处理去除蛋白质。按照分析方法2 2 4 对三种工艺提取 物进行蛋白质含量测定，结果见图3 5 。 1 2 1 0 盆8 曩6 峰 蔷4 2 o 。 碱法提取高压一碱法提取高压法提取 葡聚糖提取工艺 图3 5 三种提取工艺提取物的蛋白质含量比较 f i g 3 - 5p r o t e i nc o n t e n to f t h et h r e ee x t r a c t i o n s 如图3 5 所示，碱法提取工艺的提取物蛋白质含量最低2 3 4 ，高压碱法提取工 艺的提取物蛋白质含量居中，2 5 9 ；而高压法提取工艺的提取物蛋白质含量在1 0 左右，含量最高。前两种工艺过程中都用到碱来除去酵母细胞壁中的蛋白质，和报道 中一样，碱处理效果很好；而高压法应用温和的蛋白酶来除蛋白质，由于蛋白酶作用 条件的限制导致效果不是很理想，但仍然是将来值得研究的方法。目前，从产品蛋白 质含量比较看出，碱法和高压碱法提取工艺除蛋白质效果优于高压法提取工艺。 3 2 3 不同提取工艺样品灰分含量 利用分析方法2 2 5 对三种提取工艺的提取物进行灰分含量的测定，结果见图3 - 6 。 ，一、 毋 v 删 钿 求 蒜 碱法提取高压一碱法提取高压法提取 葡聚糖提取工艺 图3 6 三种提取工艺提取物的灰分含量比较 f i g 3 - 6a s h c o n t e n to f t h et h r e ee x t r a c t i o n s 如图3 6 所示，高压碱提取工艺的提取物灰分含量最低，仅为l 乏；高压法 3 结果与讨论 提取工艺的提取物次之，含量为6 6 7 ；碱法提取工艺的样品灰分含量最高，远高于 另外两种样品。 3 2 4 不同提取工艺样品提取率 根据分析方法2 2 2 中的公式计算三种提取工艺提取物的提取率，结果见图3 - 7 。 2 0 会1 5 褥 墓1 0 5 0 碱法提取 高压一碱法提取高压法提取 葡聚糖提取工艺 图3 - 7 三种提取工艺提取物的提取率比较 f i g 3 - 7y i e l do f t h et h r e ee x t r a c t i o n s 由图3 7 可以看出，高压碱法提取工艺的提取率是1 4 2 7 ，碱法提取工艺的提 取率是1 3 6 8 ，两种工艺的提取率非常接近。而高压法提取工艺的提取率最高，达到 2 2 1 4 ，根据分析推断是由于在提取过程中，高压法采用添加碱性蛋白酶的方法除蛋 白质，提取物中蛋白质含量高，同时因操作步骤较少，导致提取物得率较高。 3 2 5 不同提取工艺样品脂类含量 通常酵母细胞壁的脂质含量较高，其含量随酵母菌种类和生长条件不同而异。这 些脂质大多和细胞壁的其他成分以共轭键形式存在于细胞壁中。脂类也是酵母 p - 0 ，3 ) - d 葡聚糖中的杂质之一。通过氯仿一甲醇冷抽提法对三种样品脂类含量进行测 定，结果见图3 8 。 碱法提取高压一碱法提取高压法提取 葡聚糖提取工艺 图3 8 三种提取工艺提取物的脂类含量比较 f i g 3 - 8l i p i dc o n t e n to f t h et h r e ee x t r a c t i o n s 3 2 8 7 6 5 4 3 2 l 幺 厄 乞 乞 乞 乞 乞 色 曩v棚缸粼蹬 天津科技大学硕士学位论文 由图3 8 中结果可看出，三种提取工艺提取物的脂类含量均小于3 。由此推测 三种提取工艺在去除产品中的杂质如脂类物质时，作用效果很接近。 3 2 6 不同提取工艺样品多糖组分的测定 三种提取工艺提取物经硫酸完全水解后，用氢氧化钡中和，过滤，将滤液浓缩至 适当浓度，水解产物与标准葡萄糖、甘露糖对照品进行纸层析( 新华一号滤纸) ，以正 丁醇：乙酸：水( 1 0 ：3 ：6 ) 为展开剂，以苯胺一邻苯二甲酸为显色剂，得到棕色斑点，各 组分迁移率见表3 - 4 ，三种提取工艺提取样品纸层析示意图见图3 - 9 。 表3 - 4 纸层析各组分的迁移率 t a b l e3 - 4m o b i l i t i e so f t h ef r a c t i o n si np cp a r e m 。羹 掌 飞 r 【i oo _ +- a百e d 、。e 图3 - 9 水解产物纸层析示意图 f i g 3 - 9s k e t c hm a po f p a p o rc h r o m a t o g r a p h y ( p c ) o f t h eh y d r o l y s a t e 从图3 - 9 中可以看出，三种提取工艺的提取物的水解产物只有一个斑点，而且r f 值与葡萄糖标准品相同，说明三种提取工艺获得的样品在单糖组成上相一致，均为葡 萄糖，不含有甘露糖。 3 2 7 不同提取工艺样品红外光谱分析结果 3 结果与讨论 分子构象是决定p ( 1 ，3 ) 一d 葡聚糖生物活性的重要因素。1 9 8 6 年，m a t s u z a k i 等在 研究葡聚糖抗肿瘤活性作用时发现i b - ( 1 ，3 ) d 葡聚糖苷的重要性。绝大多数的抗肿瘤多 糖有基本的1 3 构象瞪。p 葡聚糖位于细胞壁的最内层和原生质体膜相连接。它的主要 生理功能是维持细胞壁的机械结构，保持细胞正常的生理形态。一般认为酵母b 葡聚 糖由1 3 - ( 1 ，3 ) 一d 葡聚糖和i b - ( 1 ，6 ) 一葡聚糖组成，两者的比例为8 5 ：1 5 1 s 2 j 。大多数碱不 溶性葡聚糖是i b - ( 1 ，3 ) 键连接，同时在链间穿插3 的d ( 1 ，6 ) 葡聚糖糖苷键。 依据分析方法2 2 7 9 分别对1 3 - ( 1 ，3 ) 葡聚糖标准样品和三种提取工艺获得的提取物 样品品进行红外光谱分析，实验结果见图3 11 - 3 1 4 。 图3 11 1 3 - ( 1 ，3 ) 葡聚糖标准品的红外光谱图 f i g 3 - 11i rs p e c t r u mo f s t a n d a r di s - ( 1 ，3 ) g l u c a n ? 如图3 1 1 所示，p l ，3 葡聚糖标准品在11 6 1e r a 1 和8 9 0c m 1 处存在的显著特征吸 收带，说明该多糖糖链主要组成单糖为吡喃糖，成苷的半缩醛羟基主要为p 构型。在 波长3 4 0 7 c m 1 和2 9 2 1c m 1 处有明显的吸收，分别对应的是o h ，c h 的伸缩振动吸 收带。在1 1 6 1 - - 1 0 1 0c m 1 范围内存在低波数1 0 4 1c m 1 的强吸收，为葡萄糖的特征吸 收。在标准1 3 - ( 1 ，3 ) 葡聚糖的红外光谱图中还可以看到在1 4 5 5 - 1 3 7 6c m 1 的多重峰为 c h 的变角振动。 天津科技大学硕士学位论文 图3 - 1 2 高压提取工艺提取样品的红外光谱图 f i g 3 - 1 2i rs p e c t r u mo f t h es a m p l eo f h i g h p r e s s u r ee x t r a c t i o n 在图3 1 2 中，3 4 2 0e m 1 和11 5 8 - - 一1 0 4 4e m 1 分别为o h 和c o 的伸缩振动，1 0 4 4 c m 1 的强吸收也说明了高压法提取的多糖主要组成单糖为葡萄糖。2 9 2 1c m 1 的强吸收 峰以及1 4 5 8 - - - , 1 3 7 5c m 1 的多重峰分别为c h 的伸缩振动和变角振动。在糖类的环振 动吸收区9 0 0 - - 7 0 0e m 1 ，我们可以看到8 9 0e m 1 有个振动吸收，说明高压法提取的葡 聚糖是由1 5 - ( 1 ，3 ) 糖苷键所连接的。谱图还在1 5 4 7e r a 1 处出现了一个明显的吸收峰为 芳香环的骨架振动，说明有氨基化合物结合，这在其他两种提取工艺制得的葡聚糖中 都没有出现，说明高压法提取的葡聚糖中有没除尽的蛋白质。 图3 1 3 碱法提取工艺提取样品的红外光谱图 f i g 3 1 3i rs p e c t r u mo f t h es a m p l eo f a l k a l i n ee x t r a c t i o n 3 结果与讨论 在图3 1 3 碱法提取工艺提取物的红外光谱图中，3 3 8 6c m 1 和1 1 5 8 - - 1 0 4 1c m - 1 分 别为o - h 和c o 的伸缩振动，1 0 4 1c r n 1 的强吸收也说明了提取多糖主要组成单糖为 葡萄糖。2 9 2 1c m 1 的尖峰以及1 4 5 8 - 1 3 7 6c m 1 的不太尖的峰分别为c h 的伸缩振动 和变角振动。在糖类的环振动吸收区9 0 0 - - - 7 0 0c m 1 ，我们可以看到8 9 0c m - i 有个振动 图3 - 1 4 高压碱法提取工艺提取样品的红外光谱图 f 谵3 - 1 4i rs p e c t r u mo f t h es a m p l eo f h i g h - p r e s s u r e - a l k a l i n ee x t r a c t i o n 图3 1 4 中，3 3 8 6c m 1 和l1 5 7 - - 1 0 4 3c m 1 两处为糖类的o h 和c o 的伸缩振动， 1 0 4 3c m 1 的强吸收，为葡萄糖的特征吸收。2 9 2 1c m 1 的尖峰和1 4 1 5 - - 1 3 7 2c m 1 的多 重峰分别为c h 的伸缩振动和变角振动。谱图中在1 2 5 0c m 1 处的吸收峰代表c o c 的伸缩振动，这和标准p ( 1 ，3 ) - 葡聚糖的谱图是完全吻合的。在糖类的环振动吸收区 9 3 0 - - 7 0 0c m 1 ，高压碱法提取的多糖在8 9 0c m 1 处的吸收峰是由p 吡喃糖的c i h 变 角振动产生的，说明其糖链中存在b 吡喃环。 3 2 8 小结 通过对三种提取工艺提取物的成分分析比较，可以看出将高压法与碱法结合的高 压一碱法提取工艺，有利于提高酵母葡聚糖得率和多糖纯度，而且可以降低提取物中 的灰分、蛋白质、脂类等杂质含量。因此，高压一碱法是比较理想的酵母葡聚糖提取 方法。 3 3 高压一碱法提取工艺条件的优化 3 3 1 单因素实验 3 3 1 1 碱处理浓度的影响 提取样品中蛋白质的含量是影响酵母葡聚糖含量的主要因素。通常去除蛋白质的 方法是酶处理和碱处理，相比之下碱处理的效果要优于蛋白酶处理。分别用3 、5 、 天津科技大学硕士学位论文 6 、7 ( w v ) 的n a o h 溶液进行提取，提取样品的蛋白质和多糖含量见图3 1 5 。 3567 碱液的浓度( ) 9 2 9 0 8 8 集 8 6 啊 加 8 4 絮 8 2 8 0 图3 1 5 碱处理浓度对多糖含量的影响 f i g 3 - 1 5e f f e c to f t h ea l k a l ic o n c e n t r a t i o no nt h ep o l y s a c c h a r i d ec o n t e n t 图3 1 5 结果显示随着碱浓度的增加蛋白质含量呈下降趋势，而多糖含量是先升后 降。结果还可以看出随着n a o h 浓度的升高，蛋白质去除率并非呈直线上升，碱处理 浓度在5 0 o - - 6 时蛋白质含量减少最多而多糖含量逐步增加，从增加蛋白质去除率， 提高多糖含量等方面综合考虑选择6 n a o h 作为碱处理浓度。 3 3 1 2 碱处理压力的影响 在酵母葡聚糖的制备过程中，蛋白质含量的高低是影响产品纯度的重要因素之一， 在提高纯度的情况下，也要求高收率。在一定碱液浓度下，选择o 0 7 5 m p a 、0 1 m p a 、 0 1 2 5 m p a 三种高压条件提取酵母葡聚糖，样品的蛋白质和多糖含量见图3 1 6 。 9 1 9 0 8 9 集 8 8 棚 加 8 7 寨 8 6 8 5 0 0 7 50 10 1 2 5 压力( i w a a ) 图3 1 6 碱处理压力对多糖含量的影响 f i g 3 - 1 6e f f e c to f t h ea l k a l it r e a t e dp r e s s u r eo nt h ep o l y s a c c h a r i d ec o n t e n t 如图3 1 6 所示，随着碱处理压力的增加蛋白质含量呈直线下降趋势，压力继续升 高蛋白质去除率上升；多糖含量在0 1 m p a 压力以下是伴随压力升高而增加的，压力 高于0 1 m p a 以后引起多糖损失，因此多糖含量呈下降趋势。 与磷酸甘露聚糖结合形成细胞壁表层的蛋白质，用碱液较易去除，与糖共价结合 5 3 5 2 与 1 5 o 3 2 1 0 零v缸峰皿嘲 4 3 2 j 2 国 岛 2 2 2 2 1 1 零v棚舡峰皿嘲 3 结果与讨论 的蛋白质，在较低温度的碱液中不能将它有效去除，只有在高压高温下，才能将其去 除。 3 3 1 3 碱处理时间的影响 将酵母细胞壁用6 ( w v ) 的n a o h 溶液，在o 1 m p a 压力下，分别作用2 0 m i n 、 3 0 m i n 、4 0 r a i n 、5 0 m i n ，观察碱处理时间对蛋白质去除率和提取物多糖含量的影响， 实验结果见图3 1 7 。 水 v 钿 蟋 皿 嘲 9 3 9 1 寥 8 9 棚 钿 爨 8 7 嫡 2 08 0 4 0 5 0 时间( m i n ) 图3 - 1 7 碱处理时间对多糖含量的影响 f i g 3 - 1 7e f f e c to f t h ea l k a l it r e a t e dt i m eo nt h ep o l y s a c c h a r i d ec o n t e n t 从图3 1 7 中可以看出碱液处理时间对蛋白质含量的影响不显著，随着碱液处理时 间的延长蛋白质含量呈下降趋势，但是作用时间为2 0 m i n 和5 0 m i n 时，蛋白质含量仅 仅差了0 4 ；从图中还可以看出，多糖含量在3 0 r a i n 达到最大值9 0 7 6 ，碱处理时 间继续延长多糖含量开始降低。以上结果说明在高压高温条件下，碱处理时间对多糖 有一定影响，时间长多糖损失严重，导致多糖含量降低。 3 3 1 4 碱液添加量的影响 选择5 ：1 、1 0 ：1 、1 5 ：1 、2 0 ：1 ( v w ) 的比例添加6 ( w v ) 的n a o h 溶液，在0 1 m p a 压力条件下提取酵母葡聚糖，产品的蛋白质和多糖含量见图3 1 8 。 集 2 啊 钿 蝎 皿1 5 嘲 9 0 未 一 钿 8 5 絮 8 0 5 ：l 1 0 ：l1 5 ：l2 0 ：l 碱液添加量( v w ) 图3 1 8 碱液添加量对和多糖含量的影响 f i g 3 - 18e f f e c to f t h ea l k a l ia d d i t i o nv o l u m eo nt h ep o l y s a c c h a r i d ec o n t e n t 明 2 5 1 5 0 天津科技大学硕士学位论文 图3 1 8 结果显示碱液添加量的影响并不十分显著，随着碱液添加量的增加，蛋白 质含量和多糖含量均呈下降的趋势，但各水平之间差异很小，蛋白质含量的减少低于 o 5 ，多糖含量的变化范围在1 5 之内。从减少碱液用量、降低环境污染的角度考 虑选择5 ：1 ( v w ) 的比例添加碱液。 3 3 2 正交实验 在以上单因素试验的基础上，选取碱处理浓度、碱处理时间和碱处理压力三个因 素设计了l k 3 4 ) 进行正交实验，以蛋白质含量和多糖含量为指标，具体结果见表3 5 和表3 - 6 。 表3 - 5 正交实验结果分析 t a b l e3 5t h er e s u l to fo r t h o g o n a la r r a y 实验号 碱处理浓度碱处理时间 碱处理压力空白蛋向质含量 abcd ( ) 多糖含量 ( ) 3 4 2 2 5 8 2 0 7 2 2 0 2 0 7 1 8 9 1 6 0 2 0 2 1 9 3 7 8 6 9 8 4 7 0 8 0 4 3 9 1 6 2 9 0 5 8 8 1 7 6 7 4 4 0 7 8 6 i 8 0 3 9 t p 矿1 9 7 8 t 一7 4 i 1 8 k 2 8 7 9 9 8 4 6 38 5 5 7 。 2 3 i 3 。 3 。 2 撕 拟 蚴 。 2 3 。 2 ，3 。 2 3 州 勉 ! 墨 哗 蝴 。 | 。 2 2 矿 3 3 3 抛 掷 懈 嘣 蚴 。 2 3 4 5 6 7 8 9 h 3 结果与讨论 表3 - 6 正交实验方差分析 t a b l e 3 - 6v a r i a n c ea n a l y s i so f t h eo r t h o g o n a lt e s t 注：查表得f o 1 - - 9 o o , f o o s f f i i 9 0 0 正交试验结果见表3 5 。通过r 值计算可以看出，在蛋白质去除上( 蛋白质含量 越低越好) ，三因素影响蛋白质含量的主次关系依次是碱处理浓度( a ) 碱处理压力( c ) 碱处理时间( b ) ；在多糖含量上，同样是碱处理浓度影响最大，其次是碱处理压力， 碱处理时间影响最小。为了进一步判断试验误差与试验条件是否影响试验结果，将正 交试验数据进行方差分析，找出这些因素中的主效因子。如分析结果表3 - 6 所示，碱 处理浓度对试验结果影响非常显著，碱处理压力对蛋白质含量影响不显著，而对多糖 含量影响一般显著，碱处理时间对结果影响不显著。 从蛋白质去除的角度考虑，正交实验结果推定a 3 c 3 8 3 为最佳提取条件，即碱处 理浓度9 ，碱处理压力o 1 2 5 m p a ，碱处理时间4 0 m i n ；从多糖含量的角度考虑，正 交实验结果推定a 2 c 2 8 2 为最佳提取条件，即碱处理浓度6 ，碱处理压力0 1 m p a ， 碱处理时间3 0 m i n ，推定结果与表3 3 的实测结果比较只有碱处理时间不一致。两种 最佳提取条件比较可以发现，碱处理浓度和压力升高，产品蛋白质的含量显著下降， 但是同时多糖含量明显降低，多糖损失严重。此外，碱处理时间对产品中蛋白质含量 和多糖含量影响都不显著。 综合上述分析，考虑到降低污染、省时和提高多糖收率的原则，本研究确定高压 一碱法提取酵母葡聚糖的最佳组合为：a 2 c 2 8 2 ，即碱处理浓度6 ，压力0 1 m p a ，时 间3 0 r a i n 。在最佳条件下进行验证试验，结果是多糖收率2 3 3 0 ，样品中酵母葡聚糖 含量为9 1 8 5 ，蛋白质含量为2 5 8 ，多糖含量结果优于正交试验中的各组数据。 4 0 天津科技大学硕士学位论文 3 3 3 干燥方式的比较 干燥方法影响了葡聚糖微粒的微观结构，从而导致不同的物理特性( 分子大小和 形状，水润能力，分子内氢键聚合度) 流动性以及粘稠能力【8 3 1 。各种不同的干燥方法 对提取得到的酵母葡聚糖样品颗粒的物理状态有重要影响，同时影响它们的免疫调节 活性。将高压一碱法提取工艺所得的提取物，在水洗离心后分别用丙酮干燥法、无水 乙醇干燥法和真空冷冻干燥法进行干燥，干燥提取物的各项指标见表3 7 。 表3 7 不同干燥方式提取物性能指标比较 t a b l e3 - 7c o m p a r i s o no f t h ee x t r a c t i o no f t h ed i f f e r e n td r y i n gm e t h o d s 由表3 7 可见，三种干燥方式中差异最明显的是水分含量，然后为得率、色泽和 形状，其它两项指标差异并不明显。 水分含量相差较大是由于三种干燥方式不同的干燥机制所造成，无水乙醇干燥法 和丙酮干燥法利用的是乙醇和丙酮具有极强的亲水性，而酵母葡聚糖的亲水性很差， 正是它们之间对于水亲和力的悬殊差异而导致水分( 包括自由水和结合水) 的转移，因 而实现产品的干燥；而真空冷冻干燥法利用的是冰晶升华原理，在真空状态下将冻结 了的物料中的水分不经冰的融化直接从固态冰升华为水蒸汽，从而达到干燥的目的， 但这一方法除去的多是样品中所含的自由水而结合水较少，因此，真空冷冻干燥法所 得的提取物水分含量比丙酮和乙醇干燥法的提取物水分含量高。两种有机溶剂之间比 较可以看出，丙酮干燥法的提取物水分含量低于无水乙醇干燥法的提取物水分含量， 这是由于丙酮和无水乙醇相比，丙酮的亲水性更强，它可以是结合水也能够更充分的 转移，实现产品干燥。 同时也正是这种干燥机制上的不同形成了产品最终形状的差异，在前两种方法 中，酵母葡聚糖处于一强极性溶液环境中，结合水的转移迫使酵母葡聚糖之间疏水作 用力的增强，最后形成紧密的细小颗粒，样品成粉末状；而后一种方法由于水分的结 晶、升华导致样品呈蓬松的片状结构。 无水乙醇干燥法和丙酮干燥法提取物得率比冷冻干燥法低的原因由于操作步骤 多，在操作转移过程造成了损失。 3 3 4 酵母葡聚糖性质和结构分析 3 3 4 1 理化性质分析 ( 1 ) 溶解性分析 3 结果与讨论 成品不溶于水、无水乙醇、无水乙醚，也不溶于盐酸、硫酸和碱液中，但可溶于二 甲基亚砜中。 ( 2 ) 颜色反应 与葸酮- 硫酸反应呈阳性，苯酚硫酸反应呈阳性，表明产品为多糖类化合物：与 碘反应呈阴性，表明产品中不含糖元。 3 3 4 2 主要成分分析 按照前述优化后的提取工艺，对提取物的蛋白质、多糖、脂类、灰分含量和提取 率进行了测定，结果见表3 8 。 表3 8 产品主要成分含量 t a b l e3 - 8m a j o rc o m p o n e n t sc o n t e n to f t h ep r o d u c t 由表3 8 中的结果可以看出，按照优化后的提取工艺提取的酵母葡聚糖纯度接近 9 2 。其中蛋白质和脂类两种主要杂质的含量都低于高压法以及碱法提取工艺。 3 3 4 3 结构分析 ( 1 ) 多糖组分分析 酵母葡聚糖经硫酸水解后，水解产物与标准葡萄糖、甘露糖对照进行纸层析( 新 华一号滤纸) ，以苯胺一邻苯二甲酸为显色剂，得到棕色斑点，各组分迁移率见表3 - 9 。 表3 _ 9 纸层析各组分的迁移率 t a b l e3 - 9m o b i l i t i e so f t h ef r a c t i o n si np cp a t t e m 天津科技大学硕士学位论文 abc 图3 - 1 8 酵母葡聚糖水解物纸层析示意图 f i g 3 1 8p a p e rc h r o m a t o g r a p h y ( p c ) p a t t e r no f t h ey e a s tg l u c a nh y d r o l y s a t e 酵母葡聚糖的水解产物层析示意图( 见图3 1 8 ) 反映出，甘露糖标准品斑点的 r f 值为o 4 3 ，水解产物和葡萄糖标准品斑点的r f 值为o 3 8 。这就表明高压碱法提取 工艺得到的提取物是一种由葡萄糖构成的均一多糖，即为葡聚糖。 ( 2 ) 红外光谱分析 。 酵母葡聚糖产品与p ( 1 ，3 ) 葡聚糖标准品的红外光谱比较如图3 1 9 。 图3 - 1 9 酵母葡聚糖产品和p - ( 1 ，3 ) - d 葡聚糖标准品的红外光谱图 f i g 3 - 1 9i rs p e c t r u mo f t h es t a n d a r d1 3 - ( 1 ，3 ) g l u c a na n dy e a s tg l u c a np r o d u c t 注：1 表示样品：2 表示标准品 从图3 1 9 中可看出产品酵母葡聚糖在8 9 0 c m 1 处有明显的p 糖苷键吸收峰，而在 810 c m 1 和8 7 0 c m 1 处均无吸收峰，表明无甘露糖苷的存在，在2 9 2 2 c m 1 和13 7 0 c m 1 3 结果与讨论 处的特征吸收峰表明多糖为p ( 1 ，3 ) 糖苷键所连接。与p ( 1 ，3 ) - d 葡聚糖标准品红外光 谱图作一比较，结合提取产品的单糖组分分析结果可以证明采用高压碱法提取的产品 是p 一( 1 ，3 ) - d 葡聚糖，而无其它杂多糖的存在。 3 3 5 小结： ( 1 ) 在单因素实验的基础上，选择碱处理温度、碱处理压力、碱处理时间三个 因素，用l 9 ( 3 4 ) 设计正交实验，优化出提取酵母葡聚糖的最佳条件：碱处理浓度6 ， 压力0 1 m p a ，时间3 0 r a i n 。 ( 2 ) 干燥方法对酵母葡聚糖微粒的色泽和形态有显著的影响。在丙酮干燥中， 酵母葡聚糖的状态是乳白偏黄的细微粉末。通过无水乙醇干燥和冷冻干燥的方式除去 水分会分别形成坚硬的颗粒和薄板状的多层多孔结构，同时水分含量都偏高。因此， 选择丙酮干燥法是脱水较彻底的干燥方式。 。 ( 3 ) 采用优化后的条件提取酵母葡聚糖，并对提取产品进行性质分析，结果为 提取物多糖含量达到9 1 8 5 ，蛋白质、脂类和灰分等杂质含量分别为2 5 8 、1 6 0 和2 7 9 ，酵母葡聚糖的提取率为1 5 2 5 ，经过纸层析和红外光谱分析得出，提取物 是由d 葡萄糖苷键连接的单一多糖，即葡聚糖。 3 4 酵母水溶性葡聚糖的制备 由于高压碱法提取工艺制备的酵母葡聚糖分子量比较高，在水中不溶，使其在应 用中具有一定局限性。为了扩大产品的适用范围，是酵母葡聚糖有效发挥抗肿瘤、抗 炎、抗辐射、提高机体免疫力等生物活性，需要提高其在水中的溶解度。提高1 3 - ( 1 ，3 ) d 葡聚糖的水溶性可以从下面几个方面来考虑：( 1 ) 解聚降低分子量，解聚方法有酸 解、碱水解、酶消化、超声波和热变性，得到低分子量的片段。( 2 ) 化学改性，常 用的化学改性方法有磺化、磷酸化和羧甲基化【6 9 】。 3 4 1 酵母水溶性葡聚糖制备条件优化 选取水解温度、水解时间、甲酸添加量和甲酸浓度四个因素设计了l 9 ( 3 4 ) 进行正 交实验，以酵母水溶性葡聚糖得率为指标，具体结果见表3 1 0 和3 1 1 。 表3 1 0 酵母水溶性葡聚糖收率正交实验结果 t a b l e3 - 1 0t h eo r t h o g o n a lr e s u l to f y i e l do f s o l u b l ey e a s tg l u c a n 天津科技大学硕士学位论文 表3 1 l 方差分析 t a b l e3 11t h ea n a l y s i so fv a r i a n c e 注：查表得f o t = 9 0 0 ，f o o s = 19 0 0 ，p f o 0 5 ，f o 1 从表3 1 0 和表3 1 l 可以看出，在四个影响因素中，影响酵母水溶性葡聚糖得率 的主次关系依次是甲酸浓度( d ) 水解时间( b ) 水解温度( a ) 和甲酸添加量( c ) 。甲酸 浓度对试验结果影响显著，水解时间、水解温度和甲酸用量对酵母水溶性葡聚糖得率 影响不显著。如表3 1 0 所示，正交实验结果推定最适水解条件为d 3 8 3 a z c l ，而在正 3 结果与讨论 交实验中出现的最佳条件为d 2 8 3 a 2 c l ，只有甲酸的浓度有区别，其结果数据( 酵母 水溶性葡聚糖得率为8 1 6 3 ) 高于其它各组。通过r 值计算可以看出，甲酸浓度是 酵母水溶性葡聚糖制各过程中最重要的影响因素，因此最终确定优化组合为： d 3 8 3 a 2 c i ，即甲酸浓度9 0 ，时间为1 5 h ，温度为8 0 ，甲酸添加量为1 ：1 0 ( w v ) 。 在此优化条件下进行验证实验，结果是酵母水溶性葡聚糖得率为8 5 2 5 。 3 4 2 酵母水溶性葡聚糖的性质和结构分析 3 4 2 1 溶解性 实验结果表明，采用甲酸水解处理解决了酵母葡聚糖的水溶性问题，成品溶于水、 盐酸、硫酸和碱液中，不溶于无水乙醇、无水乙醚等有机试剂。 3 4 2 2 红外光谱分析 将甲酸水解得到的酵母水溶性葡聚糖进行红外光谱分析，其结果和甲酸水解前酵 母葡聚糖的比较见图3 2 0 。 如加3 5 0 1 13 叩d2 5 0 02 叨1 卯d1 叩0锄 w a v e n u 咄e rc 叶1 图3 2 0 甲酸水解前后酵母葡聚糖的红外光谱图 f i g 3 - 2 0i rs p e c t r u mo f t h ey e a s tg l u c a nb e f o r ea n da f t e rm e t h y la c i d h y d r o l y s i s 注：1 水解前：2 水解后 如图3 - 2 0 所示，经甲酸水解制备的酵母水溶性葡聚糖在在8 9 0 c m 1 处有明显的争 糖苷键吸收峰，而在8 1 0 e r a 1 和8 7 0 c m 1 处均无吸收峰，在2 9 2 3 c m 1 和1 3 7 0 c m 1 处的 特征吸收峰表明多糖为p - ( 1 ，3 ) - 糖苷键所连接，这与水解前的酵母葡聚糖红外光谱图完 全一致。 3 5 酵母水溶性葡聚糖的抑菌活性实验 p - 0 ，3 ) d 葡聚糖普遍存在于多种细菌、真菌、植物和酵母细胞壁中，迄今为止， 它已经以多种产品形式得到了研究和应用。特别是由酵母细胞壁获得的p - ( 1 ，3 ) - d 葡聚 糖已经得到了研究和为人们所熟知。近年来发现真菌细胞壁中i b - ( 1 ，3 ) d 葡聚糖作为免 天津科技大学硕士学位论文 疫佐剂、抗癌药等使用时，对机体免疫系统表现出非特异性免疫调节作用。酵母葡聚 糖能提高小鼠对细菌、真菌、病毒和寄生虫的抵抗能力。 b ( 1 ，3 ) d 葡聚糖酵母细胞壁的主要组分，通过病毒刺激受感染宿主的免疫系统 和加强受感染宿主的预防机能。据报道，在炎症期间由巨噬细胞和单核细胞分泌的 n 晒吨以及由此诱导的n o ( 可诱导的氧化氮) 可以有效地预防包括禽流感病毒的r n a 病毒f 8 4 j 。 然而，在上面引用的文献中，都没有报道或者公开由酵母细胞壁提取的特定水溶 性葡聚糖的直接抗菌活性。本实验对酵母水溶性葡聚糖进行直接的抗菌活性测定，为 其代替抗菌素或作为抗菌增效剂应用于食品、药品等工业提供理论依据。 3 5 1 酵母水溶性葡聚糖抑菌效果测定 按照实验方法2 3 6 5 分别对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鸡沙门氏菌、枯草芽孢 杆菌、黑曲霉和啤酒酵母进行抑菌效果的测定，抑菌结果见表3 1 2 。 表3 1 2 酵母水溶性葡聚糖的抑菌效果。 t a b l e3 1 2a n t i m i c r o b i a le f f e c to f y e a s ts o l u b l eg l u c a n 注：“一”无抑菌圈；“+ ”抑两圈直径为1 0 - - 1 5 r a m s “+ + ”抑菌圈直径1 5 - 2 0 n u n s “卅”抑菌圈直径2 0 - - 2 5 n n n s 。抖什”抑菌圈直径2 5 r a m 以上 从表3 1 2 可以看出，由微粒型酵母 3 - ( 1 ，3 ) d 葡聚糖经甲酸水解后制备的低分子 量酵母水溶性葡聚糖溶液对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的效果较好( 见图3 - 2 1 a 和图3 - 2 1 b ) ，抑菌直径达到2 0 r a m 以上，对鸡沙门氏菌的抑菌效果好( 见图3 - 2 l c ) ，抑 菌直径达到15 r a m ，对大肠杆菌具有抑菌效果( 见图3 2 1 d ) ，抑菌直径为1l m m ，对啤 酒酵母和黑曲霉无抑菌效果( 见图3 - 2 1 e 和图3 - 2 1 0 。结果表明酵母水溶性葡聚糖对细 菌有很明显的抑制作用，对酵母菌和霉菌无抑制作用。对细菌的抑菌效果显示，酵母 水溶性葡聚糖对革兰氏阳性菌的抑制作用明显强于革兰氏阴性菌。 ，一 岱 ，。，l o ： ：济； e 1 j y 书i n 】i i i 】r 疆二 历w 及弭：i 同f ；，：研用冒刀霸胃 、 i i i ，= = = ， 每l 凄 谬 _ _ _ ， _ o 7 7 擒01 | 堙i 甓j 留哥 藏卷强譬 ，_ _ _ ，4 - ”t ? 爹屯? 0 7 4 “” i j j 亚：重1 ：1 e ：；组，l 童m ：出： j ，； t l 1 彳 露懑， 黪 影 黪鬟 一；一 j够 黼 糊 天津科技大学硕士学位论文 3 5 2 最低抑菌浓度( m i c ) 的测定 根据酵母水溶性葡聚糖抑菌效果实验的结果，选择大肠杆菌等抑菌效果比较明显 的四种细菌作为供试菌种