（微生物学专业论文）新的低分子多肽电泳体系x尿素page体系的建立及应用.pdf

原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进 行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何 其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人 承担。 论文作者签名： 娃选e l 期：丝五：；2 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅 和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本 学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名： 蝉导师签名：侮日 期：二塑叫 山东大学硕士学位论文 摘要 随着生物技术的发展，小分子多肽的开发应用日益广泛。特别是生物活性肽、 抗菌肽的大量涌现及参与木素、纤维素降解的小分子肽的发现，引发了小分子多 肽研究的热潮。由于其分子较小，致使其分离、纯化难以进行。目前常使用s d s 电泳技术、毛细管电泳技术及高效液相技术分离纯化小分子多肽，其中s d s 电泳 技术由于操作简单方便、成本较低，成为最常使用的分离方法。 本文通过对s d s 电泳技术进行改进，发现增加分离胶浓度、交联度，添加6 8 m 尿素，使用高离子强度、高p h 值的缓冲体系或者改变缓冲体系如使用t r i s - t r i c i n e 电极缓冲液系统，可以提高s d s p a g e 的分辨率。但是这些改进都是基于s d s 作 为表面活性剂，仍存在一定的局限性，同时使用改进后的s d s 电泳系统仍很难分 离3 0 0 0d a 以下的小分子多肽。 本研究选择了一种新的阴离子表面活性剂x ，并对影响电泳分离效果的诸多 因素如表面活性剂x 的浓度、分离胶的浓度、缓冲系统p h 值、电极缓冲液离子强 度、还原剂的选择、样品处理温度、样品缓冲液p h 值、上样量及显色方法等进 行实验探讨，从而建立了新的电泳体系，即x 尿素p a g e 体系。目前，该体系已 经可以较好的分离i 7 0k d a 的肽及蛋白质。 将x _ 尿素p a g e 体系应用于实验室中多种小分子多肽样品的检测、酶的复性 电泳及双向电泳的第二向电泳中，并对该新体系下小分子多肽的转膜电泳条件进 行了优化。实验结果证实了该电泳体系在分离和纯化小分子多肽方面具有很大的 优越性。本系统操作简单、分辨率高，成本较低，具有很广阔的应用前景。 关键词：s d s p a g e ，表面活性n x ，x 尿素p a g e ，转膜电泳，蛋白复性， 双向电泳 4 、 w i t ht h ed e v e l o p m e n to fb i o t e c i m o l o g y , t h ee x p l o i t a t i o na n da p p l i c a t i o no fl o w m o l e c u l a rw e i g h tp e p t i d e sb e c o m em o r ea n dm o r ee x t e n s i v e , e s p e c i a l l yf o rt h e a v a l a n c h eo fb i o l o g i c a l l ya c t i v ep e p t i d e sa n da n t i m i c r o b i a lp e p t i d e s , a n dt h e d i s c o v e r yo fl o wm o l e c u l a rp e p t i d e sd u r i n gc e l l u l o s eo rl i g n i nd e g r a d a t i o na sw e l l n o ww eo r d i n a r i l yu s es d s p a g e ，c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sa n dh i g hp e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h yt os e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o no fl o wm o l e c u l a rp e p t i d e s h o w e v e r , s d s p a g eb e c a m et h em o s tp o p u l a rs e p a r a t i o nm e t h o & d u et oi t se a s y o p e r a t i o na n dl o w c o s t w et r i e dt od os o m ei m p r o v e m e n to ft h es d s p a g ea n df o u n dt h a ti t c a n i n c r e a s er e s o l u t i o no fs e p a r a t i n gl o wm o l e c u l a rw e i g h tp e p t i d e sb yu s i n gh i g h c o n c e n t r a t e da n dc r o s s - l i n k e dp o l y a c r y l a m i d eo r 、“t l l6 - 8 mu r e a h i g h - m o l a r i t i e so r h i g h - p hb u f f e r sw e r ea l s ob ef o u n dt ob ee f f e c t i v ef o rt h es e p a r a t i o no fp e p t i d e s o t h e r w i s e ，c h a n g i n gt h eb u f f e rs y s t e ms u c ha su s i n gt r i s - t r i c i n ee l e c t r o d eb u f f e r s y s t e mc o u l da l s oa c h i e v es u c c e s s f u lr e s o l u t i o no f t h el o wm o l e c u l a rw e i g h tp e p t i d e s b u ta l lt h e s ei m p r o v e m e n t sw e r eb a s e do nt h es y s t e mw h i c hu s e ds d sa ss u r f a c t a n t t h ei m p r o v e ds d s p a g es y s t e m sc o u l ds e l d o ms e p a r a t i n gp e p t i d e so fm o l e c u l a r w e i g h tb e l o w3 0 0 0 w ec h o s ea n i o ns u r f a c t a n txa sd e n a t u r a n ta n dd i ds o m er e s e a r c ho nt h e i n f l u e n c i n gf a c t o r so fs e p a r a t i o ne f f e c ts u c ha sc o n c e n t r a t i o no fs u f f a c t a n tx a n d s e p a r a t i n gg e l ，t h ei o n i cs t r e n g t ho rp i - io fb u f f e rs y s t e m , r e d u c i n ga g e n t , t e m p e r a t u r e o fd e a l i n gw i t hs a m p l e s ，t h ep ho fs a m p l eb u f f e ra n dt h es t a i n i n gm e t h o dc h o i c ee t c t h e nw ee s t a b l i s h e dan e we l e c t r o p h o r e s i ss y s t e m ，n a m e dx - u r e a - p a g es y s t e m t h i sn e ws y s t e mc o u l ds e p a r a l ep e p t i d e sa n dp r o t e i n si nt h er a n g eo f1 - 7 0 k d a t h i sx - u r e a p a g es y s t e mw a sa p p l i e dt ol o wm o l e c u l a rw e i g h tp e p t i d e s s e p a r a t i o n s ，e n z y m a t i cr e c o v e r ye l e c t r o p h o r e s i sa n dt h es e c o n dd i m e n s i o n e l e c t r o p h o r e s i so f2 - dg e le l e c t r o p h o r e s i s b a s e do nt h i sn e ws y s t e m ，w es t i l l 5 山东大学硕士学位论文 o p t i m i z e dt h ec o n d i t i o n so fe l e c t r o p h o r e s i st r a n s f e rf o rp e p t i d e ss e p a r a t i o n s i ti s p r o v e dt oh a v ea l le x c e l l e n tp o t e n t i a lf o rp e p t i d e ss e p a r a t i o n s t h i ss y s t e mh a s aw i d e a p p l i e df o r e g r o u n d a si t se a s yo p e r a t i o n ，h i g hr e s o l u t i o na n dl o wc o s t k e y w o r d s ：s d s p a g e ，s u r f a c t a n t ) ( x u r e a - p a g e ，e l e e t r o p h o r e s i s t r a n s f e r , e n z y m a t i cr e c o v e r y , 2 - dg e le l e c t r o p h o r e s i s 6 山东大学硕士学位论文 符号说明 b i c i n e n - 二( 羟乙基) 甘氨基酸 b i s - t r i s 双( 2 羟乙基) 亚氨基三羟基甲基甲烷 c a s 铬天青 c a p s 3 - 【环己基氨基】- l 一丙磺酸 c h a p s 3 - 3 一( 胆酰胺基丙基) 二甲氨基 丙磺酸盐 c h c a 2 - 氰基4 一羟基肉桂酸 c m c 羧甲基纤维素钠 d t t 二硫苏糖醇 m e s 2 ( n 马啉代) 乙烷磺酸 m a l d i - t o f - m s 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 s d s 十二烷基硫酸钠 t a u r i n e 氨基乙磺酸 t e m e d n ，n ，n ，n 四甲基乙二胺 t f i c i n e三羟甲基甲基甘氨酸 t r i s三羟甲基氨基甲烷 7 山东大学硕士学位论文 1 研究背景 第一章绪论 随着生物技术的发展，小分子多肽的开发应用日益广泛。许多生理必需的调 节因子都是生物活性肽类，如缓激肽、胰岛素、抗利尿素、降钙素等。目l j ，所 有的常规抗生素都出现了相应的抗药性致病株系，致病菌的抗药性问题已经日益 严重地威胁着人们的健康，因此寻找全新类型的抗生素是解决抗药性问题的一条 有效途径。而抗菌肽由于抗菌活性高、抗菌谱广、种类多、可供选择范围广、靶 菌株不易产生抗性突变等原因，被认为在医药工业上有着广阔的应用前景。另外 研究者们发现生物降解木素、纤维素的过程中，不仅需要大分子酶的参与，还需 要各种小分子的参与，而且不少小分子物质是肽类物质。小分子多肽的日见重要 性，引发了小分子多肽研究的热潮。 。 1 1 小分子多肽的研究进展 i 1 1 生物活性多肽的研究进展 肽是涉及生物内多种细胞功能的生物活性物质，是机体完成各种复杂生理活 动必不可少的参与者。生物体内已经发现几百种肽，所有细胞都能合成肽类物质， 其活动也受多肽的调节。肽涉及人类的激素、神经、细胞生长和生殖各领域，其 重要性在于调节体内各个系统器官和细胞。 生物活性肽分布很广，多来源于动植物体。内源性生物活性肽主要包括体内 一些重要内分泌腺分泌的肽类激素，如促生长激素释放激素( g h r h ) 、促甲状 腺素( t s h ) 、肝脏合成的类胰岛素生长因子( i g f s ) 、胸腺分泌的胸腺肽、脾 脏中的脾脏活性肽( s t f ) 、胰腺分泌的胰岛素等；由血液或组织中的蛋白质经 专一的蛋白水解酶作用而产生的组织激肽，如缓激肽、胰激肽；作为神经递质或 神经活动调节因子的神经多肽如内啡肽、脑啡肽等。外源性生物活性肽直接或间 接来源于动物食物蛋白质，如动物乳汁就可直接提供多种生物活性肽，包括乳源 性表皮生长因子( e g f ) 、i g f s 、神经生长因子( n g f ) 、转化生长因子( 1 g f ) 山东大学硕士学位论文 和胰岛素等” 生物活性肽的生理和药理作用主要是激活体内有关酶系，促进中间代谢膜的 通透性，或通过控制d n a 转录或翻译而影响特异的蛋白合成，最终产生特定的 生理效应或发挥其药理作用。约8 0 酪蛋白和2 0 乳清蛋白组成t - l 蛋白，许多 生物活性肽存在于这些乳蛋白序列中，其在胃肠道消化水解或食物加工过程中释 放出来，从而发挥生物学作用。j o l l e s 等首次报道，用胰蛋白酶水解人乳蛋白可得 到一种短肽，它在体外试验中能增强小鼠腹腔巨噬细胞对羊红细胞的吞噬作用， 静脉注射小鼠后使其抗肺炎克氏杆菌感染能力增强1 2 j 。除人乳蛋白外，人们还从 牛乳酪蛋白中分离出两个免疫调节肽：l e u - l e u - t y r 、t h r - t h r - m e ! t - p r o - i l e - t y r 。 这些肽具有多方面的生理功能，不仅能够刺激机体淋巴细胞的增殖，增强巨噬细 胞的吞噬能力，提高机体对外界病原体感染的抵抗能力【3 】，而且近年来的研究结 果表明，免疫活性肽还能抑制肿瘤的生长。b r a n t a l 等1 4 】首先报道，从牛乳p 酪 蛋白的酶解物中分离出具有吗啡样活性的物质，即9 - 酪蛋白阿片肽a ( i 酗c m 7 ) 。 研究发现，1 3 - c m 能在动物胃肠道被完整地吸收，产生与内源性阿片肽类似的生 理调节功能，如刺激胰岛素、生长抑素释放，调节肠运动，提高采食量，促进肠 道水分与电解质的吸收，此外还影响动物的行为，呼吸、睡眠等【5 ，6 ，7 ，。9 】。 k a n a n r r o g i n 等认为，1 3 - c m 7 可使血浆中生长激素( g h ) 和胰岛素生长因子( i g h ) 水平升高【i o l 。酪蛋白磷酸肽( c p p ) 是目前研究最多的矿物元素结合活性肽，c p p 能与矿物质形成可溶性的有机磷酸盐，可以充当各种矿物质特别是钙离子在体内 的载体，能够促进小肠粘膜细胞对钙离子和其他矿质元素的吸收 i l l 。此外c p p 能 增加牙齿牙菌斑上磷酸钙的含量，有助于防止牙釉质的去矿化【1 2 l 。 由于肽类所具备的这些生物活性，使得生物活性肽的生产和应用己成为一个 广泛的研究领域，开发利用这些生物分子作为新的治疗药剂的前景非常广阔，尤 其是在生物保健品方面，开发和利用生物活性肽将会越来越显得突出。生物活性 肽的来源主要有四种【1 3 ，1 4 ”1 ：( 1 ) 分离纯化存在于生物体中的各类天然活性肽。 常用方法有盐析、层析技术等等，但由于活性肽分子量较小，所以难以分离、纯 化。( 2 ) 体外用酸或碱水解蛋白质产生的。使用该法，水解过程难以控制且氨 基酸易受破坏，从而影响了肽的生物活性。( 3 ) 通过生物合成法如固相合成、 重组d n a 技术合成等制备活性肽。活性肽合成的方法各有优缺点，方法的选择 9 山东大学硕士学位论文 主要取决于所需肽的长短和数量。固相合成法广泛用于生产高价值的短到中长的 药理肽，如催产素、酪啡肽和酪激肽等，但缺点是成本高，而且在反应过程中对 健康和环境可能有害。重组d n a 法也被广泛应用，但现在的趋势是这种方法仅 限用于大肽和蛋白质的生产，许多具有营养特性的活性肽都是短肽，所以在这方 面用重组d n a 法是很有限的。( 4 ) 酶水解蛋白质制取肽。从多种蛋白质中酶解 获得的吗啡样小肽就是一个事例。该法有很多优点，其反应条件温和，安全性极 高且成本较低，但其生产过程复杂，提纯难度大，对p h 、温度等要求较严格， 制约了大规模生产。 1 l2 抗菌肽研究进展 近年来，由于药物的滥用、药物残留及细菌耐药性等问题日渐严重，越来越 多的国家开始呼吁禁用抗生素。抗菌肽因其独特的生物活性以及不同于传统抗生 素的特殊作用机理，已引起人们的极大的研究兴趣，成为分子生物学和生物化学 研究领域的热点之一【1 6 】。 抗菌肤是生物体内经诱导产生的一种小分子多肽，它富含阳离子氨基酸残基 并且具有抗菌活性。最早发现的抗菌肽c e c r o p i n s 是由瑞典科学家b o m a n 等7 】人经 注射阴沟杆菌及大肠杆菌诱导惜古比天蚕蛹产生。此后科学家们在昆虫、被囊动 物、两栖动物、鸟类、鱼类、哺乳动物、植物乃至人类等多种生物体中发现并分 离获得了3 0 0 多种内源性抗菌肽f l s ，1 9 , 2 0 , 2 1 ，捌。迄今为止，被测定肽链序列的抗菌 肽己达数百种，它们的一级结构差别很大，但都由1 3 5 0 个氨基酸组成，分子量 小于5 k d a 。与普通抗生素相比，抗菌肽具有更广的抗菌谱，除了抗细菌、真菌 外，2 4 , 2 5 ，2 6 1 ，有的抗菌肽还能作用于原虫口7 1 、有包膜的病毒 2 8 , 2 9 , 3 0 l 及癌细胞【3 ， 同时能加速免疫和伤口愈合过程。这预示抗菌肽在治疗及预防癌症和抗病毒、抗 感染等方面具有良好的应用前景。目前在哺乳动物体内发现的十余种具有抗菌活 性的肽都属于d e f e n s i o n s 和c a t h e l i c i d i n s 两大家族1 3 2 1 ：p r o t c g r i n s ( 有人称“蛋白 整合素：p g ) 包括5 种，g f p g 1 p g 5 ，最初从猪白细胞中分离得到p 以； p r o t e g r i n s 是c a t h e l i c i d i n s 家族中一类富含c y s 、a r g 的小分子肽，仅含有1 6 1 8 个氨基酸，分子量约2 0 0 0d a 。k o k r y a k o v 等人报道，d c f e n s i o n s 和t a c h y p l c s i s 等 l o 山东大学硕士学位论文 富含a r g 的阳离子肽具有抗人类h i v - i 病毒活性刚。t a m a m u r a 等【3 习实验证明 p g 1 及异构体有抗人类h i v 1 病毒的活性，为攻克人类顽疾艾滋病提供了 新的解决途径另外，y i n gz h a n 9 1 3 6 1 从蚕豆( v i c i a f a b a ) 这种豆类植物中也获得 了植物抗菌肽，命名为f a b a t i n e ，但它只对革兰氏阳性和阴性细菌有效，对酵母 无效；h o l z 卯j 研究了真核和原核生物中核糖体合成的抗菌肽，如杆菌素、昆虫防 御素。 由于抗菌肽的分子量很小，所以直接从动植物组织、微生物发酵液中提取天 然小分子多肽时，分离提纯存在一定的困难，故目前化学合成和基因工程法成为 获得抗菌肽的主要手段。化学合成法可以方便地在合成过程中改变多肽的一级结 构，加入特殊氨基酸，对多肽末端进行修饰，例如 扫e e c r o p 协和m e l i t i m 的前1 3 个 氨基酸组成的杂合肽c n ( 1 1 3 ) m n ( 1 1 3 ) 具有很强的抗苗活性而无溶血活性 1 3 8 ) 。但是化学合成法成本昂贵，限制了该方法的工业化应用。而通过基因工程在 微生物中直接表达抗菌肽基因，由于抗菌肽分子小、易被蛋白酶降解、表达产物 可能对宿主有害，从而影响了基因的高水平表达。为了克服多肤抗生素对细菌细 胞的毒性，人们采用融合表达或选择对多肽抗生素具有抗性的株系进行原核表 达。最早j a y n e s 于1 9 8 9 年在大肠杆菌中融合表达t s h i v a - i 基因。1 9 9 3 年，p i e r s 等 3 9 1 将d e f e n s i n ，h n p 1 ，e e c r o p i n m e l i t t i n 杂合肽基因分别与4 个不同的载体蛋白相 融合，并在大肠杆菌中进行表达。1 9 9 9 年，沈俊卿等【帅】在酵母中表达了c e c m p i n 的类似物。 1 1 3 参与木素、纤维素降解的小分子肽的研究进展 木素( 或称木质素，l i g n j n ) 是异质多晶的三维生物多聚体，与纤维素、半纤维 素一起构成了木质纤维材料细胞壁的主要成分。结构极其复杂，因而其生物降解 也极困难。目前，人们已发现了多种与木素生物降解相关的酶，然而各类木素降 解酶在体外均难以实现对天然木素的彻底降解1 4 l 】；免疫标记研究证明，大分子酶 蛋白无法穿过完整木材的微孔结构进入细胞壁启动木素降解 4 2 ，4 3 1 。这些研究均促 使研究者对已发现的木素降解酶在天然木素降解中的作用进行重新评价，并推测 木素降解可能需要各种活性小分子物质的参与，以启动木素降解和抑制木素降解 山东大学硕士学位论文 酶的聚合作用。纤维素主要存在于植物细胞次生壁的中层，大分子酶无法直接进 入次生壁1 4 2 , 州，但电镜切片可观察到次生壁可首先发生降解。研究者们推测，应 存在可降解纤维素的低分子化合物。于是活性低分子物质在木素、纤维素降解中 的作用成为一个新的研究热点。研究者们在实验中发现，不少活性低分子物质都 是肽类物质。1 9 9 2 年，e n o k i 等人【4 5 】从gt r a b e u m 以木质纤维素为底物的胞外培养 液中分离到一个分子量在1 0 0 0 5 0 0 0d a 的活性物质，经证实为含糖的小肽。本实 山东大学硕士学位论文 1 9 7 1 年s w a n k 等【5 4 l 通过增加甲叉双丙烯酰胺的浓度( 交联度c ) 、在分离胶 中加8m o l 的尿素，能提高低分子多肽的分辨率，但效果并不理想。 1 9 8 3 年k y t e 等 5 5 1 用含有8m 尿素、浓度为2 0 的分离胶，并通过改变缓 冲体系，分别用消旋毗啶、氯化毗啶和t r i s - h c i 配置阴极电极缓冲液、浓缩胶和 分离胶的不连续缓冲系统，可有效分离由2 5 2 5 0 个残基组成的多肽。 1 9 8 6 年f l i n g 等 5 6 1 用不加尿素的高摩尔浓度的t r i s 缓冲体系( 分离胶中含 o 7 5mt r i s 、电极缓冲液中含o 0 5mt r i s ) 、浓度为8 - 2 5 的梯度胶，可有效 分离分子量5 - 1 0 0 k d a 的肽及蛋白质。 1 9 8 7 年s c h a g g e i i 绷建立了c i 鹏s d s p a g e 体系，他们用t f i c i n e ( 三羟甲基 甲基甘氨酸) 代替传统的甘氨酸作为尾随离子，并在常规s d s p a g e 体系分离胶 与浓缩胶的基础上增加了一层凝胶，即灌注分离胶、间隙胶和浓缩胶三层凝胶减 小电流延长电泳时间，明显提高了小分子肽的分辨率，可分离1 1 0 0k d a 的蛋白 质。但其需要配置三层胶，不同的阴极、阳极电极缓冲液，而且m c i n e 价格比较 昂贵。实验中发现该方法分离大于3k d a 的蛋白质效果尚可，但分离小至l k d a 的 小分子时效果并不理想，表现为带型弥散。 1 9 9 1 年w i l t 加l g 等【5 8 】使用的新的缓冲体系，其分别用b i c i n e n 二( 羟乙基) 甘氨基酸】作为尾随离子、硫酸盐作先导离子、浓缩胶缓冲液及分离胶缓冲液分 别用b i s t r i s 、t f i s 作反向离子，通过该体系可分离1 1 0 0k d a 肽和蛋白。 1 9 9 6 年b a u m a n n 等垆明采用微制备凝胶电泳，成功地分离纯化了3 种难溶的 小分子淀粉样肽。这种将连续洗提微制备凝胶电泳装置与t d c i n e s d s p a g e 相 结合的方法，还能将2 个分子量分别为4 3 2 9d a 和3 2 8 9d a 的小肽清楚地分离开。 2 0 0 1 年k a s h i n o 等【删使用浓度为1 8o o - 2 4 的梯度胶做分离胶，并用含6m 尿 素的t r i m e s 2 ( n 马啉代) 乙烷磺酸1 分离胶缓冲液，可以有效的分离5 1 0 0k d a 的肽和蛋白质。 2 0 0 2 年s u n g k u n y i m 等【6 ，6 2 在分离胶缓冲液中添加t r i e i n e 及三种氨基酸 ( g l y 、s e r 和a s h ) 做电解质，不用浓缩胶可分离3k d a 以上的多肽，但分子量 并不具有良好的线性关系。 2 0 0 3 年t a s t e t 等1 6 3 采用综合缓冲体系，分别用t a u r i n e ( 氨基乙磺酸) 和氯 离子作尾随和先导离子、t d s 作反向离子可有效分离6 - 2 0 0k d a 的肽和蛋白质。 1 4 山东大学硕士学位论文 f = = = = = = = ! ：! ! ! ! = = = = = = = = ! = = 竺= ! = ! = = ! = ：= = = ! ! = ! = = ：= = = = 或多肽在电泳过程中主要靠分子形状，分子量不同而分离。c g e 由k 唱e r 等【7 0 l - 于1 9 8 7 年提出，由于凝胶具有粘度大、抗对流的特点，能减少溶质的扩散，所得 峰型尖锐，柱效极高，是毛细管电泳的理想介质，但制各困难、寿命偏短、使用 时易产生空泡。目前，又有一种非交联，线性、疏水多聚凝胶柱被用于多肽类物 质的分离分析，此电泳法适于含疏水侧链较多的肽分离。这种凝胶易于灌注，使 用寿命长，性质较为稳定。 ( 3 ) 毛细管电色谱( c e c ) c e c 可以说是高效液相色谱( 玎p l c ) 和毛细管电泳的有机结合1 7 ”，其以h p l c 的固定相p 2 】填充到毛细管中或涂敷在毛细管壁上，流动相以电渗流为动力。由于 电渗流不依赖分子大小和柱长，故此法适于分离小分子样品。目前已证明反相模 式硅胶固定相c e c 能分离中性小分子肽y e 等吲以强阳离子交换填料为固定 相的i e c e c 分离小分子肽。他们研究了样品缓冲液浓度、p h 值、电压对分离 的影响，发现带电小分子肽和填料问的静电作用在i e - c e c 分离中起重要作用。 从十几种二至八肽的分离结果来看，各峰峰形尖锐且分得很开，能完成小分子肽 的快速分离。y u a n z h o n gy a n g 等1 硎以c l s s c x 吸附剂混合模式固定相c e c ，用相 同的洗脱条件即可有效分离结构相近的合成肽。他们通过调整电极缓冲液的成 分、疏水作用及离子交换作用，提高了肽在色谱层析中的保留能力，从而提高了 分离结构相似小肽的分辨率。 ( 4 ) 胶束电动毛细管层析( m z c c ) m e c c 的原理是在电泳液中加入表面活性剂如s d s ，使一些中性分子带相 同电荷分子得以分离。阴离子、阳离子表面活性剂的应用可使一些小分子肽形成 带有一定电荷的胶束，从而得到很好的分离效果。有文献报道在电解液中加入环 糊精等物质，可使含疏水结构组分的多肽选择性与环糊精的环孔作用，从而利用 疏水作用使多肽得到分离嗍。 ( 5 ) 毛细管等电聚焦电泳( c i e f ) 由于不同的蛋白、多肽的等电点( p i ) 不同，因此用两性电解质在毛细管内 建立p h 梯度，其可使在蛋白、多肽在等电点p h 条件下聚集沉淀下来，而与其 他肽分离开来。c i e f 在分离、分析混合多肽物质中应用不多，主要应用与不同 来源的多肽异构体之间的分离，如对r h g 不同异构体分离7 6 】。由于在c i e f 柱表 山东大学硕士学位论文 面覆盖物的不稳定性限制了此法的广泛应用。 1 2 3 高效液相色谱 山东大学硕士学位论文 可有效分离非对映异构体两性分子的舡螺旋肽类物质。与r p h p l c 不同，使用 h i l i c ，c e x 分离肽时温度对分离效果有很大的影响。将温度从2 5 c 升高到6 5 ， 增加保留时日j ，可有效的提高小分子多肽的分辨率。 ( 2 ) 样品处理 很多小肽没有发色团，在用液相色谱分离分析前需要进行衍生化引入有紫外 或荧光吸收的官能团。谢孟峡等 g h 分别用氯甲酸9 芴基甲酯、9 芴基甲氧基甲酸 琥珀酰亚胺类酯和丹磺酰氯做衍生剂对小肽进行衍化反应，结果发现氯甲酸9 芴基甲酯对小肽的衍生反应速度快、反应完全、产物稳定。 r o t u r i c r 等踟发现传统的r p h p l c 不能分离源于食物的亲水性小分子肽混 合物。若先用9 芴甲基羰基氯对小分子肽样品做柱前衍化，再通过r p h p l c ，可 达到满意的分离，实验最终成功得到1 5 个二、三、四肽。 以上提到的几种分离方法各有利弊，s d s 电泳操作简单，所需仪器成本较低， 但是现有的电泳技术灵敏度、分辨率较低，不易分离低于3 k d a 的小分子多肽。 毛细管电泳所需样品浓度低，灵敏度高，比较适用于分离二至八肽，尤其是二肽、 三肽。但是c e 的电渗难以控制造成基线不稳、重复性差、定性及定量难等影响。 另外毛细管电泳中有很多的模式用到填充管或涂层管，这需要有专业知识和设备， 填充的效果对分析的结果有很大的影响。c e 的一个比较大的缺点是其分离量 小，主要用于小肽分析，不能进行常量制备，进行微量制备时需多次收集。h p l c 可以有效分离1 k d a 左右的小分子多肽，但是分离效果往往受流动相的影响，分 离条件比较复杂，需要不断的摸索优化分离条件。另外由于柱效的影响，其分辨 率较低。可见这几种方法的使用都受一定的限制，因此实验过程中往往是几种方 法的连用，或者根据样品的性质选用合适的分离方法 综上所述，小分子多肽的研究日趋重要，但由于其分子量较小，对分离纯化 工作造成极大的不便。目前，我们常应用s d s 电泳技术、毛细管电泳技术、高效 液相技术分离纯化小分子多肽。而s d s 电泳技术由于操作简单方便、成本较低， 成为最常使用的分离方法。研究者们通过在分离胶中添加尿素，使用高浓度、高 交联度的分离胶或者使用梯度胶，增加缓冲液的离子强度、p h 或者改变缓冲系 统如用t r i s t d c i n e 体系代替t d s - 甘氨酸体系等方法来提高电泳的分辨率。这些方 法确实可以提高小分子多肽的分离效果，但其都是基于s d s 作为表面活性剂的改 1 7 山东大学硕士学位论文 进，存在诸多局限性。 2 本文的研究内容及意义 小分子多肽是体内必不可少的因子，在机体的生理活动中具有举足轻重的作 用，生物技术的发展也促进了大规模抗菌肽的发现。本实验室的工作也证实了木 素、纤维素的生物降解，不仅需要大分子酶的参与，还需要活性小分子的参与， 而且不少活性小分子物质是肽类物质。可见对小分子多肽的研究具有重要意义。 目| j i f 常用s d s 电泳技术来分离纯化小分子多肽。本文对文献中报道的s d s 电 泳改进方法进行实验，实验中发现增加分离胶浓度、交联度，添加6 8 m 尿素， 使用高离子强度、高p h 值的缓冲体系或者改变缓冲体系如使用t r i s t r i c i n e 电极缓 冲液系统，可以提高s d s p a g e 的分辨率，但是这些都是基于s d s 作为表面活性 剂的改进仍存在一定的缺陷性。s d s 分子量较小，不利于降低多肽的迁移率，因 此希望能找到合适的表面活性剂代替s d s ，建立一个新的低分子肽电泳系统，并 将其广泛应用于小分子肽的分离纯化和检测中。 通过分析我们选择了合适的表面活性剂x ，并对影响电泳分离效果的各因素 ( 如表面活性剂x 的浓度、分离胶的浓度、缓冲系统p h 值、电极缓冲液离子强度、 还原剂的选择、样品处理温度、样品缓冲液p i - i 值、上样量及显色方法) 进行实 验探讨，从而建立了新的小分子多肽电泳体系x 尿素- p a g e 体系。对该体系的相 关工作( 如电泳后转膜、蛋白复性、回收目的带做质谱分析及代替s d s p a g e 用 作双向电泳第二向电泳等) 进行研究，进一步完善了该体系。 实验证实x - 尿素p a g e 体系，可有效分离1 1 0 0k d a 的肽及蛋白。我们应用 该体系对各种标准样品及实验室中多种发酵液的粗样进行分析，发现该系统具有 很高的分辨率，并且在大肠杆菌中分离到一个低分子肽( 分子量约2 k d a ) 。本系 统操作简单、分辨率高、成本较低，具有很广阔的应用阿景。 1 8 2 1 实验材料 2 1 1 样品 低分子肽标准分子量2 5 1 2 1 6 9 4 9d a ( p h a r m a c i al k b ) ，中分子量蛋白标准分子量 1 4 , 4 0 0 - 6 6 , 0 0 0 d a ( w a s t o n ) ，低分子量蛋白标准( 1 0 6 0 - 2 6 , 6 0 0 d a ) 、牛血清白蛋白 ( 6 6 ，0 0 0d a ) 、细胞色素c ( 1 2 ，3 0 0d a ) 、牛胰岛素( 5 7 8 0d a ) 均为s i g m a 公司产品。 2 1 2 试剂 实验中所用试剂均为分析纯。 ( 1 ) 丙烯酰胺贮液【s 3 l ( a ) 丙烯酰胺贮液( t = 3 0 ，c = 3 ) 称取2 9 1g 丙烯酰胺和0 9g 甲叉双丙烯酰胺，用双蒸水溶解，定容至1 0 0m l ， 过滤备用。 ( b ) 丙烯酰胺贮液( 1 习o ，c = 6 ) 称取2 8 2g 丙烯酰胺和1 8g 甲叉双丙烯酰胺，用双蒸水溶解，定容至1 0 0m l ， 过滤备用。 1 9 山东大学硕士学位论文 ( 2 ) 浓缩胶缓冲液( 1m o l l i r i s h c i ，p h6 8 ) 6 0 6 9 t r i s 溶解于3 5 m i 双蒸水中，用浓盐酸调节p h 至6 8 ，再用双蒸水定容至 5 0 m l 。 ( 3 ) 分离胶缓冲液( 1 5m o l l t r i s - h c l ，p h8 8 ) 1 8 1 6g i r i s 溶解于7 5i i l l 双蒸水中，用浓盐酸调节p h 至8 8 ，再用双蒸水定容 至1 0 0r a l 。 ( 4 ) 分离胶缓冲液( 1 5m o f l i r i s h c i ，p h9 5 ) 1 8 1 6g i r i s 溶解于8 0 m l 双蒸水中，用浓盐酸调节p h 至9 5 ，再用双蒸水定容 至1 0 0m l 。 ( 5 ) 1 0 s d s ( 6 ) 1 0 过硫酸铵：使用前新鲜配制。 ( 7 ) t e m e d ( n ，n ，n ，n 四甲基乙二胺1 ( 8 ) 尿素 ( 9 ) 电极缓冲液( 1 ) 0 0 2 5m o i lt r i s ，o 1 9 2m o f l 甘氨酸，0 1 s d s ，p h8 3 ( 1 0 ) 电极缓冲液( 2 ) 0 0 5 0m o f lt r i s ，0 3 8 4m o l l 甘氨酸，o 1 s d s ，p h8 3 ( 1 1 ) 电极缓冲液( 高p h ) o 4 6m o l lt r i s ，0 0 4 7m o l l 甘氨酸，o 1 s d s ，p h9 5 ( 1 2 ) t r i s t r i c i n e 电极缓冲液 ( a ) 阳极缓冲液( 1 ) ：1 2 1 1 4g i r i s 溶于4 0 0 m l 双蒸水，用1 0 m o f l h c ! 调p h 至8 9 ，定容至5 0 0 m l 。 ( b ) 阴极缓冲液( 1 ) ：将6 0 5 7gt r i s ，8 9 6 9t r i c i n e 及o 5 9s d s 溶于4 0 0m l 双 蒸水中，定容至5 0 0 m l 。 ( 1 3 ) 样品缓冲液( p i q6 8 ) 1 6 m l 浓缩胶缓冲液( p h 6 8 ) + 4 m l1 0 s d s + 0 6 9 二硫苏糖醇( d 1 ) + 2 5 i l l l 8 7 甘油+ o 1m g 溴酚蓝，用双蒸水稀释到2 0m 1 ( 1 4 ) 样品缓冲液( p h8 8 ) 1 6 m 1 分离胶缓冲液( p h8 8 ) + 4 r o l l 0 s d s + 0 6 9 d t t + 2 5 m l8 7 甘油+ 2 0 2 2 1 分离胶浓度( t ) 对分离效果的影响 ( 1 ) 制胶：按表2 一l 数据分别配制不同浓度的分离胶及浓缩胶。在模具中灌注 分离胶后，小心的在分离胶的表面加一层水，封住胶面，促使胶聚合并使凝胶表 面平直。待分离胶聚合形成界面后( 约4 0 分钟1 小时) ，吸掉水，注入浓缩胶， 插入梳子。 表2 1s d s 电泳各凝胶浓度配方 注：1 该制胶模具所制胶为7 0 m m * 8 0 m m * l m m 2 在加过硫酸铵和t e m e d 以前抽气 ( 2 ) 样品的处理：样品与样品缓冲液( p h 6 8 ) 混合均匀，煮沸3 分钟 ( 3 ) 电泳：将电极缓冲液( 1 ) 注入电泳槽中。先恒压6 0 v ，待样品进入分离胶 界面时升电压至1 2 0 v 。电泳时间约1 5 h - 2 h ，胶浓度越高电泳时问越长。 ( 4 ) 固定、染色和脱色：电泳完毕后，将胶置于固定液中固定l h ，然后放置于 染色液中染色过夜，转置脱色液中脱色，并多次更换脱色液，直至背景清晰。 ( 5 ) 及时拍照观察分析。 2 l 山东大学硕士学位论文 2 2 2 分离胶交联度( c ) 对分离效果的影响 ( 1 ) 制胶：配制由分离胶、间隙胶、浓缩胶组成的三段胶。按表2 - 2 数据分 别配制不同交联度的分离胶。间隙胶为1 0 t ，3 c ，浓缩胶为3 t ，3 c 。 表2 - 2s d s 电泳各凝胶交联度配方 ( 2 ) 样品处理、电泳、固定、染色、脱色步骤同2 2 1 。 2 2 3 尿素对分离效果的影响 ( 1 ) 制胶：分别配制含4m o l l 尿素、6m o l l 尿素及8m o l l 尿素的分离胶， 分离胶终浓度为1 5 t ，3 c 。 ( 2 ) 其余步骤同方法2 2 1 。 2 2 4 缓冲系统p h 值对分离效果的影响 ( 1 ) 选用不同的缓冲液系统，浓缩胶缓冲液( p h 6 8 ) 一分离胶缓冲液( p h 8 8 ) ， 浓缩胶缓冲液( p h 6 8 ) 一分离胶缓冲液( p h 9 5 ) ，浓缩胶缓冲液( p h 8 8 ) 一分 离胶缓冲液( p h 9 5 ) ，配制3 t ，3 c 的浓缩胶及1 5 t ，3 c 的分离胶。 ( 2 ) 样品处理：选择与浓缩胶相同p h 值的样品缓冲液处理样品。煮沸3 分钟。 ( 3 ) 电泳：根据分离胶缓冲液的p h 值选择电极缓冲液。制胶所用分离胶缓冲 液为p h 8 8 时，使用电极缓冲液( 1x ，p h 8 3 ) ；制胶所用分离胶缓冲液为p h 9 5 时，使用电极缓冲液( 高p h ，p h 9 5 ) 。电泳条件为：恒压，浓缩胶6 0 v ，分离胶 1 2 0 v 。三种体系所用电泳时间分别为2 h 、1 7 l l 、1 2 h 。 2 2 5 电极缓冲液离子强度对分离效果的影响 配制3 0 0 1 ，3 c 的浓缩胶及1 5 t ，3 c 的分离胶。常规s d s 电泳使用电 p h 8 3 ) 。电泳。 的影响 及1 5 0 o i 、6 c 的分离胶。 分离胶是凝胶电泳系统中的核心部分，起分子筛和载体的作用。分离胶的浓 度直接影响到样品的分离效果。电泳结果显示：1 2 、1 5 的分离胶可对分子量 1 0 1 0 0 k d a 之问的蛋白进行分离，但是对1 0 k d a 以下的小分子多肽无分离效果。 从图2 - 1 实验结果来看，在低分子量蛋白标准出现四条带( 分子量分别为2 6 6 0 0 、 1 7 0 0 0 、1 4 2 0 0 、1 0 7 0 0