（环境科学专业论文）食用菌渣堆肥过程中氮素转化规律的研究.pdf

a b s t r a c t w i t ht h ei n c r e a s i n gr e q u i r e m e n to fe d i b l em u s h r o o m s ，t h ea m o u n to fs p e m m u s h o md r e gh a sas i g n i f i c a n tr i s e am a s so fs p e n tm u s h r o o m d r e gl i t t e r e dc o u l d n o to n i vc a u s cs e r i o u se n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o n , b u ta l s ol e a dt oa w a s t eo f r e s o u r c e s a e r o b i cc o m p o s t i n gi sa ni m p o r t a n tw a y t ot r a n s f o r ms p e n tm u s h r o o md r c gt oh i g n q u a l i t yo r g a n i cf e r t i l i z e r t h i sp a p e rf o c u s e d o na e r o b i cc o m p o s t i n gu s i n gd l n e r c m r a t b so fe d b l ef u n g id r e gt oc o wd u n ga n di t sn i t r o g e nt r a n s f o r m i n gb y 鹏a s u r l n g t h ec o m c n t so fv a r i o u sn i t r o g e n f o r m , t h en u m b e ro fn i t r o g e nt r a n s f o r m a t l o n m i c r o b e sa n dt h ea c t i v i t yo fs o m ee n z y m e s t h i sp a p e ra l s oi n v e s t i g a t e dt h en i t r o g e n p r o t e c t i o no fc o n 驴o s t n gb ya d d i n gm a t u r e dc o m p o s t a n dm i x e dm i c r o b i a li n c o c u l a n t t h em a hc o n c l u s i o n sa a sf o l l o w s ： 1 t h er a t 0o fm u s h r o o md r e gt oc o wd u n g ( b y w ei g h t ) i n3c o m p o s t 仃a t 鹏吣 w e 陀2 ：1 1 ：la n d12 ，r e s p e c t i v e l y a t , o t h e r2c o m p o s t t r e a t m e n t sw i t h2 ：lo t m u s h r o o md r e 酢o wd u n gr a t i ow e r ea d d e dw i t hm a t u r e dc o m p o s ta n dc o m p o s n e c e l l u i o s e d e g r a d i n gm i c r o b e ，r e s p e c t i v e l y t h ed u r a t i o no ft h e r m o p h i l i cp h a s e ( 5 5 c ) w e r e6d a y si nt h et r e a t m e n t o fm u s h r o o md 他酢o wd u n gr a t i o2 ：1 ，8d a y si n m e 饥a t m e mo f1 ：la n d10d a y si nt h et r e a t m e n to f1 ：2 t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e a p p r o p r i a t ea m o u n to fc a t t l ed u n gm i x e dw a s b e n e f i tt ot e m p e r a t t a er l s m go ts p e n t m u s o md r e gc o m p o s t a tt h es a m et i m e ，t h eh i g ht e m p e r a t m e p e r i o dw 弱 p r o l o n 窖e d t o8d a y si nt h et r e a t m e n t s w i t hm a t u r e dc o m p o s ta n dc o m p o s n e c e l l u l o s e d e g 训i n gm i c r o b e t h ep ho fa l l 5t r e a t m e n t sa l s o f i tt ot h em t 眦d c o 删) o s ts t a n d a r d s t h er e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tt h e5 t r e a m e n t sh a db e e nc o 呷。咖d s u c c e s s f u l l y 2 w i t ht h ep r o c e s so fc o m p o s t i n g , t h ea m o u n to fn h 4 。n o fa l l 骶a t 鹏n 协 m c 陀a s e dr l r s t l ya n dt h e nd e c r e a s e d ，w h i l et h et r e n do f n o s - nc o n t e n t w a so p p o s 舵 t h e 腿i nf o r mo fn i t r o g e nw a so r g a n i cn i t r o g e n , w h i c hh a das i m i l a rt r e n d a st o t a i n 薛r la tt h ee n do fc o m p o s t i n g ，t o t a ln i t r o g e nc o n t e n t i nt h e 仃e a t m e m sw i t n a d d i t i v ei n e 代a s e dc o m p a r e dt ot h a ti nt h et r e a t m e n tw i t h o u t a d d i t i v e i ti m p l i e dt h a t l i a b s t r a c t t h em a t u r e dc o m p o s ta n dc o m p o s i t ec e l l u l o s e - d e g r a d i n gm i c r o b ea d d e dc o u l dr e d u c e n i t r o g e nl o s si nm u s h r o o md r e gc o m p o s t , s , 3 a m m o n i f i e rw a sd o m i n a n ti nn i t r o g e nt m m f o r r m t i o nm i c r o b e si nt h ec o m p o s t i nt h e3t r e a t m e n t s ，t h en u m b e ro fa r n n x ) n i f i e r si n c r e a s e d g r e a t l yf i r s t l ya n dt h e n d e cl i n e dg r a d u a l l y h o w e v e r , t h ea m o u n to f n i t r i f y i n gb a c t e r i aa n dn i t r i t eb a c t e r i a i n c r e a s e di n c o o l i n gs t a g ea n di nr m t u r a t i o ns t a g e t h en u m b e ro fd e n i t r i f y i n g b a c t e r i aa l s oi n c r e a s e di nt h es a m es t a g eo f c o m p o s t i n g t h en u m b e ro f a z o t o b a c t e r w a sl a x ) r et h a nt h ea m o u n to fn i t r i f y i n gb a c t e r i aa n dd e n i t r i f y i n gb a c t e r i ad u r i n g c o m p o s t i n g a tt h ee n do fc o m p o s t i n g ，t h en u m b e ro fa z o t o b a c t e rw a ssl i 曲t l yl e s s t h a nt h a ta tt h eb e g i n n i n go fc o m p o s t i n g i na d d i t i o n , t h en u m b e rc o m p a r i s i o no f v a r i o u sk i n d so fm i c r o b ei nc o m p o s t i n gw a sb a c t e r i a a c t i n o m y c e t e s f u n g i t h e a c t i v i t yo fc e l l u l o s ee n z y m ei n3c o m p o s t sd e c l i n e di nt h e r m o p h i l i cp h a s ea n d s u b s e q u e n t l yi n c r e a s e di nc o o l i n gp h a s e t h ea c t i v i t yo fc e l l u l o s ee n z y m ei nt h e t r e a t m e n ta d d e dc o m p o s i t ec e l l u l o s e - d e g r a d i n gm i c r o b ew a sm a x i m u mo n21t hd a y i ts u g g e s t e dt h a tc el l u l os e - d e g r a d i n gm i c r o b ea d d e ds t a r t e dt opl a ya bi nt h e m a t u r e ds t a g eo fc o m p o s t t h ee n z y m ea c t i v i t i e so fp m t e a s ea n di j r c a s e d r o p e d r a p i d l yi nt h e r m o p h i l i cp h a s ea n dw e r es t e a d y 幻c o o l i n gp h a s ea n dhm a t u r e dp h a s e k e yw o r d s ：s p e n tm u s h r o o md r e g ；c o m p o s t i n g ；m i x e d i n o c u l a n t ；n i 臼o g e n u a n s f o r r m t i o n ；e n z y m ga c t i v i t y i i i 文献综述 1 文献综述 伴随着我国经济的快速发展、人口的不断增加以及人民生活水平的不断提 高，各种固体废弃物的数量也在不断地增加。固体废弃物，如生活垃圾、农业秸 秆、畜禽粪便、食品加工业副产品以及污泥等，如果随意的丢弃不仅污染大气、 水体和土壤，也影响市容。目前，固体废弃物的处理方法主要有填埋、焚烧和堆 肥处理等。利用堆肥处理技术不仅有效地减少了环境污染，也能使固体废弃物变 废为宝，得到合理的利用。堆肥技术分为好氧堆肥和厌氧堆肥。其中以好氧堆肥 技术运用的最为广泛。 好氧堆肥过程是指在有氧气存在的条件下，堆肥微生物降解有机物料为简单 有机物，生成易被植物吸收的氮、磷、钾等化合物，并合成土壤清陛物贡一腐 殖质的过程。此过程实现了固体废弃物的无害化、资源化和减量化。然而，高温 好氧堆肥过程存在着大量的氮素损失，这不仅造成大气污染，而且也大大降低了 有机肥的肥效，影响了有机肥的推广和应用。在高温好氧堆肥过程中，减少氮素 的损失是关键，而研究堆肥过程中氮素的形态转化则是控制氮素损失的基础【l 】。 1 1 堆肥过程中氮素的转化规律 堆肥过程中的主要氮素形态有铵态氮、硝态氮和有机氮。其中，有机氮是堆 肥中氮素的主要组成形态，它在堆肥过程中与总氮的变化趋势很相似。有机氮的 主要组成成分是：氨态氮、氨基酸态氮、氨基糖态氮、酸解未知态氮和非酸解态 氮【2 】o 堆肥中氮素形态之间的转化是非常复杂，与不同阶段的微生物群落性质有 关，主要包括两个因素：氮素的固定和氮素的释放【l 】。堆肥中氮素的转化可以从 一次发酵和二次发酵两个时期来进行分析： 1 1 1 一次发酵 在一次发酵初期堆肥微生物的作用下，较容易降解的有机物开始分解，含氮 有机物降解释放氨气，生成的氨以n h 4 + n 的形式存在于堆肥中，此阶段铵态氮 含量不断的增加，会是堆肥环境的p h 上升。进入高温阶段时，温度升高和高p h 使得n h 3 在环境中的溶解度下降，导致氨气大量的挥发。从堆肥开始时期，铵 态氮的含量不断的增加，在有机物降解最剧烈时达到峰值，之后其含量开始不断 减少。 文献综述 此阶段堆肥中氮素损失最为严重，主要是由于堆肥环境中温度较高，氮素以 氨气的形式挥发。另外，少量易挥发含氮有机物的挥发也是导致氮素损失的原因 之一。 1 1 2 二次发酵 进入二次发酵阶段，堆肥环境中温度不断地下降，至到与环境温度接近。由 于硝化菌多为好氧嗜温菌，一般认为环境温度高于4 0 时，硝化作用受到严重 的抑制【l 】。而在堆肥二次发酵阶段，环境温度降低，条件适宜，堆肥中的硝化菌 数量增加，硝化作用加强，堆肥中铵态氮不断地被氧化为硝态氮。铵态氮含量不 断地减少，而硝态氮含量不断的增加。此阶段中氨气的挥发非常微弱，氮素损失 较少。 因此，堆肥过程中氮素的损失主要发生在一次发酵阶段，减少此阶段氨气的 挥发是堆肥中实施保氮措施的关键。 1 2 堆肥过程中影响氮素损失的因素 造成堆肥中氮素损失的因素有很多，如高p h 、高含水量、c 埘的下降、通风 速率的增加、n h 3 浓度的增加和温度上升等。其中高含水量、高p h 和温度的不 断上升是堆肥化的必然过程，因此堆肥中氮素的损失是不可避免的，只能通过适 当的方法和手段来减少其损失。 1 2 1p h 氨气在中性环境中以n h 4 + 的形式存在，而在碱性环境中是以未电离的n h 3 形式存在【3 1 。因此，随着p h 上升，氨气的挥发量则会不断地增加。而在堆肥过 程中，含氮有机物不断地降解释放氨气，导致堆肥中p h 也不断地升高。高p h 和高温度的共同作用使得n h 3 在环境中几乎是不溶的，从而导致堆肥中n h 3 的 大量损失。 堆肥环境中的微生物最适的p h 是微酸性和中性。有研究人员建议【4 1 ，堆肥 初始的p h 应在6 6 7 2 范围内。在堆肥进程中有机酸的形成也会使堆肥p h 向微 酸l 生偏移。一般认为，堆肥环境p h 在5 - 6 之间保氮效果最好，而在碱性环境最 不利于保氮。 1 2 2c n 微生物的新陈代谢和细胞的合成需要大量的营养元素和微量元素，如碳、氮、 2 文献综述 磷、钾、锰、钙和镁等。碳在微生物代谢中只有1 3 用于了细胞的合成，而其它 则被转化成c 0 2 消耗掉【5 】。而氮则主要是用于细胞质的合成。在堆肥进程中，有 机物c 悄对堆肥中微生物分解速率有着重要的影响，微生物平均每合成l 份氮 需要利用4 份碳作为能源和构成组织碳架【6 】。细菌在生长繁殖中所需要的c k n 是 2 0 2 5 ，真菌的c 悄约为1 0 。堆肥过程中最佳的c l n 为2 5 3 5 6 。若堆肥中c 埘 超过4 0 ，微生物生长受到了限制，有机物降解速率减慢，堆肥化进程延长。但 是如果堆肥中c k n 小于2 0 ，氮素相对过剩，氮素被转变为铵态氮而挥发，导致 了大量的氮素损失。 堆肥中c k n 的最佳范围为2 5 3 5 ，但是也要考虑氮素的可利用性。堆肥中不 同的堆肥物料，其可降解性不同，氮素的可利用性也不同。可利用氮素含量越高， 堆肥过程中氨气的挥发也会越严重。 1 2 3 通风量 有研究表明：减少堆肥物料中空气的流动，特别是在高温阶段空气的流动， 能降低堆肥中氨气的挥发【7 1 。通气方式和通气速度也影响了氨气的挥发【8 】。翻堆、 强制通风以及鼓风都能加快堆肥中氨气的挥发速度，但是适当的通风是好氧堆肥 的关键，否则会造成堆体局部的厌氧，加剧反硝化作用，使氮素以n 2 形式挥发。 合适的通气也能够适量带走堆肥高温期的热量，防止大量的热量积累，温度上升 而抑制堆肥中微生物的活动，一般认为在堆肥温度超过7 0 时要进行强制通风 【1 1 。在保证堆体适宜氧气含量和温度的条件下，通过适当的减少对堆体的翻动来 减少氨气挥发。一般认为相对于连续式通风，间歇式通风能有效地减少氨气的挥 发量。 适宜的含水量也是保证堆肥中微生物活动的关键因素之一，一般认为堆肥最 适的含水量是5 0 - 6 0 。含水量过低，不利用堆肥微生物的生长；含水量过高， 会造成局部的厌氧和增加反硝化作用。另外，堆制的方式不同，氮素损失也不同， 研究表明【9 】，开放式堆肥会造成氮素大量的损失。 1 3 堆肥过程中的保氮措施 国内外研究学者对堆肥中氮素的损失控制进行了大量的研究，可以总结为一 下两方面：选择适宜的堆肥工艺和使用合理的堆肥添加剂。 1 3 1 适宜的堆肥工艺 适宜的堆肥工艺条件主要有合适的c n 、p h 值、温度、通气量和堆肥方式 文献综述 等。堆肥过程中最适的c n 是2 5 3 5 ，但是还需要考虑堆肥中氮素和碳素的可以 用性，不同原料的氮素和碳素可利用率不同。例如畜禽粪便c n 较低，堆肥中 的氮素多能够被微生物快速利用，需要添加一些c n 较高且碳素可利用率高的 原料来调节。堆肥p h 值在5 - 6 时，保氮效果最好。保证合适的通风量既能够防 止堆肥中的局部厌氧，也能防止过高的堆温抑制微生物生长。堆肥温度应控制在 合适的范围，过低则堆肥进程缓慢，甚至达不到无害化标准；过高则抑制堆肥中 微生物的活动，并造成堆肥环境局部厌氧，增加反硝化作用。 s h i w 等【lo 】研究了翻堆和加湿对堆肥中氮肥的影响，结果表明：腐熟度足够 长的条件下，翻堆和加湿有利于提高氮肥的品质。m c g i l l 等【l l 】表明在堆肥的后阶 段，硝态氮含量上升后，强制通风和降低水分能防止反硝化作用，另外渗滤液的 循环利用也能减少氮素的损失。张相峰等【1 2 】研究表明，一次发酵中，采用温度 反馈通气量来控制的好氧堆肥，能实现有机底物的快速稳定，但是也存在大量的 铵态氮积累引起了氨挥发和局部厌氧造成的反硝化作用，导致了大量的氮损失， 减低了氮肥利用价值。他们认为有效地控制通风和温度能减少氮素的损失和加快 物料降解，通过适量的添加微生物可利用的碳来提高堆肥物料的c n ，以及添加 酸性物质降低p h ，将可能会减少氮素的损失。 1 3 2 使用堆肥添加剂 堆肥添加剂主要是为了加快堆肥化进程或是提高堆肥产品的质量【1 2 】，主要包 括添加微生物菌剂、有机物质和无机物质。在堆肥保氮措施中主要添加的物质有 3 大类g 物理添加剂、化学添加剂和微生物添加剂。 1 3 2 1 物理添加剂 堆肥的物理添加剂主要沸石、活性碳、硅胶，泥炭、草炭、锯末，还有一些 天然农业废弃物如稻草等。这些物质有一定的吸附性，能够吸附堆肥中氨气，防 止氨挥发。而泥炭、锯末和草炭等有机物料的c n 高且吸附性好，能减少铵态 氮在堆体中的积累，并吸附较多的铵态氮，从而减少氨气的挥发。 张相峰等【1 3 】提出添加泥炭、锯末等物质能够提高堆肥物料的c n ，且能够吸 附铵态氮，减少氮素的损失。黄懿梅等【1 4 】研究表明添加草炭和过磷酸钙能够使 堆肥高温期延长5 d ，并使堆制过程中氮素损失率下降了6 5 1 ，保氮效果明显。 钱承梁和鲁如坤【1 5 】研究表明，红壤和稻草分别是马粪、猪粪和羊粪堆肥中最佳 的添加物，可以有效抑制氮素的排放。k i r c h m a n n 掣1 6 1 在鸡粪堆肥中添加稻草进 行好氧和厌氧堆肥，发现添加稻草能降低好氧堆肥中氨气的挥发，且厌氧堆肥中 氮素损失也最少。草炭作为一种半腐烂的植物残体，富含有机质和氮素，具有很 4 文献综述 强的氨气吸附性能。钟顺清等【r 7 】研究了两种草炭对尿素在土壤中转化后的铵态 氮和碱解动态变化的影响，结果表明两种草炭不仅抑制了尿素硝化产生硝态氮， 而且抑制了氨的挥发，使较长时间内土壤中铵态氮含量保持较高水平，草炭的加 入能增加土壤中微生物活性，减少肥料的氮素损失。 一些吸附性能较好的无机物也能达到较好的氨气吸附性能，如沸石、蛭石、 活性碳和硅胶等。如沸石具有高效的吸附性能，在环境治理上有重要的作用，且 成本低廉、制备简单、无二次污染，常被用于贫瘠土壤的保肥剂和土壤改良剂。 王岩等【1 8 】人在牛粪堆肥中添加蛭石、锯末、稻壳和稻草的进行保氮实验研究发 现，添加锯末的处理在发酵5 0 4 h 后的氮素累计挥发量最少。草炭是半腐烂的植 物残体，具有较强的吸氨性，也是一种较理想的保氮物质。马良等【1 9 】研究表明， 改良的活性炭能达到较好的吸收空气中氨的效果，由于普通的活性炭吸附完全是 物理吸附，对吸附气体没有选择性，但是经改良的活性炭对氨气的吸附净化能力 较未改良的活性炭好。 1 3 2 2 化学添加剂 目前，国内外研究的化学添加剂主要有：氯化镁、氯化钙、氯化铁、明矾、 磷酸、过磷酸钙等。化学物质保氮的主要原理是氧化剂的氧化和酸碱中和反应， 目前利用酸碱中和反应原理的研究为多【8 】。 w i t t e r 等【2 0 l 研究发现，在鸡粪好氧堆肥中通过添加c a 盐和m g 盐能显著减 少氨气挥发，其中以m g c b 的效果最好，c a c b 次之，m 庐0 4 的保氮效果较差。 m 0 0 r e 等【2 l 】研究发现，添加明矾的堆肥相比于对照，氮素含量增加了2 倍。d a r e e s b o u c h e r 等【2 2 】研究发现在污泥和松树皮锯末堆肥中添加f e c 6 ，不仅能减少氨损 失又增加了有机氮的矿化。j e o n y 等【2 3 】在堆肥中添加m g 和p 盐使堆肥中氨以磷 酸铵镁的形式沉淀下来，这种方法大大降低了堆肥中氨气的损失。叶素萍【2 4 】在 畜禽粪便堆肥中添加过磷酸钙、沸石、m n s 0 4 、c u s 0 4 ，这四种物质对堆肥氮素 损失都有一定的抑制作用，其中以添加占堆肥总重2 m n s 0 4 的处理保氮效果最 好。也有研究在堆肥中加入磷酸和镁源来生成磷酸铵镁沉淀，从而减少了氮素的 损失。 钱承梁等【1 5 】研究标明牛、猪、马、鸡、兔、羊及人粪中添加1 0 的过磷酸钙 后，都能防止氨挥发，多数粪肥的氨挥发曲线趋于平缓，人粪中添加质量比5 的0 5 m o l l 硫酸能作为吸收氨的较佳添加物。钟理【2 5 】利用固态镁粉和磷酸混合 制成了一种乳状液( 絮凝剂) 来去除废水中的氨，达到了较好的效果，生成的沉 淀产物磷酸铵镁( 鸟粪石) 可以作为一种复合肥。将鸟粪石结晶原理应用到好氧 堆肥过程中，通过添加镁源和磷酸使堆肥中氨以磷酸铵镁结晶的形式沉淀下来， 5 文献综述 达到了较好的保氮效果瞄2 7 。任丽梅等【2 8 】在模拟堆肥试验中添加氢氧化镁、磷酸 和水的混合物，研究发现这几种添加剂减少了堆肥中氮素的损失，可以作为氮素 损失原位固定剂。 利用化学添加剂作为保氮材料的优点是添加量少，保氮效果好。但是成本高， 副作用大，其中添加的化学剂中含有的重金属及其它有害物质被施入土壤中，会 对农作物造成危害，并造成环境污染。因此，如果选用化学物质作为保氮剂时， 要考虑其毒性，并尽量控制用量，防止对环境造成不良的影响。 1 3 2 3 微生物添加剂 堆肥过程中添加外源微生物能调控氮素和碳素的代谢，从而减少氮养分的损 失 2 3j 。堆肥主要的微生物添加剂有纤维素降解菌、固氮菌、溶磷菌以及一些复 合微生物菌剂等。复合微生物主要包括酵素菌、e m 菌、f m 菌和v t 菌等。 t i w a r i f 2 9 , 3 0 】研究了不同底物中添加纤维素降解菌和固氮菌及溶磷菌对总氮含 量的影响，与对照相比，添加纤维素降解菌使堆肥总氮提高了8 3 0 o - 5 7 1 ，添 加固氮菌及溶磷菌使堆肥中总氮提高了1 0 3 0 0 - 5 9 5 。石春芝等【3 l 】研究了垃圾堆 肥中接种混合自生固氮菌和纤维素降解菌对堆肥含氮量的影响，试验证明固氮菌 能提高堆肥的含氮量，纤维素降解菌能协同固氮菌的生长。 赵京音等【3 2 】利用有效微生物菌群e m 菌对鸡粪堆肥腐熟度进行了研究，发现 常温2 0 天可达到无害化标准，氮素损失也相对减少了3 0 ，有机质和氮素的保 留效率显著提高，这样既提高了堆肥的农用价值，又改善了环境质量。e m 菌能 控制臭味产生，又能减少铵态氮的积累，促进了铵态氮向硝态氮和有机氮转化， 又促进碳类物质分解向芳香有机小分子化合物转化。黄懿梅等【3 3 】研究了引入外 源微生物e m 菌和f m 菌的鸡粪和锯末的自动化高温堆肥中，结果表明两种菌剂 的保氮效果都较好，其中f m 菌在有机碳分解、有机氮的合成及缩短堆肥周期方 面效果较好。胡菊【3 4 1 在鸡粪和牛粪堆肥中添加v t 菌剂，研究发现四个处理中总 氮含量都有所增加，并能促进有机氮的积累。但是目前微生物菌剂在堆肥上的应 用还在争议中，生产应用上较少。 其它保氮措施，如在堆肥外面铺一层堆肥和泥炭，能帮助吸附氮素，防止氮 素的损失【3 5 1 。稳定且较低温度的外界环境能够减少氨转化为流动态的氮素【l 】i 。近 年来国内外也筛选出了1 0 种无机脲酶抑制剂，如邻苯二酚、对苯醌和硫酸铜等， 他们能抑制堆肥中尿素在脲酶作用下转化为铵态氮，防止氮素的损失【36 1 。h o n g 等p 利用生物过滤器中介质对氨气释放的影响，来降低堆肥过程中氨气的挥发， 而且介质对氨的释放影响比较大。 6 文献综述 1 4 堆肥过程中微生物菌群 高温好氧堆肥是通过调节堆肥条件，使堆肥环境适合微生物的迅速繁殖来降 解有机质，并产生高温杀死堆肥中病源菌和杂草种子，使物料达到稳定化【38 1 。 堆肥原料及调理剂大多是有机废弃物，主要成分是碳水化合物、蛋白质、脂类和 木质素。这些复杂物质可以在堆肥微生物的作用下分解为简单的小分子物质。微 生物降解这些物质主要是通过催化分解底物的酶作用的结果，底物越复杂所需的 酶系统越多。好氧堆肥中，有机物的降解是在细菌、放线菌和真菌等多种微生物 的共同作用下完成的。 堆肥中氮素的转化主要有四种，氨化作用、硝化作用、反硝化作用和固氮作 用。在堆肥中，多种功能微生物都参与了堆肥中氮素的转化，例如氨化细菌、硝 化细菌、反硝化细菌、亚硝化细菌、固氮菌、纤维素降解菌和蛋白质水解菌等【3 3 】。 1 4 1 细菌 好氧堆肥过程中存在的细菌数量最多，由于细菌有较大的比表面积，使得堆 肥中可溶性有机物能快速的被吸收到细胞内，实现快速的分解。不同的堆肥环境 中分离出的细菌在分类学上有多样性，主要包括假单胞菌属( p s e u d o m o n a s ) 、克 雷伯氏菌属( k l e b s i e l l a ) 以及芽孢杆菌属( b a c i l l u s ) 的细菌等【3 8 】。 a b d e n n a c e u r 等【3 9 】研究发现，在堆肥初始阶段，嗜温细菌是堆肥中最主要的 微生物，每g 干物料中细菌数量可以达到( 0 8 5 5 8 ) 1 0 9 之间；随着堆肥温度 的上升，嗜温细菌减少，嗜热细菌的数量达到最大值；在降温阶段，堆肥中的嗜 温细菌数量又开始回升，嗜热细菌减少。在堆肥高温期，一些能生成较厚孢子壁 的细菌能抵抗高温，例如芽孢杆菌属的一些种，就会成为高温阶段的优势菌种。 b e f f a 等【4 0 1 在堆肥高温阶段筛选出了嗜热菌属，这些细菌甚至能够在8 2 垛温中 生存。 1 4 2 放线菌 堆肥中的放线菌变化趋势和细菌相似。放线菌是有多细胞菌丝的细菌，能够 分解纤维素和溶解木质纤维素。其更像是真菌，虽然其分解纤维素和木质纤维素 的能力没有真菌强，但是相比于真菌，放线菌能够忍受较高的温度和p h 。故在 高温阶段，放线菌是分解这些物质的优势菌群。w a k s m a n 等【4 i 】研究表明，堆肥 中优势的嗜热放线菌有诺卡氏菌( n o c a r d i a ) 、链霉菌( s t r e p t o m y c e s ) 、高温放线菌 ( t h e r m o a c t i n o m y c e ) 和单孢子菌( m i c r o m o n o s p o r a ) 等，它们存在于堆肥的高温阶段、 降温阶段和腐熟化阶段。 7 文献综述 1 4 3 真菌 真菌对堆肥物料的稳定和腐熟有重要意义，主要是因为真菌能够利用堆肥物 料中所有的木质纤维素，特别是白腐真菌。由于真菌菌丝比较发达，具有机械穿 插作用，能对堆肥物料起到一定的物理破坏作用，促进生化反应，有利于有机质 的降解。堆肥中优势的种群主要有嗜温性真菌地霉属( g e o t r i c h u m s p ) 和嗜热性 真菌烟曲属( a s p e r g i l l u sf u m i g a t u s ) ，其它如担子菌( b a s i d i o m y c o t i n a ) 、子囊菌 ( a s c o m y c o t i a ) 、橙色嗜热子囊菌( t h e r m o a s c u s a u r a n t i a c u s ) 也具有较强的木质素 分解能力【3 3 1 。有研究表明，堆肥中真菌大部分为嗜温菌，可以在5 3 7 的环境 下生存【3 3 】。随着温度的增加，堆肥中的真菌的数量不断地减少，在堆肥温度达 到5 0 。c 时，大部分真菌都不存在，在温度超过6 0 。c ，真菌几乎全部消失【3 7 1 。当 温度低于4 5 时，真菌的数量又开始回升【4 2 】。食用菌菌渣堆肥中含有大量的食 用真菌，能促进木质纤维素的分解【4 3 1 。 1 4 4 氮素转化功能菌群 氨化作用是指在氨化微生物的作用下含氮有机物被降解为氨的过程。堆肥中 主要的含氮有机物有蛋白质、核酸、尿素、尿酸和几丁质等【4 4 1 ，他们都能够被 微生物降解为氨。如蛋白质先在微生物蛋白酶的作用下水解成缩氨酸片段，如多 肽、寡肽和氨基酸，再在脱氨基作用下产生n h 4 + 或n h 3 。n h 4 + 或n h 3 在水相中 保持化学平衡，在堆肥高温和高p h 条件下，影响了这个化学平衡，使其向n h 3 方向移动，造成了大量的氮素损失。 硝化作用主要包括两个不同阶段，首先是氨在亚硝化细菌的作用下被氧化为 亚硝酸盐，然后亚硝酸盐在硝化细菌的作用下被氧化为硝酸盐。硝化细菌和亚硝 化细菌分别通过氧化氨和亚硝酸获得能量，通过同化c 0 2 来构成细胞物质，故 多为化能自养菌，严格好氧。 反硝化作用是指在厌氧条件下，n 0 3 。被还原为n 0 2 。、n h 4 + 、n o 、n 0 2 、n 2 0 、 n 2 的过程。堆肥中的反硝化菌多为异养型，兼性厌氧细菌，在好氧条件下以0 2 为最终电子受体，在缺氧条件下以n 0 3 为最终电子受体，被还原为气态氮散入 大气中。反硝化作用又称为硝酸还原作用。堆肥环境中如果供氧不足，容易发生 反硝化作用，使硝态氮转化为气态氮挥发，造成氮素的损失，使堆肥产品质量下 降，因此堆肥过程应尽量避免反硝化作用。 固氮菌可分为自生固氮菌和共生固氮菌。自生固氮菌多为好气性中温菌。固 氮菌可以利用空气中的n 2 ，也可利用铵盐和硝酸盐类，一般利用的碳源是糖、 有机酸和醇类。堆肥中的固氮菌在堆肥周期中变化不大【4 6 1 。 8 文献综述 1 5 堆肥中微生物酶研究 堆肥化过程是在堆肥微生物分泌酶的作用下，分解堆肥中复杂的有机物为简 单的易被微生物利用的有机物质和无机物质的过程，又称为矿化过程。有机物质 在分解的同时，还有新的有机物质合成，在酶促作用下进一步将中间产物合成为 稳定的腐殖质。堆肥过程中的一切生物化学过程都是在酶的参与下进行的。堆肥 中的酶可以分为胞内酶和胞外酶，通过简单的培养可以实现分离，胞外酶的数量 占优势【4 7 1 。 1 5 1 纤维素酶 堆肥物料中存在着有大量的纤维素，纤维素是固态废弃物中一种较难降解的 成分。纤维素酶是由一类酶系组成的复合酶，纤维素需要在这一类酶系的协同作 用下才能水解，这类酶有内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和b 葡萄糖苷酶。它们 能使纤维素水解为纤维二糖，进而水解为葡萄糖。自然界中很多细菌、真菌和放 线菌都能降解堆肥中的纤维素。堆肥体系中真菌的数量相比于细菌少，但是在堆 肥中真菌对纤维素的降解有着重要作用，因为真菌具有发达的菌丝，其分泌的胞 外酶联合机械穿插作用能共同降解堆肥中的纤维素和木质素。放线菌分解纤维素 和木质素的能力没有真菌强，但是它能忍受较高的环境温度和p h 。因此，在堆 肥的高温阶段，放线菌是分解纤维素和木质素的优势菌群。 1 5 2 蛋白酶 蛋白酶可水解蛋白质为短肽，短肽再进一步被水解为氨基酸。本世纪初，报 导的微生物蛋白酶的种类已超过9 0 0 种，可以分为酸性蛋白酶、碱性蛋白酶和中 性蛋白酶。关松荫【4 8 】研究了不同有机肥对土壤酶活性的影响，相比于秸秆肥， 以施牲畜粪堆肥的土壤中的蛋白酶和脲酶最高。 1 5 3 脲酶 大部分细菌和真菌中都分泌脲酶。脲酶是一种酰胺酶，专一性比较强，能水 解尿素为氨和二氧化碳。脲酶的活性和微生物的数量、有机质含量、全氮及无机 氮含量成正相关，故脲酶的活性也代表了堆肥的氮素状况。j o n a t h a n 等【4 9 】在堆肥 物料中加入不同量的石灰，研究了其堆肥中酶活性的变化，发现脲酶的活性在堆 肥初期和高温期与投加的石灰量成反比。 9 文献综述 1 6 课题的提出及研究内容 随着人们生活水平的提高，作为健康食品的食用菌生产量也在不断地提高。 随着食用菌生产量的不断增加，食用菌菌渣的生成量也在不断地增加，随之产生 了大量的环境问题。食用菌菌渣是指食用菌培养基栽培过食用菌后丢弃的固体废 弃物。有研究统计2 0 0 6 年我国食用菌菌渣已达到3 6 8 5 万吨【删。食用菌菌渣中 含有大量的食用菌菌丝、木质纤维素降解酶及食用菌代谢产物，如糖类、生物活 性物质等【5 1 5 2 】。但是，如果随意丢弃就会滋生大量的霉菌和害虫，污染环境。 食用菌菌渣如果能得到合理利用既能提高经济效益，又能保护环境、实现资源的 的合理利用。 目前，食用菌菌渣的再利用主要用于再利用栽培食用菌、饲料、生物有机肥、 土壤改良剂、纤维素粗酶和环境修复材料等。高温好氧堆肥作为农业固体废弃物 资源化和无害化的一个有效处理途径，也被越来越多的用在有机固体废弃物的处 理上。堆肥过程就是在堆肥微生物的作用下降解有机质，并产生热量杀死有害的 病原菌和杂草种子，使有机物稳定的过程。目前国内已有一些关于食用菌菌渣堆 肥的报道，陈广银等【5 2 】研究表明在落叶堆肥中添加食用菌菌渣能加快落叶中有 机质的降解，孙建华等【5 3 】利用食用菌菌渣和猪粪堆肥实现了废物资源化利用。 但是将食用菌菌渣和牛粪联合堆肥生产高氮有机肥的研究还未见有报道。 在高温好氧堆肥过程中，有大量的氮素损失使堆肥的品质下降，影响有机肥 的肥效，也影响了堆肥的普及和应用。研究堆肥中氮素转化和损失的规律，对提 出保氮效果研究具有非常重要的意义。本试验选用不同比例的食用菌菌渣和牛粪 为主要原料进行好氧堆肥，并添加腐熟堆肥和外源固态菌剂来做保氮效果研究。 通过测定各堆肥处理中铵态氮、硝态氮、有机氮和总氮含量的变化，来研究氮素 转化和损失规律；通过测定堆肥周期中各种微生物的数量( 细菌、真菌、放线菌、 亚硝化菌、硝化菌、氨化菌、反硝化菌、固氮菌和高温菌) 与各种微生物酶活( 蛋 白酶、纤维素酶和脲酶) ，来考察其对氮素转化规律的影响。 1 0 固体菌剂的制备 2 固体菌剂的制备 堆肥物料中含有大量的纤维素，添加纤维素降解菌能快速地把堆肥中的纤维 素降解为二糖和单糖，酵母菌则能利用生成的单糖和二糖。因此添加纤维素降解 菌和酵母菌能加快堆肥降解速率，缩短堆肥周期。制备固态菌剂能使微生物更快 适应堆肥环境。本节制备了纤维素降解菌和酵母菌的固体菌剂，为堆肥试验做准 备。 2 1 材料 试验用菌：纤维素降解菌x 1 、x 2 、x 3 和x 4 ，酵母菌j l 、j 2 、j 3 和j 4 ，均 为郑州大学化工与能源学院环境与生态研究所筛选和保存菌种。 2 2 试验方法 2 2 1 培养基 纤维素菌种活化用p d a 培养基，培养使用液体产酶培养基。酵母菌活化和 培养均用酵母菌培养基。 p d a 培养基：土豆2 0 0 9 、葡萄糖2 0 9 、水1 0 0 0 m l 。土豆去皮，切成小块， 在锅中加水煮沸半个小时，过滤，在滤液中加入葡萄糖和2 0 9 琼脂粉。自然p h 值，1 2 1 、0 11 v i v a 高压灭菌3 0m 访。 液体产酶培养基：秸秆粉与麸皮质量比4 ：l 混匀，取2g 加入2 5 0m l 三角 瓶，每瓶再加入1 0 0m l m a r i d e i s 营养液【5 4 1 。自然p h 值，于1 2 1 、0 1m p a 下 灭菌3 0r n m 。 m a n d e i s 营养液【4 9 】：( n h 4 ) 2 s 0 41 4g ，k h 2 p 0 42g ，尿素0 3g ，m g s 0 4 7 h 2 0 0 - 3g ，e a c ho 3g ，f e s 0 4 7 h 2 07 5 0n a g ，m n s 0 4 h 2 02 5 0m g ，z n s 0 42 0m g ， c o c l 23 0m g ，水10 0 0m l 。 酵母菌分离培养基：酵母膏5g ，葡萄糖1 0g ，琼脂2 0g ，蒸馏水1 0 0 0 札。 自然p h 值，1 2 1 、0 1m p a 高压灭菌3 0 r a i n 。 2 2 2 固态菌剂的制备方法 ( 1 ) 用无菌水洗涤保存菌种的斜面，得到菌悬液； ( 2 ) 菌悬液在无菌环境中接入种子瓶中，3 0 。c ，1 5 0 r r a i n 培养一定时间得到种 1 1 固体菌剂的制备 子液。其中，酵母菌培养2 4 h ，木质素和纤维素降解菌培养4 8 h ； ( 3 ) 取1 0 m l 的种子液接种到发酵瓶中扩大培养4 8 h 得到发酵菌悬液； ( 4 ) 将1 0 0 m l 发酵液与1 0 0 9 干燥的灭菌麸皮混合在5 0 0 m l 的三角瓶中培养 4 8 h 后，放入无菌室中自然阴干，得到固体菌剂，按实验的需求配比得到 复合微生物菌种。 2 2 3 酶活测定 纤维素酶主要包括c x 酶，c l 酶和c b 酶三种【5 5 】，滤纸是中等聚合度的纤维素 材料，故用f p a 酶活力( 滤纸酶活) 来代表总的纤维素酶活力【5 6 1 。本实验测定 了所选菌种的c x 酶、f p a 酶和半纤维素酶。采用d n s 还原糖法测定各纤维素 酶活性。 各活化的纤维素菌种接种在纤维素液体培养基中，3 0 ，1 5 0 r m i n 下培养2 天后，过滤得到酶液，测定酶液中纤维素酶和半纤维素酶活力。 ( 1 ) 葡萄糖标准曲线的绘制 取7 支1 5 m l 的刻度试管，分别加入lg l 葡萄糖标准溶液o 、0 2 、0 4 、0 6 、 0 8 ，1 0 、1 2m l ，各试管补加蒸馏水至2m l 摇匀，加入2 m l d n s 显色剂，置 于沸水浴中显色1 0m i n ，取出冷却后定容到1 5m l 。在5 5 0n m 波长处测定其吸 光度。其为测定f p a 和c x 酶活的标准曲线。 ( 2 ) 木糖标准曲线的绘制 取7 支1 5m l 的刻度试管，分别加入l l 木糖标准溶液0 、0 2 、0 4 、0 6 、 o 8 、i 0 、1 2m l ，各试管补加蒸馏水至2m l 摇匀，加入2m l d n s 显色剂，置 于沸水中显色1 0m i n ，取出冷却后定容到1 5i n l 。在5 5 0n l t i 波长处测定其吸光 度。其为测定半纤维素酶活的标准曲线。 ( 3 ) 酶活性测定 5 7 1 f p a 酶活力测定：取两支1 5m l 刻度的试管，各加o 2m l 酶液，再加1 8m l 的p h4 8 醋酸缓冲液，两管内同时加入l x 6c m 滤纸条，两管同时置于5 0 c 恒温 水浴6 0m i n ，取出后空白管