（发酵工程专业论文）镇江香醋发酵过程中微生物分离及其产酸特性.pdf

摘要 摘要 镇江香醋是我国传统四大名醋之一，采取独特的固态分层发酵工艺，以套醪接种的 方式进行接种，这一特点使得每一批醋酸发酵过程中的微生物区系相对稳定。 本文采用传统的微生物分离计数方法考察镇江香醋醋酸发酵过程中产酸菌和真菌 数量的动态变化情况。结果显示产酸菌数量在7 d 时最高，真菌数量在发酵开始时最高， 此后随着发酵的进行产酸菌、真菌数量均显示不断减少地趋势。本研究同时还对分离的 产酸菌和酵母菌进行测序鉴定。所测序列提交n c b i 再经b l a s t 比对确定共分离出1 种酵母菌c a n d i d ar u g o s a 和5 种产酸菌：s t a p h ) l o c o c c u ss p 、b a c i l l l l s ，“，括、p a e n i b a c i l l u s s p 、l a c t o b a c i l l u sc a s e i 和a c e t o b a c t e rp a s t e u r i a n u s 。此5 种产酸菌中乳酸菌、醋酸菌、 芽孢杆菌均属于醋醅中可以检出的常见菌群，但作为产酸的芽孢杆菌，p a e n i b a c i l l u ss p 和b a c i l l u s ，w 括还是首次从醋醅中检出。有研究显示芽孢杆菌与醋的风味、醋的返浑和 沉淀现象有关。另外对于葡萄球菌，尽管利用分子生物学方法( p c r d g g e ) 已确定其在 镇江香醋醋醅中的存在，但这还是首次从醋醅中获得葡萄球菌纯培养物。有文献报道某 些种类的葡萄球菌在香肠、火腿等发酵食品生产过程中可产生独特的风味物质，对于其 在食醋酿造过程中的具体作用还不清楚，需要作进一步探讨。 对己鉴定的5 种产酸菌分别进行液态发酵，然后利用h p l c 分别测定发酵液中有机 酸组成情况。结果显示这5 种产酸菌均能生成乳酸，而在镇江香醋含有的多种有机酸成 份中，醋酸含量最高，乳酸其次，因此这些产酸菌的共同作用可能是成品醋中乳酸含量 较高的主要原因之一。另外从5 种产酸菌液态发酵产物中共检出7 种有机酸，它们分别 是乳酸、乙酸、富马酸、琥珀酸、丙酮酸、酒石酸和草酸。且每种产酸菌均能生成2 种 以上不同的有机酸。因此推测在实际酿醋过程中，这5 种产酸菌也将起着重要作用，可 以产生多种有机酸，从而不仅为醋液提供一个良好的缓冲体系，降低了香醋的刺激性， 同时也使醋液具有酸而不涩、酸中有甜的柔和风味，赋予镇江香醋独特的口感。另外初 步研究了b a c i l l u s ，“，括实验室规模下其固态发酵产酸性能，发现其结果与液态发酵时不 同。 关键词：镇江香醋，产酸菌，鉴定，1 6 sr d n a ，1 8 sr d n a ，高效液相色谱，有机酸 a b s t r a c t a b s t r a c t z h e n j i a n ga r o m a t i cv i n e g a ri so n eo ft h ef o u rc h i n e s ef a m o u sv i n e g a r s t h ev i n e g a r i n d u s t r yb e l o n g st ot r a d i t i o n a lf e r m e n t a t i o nt e c h n i q u e s t h ea c e t i ca c i df e r m e n t a t i o no f z h e n j i a n gv i n e g a rl a s t e da b o u tt w e n t yd a y s ，a n dt h e7 t h d a y s c u l t u r e sw e r e u s e df o r i n o c u l a t i o n s ot h em i c r o b i a ls t r u c t i l r ea n d q u a l i t y o fe a c hf e r m e n t a t i o nc i r c l ew e r e c o m p a r a t i v e l ys t a b l e t h ed y n a m i cc h a n g e so fa c i d - p r o d u c i n gm i c r o b e sa n df u n g iw e r es t u d i e dh e r ed u r i n gt h e a c e t i c a c i df e r m e n t a t i o np r o c e s s t h er e s u l t sr e v e a l e dt h a ta c i d p r o d u c i n gm i c r o b e s ，a t 7 t h d a y ss o l i dc u l t u r e so fz h e n j i a n gv i n e g a r ，m o u n t e dt ot h e i rs u m m i tp o p u l a t i o n sw h i l e d e s c e n d e da f t e rt h a t a st of u n g i ，t h e yd e c r e a s e di nt h ew h o l ec o u e s eo fa c e t i c a c i d f e r m e n t a t i o n a c i d p r o d u c i n gm i c r o b e sa n df u n g ii s o l a t e df r o mt h es o l i dc u l t u r e so fz h e n g j i a n gv i n e g a r w e r ei d e n t i f i e db ym o l e c u l a rt e c h n i q u e s f i r s tt h e16 sr d n ao r18 sr d n aw e r ea m p l i f i e d ， t h e nt h ep e rp r o d u c t sw e r ec l u s t e r e di n t od i f f e r e n to t u sa c c o r d i n gt ot h ea r d r a t y p e s w i t hr e s t r i c t i o ne n z y m e sh i n fia n dc s p 6i ，a n dt h e ne v e r yo t uw a ss e q u e n c e d ，s u b j e c t e dt o n c b ia n db l a s t e dt od e t e r m i n et h e i rs p e c i f i cg e n e r ao rs p e c i e s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tf i v e s o r t so fa c i d - p r o d u c i n gm i c r o b e sw e r ei d e n t i f i e d ，w h i c hw e r es | n p h y l o c o c c u ss p ，b a c i l l u s r u r i s ，a c e t o b a c t e rp a s t e u r i a n u s ，l a c t o b a c i l l u sc a s e ia n dp a e n i b a c i l l u ss p ，r e s p e c t i v e l y b u t o n l yo n ek i n do fy e a s t ，t h a ti s c a n d i d ar u g o s a ，w a sf o u n dh e r e a m o n gt h e s ef i v e a c i d - p r o d u c i n gm i c r o b e ss t a p h y l o c o c c u ss p w a si s o l a t e df r o ms o l i dc u l t u r e so fv i n e g a rf o r t h ef i r s tt i m e ，a n db a c i l l u sr u r i s ，p a e n i b a c i l l u ss p ，a sa c i d - p r o d u c i n gb a c i l l u s ，w e r ea l s of i r s t i s o l a t e di ns o l i dc u l t u r e so fv i n e g a r t h e i rp e r f o r m a n c e si nt h ev i n e g a r - b r e w i n gw e r en o tw e l l i n v e s t i g a t e da n ds h o u l db et a k e ni n t of u r t h e rs t u d i e s a f t e rt h a tt h ef i v ei d e n t i f i e da c i d p r o d u c i n gm i c r o b e sw e r ec u l t i v a t e di ns h a k i n gf l a s k s ，a n d t h eo r g a n i ca c i d sc o m p o s i t i o n ( o x a l i ca c i d ，t a r t a r i ca c i d ，p y r u v i ca c i d ，m a l i ca c i d ，o x a g l u t a r i c a c i d ，l a c t i ca c i d ，a c e t i ca c i d ，c i t r i ca c i d ，f u m a r i ca c i da n ds u c c i n i ca c i d ) w e r ee x t r a c t e da n d t e s t e db yh p l c ，i nt h ep u r p o s eo fi n v e s t i g a t i n gt h e i rp e r f o r m a n c e si nt h eb r e w i n go f z h e n j i a n gv i n e g a r t h er e s u l t sr e v e a l e dt h a ta l lo ft h e mc a np r o d u c el a c t i ca c i dw h i c hw a st h e g r e a t e s tu n v o l a t i l ec o m p o n e n ti nz h e n j i a n gv i n e g a r ，s om o s tp r o b a b l yt h a ta l lt h e s ed i f f e r e n t a c i d - p r o d u c i n gm i c r o b e sw e r eo n eo ft h er e a lr e a s o n sy i e l d i n gh i g hl a c t i c - a c i dq u a n t i t i e si n z h e n j i a n gv i n e g a r a d d i t i o n a l l ys e v e nk i n d o fo r g a n i ca c i d sw e r ea l s od e t e c t e di nt h i s e x p e r i m e n t s ow ec a l lc o m et ot h ec o n c l u s i o nt h a tt h ea f f l u e n to r g a n i ca c i dc o m p o s i t i o n p r o d u c e db yt h e s ed i f f e r e n ta c i d - p r o d u c i n gm i c r o b e sw i l lg r e a t l yi m p r o v et h ef l a v o ro f z h e n j i a n ga r o m a t i cv i n e g a r a n dw ea l s os t u d i e dt h eo r g a n i ca c i dp r o d u c e db ys o l i dc u l t u r e s o fb a c i l l u sr u r i s ，w h i c hw a s q u i t ed i f f e r e n tf r o mt h a to fi t sl i q u i df e r m e n t a t i o nb r o t h k e y w o r d s ：z h e n j i a n ga r o m a t i cv i n e g a r , a c i d - p r o d u c i n gm i c r o b e s ，16 sr d n a ，18 sr d n a ， i d e n t i f i c a t i o n ，h p l c ，o r g a n i ca c i d 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是誉人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签各姓挈，_ 导师撇： 日 期： 第一章绪论 第一章绪论 食醋起源于中国，是我国劳动人民在长期生产实践中创造出来的一种酸性调味品， 它的发明、发展和传播是对人类饮食文化的一大贡献。古谚有“开门七件事，柴米油盐 酱醋茶”，可见其在人们生活中的重要地位。 1 1 醋的生产状况 1 1 1 欧美国家 西方主要以果醋和纯种醋酸菌液态发酵生产食醋为主。前者以意大利、法国为主的 欧洲传统葡萄酒生产区，其食醋绝大部分是果醋。据1 9 9 7 年的资料，当年欧洲年产食 醋四亿5 千万升。其中第一大生产国是意大利，年产5 千四百万升，其次西班牙和法国 的产量也很大。欧洲食醋中以意大利摩德纳地区的芳香( b a l s a m i c o ) 醋最著名。芳香醋发 酵后还要贮藏三年才为成品，该醋不仅风味突出而且被认为具有很高的保健价值。 除此之外欧美比较成熟的是以纯种醋酸菌进行醋酸发酵的工艺，是工业化生产食醋 的主要方式。2 0 世纪5 0 年代出现了深层发酵醋酸工艺，1 9 5 4 年德国f r i n g s 公司【l 】开发 上市了名叫“a c e t a t o r 的深层醋酸发酵罐，将5 酒精和7 酸度的醪液制成1 0 1 2 的酒 精醋，发酵时间约2 d 。直到2 0 世纪8 0 年代末，国外很多酿造企业仍然采用自吸式深层 发酵法生产食醋。而酶的固定化技术在醋酸发酵领域中探索试用已逐渐成为研究热点， 英国k e n n e a 等人用含水氧化钛纤维鳌合物在塔型发酵器包埋醋酸菌，生酸速度为 5 o g l 1 h 1 1 1 2 中国食醋酿造 中国的食醋酿造历史悠久，主要是以谷物为生产原料。食醋的诞生最初从酿酒开始， 早在奴隶社会，奴隶主经常用上好的谷物酿酒供他们宴饮作乐和祭祀神灵。酒中的主要 成分乙醇受微生物“醋母”的作用，被空气中的氧气氧化而变成醋酸，出现了当时人们认 为的“坏酒”现象，人们称这种酿坏的酒为“苦酒”，显然“苦酒”就是原始食醋的概念。有 文献记载我国食醋的酿造技术可追溯到两千多年前的周朝甚至更早。根据庄颖著物原 类考的考证，认为“酱成于盐，同时已有醋，一名苦酒，周时称醢，汉始称醋”【2 j 。周 礼天官中即有“醢人主作酸”的记载。从这些记载来看，食醋的起源当在周朝之前【2 j 。 而在古时，醋还有酰、酢等异称。公元前6 世纪，醋就已成为常用的调味品，如论语 中就有“或乞酰焉”之语，在公元前4 世纪就有了专门管理酿醋的官员，如周礼天官 中的酰人。 公元6 世纪中叶，酿醋已有了较为科学的方法，如当时的农学家贾思勰著书齐民 要术中，书中谈到了有关酿造方面的知识，其中包括酿醋。这是我国现存史料中，对 粮食酿造醋的最早记载。同时，这一记载也表明中国是世界上谷物酿醋最早的国家。在 齐民要术里还有“春酒压讫而动”的记载，包启安解释说动就是酸败”，是因制酒条 件控制不当，污染而酸败。人们发现酒酸败后其味酸美，特意令酒氧化成醋，这就是糖 化、酒化、醋化复合发酵制醋工艺的由来【2 】。 江南大学硕士学位论文 随着实践经验的不断积累，到了明代，酿醋常识己普及普通百姓之家、如农政全 书卷四中就载有“作酢法”、“秫米神酢法”等百姓酿醋的详细方法。至此，我国古代发 酵制醋的工艺基本形成。 解放前，我国食醋生产沿用古老落后的生产工艺，虽能制出风味好的优良食醋，但 原料出醋率低、质量不稳定、产品卫生条件较差、劳动强度大、发酵周期长。 解放后，由于党和国家的重视，食醋生产工艺和设备有了很大的改进。1 9 5 6 年，山 东济南酿造厂试产成功新固态发酵法制醋，即使用人工培养的曲霉和酵母菌进行固态糖 化和酒精发酵，提高了出醋率。1 9 6 7 年，上海醋厂和上海市粮油工业公司酿造实验工厂 联合创造了酶法液化自然通风回流的固态发酵工艺p 】，使用了纯培养的枯草杆菌、曲霉 菌、酵母菌和醋酸菌，解决了人工翻酷的问题，进一步提高了原料利用率、缩短了生产 周期。1 9 7 1 年山西省长治市副食品厂创造了我国生料制醋新工艺1 3 j ，1 9 7 2 年起石家庄市 副食品一厂开始研究深层发酵醋新工艺，取得5 0 0 0 l 标准罐试产成功1 3 】，1 9 7 7 年上海醋 厂和上海市酿造科学研究所协作成功地将自吸式充气发酵雄应用于液醋生产，其优点是 原料利用率高、劳动生产率高、发酵周期短、食品卫生好，这是我国近代制醋工业的一 项重大技术突破。 我国各地群众经过长期的实践按照各地气候、原料等条件，创造出工艺不同、风格 各异的制醋方法，所酿制产品具有各自独特的风味。许多省份都有自己的原产醋，著名 的有镇江香醋、山西老陈醋、四川麸醋、福建红曲醋、江浙玫瑰米醋等。其中产量最大， 生产工艺最规范成熟，国际影响最大的名醋是镇江恒顺集团生产的镇江香醋。同时一些 新技术的应用使传统产品不仅保留原有独特风味，而且品质得到进一步提高。 1 2 食醋的酿造工艺和生产原理 目前我国的酿醋工艺基本上可分为：( a ) 、自然发酵传统酿造( 老法) 工艺，如镇江香 醋、山西老陈醋、四川保宁醋、福建红曲老醋、江浙玫瑰醋等；( b ) 、新型酿醋工艺，如 酶法液化通风回流法、生料制醋、淋浇法制醋、液态深层发酵醋等。我国食醋传统制法 大多是采用固态发酵，产品风味好，有其独特的风格，但也存在着需要原辅料多、发酵 周期长、原料利用率低及劳动强度高的缺点。近年来，食醋的生产在工艺和设备方面都 有许多改进，实现了酶法液化通风回流法制醋和液体深层发酵法制醋等新工型4 5 。 食醋的酿造过程可分为淀粉糖化、酒精发酵和醋酸发酵3 个主要过程，这3 个过程 都离不开不同种类微生物所产生的酶的作用【4 。8 1 。即由曲霉产生的糖化型淀粉酶使淀粉水 解为糖类，蛋白酶使蛋白质分解为各种氨基酸；酵母菌分泌的各种酒化酶使糖分子分解为 酒精；由醋酸菌产生的氧化酶将酒精氧化成醋酸。整个食醋的发酵过程就是这些微生物 产生的酶的互相协同作用，从而产生一系列的生物化学变化的过程。 1 3 镇江恒顺香醋简介及其研究进展 镇江恒顺香醋是我国传统四大名醋之一，具有醇香浓厚，回味悠长的特点。对恒顺 香醋还有“香醋摆不坏，愈陈愈香”的古语。镇江香醋用糯米为原料，是一种典型的米醋。 梁代陶弘景神农本草经注中就有关于米醋用法的记载。据此，恒顺香醋已有1 4 0 0 多年的历史。1 8 4 0 年，江苏丹徒的朱兆怀始创“朱恒顺糟坊”，1 8 5 0 年易牌号为“朱恒顺 第章绪论 糟淋坊”，以酒糟加入谷壳发酵，酿制香醋，这是镇江第一家醋厂( 今恒顺酱醋厂) ，也是 今天镇江香醋的真正发源地。1 9 0 9 年，恒顺以醋参加南洋劝业会评赛，荣获了第一枚金 牌奖。民国年间，又多次在江苏物产展览会、京沪铁道沿线评赛会、西湖博览会上获多 种奖牌，镇江香醋名声日盛。中国医药大典记载，“醋产浙江杭绍二县为最佳，实则 以江苏镇江为最”。 恒顺香醋采用固态分层发酵工艺酿制，富含营养物质，风味独特。时至今日，镇江 恒顺集团年产食醋1 0 万吨以上。无论产量知名度，镇江恒顺香醋都居全国之首。所以 对镇江香醋的发酵机理的、其功能因子活性成分、工艺的改进进行研究有着重要意义。 其生产流程如图1 1 所示。 原料：糯米 水一j 浸泡 j | 蒸熟 、i 酒药l 却 釜一等 麦曲 爰酵 加盐 d 酿 j 础色液 酿酒过程醋酸发酵过程 后期加工过程 图1 - 1 镇江香醋生产工艺流程图 f i g 1 1f l o wc h a r to f z h e n j i a n ga r o m a t i cv i n e g 盯 截止目前，镇江恒顺醋业集团己与江南大学、江苏大学等多加科研机构合作，对镇 江香醋进行了广泛的研究。主要研究包括对其传统酿造工艺的阐述以及在此基础上其工 艺的改进，酿造过程中微生物群落的分析，镇江香醋的功能性成分的分析检测，镇江香 醋的药用及保健价值，新品醋的开发等。 1 3 1 传统工艺的改进以及高新技术的应用 镇江香醋历史悠久，风味独特，但传统的手工作坊式的生产方式严重制约其发展， 生产成本高，产量低，远远不能满足市场的需要。自解放后，2 0 世纪9 0 年代后恒顺醋 厂与江南大学等高校进行技术合作，对其生产工艺做了较大改善，主要体现在如下各方 面。 在酒精发酵阶段，借鉴制酒工艺，采取原料粉碎后加入耐高温淀粉酶和糖化酶的双 酶法液态深层发酵工艺。使用这一工艺明显缩短酒醪制备时间，并保证了酒醪质量的稳 定，同时通过添加活性干酵母、生香酵母和麦曲，使酒醪中具备较多的风味物质。产生 的风昧物质克服了仅使用酵母进行酒精发酵，从而严重影响后续醋酸发酵使产品风味欠 佳的问题。总之，改进后的生产工艺不但提高了生产效率，同时又很好地保留原镇江香 醋传统工艺酿造醋的风味 9 , 1 0 , 1 1 1 。 江南大学硕士学位论文 镇江香醋一个重要理化指标氨基酸态氮含量，在夏季生产中往往不易达标，而且由 于蛋白质降解不完全，容易造成成品醋出现返混和沉淀现象。通过在醋酸发酵过程中添 加酸性蛋白酶可改善蛋白质的降解情况，提高氨基氮的含量( 一般可使香醋氨基酸态氮含 量比原来提高5 0 以上) ，解决了传统工艺生产时的成品醋易出现返混和沉淀的难题p j 。 通过在醋酸发酵阶段“以池代缸”、机械化翻醅技术的运用使制醋行业从高强度的手 工劳动中解放出来，大幅度地增加了产量，提高了厂房设备的利用率，且更利于产品质 量有效控制，保证了制醅质量的同一性i 。 对部分中高档产品采取超滤技术过滤醋液，过滤后醋液透明度好，澄清度高，无沉 淀，对细菌分离率达9 7 以上，很好解决了困扰食醋行业的成品醋的沉淀问题1 9 j 。但 由于成本较高相对，此技术只应用于部分中高档产品。 1 3 2 食醋酿造过程中微生物作用的研究 镇江香醋的酿造是一个多菌种混合式的固体发酵过程，固体发酵的复杂性及不可控 性、混合菌种相互作用的复杂关系、独特的生产工艺造就镇江香醋酿造微生物的多样性。 包启安【1 2 】等人详细阐明了镇江香醋发酵工艺中不同阶段不同微生物的作用。在酒精 发酵阶段，麦曲中米曲霉不仅具有强大的糖化能力，还发挥着蛋白水解酶的作用。它可 将蛋白质水解至肽，酶系中的氨基肽酶和羧基肽酶又可将肽继续分解成氨基酸，构成了 食醋的呈味成分，使醋味柔和而圆滑，同时通过麦曲中米曲霉相关酶系的作用，可以生 成大量风味物质和风味物质前体，为以后醋酸发酵打下了坚实基础。这也是镇江香醋最 终产品风味独特的重要原因。酵母菌( 酿酒酵母、产酯酵母) 可生成乙醇和酯类物质，前 者是后续醋酸发酵的重要基质，而后者是醋液中主要的香味物质。至于醋酸菌、乳酸菌 等产酸菌可产生醋酸、乳酸以及其他多种有机酸( 草酸，酒石酸，丙酮酸，苹果酸，1 3 t , - 酮戊二酸，柠檬酸，富马酸，琥珀酸) 。众多有机酸的存在提供了良好的缓冲体系，不仅 大大降低醋液的刺激性更极大的改善了产品的风味，使产品酸而不涩，造就了镇江香醋 独特的口感。 许伟【1 3 】等人利用p c r d g g e 分子生物学方法详细考察了镇江香醋醋酸发酵过程中 微生物群落组成情况。作者发现在醋酸发酵过程中除了有常见的醋酸菌，还有较多种类 的乳酸菌和酵母菌。其中酵母菌主要来自于酒醪，而乳酸菌是兼性厌氧菌，作者据此推 断这可能与镇江香醋采用的醋酸固态分层发酵工艺有关。传统的固态分层发酵工艺与实 际意义上的通风发酵有所不同，这个环境可能是一个微氧环境，或者说不同位置的醋醅 的氧含量是不一样的，甚至有局部厌氧或痕量氧存在的可能，因此造成镇江香醋醋醋微 生物群落多样性的主要原因。 1 3 3 功能性物质的研究及风味物质的分析检测 中国工程院院士阮长耿、中科院上海细胞所研究员张学军等7 名专家鉴定，证实镇 江恒顺香醋的抗氧化性和含有的川芎素所具有的保健作用，既有理论意义又有实用价 值。由镇江市科技局组织，恒顺醋业股份有限公司和江南大学共同承担研究任务，经过 4 年对恒顺香醋抗氧化性和川芎嗪含量的研究，得出全新的关于香醋保健功能的结论。 经专家鉴定认为：利用香醋抗氧化性有利于更好地开发出具有预防心脑血管疾病、延缓 第一章绪论 衰老的保健产品。贺铮怡【1 4 】等人在镇江香醋中检测到较高含量的川芎嗪，即四甲基吡嗪 ( t e t r a m e t h y l p y r a z i n e ) ，是中药川芎的主要有效成分之一。文献报道川芎嗪对心脏，冠脉 循环，血压调节均有作用。川芎嗪能使麻醉犬血管阻力下降，使脑、股动脉及下肢血流 量增加。川芎嗪静注或肌注麻醉动物，有显著降压作用，其药用价值不可忽视。此外， 吡嗪类物质还是重要的风味物质【”】。徐清萍【1 6 】等人对镇江香醋的抗氧化性作用进行了深 入研究，发现香醋乙醇沉淀上清液d p p h 自由基清除活性较强，o 5m g m l 时d p p h 自 由基清除率为6 2 6 7 ，从而使得镇江香醋具有良好的抗氧化作用。长期食用镇江香醋具 有抗氧化性，抗疲劳，调节血糖、血压、促进食欲、护胃、促进钙吸收、预防骨质疏松 等作用1 7 , 1 8 】。 马永昆 1 9 , 2 0 】等人利用g c m s 技术测定镇江香醋的主要香气成分，发现其主要是酸 类、酯类、醛类和杂环类化合物，并以苯乙醇、3 甲基丁酸、苯乙酸、3 甲基丁醛、2 甲基丁醛、糠醛、2 ，3 丁二酮、3 羟基2 丁酮、乙酸乙酯、2 ，3 丁二醇二乙酸酯、三甲基 恶唑、三甲基吡嗪、四甲基吡嗪、5 乙基二氢2 ( 3 h ) 呋喃酮、2 甲氧基4 - 乙烯基苯酚等 1 5 种特征香气成分及其相对含量构建了镇江香醋的香气指纹图谱。贺铮怡【1 4 】等人采取 g c m s 以及反向h p l c 技术定性定量检测镇江香醋中川芎嗪。 有机酸是食醋中重要组成成分，是主要风味物质之一，其种类、含量及其相互比例 与产品质量和风味密切相关。数据显示镇江香醋总酸很高( 平均约6 8 2 ) ，但并无刺激感， 酸味柔和，这与香醋中丰富的有机酸含量是密不可分的。因为我国食醋绝大多数是谷物 醋，谷物醋酯类物质种类较少，但氨基酸和挥发性有机酸含量要大得多。过去国内在食 醋分析方面更多是利用特殊分析手段快速准确对已定性成分进行定量。2 0 0 2 年陈斌，吴 珏等探讨了利用近红外光谱法快速分析了食醋中的总酸，挥发酸含量的可行性1 2 。随着 高效液相色谱和毛细管气相色谱等色谱手段的广泛应用，在2 0 0 7 年吕利华【2 2 j 等人建立了 采用离子排斥色谱法快速测定山西老陈醋中的8 种主要有机酸的方法。2 0 0 8 年张丽娟【2 3 l 等人利用h p l c 方法对镇江香醋醋酸发酵过程中的有机酸进行了分析。 1 3 4 新品醋的开发研究 镇江恒顺醋厂积极开发新产品，如蜂蜜醋、苹果醋、柠檬醋、奶醋、菠萝醋、醋胶 囊【2 4 】等果醋或保健醋的开发，这些产品业已取得了良好的社会和经济效益。 1 3 5 镇江香醋的保健和药用功能 据专家研究镇江香醋具有降血压和降血脂、分解乳酸消除疲劳、抗菌作用、防治感 冒、防治肝病、治疗糖尿病、抗癌作用、美容延缓衰老、炮制中药材等功效。除上述功 效外，镇江香醋还有减肥、解酒、利尿作用，又有治疗结石、骨质增生、坐骨神经痛、 腰腿扭伤、血肿、骨折、肠道寄生虫及外科一般炎症等作用【2 5 6 1 。所以说镇江香醋的药 用价值非常广泛，临床上用以治疗百种疾病，秦万章教授【2 5 】所著镇江米醋的药用功能 一书中收录了镇江香醋入药之方达2 8 0 0 余例。 1 4 微生物的分子鉴定以及a r d r a 分型 传统的微生物鉴定方法是先获得纯培养物，再结合常规生理生化实验，参照相应的 细菌和真菌鉴定手册，对所需要鉴定的微生物加以鉴定。但这种方法耗时耗力，准确度 江南大学硕士学位论文 也常常受到多种因素的干扰。随着分子生物学的进展，其最新研究成果被广泛应用于微 生物系统发育分析和快速鉴定等方面的研究。 r d n a 是微生物遗传物质中相对保守的序列，但不同种属间也存在相应变异，因此 可以作为一种分子遗传的标记，用以对微生物进行系统分类或者快速鉴定。即通过特异 引物扩增出微生物的1 6 sr d n a ( 细菌) 或1 8 sr d n a ( 真菌) 片段，然后测定其序列，最后把 所测序列提交g e n b a n k 等数据库中比对加以鉴定。 a r d r a ( a m p l i f i e dr i b o s o m a ld n ar e s t r i c t i o na n a n l y s i s ) 是上世纪9 0 年代兴起的新 技术1 2 m 引。基于p c r 技术选择性扩增1 6 sr d n a 或1 8 sr d n a 片段，在对r d n a 片段进行限 制性酶切长度多态性分型( r f l p ) ，其a r d r a 图谱可以作为一种分类标志，特别在对环 境微生物区系进行考察时，构建克隆库和a r d r a 酶切分析技术相结合，对挑选的阳性 转化子进行快速初步分类，然后对每一类分别进行测序，避免了不必要的浪费。 1 5 本课题要达到的目的与要求 镇江香醋是中国四大名醋之一，具有醇香浓厚，回味悠长的特点。镇江香醋有一个 鲜明的特点，即醋中酸含量很高( p h 为3 7 3 ，总酸为6 8 2 ) ，但并无刺激感，且酸味柔 和。这其中有机酸的作用是非常重要的，大量有机酸的存在不仅为香醋提供了一个良好 的缓冲体系，而且有机酸还是香醋中重要的风味物质。另外镇江香醋还富含各种醇、醛、 酯等物质，这些成份的存在使镇江香醋具有独特的口感和风味，这与镇江香醋独有的微 生物的作用是密不可分，而这些微生物又与镇江香醋独特的固态分层发酵工艺息息相 关。在镇江香醋1 0 0 多年的发展和传承过程中，香醋酿造的极端酸性环境长期对酿醋微 生物进行驯化，各种微生物经过遗传、变异、消长和衍化等微生物群落的演替，使镇江 香醋具备独有的酿造微生物区系，特别是酿醋微生态环境中富集了丰富的可耐强酸的极 端微生物。因此对镇江香醋醋酸发酵过程微生物群落的变化情况、产酸菌的分布以及产 酸特性进行研究有着重要意义。在此基础上可以更好地了为进一步挖掘镇江香醋酿醋极 端微生物如产酸菌资源的研究、开发及其保护提供理论基础，而且对于镇江香醋的发展 以及其经济和科学研究价值也具有重要的作用。另外本实验室已经利用p c r d g g e 的 方法详细考察了镇江香醋醋酸发酵过程中微生物群落变化，发现了多种酵母菌以及醋酸 菌、乳酸菌等产酸菌的存在。所以在考虑到上述因素以及作为镇江香醋微生物群落分析 课题的一部分和本实验室工作的延续，本文将从传统的微生物纯培养方面对已经利用分 子生物学获得的结果加以验证和补充，因此拟就如下方面进行研究： 1 、采用传统纯培养方法，对恒顺香醋醋酸发酵过程中的微生物( 产酸菌、真菌) 数量 动态变化情况进行考察： 2 、对恒顺香醋醋酸发酵过程中的微生物( 产酸菌、酵母菌) 进行分离和分子生物学 ( 1 6 sr d n a 、1 8 sr d n a ) 测序鉴定； 3 、对分离出的产酸菌进行摇瓶发酵，利用h p l c 测定发酵液中有机酸组成情况， 初步研究其在镇江香醋醋酸发酵过程中的作用。 6 第二章镇江香醋醋酸发酵过程中产酸菌、酵母菌的分离鉴定 第二章镇江香醋醋酸发酵过程中产酸菌、酵母菌的分离鉴定 目前，国内外对于食醋酿造行业的研究主要集中于：醋酸菌的分离【3 3 - 3 6 、生理生化 和分子生物学快速鉴定3 7 - 3 9 、醋酸菌的分类学研究3 7 - 3 9 、优良醋酸菌的选育 3 3 - 3 6 】、食醋 酿造工艺的改进【1 0 1 、新品醋( 主要是保健醋和果醋) 的研制开发4 0 ，4 1 1 、食醋中功能因子的 研究【1 4 】。但是对于食醋酿造过程中的微生物区系的组成以及不同微生物的功能还缺乏全 面深入的了解，关于这方面的文献报道也不拶1 3 j 。 镇江香醋总酸含量较高，平均约6 8 2 ，但并无刺激感，酸味柔和。已有研究表明 这与醋中含量丰富的有机酸所起的缓冲作用是密不可分的 4 2 , 4 3 1 。另外有机酸还是镇江香 醋中的主要风味物质之一，其种类、含量及其相互比例与产品质量和风味密切相关，所 以研究镇江香醋中产酸菌( 产有机酸的微生物) 的分布及其产酸特性有着重要意义。 本文以镇江恒顺醋厂醋酸不同发酵时间的醋醅为实验材料，考察镇江香醋醋酸发酵 过程中产酸菌数量的变化情况，并对分离的产酸菌采用分子生物学方法加以鉴定。许伟 副等人利用p c r d g g e 方法在醋醅中检出多种酵母菌的存在，因此本文也尝试对镇江 香醋醋酸发酵过程中的真菌数量变化情况进行考察，同时对分离的酵母菌加以分子鉴 定。 2 1 材料与方法 2 1 1 仪器与试剂 ( 1 ) 主要试剂 p e p t o n e ，a g a r ，y e a s te x t r a c t ，g o l d v i e w ，氨苄青霉素，t r i sb a s e ，e d t a 购自上海 生工生物工程有限公司；氯化钠，葡萄糖，甘油，b e e f e x t r a c t ，冰乙酸，无水乙醇购自 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司；轻质碳酸钙由江苏省微生物研究所有限公司提供； e x t a qd n a 聚合酶，d n t p 购自大连t a k a r a 公司；细菌基因组d n a 提取试剂盒( 离心 柱型) 、p c r 产物纯化试剂盒( 离心柱型) 购自捷瑞生物工程( 上海) 有限公司；限制性内切 酶h i n fi 和c s p 6i 购自f e r m e n t a s 公司。 ( 2 ) 仪器设备 名称 高速冷冻离心机 生化培养箱 台式离心机 p c r 仪 超净工作台 u v 2 1 0 0 紫外分光光度计 电子天平 超净工作台 l s b 5 0 l 型立式圆形压力蒸汽灭菌锅 公司 s i g m a ( 美国) 上海博讯医疗仪器有限公司 上海安亭仪器厂 中国l o n g g e n e 科学仪器有限公司 上海定山湖净化设备厂 上海( 尤尼克) 仪器有限公司 美国，s a r t o r i u s 上海定山湖净化设备厂 上海医用核子仪器厂 江南土学砸f 1 学位论女 h y g i i 型回旋式恒温调速摇床上海新星自动化控制设备成套厂 p h s - 3 c 型精密p h 计 雷磁仪器 1 0 l 一2 型电热鼓风干燥箱上海市仪器商店 h h - 4 型数显恒温水浴锅金坛市富华电器有限公司 显微镜上海光学仪器厂 ( 3 ) 实验材料 以镇江恒顺醋厂发酵不同时间的醋醅( s d ，7 d ，1 0 d ，1 3 d 15 d ，1 8 d ) 的上层样为实 验样品( 图2 - 1 ) ，取完样后迅速带回，4 冰箱保存。为了尽量保证醋醅中微生物种类和 数量不发生较大变化，样品取回后立即进行微生物分离计数。 图2 - 1 镇江香醋厂醋醅 f i g2 - it h es o l i dc u l t u r e s o f z h e n j i a n ga r o m a t i cv i n e g a r ( 4 ) 分离计数培养基 ( a ) 产酸菌分离计数培养基( g y c ) 葡萄糖1 ，酵母粉1 ，轻质c a c o 】05 ，琼脂2 ，1 2 1 灭菌2 0 m i n ，等降温 至5 5 左右添加无水乙醇3 ( v v ) 。 ( b ) 真菌分离计数培养基( p d a ) 称取2 0 0 9 马铃薯，洗净去皮切碎，加水1 0 0 0 m l 煮沸半个小时，纱布过滤，定容 至1 0 0 0 m l ，添加2 0 9 葡萄糖和1 7 - 2 0 9 琼脂并定容至1 0 0 0 m l ，1 2 1 灭菌2 0 m i n 。等 降温至5 5 ( 2 左右时，加入氨苄青霉秉5 0 1 a g m l ( 真菌分离计数时用以抑制细菌的生长) 。 ( 5 ) 保藏用培养基 产酸菌保减培养基：葡萄糖1 ，酵母粉1 ，琼脂2 ，甘油25 ，轻质c a c 0 3o5 ， 自然p h ，1 2 1 灭菌2 0 m i m 真菌保藏用p d a 培养基。 2 1 2 产酸茵，真茵的分离计数 1 0 2 发酵不同时间( s d ，7 d ，1 0 d ，1 3 d 1 5 d i8 d ) n 醅样品装入混有玻璃珠和9 0 m l 无苗生理盐水( o8 5 ) 的5 0 0 m l 三角瓶中，l l5 r p m 震荡3 0 m i n 后取菌悬液用无菌生理盐 水1 0 倍梯度稀释，以合适梯度涂布平板计数，每个梯度三个平行。 第二章镇江香醋醋酸发酵过程中产酸菌、酵母茵的分离鉴定 ( 1 ) 产酸茵的分离计数方法 在分离培养基中以轻质c a c 0 3 作为产酸指示剂，以1 0 2 、1 0 刁、1 0 4 梯度稀释样涂布 平板，3 7 培养3 - 5 d 。若菌株产酸则会与c a c 0 3 反应产生透明圈，其菌落为产酸菌【3 3 3 6 1 。 及时观察菌落生长状况、形态并进行菌落计数。同时依据产透明圈大小以及菌落形态不 同挑取单菌落，划线分离纯化，4 冰箱保存，以备菌种进步鉴定。 ( 2 ) 真菌的分离计数方法 p d a 培养基中加入氨苄青霉素5 0 u g m l 以抑制细菌的生长，进行酵母菌的分离和 计数，以1 0 一、l o 之、l o 。梯度稀释样涂布平板，酵母菌3 0 。c 培养3 5 d 。及时观察菌落 生长状况、形态并进行菌落计数。 2 1 3 产酸茵、酵母菌的测序鉴定 利用分子生物学手段进行鉴定，即分别提取其染色体，扩增其1 6 sr d n a 或1 8 s r d n a ，然后用h i n fi 或c s p 6i 对扩增的1 6 sr d n a 和1 8 sr d n a 产物分别进行酶切 a r d r a 分型【2 7 1 ，对酶切后显示不同类型的产酸菌和酵母分别构建t 载体送出测序，序 列提交g e n b a n k 进行b l a s t 比对确定具体种属。 ( 1 ) 产酸茵的分子生物学鉴定 ( a ) 产酸菌d n a 的提取 参见捷瑞生物工程( 上海) 有限公司细菌基因组d n a 提取试剂盒( 离心柱型) 。 ( b ) 1 6 sr d n a 的扩增 i ：引物 采用细菌通用引物 p o ：5 一g a ga g tt t ga t cc t gg c tc a g - 3 ， p 6 ：5 - c t ac g g c t ac c t t g tt a cg a 一3 i i ：p c r 反应体系及程序 反应体系( 5 0 p l ) 10 x b u f f e r ( m g )5 0g l d n t p s ( 2 5m m l 4 0l , t l p o ( 2 0g m ) 2 0p , l p 6 ( 1 2 5p m ) 2 0g l e x t a qd n a 聚合酶( 5u i t l ) 1 0g l t e m p l a t ed n a 2 0g l d d h 2 0 3 4 0 t , t l 9 第二章镇江香醋醋酸发酵过程中产酸菌、酵母菌的分离鉴定 反应程序 预变性954min 变性 9 5 4 5s 、 退火 5 6 c4 5s - ( 3 0 个循环) 延伸 7 2 9 0s j 终延伸 7 2 1 0 m i n p c r 产物用0 8 琼脂糖凝胶电泳分离检验，电压约11 v c m ，电泳时间2 0 m i