（材料学专业论文）纳米材料增效固定化酶电极的研究与应用.pdf

摘要 葡萄糖生物传感器具有选择性高、简便、快速的特点，是检测葡稍糖浓度最 零掰豹方法。为撬褰簧惑嚣瓣经戆，选择采箱豢懿藿定绽方法帮固定纯榜睾季，戳 提简固定化酶的艇应活性和稳定性，以及利用导电聚合物或导电金属纳米粒子制 备徽接电子传递的第三代电流型葡萄糖生物传感器，以提高其响应电流大小、响 应遂度、灵敏发鞫选择性，怒一令多学秘交叉翦澄课题。 以聚乙烯酩和葡萄糖氧化酶共同静电纺丝，利用静嘏纺丝超细纤维具有高的 比液面积和多孔疏松结构的优势固定化葡萄糖氧化酶，以提高酶电极的性能，构 筑蜜培型生物传感器。膜的紫外一可见光谱、红外谱图和扫描电镜分橱均表明酶 基缀藏功固定农静龟绩丝形袋瓣超绥纡缭貘中。宅纯学测试表藐蠢定纯戆酶镪然 保持活性。采用静电纺丝法固定葡萄糖氧化酶比利用浇铸膜法所得到的酶修饰电 极对葡萄糖有更高的响应电i j f c 和灵敏度，熙短的响应时间，更宽的响废范围。通 过程静电纺丝溶液中麓入续凑衾进一步提寒了酶貘夔邀予绩浚能力，劳使蘩莓糖 氧化酶电极工作电位降低，脊利于避免尿酸、抗坏血酸替物质的干扰，提高电投 的选择性。 以脉冲电流彀化学聚合法褥到超细纤维状导电聚合物聚苯胺，并农负向脉冲 期润将溶液中静a 矿还原褥瓣均匀分散静瓤纳米粒子。琴j 震超细绎镶获聚苯胺 较大的比表面积和高的空隙率，以及膜中a g 纳米粒子商的吸附活性和良好的电 子介体作用固定化酶，电化学测试表明，复合膜修饰电极的稳定性、灵敏度及峰 毽螭疲毫浚都考了较大疆裹，穗癍霹凌大大缨短，线往藏闺、检测羧镌更菇理怒。 通过生物糊容性良好的天然高分子聚禽物壳聚糖分别与氯金酸、硝酸银在还 原荆柠檬酸钠作用下通过原能还原法制备壳聚糖一纳米金纳米银复合膜，复合 膜缀合了纳米金爝颡粒比表甏彀大、吸附熊力强，可以率圈遣吸附酶镰生物大分 子豹特性及壳聚糖趣好静成艨牲和生耱稳容性的特点，以就露定亿酶构建葡萄糖 生物传感器，电化学测试结果液明，与单纯的壳聚糖固定化酶膜相比，艇合膜固定 化酶电极对底物的响应电流大，线性范围宽，稳定性大大提高，并很好地保持了 酶鹣溪瞧。 关键词：金属纳米粒子，聚合物超细纤维，固定化酶，静电纺丝，聚食物基纳米 金属簧会膜，脉砖彀滚电聚台 a b s t r a c t g l u c o s eb i o s e n s o ri sw i d e l yu s e df o rt h ed e t e c t i o no fg l u c o s es i n c ei t ss p e c i f i c c h a r a c t e r ：c o n v e n i e n ta p p l i c a t i o n ，r a p i dr e s p o n s e ，s e n s i t i v i t ya n ds e l e c t i v i t y s o m e t e c h n i q u e sh a v eb e e nt a k e n t oi m p r o v et h er e s p o n s ep r o p e r t i e so f b i o s e n s o r o n ew a y i st oc h o o s et h ep r o p e rm a t e r i a la n dm e t h o df o rt h ei m m o b i l i z a t i o no fe n z y m et o i m p r o v et h es t a b i l i t ya n dr e a c t i v i t y a n o t h e rw a yi st oi n t r o d u c et h ee l e c t r o nt r a n s f e r m e d i a t o ri nt h ei m m o b i l i z a t i o nm e m b r a n et oi m p r o v et h er e s p o n s ec u r r e n ta n d s e l e c t i v i t yo f t h eb i o s e n s o r an o v e lt e c h n i q u ef o re n z y m ei m m o b i l i z a t i o nb ye l e c t r o s p i n n i n gp o l y ( v i n y l a l c o h 0 1 ) ( p v a ) a n dg l u c o s eo x i d a s e ( g o d ) 0 1 1t h es u r f a c eo ft h ea ue l e c t r o d ef o r a m p e m m e t r i cb i o s e n s o ra r ep r e s e n t e d 。t h ei m m o b i l i z e dg o dr e m a i n e da c t i v ei n s i d e t h ee l e c t r o s p u np v af i b r o u sm e m b r a n e s t h em e m b r a n e sa r ep r o m i s i n gc a n d i d a t e s f o ri m m o b i l i z a t i o no fe n z y m e sb e c a u s eo ft h e i rh i 曲s p e c i f i cs u r f a c ea r e aa n dp o r o u s s t r u c t u r e t h ei rs p e c t r u m t h eu v v i ss p e c t r u ma n dt h es e mo ft h em e m b r a n e s s h o w e dt h a tt h e e n z y m e h a db e e ni m m o b i l i z e di n s i d e t h ep v am e m b r a n e s c h r o n o a m p e r o m e t r i cm e a s u r e m e n td e m o n s t r a t e dt h a te l e c t r o s p u nf i b r o u se n z y m a t i c e l e c t r o d ee x h i b i t e dar a p i dr e s p o n s ea n dah i g h e rr e s p o n s ec u r r e n tt og l u c o s ei nt h e n o r m a la n dd i a b e t i cl e v e l ，t h el i n e a rr e s p o n s er a n g ea n du p p e rd e t e c t i o nl i m i to ft h e s e n s o ri ss a t i s l y i n g a un a n o p a r t i c l e sw e r ei n t r o d u c e di n s i d et h ee l e c t r o s p u nf i l m st o a st h ee l e c t r o nm e d i u mt oe n h a n c et h ec a t a l y t i ca c t i v i t yo f t h es e n s o r as e n s i t i v ea n ds e l e c t i v e a m p e r o m e t r i cg l u c o s e b i o s e n s o rb a s e do na g m i c r o p a r t i c l e sd i s p e r s e d i nl l a n o f i b r o u sp o l y a n i l i n e 撑a n i ) w a s i n v e s t i g a t e d ， n a n o f i b r o u sp a n ii ss y n t h e s i z e do na ue l e c t r o d eb yan e wt e c h n i q u et e r m e dp u l s e g a l v a n o s t a t i cm e t h o d 佃g m ) d u e t oi t sl a r g es p e c i f i cs u r f a c ea r e a , g o o dc o n d u c t i v i t y ， 撼g hr e a c t i o na b i l i t y ，a n dm a n ym i c r o g a p se x i s t i n gb e t w e e nt h ef i b e r s ，p o l y m e rw i t h t h i s m o r p h o l o g y h a sp o t e n t i a l a p p l i c a t i o n i n e l e c t r o c a t a l y z e ，a n dg o dw a s c o i m m o b i l i z e di na g - m o d i f i e dn a n o f i b r o u sp a n it oc o n s t r u c t i n g m u l t i - l a y e r e d b i o s e n s o r s 。t h ep e r f o r m a n c e so f t h em u l t i l a y e r e dg l u c o s eb i o s e n s o r , i e 1 i n e a rr a n g e ， s e n s i t i v i t y , s e l e c t i v i t y ，r e s p o n s et i m e ，s t a b i l i t ya n dr e p r o d u c i b i l i t y ，黜a l li m p r o v e d m e t a ln a n o p a r t i c l e sw e r ei ns i t uf o r m e db yr e d u c t i o no fc o r r e s p o n d i n gm e t a l s a l t sw i t hs o d i u mc i t r a t ei nt h ep r e s e n c eo fc h i t o s a n a n dc h i t o s a nm o l e c u l e s a d s o r b i n g o n t ot h es u r f a c eo fa s - p r e p a r e dm e t a l n a n o p a r t i c l e s f o r m e dt h e c o r r e s p o n d i n gm e t a l - c h i t o s a nn a n o c o m p o s i t e s e n z y m ew a si m m o b i l i z e d i nt h e m e t a l - c h i t o s a nn a n o c o m p o s i t e sb e c a u s ei ti n h e r i t sb o t hb i o c o m p a t i b i l i t yo fc h i t o s a n a n d h i 蕊c a t a l y t i ca c t i v i t y o ft h em e t a l n a n o p a r t i c l e s 。t h e m e t a l c h i t o s a n n a n o c o m p o s i t e sm o d i f i e db i o s e n s o rh a se x e d l e n tp e f f o r m a n c ee s p e c i a l l yi nt h el i n e a r r a n g e ，s t a b i l i t ya n ds e l e c t i v i t y k e yw o r d s ：p o b a n e r i cu l t r a f i n ef i b e r s ，m e t a ln a n o p a r t m e s ，e l e c t r o p o l y m e r i z a t i o n ， e l e c t r o s p u n ，m e t a l - c h i t o s a nn a n o c o m p o s i t e s ，e n z y m ei m m o b i l i z a t i o n 独创性声骧 本久声鞠繇受交静学位论文蔻本入在导耀指导下进行静磷究工作帮敬褥静 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人己缀发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得运潼达堂。或其他教育机构的学位或证 书面谴用过鹣毒孝辩。与我一同工律瀚弱恚对本研究繇傲的任簿贡献麓已在论文中 作了明确战说明并表示了谢意。 学位论文 乍豢签名：任屯雷签字目袭：即多年胃扫 学位论文版权使沼授权书 本学位论文作者完全了麓蠢洼盍堂有关髹留、使建学整论文熬溉定。 特授权丞鎏太堂可以将学位论文的众部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 囱雷家有关部门或梳构送交论文静复印释窝磁盘。 ( 保密的学位论文在鳃密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：伍礼雷 签字目期：秘年f 冀撂目 球；咖簏叫 咋形 矽 名 簸 然 鼹 师 字 导 签 第一章绪论 1 1 生物传感器 第一章绪论 1 1 1 生物传感器的概念及发展 生物传感器是指用固定化的生物体成分( 如：酶、抗原、抗体、激素等) 或生 物体本身( 如细胞、细胞器、组织等) 作为分子识别元件，对被分析物具有高度选 择性的分析仪器。生物传感器是一门由生物、化学、物理、医学、电子、材料技 术等多种学科相互渗透成长起来的新学科l “，这种交叉学科在理论上和技术上均 有许多新的问题要进行探索和开发，在应用上有极为宽广的领域可以进行开拓。 生物传感器具有选择性好、灵敏度高、分析速度快，成本低、能在复杂的体系中 进行在线连续检测的特点；生物传感器的高度自动化、微型化与集成化，减少了 对使用者环境和技术的要求，适合野外现场分析的需求，在生物、医学、环境检 测、食品、医药及军事医学等领域有着重要的应用价值，已引起世界各国的极大 关注。 从1 9 世纪4 0 年代起，在科学研究中就已经开始用酶作为分析试剂来检测研 究特定的物质。1 9 6 2 年c l a r k t 2 l 等人首次提出把酶与电极结合来检测底物的设想， 他们把酶溶液夹在两层透析膜之间形成一层薄的液层，再紧贴在p h 电极、氧电 极或电导电极上，用于监测液层中的反应。1 9 6 7 年，u p d i k e 和h i c k s l 3 l 报道了酶 的固定化技术，并研制出世界上第一支葡萄糖酶电极，开创了生物传感器的历史， 这可称为第一代生物传感器。由于酶电极的寿命一般都比较短，提纯酶的价格也 比较昂贵，而各种酶多数来自微生物或动植物组织，因此就自然地启发人们研究 酶电极地衍生物：微生物电极、细胞器电极、动植物组织电极以及免疫电极等新 型生物传感器，使生物传感器的类型大大增多。 进入2 0 世纪8 0 年代，生物技术和传感技术水平的提高，在国际上引起了对 生物传感器的广泛研究。当今许多发达国家都把生物传感器列为关键技术，给予 特别盼重视和支持。近十多年来已经研制出一系列在环境监测，临床检验和生化 分析等方面具有实用价值的生物传感器，可以测定糖类、有机酸、蛋白质、抗原、 抗体、d n a 、激素、生化需氧量以及某些致癌物质等【l 】。尽管到目前为止，真正 商品化的生物传感器为数不多，但其研究和开发的势头很大，相信不久的将来一 定会研制出更多有用的生物传感器。 第章绪论 1 1 2 生物传感器原理 生物传感器原理为1 1 ：当待测物质( 底物、辅酶、酶、维生素、抗原、抗体、 抗菌素等) 经扩散作用进入固定化生物敏感膜层，经分子识别，发生化学反应， 产生的信息( 或光、热等) 继而被相应的化学或物理换能器转变成可定量和可以处 理的电信号或光信号等并输出，根据输出信号的大小或强弱便可知道所测物质的 浓度。 1 1 3 生物传感器的分类【4 】 生物传感器一般可以从以下三个角度来进行分类：根据传感器输出信号的产 生方式，可分为生物亲和型生物传感器、代谢型生物传感器和催化型生物传感器： 根据生物传感器中生物分子识别元件上的敏感物质可分为酶传感器、微生物传感 器、基因传感器、免疫传感器等；根据生物传感器的信号转化器可分为电化学生 物传感器、半导体生物传感器、测热型生物传感器、测光型生物传感器等。 1 1 4 生物传感器的特点 经典的分析技术，如高效液相色谱( h p l c ) 、气相色谱( g c ) 和质谱等，费时、 昂贵、要求对样品进行预浓缩，难以广泛应用。生物传感器作为一种新的检测手 段，与之相比有以下的优点【1 捌： ( 1 ) 测定范围广泛。根据生物反应的特异性和多样性，理论上可制成测定所有生 物物质的传感器。 ( 2 ) 测定过程简单迅速。由于分子识别元件是由高选择性的生物材料构成，一般 不需要样品的预处理，这样就将样品中的被测组分的分离和检测统一。 ( 3 ) 样品用量少，灵敏度高。由于生物敏感膜分子的高度特异性、灵敏性，故对 一些含量极低的检测对象也能准确地检测出来。 ( 4 ) 检测时不需加入其它试剂，是一种准确的“无试剂”分析方法。 ( 5 ) 重复性好。将敏感材料固定化保证可以反复多次使用，有较好的稳定性。 ( 6 ) 响应快，体积小，可以实现连续在线检测。 ( 7 ) 可进入生物体内。如安放于静脉或动脉中的葡萄糖传感器能持续不断地监测 血糖含量，并将指令传给植入人体的胰岛素泵，控制胰岛素释放量。 ( 8 ) 成本低，传感器连同测定仪器的成本远低于大型分析仪器，便于普及。 1 1 5 生物传感器的发展趋势【4 】 发展生物传感器的最初目的是为了利用生化反应的专一性，高选择性地分析 2 第一章绪论 目标物。但是由于生物单元的引入，生物结构固有的不稳定性、易变性，生物传 感器实用化还存在着不少问题。因此，人们做出了一些努力与设想来提高生物传 感器的性能。( 1 ) 选择性主要可从两方面提高生物传感器的选择性：改善生物 单元与信号传感器之间的联系以减少干扰；选择、设计新的活性单元以增加其对 目标分子的亲和力。如在酶电极中加入介体或对酶进行化学修饰可以提高这类电 极的选择性，其中介体或用于修饰的物质大都具有一定的电子运载能力。在此启 发下，一些研究者设想将酶活性中心与换能器之间用一些分子导线通过自组装技 术连接起来以消除电化学干扰。( 2 ) 稳定性为了克服生物单元结构的易变性， 增加其稳定性，最常用的手段是采用对生物单元具有稳定作用的介质、固定剂。 研究表明用合适的溶胶一凝胶作为生物单元的固定剂应用于酶电极，可以大大提 高生物单元的稳定性。( 3 ) 灵敏度对于一些特定的分析对象已发展了一些能大 幅度降低检测限的技术。随着生物传感器在食品、医药、环境和过程监控等方面 应用范围的扩大，对生物传感器提出了更高的要求。 1 2 常用的固定化酶的方法 在催化型生物传感器的制备过程中，酶的固定是一个极为重要的环节，酶的 固定方法影响酶的活性和传感器的稳定性。目前酶的固定方法有【5 】：包埋法，吸 附法，共价法，交联法。 ( 1 ) 包埋法：包埋法是把酶包埋于聚合物材料的网格结构或微胶囊结构中， 以防止酶蛋白渗出，而底物仍能渗入格子与酶接触反应。包埋法较为简便温和， 酶分子仅仅是被包埋在聚合物中，而未参加化学反应，生物活性破坏少，但此法 对大分子底物不适用，且储存稳定性和热稳定性差。由于在包埋法中，大多数酶 包埋在较厚的聚合物膜中，增大了传感器的响应时间。 ( 2 ) 吸附法：吸附固定是最简单的方法，酶分子直接吸附于不溶性载体电极 上，酶与载体之间的亲和力是范德华力、离子键和氢键。吸附法操作简单、易于 在许多材料上进行，它是一种较为温和的蛋白质固定方法，能有效地保留蛋白质 活性，酶电极的响应速度快( 一般不超过3 0 s ) 。但这种方法的酶负载量较低，这 就意味着灵敏度较低，同时吸附一般是可逆过程，吸附的酶易于脱落，因而随着 时间的延长，解吸也会减少灵敏度。因此这种酶电极的操作和储存稳定性差，最 多能使用一周，不适合实用化的要求。， ( 3 ) 共价键固定法：通过对电极进行化学修饰，再利用酶蛋白分子中可以进 行结合的一n h 、- - o h 、- - s h 、- - c o o h 等活性基团与电极表面上的反应基团 之间形成共价键连接。该方法形成的酶膜厚度与吸附法相似，且酶电极的响应速 度快、稳定性好，酶与载体之间的连接很牢固，稳定性好，无酶膜脱落和开裂现 第一章绪论 象。由于酶分子与载体材料表面形成较大的多点结合界面，共价法的结合力较强， 结合效率较高。该方法的操作反应条件激烈，影响固定的因素较为复杂。酶、载 体材料表面和连接试剂官能团的性质及其相互作用对结合效率有较大的影响，酶 的活性往往降低较大。 ( 4 ) 交联法：为了增加酶负载，进一步提高电极的稳定性，酶与多官能团试 剂进行交联反应，生成不溶于水的二维交联聚集体( 网状结构) ，交联形成的固定 化酶称为交联酶。与共价结合法一样，两者都是靠化学结合的方法使酶固定化， 其区别在于交联法使用了交联剂，常用的交联剂有戊二醛、鞣酸。单用戊二醛交 联得到固定化酶的方法很少单独使用，将此法与吸附法或包埋法联合使用可以达 到良好的加固效果。例如：先用几丁质吸附，再用戊二醛交联等，但交联剂的使 用会严重降低酶的活性。 1 3 酶固定化方法研究进展 1 3 1 自组装复合膜固定化酶 随着生物传感器的研究的深入，人们希望在分子水平上设计和控制电极的结 构，而功能分子和生物分子组合体的出现，有可能提供新一代的电子元件于是超 分子化学中的一个重要概念分子自组装被引入传感器的研究，为制备生物传感器 提供了新的途径分子自组装膜技术具有方法简单，所得到的膜性能稳定，结构高 度有序，层间分子中心对准，可实现2 d 或3 d 有序的超晶格结构：可仿自然生物 膜：对有机、无机分子及大分子、小分子等都适用因此，分子自组装复合膜将成 为研究传感器的重要的技术基础【6 】。 自组装膜( s a m s ) 是分子通过化学键或其它作用力自发吸附在固液或气固 界面上，形成热力学稳定和能量最低的有序膜当有吸附分子存在时，局部已形成 的无序膜可以自我再生成更完善的有序体系。除在界面上的化学作用外，通常在 成膜分子之间还存在范德华力的作用，以使所形成的膜更加稳定。 一、自组装膜的组装方法 自组装膜的组装方法很多，基于自组装过程中的成膜推动力不同可以大致分 为以下几类：基于化学吸附的自组装技术、静电自组装技术、基于氢键的自组装 技术、基于配位键的自组装技术、基于分子识别的自组装技术。它们各具特点又 互为补充，在基础研究和实际应用中都发挥着重要作用。重点介绍以下几种： ( 1 ) 基于化学吸附的自组装技术【1 基于化学吸附的自组装膜的种类很多，它包括：脂肪酸单层膜、有机硅衍生物 单层膜、有机硫化合物单层膜、二硫酸化合物多层膜等。其中，利用含硫聚合物 在金、银等金属上的化学吸附是自组装膜的一种十分有效的方法。由于金属与硫 4 第一章绪论 之间形成的是化学键，因此这种膜的牢固度和热稳定性都较好。这种方法也是目 前研究的最为深入的自组装体系。 ( 2 ) 静电自组装膜技术嗍 基于静电作用的层层组装法有诸多优点，如成膜分子的局限性小，只要是相 反电荷分子均可成膜；具有相反电荷分子问的距离和键的方向性不受限制等，因 此利用静电相互作用可直接形成超分子多层膜结构。在静电自组装技术中，用阴、 阳有机一无机胶体微粒的交替吸附制备层状有机一无机复合薄膜，这种静电沉积法 使二维组装发展到三维组装，多层膜的结构和厚度在分子水平上可控，提商了修 饰量，有效地增强响应性能。基于静电作用的多层膜的成膜材料广泛多样，早期 研究较多的是聚电解质多层膜，其它分子如染料、蛋白质等也可与聚合物形成多 层膜。这类多层膜的主要特点是膜的生物相容性好，位于多层膜中的蛋白质不会 失活变性，为蛋白质提供了温和的生存空间。这种含生物分子的聚电解质多层膜 对生物传感器的应用具有重要意义，作为一种有用的功能化膜，增强了膜的键合 能力。 以上所述是采用浸渍法，电荷分子自发吸附进行层层组装，最新研究发现在 循环电位扫描过程中层层组装可大大改善多层膜的均匀性，这种组装方法可称为 电化学生长法。该方法明显地优于传统的浸渍法，制备多层膜时，其组装过程可 控并且成膜时间较短，得到的多层膜更均匀，重现性好，同时又能降低溶液电解 质的竞争吸附。是制备含电活性分子多层膜的有效方法 9 - 1 0 1 。 ( 3 ) 纳米粒子有序膜的组装 纳米工程技术需要在纳米范围内控制其在表面上的有序堆积与排列，正是这 种有序堆积与排列使纳米粒子具有新的应用。 纳米粒子有序单层膜 将表面预处理过的电极浸入含纳米粒子的溶液中，纳米粒子则在电极表面吸 附，随吸附时间的增长在电极表面逐渐形成饱和的单层膜，纳米粒子单层膜的密 度与粒子的大小和电荷密度有关。纳米粒子单层膜在电极表面的形成一般通过电 极表面或纳米粒子表面的修饰来实现。a u 纳米粒子可在带有氨基或者另一巯基 的硫醇修饰的金电极表面组装单层膜【1 1 1 ，p t 纳米粒子可在双硫化物修饰的金电 极表面形成纳米粒子单层膜【1 2 1 。另外研究较多的是纳米粒子在碳电极表面的电化 学沉积，通过对碳电极表面进行阳极化处理，在碳电极表面制备了金属的纳米粒 子单层膜l l ”。如在电极表面电化学聚合苯胺时，经氧化处理的电极表面较粗糙， 所得的纳米粒子分散性较差。为此，可以通过电化学法使碳电极表面形成苯胺分 子单层，许多配位能力强的过渡金属离子，如a g + ，c d 2 十，c u 2 + ，p d 2 + ，p b 2 + 等都能通过 与表面氨基配位而吸附于电极表面，再经电位阶跃还原得到相应的纳米粒子。通 5 第一章绪论 过这种方法所得到的纳米粒子更均匀、在表面的分散度更高。如图卜1 所示【1 4 1 ， 为a g 纳米粒子在h o p g 表面形成的示意图。由图可见，a 矿和电极表面的氨基 图1 - 1 玻碳电极表面纳米银粒子制备过程示意图 配位预吸附，然后将吸附有a g + 的电极在空白电解质溶液中经电位阶跃从 0 v - 0 5 v ，a g + 则还原成零价而得到均匀分散的a g 纳米粒子。通过控制电位阶跃 时间、浸泡次数等条件可控制纳米粒子在电极表面的粒径和个数。此外，也可以 将修饰苯胺膜的电极浸泡于p t c l 6 + 。或a u c l 6 4 的酸性溶液中，此时苯胺表面将带 正电荷，通过静电吸引将这些阴离子吸附于电极表面，同样经过电位阶跃还原也 可制得a u 和p t 的纳米粒子【”】。 聚合物一纳米粒子多层膜 l等l暇桀i麟蕊m-toa-,h-anauh j b - ( o 。, , - 涠_ - _ l k 0 4 懒一一 一瞄甜- 柑憎广孙_ 柏- 蛐 图1 - 2 聚合物一纳米金自组装膜固定化辣根过氧化物酶示意图 在静电交替组装法中，聚合物一纳米粒予多层膜的制备方法简单，也是研究 最多的体系。聚合物一纳米粒子多层膜的组装一般是采用荷负电的纳米溶胶( 常用 的是a u 溶胶) ，静电吸附到荷正电的聚合物表面( 反之亦然) ，经交替吸附则形 成三维结构，所采用的聚合物包括p d d a 、巯基乙胺【1 6 】( 如图卜2 ) 及其他聚合物 等；纳米粒子包括金、银和硅等，形成的纳米多层膜非常稳定，能耐多种溶剂， 往往需要用机械刮擦或化学强处理才能使膜破坏而脱落。纳米多层膜中聚合物层 的厚度可调，微粒的层间距可变，有利于制备导体、半导体或绝缘体纳米电子材 6 第一章绪论 料。另一种组装方法是先将金属离子或金属盐化合物以静电作用形成多层膜，再 用电位阶跃法使位于膜中的金属离子还原，生成纳米粒子分散在多层膜中【1 7 1 ，由 于聚合物膜具有稳定纳米粒子并阻碍其聚集的作用，所以通过适当控制修饰液的 浓度，选择合适的还原电位，可方便地形成多层纳米粒子超薄膜。这种组装纳米 粒子多层膜的方法十分简单，不需要预先合成纳米粒子，只需在电极表面原位一 步还原而形成纳米粒子多层结构，制得的纳米粒子分布均匀，不易聚集，而且活 性高。 共价连接的多层膜 以共价连接的纳米粒子多层膜的组装常用二硫醇作为交联剂来连接a u 1 8 1 或 其它纳米粒子，当胶体金单层膜浸泡于二硫醇溶液中，该单层膜转换为含巯基的 表面，当进一步浸泡于胶体金溶液时，该巯基表面则通过s - a u 共价键合，使第 二层胶体金单层膜固定。采用此方法可以共价连接组装胶体金的多层膜。选择不 同烷基链长的二硫醇可以方便地控制多层膜中纳米粒子的间距【1 9 1 ；反过来，粒子 间距又影响了膜的特性，如导电性等。 纳米粒子有序膜的电化学和生物传感器 金属纳米粒子由于尺寸小，比表面积大，在电催化反应中起重要作用，其催 化效率主要与微粒和反应剂间的相互作用，以及微粒的比表面积有关。在纳米生 物传感器体系中，目前研究最多的是纳米粒子一酶的组装体系及其生物传感器响 应，由于纳米粒子高的比表面积和纳米粒子本身的生物相容性，所以酶在纳米粒 子表面的催化活性得到提高。导电的纳米粒子和氧化还原蛋白质之间可以发生直 接电子转移，因此酶与纳米粒子的多层组装可直接用于安培型生物传感器，不需 要电子媒介体，可作为理想的第三代生物传感器。如辣根过氧化物酶( h r p ) 与纳 米金的混合组装膜对h 2 0 2 的直接电催化还原 2 0 l 。利用小尺寸的纳米粒子与酶结 合组装的另一优点就是酶的活性中心可以更贴近电极表面，使电子转移易于进 行，提高了生物电催化活性。半人工合成的小分子生物催化剂( 如m p 1 1 ) 与导电 纳米粒子的层层组装而制备的生物传感器也不需要电子媒介体【2 1 】，多层阵列中， 随着催化剂层数增加，催化电流明显提高，说明膜内的生物催化剂都能和底物作 用，保持了固有的催化活性。 纳米粒子一酶催化体系中最关键的是酶与纳米粒子的有序组装。将金电极表 面通过巯基功能化，随后吸附胶体a u 微粒 2 2 1 ，最后辣根过氧化物酶通过静电作 用吸附到金纳米粒子表面。用这种方法组装具有一定的空间有序性，但由于长链 的非导电性的隔离物的存在，使h r p 活性中心与电极表面距离太远而不能在电 极表面进行直接电子转移，必须在反应溶液中加入适当的电子媒介体以实现其电 催化响应。当改用导电的隔离物或嵌入电活性介质来充当电子转移的中间位点 7 第一章绪论 2 3 1 ，或将电活性媒介体固定到酶分子或纳米粒子表面时 2 4 - 2 5 1 ，则可实现该修饰电 极的生物传感效应。 纳米粒子一酶组装体为基础的生物传感器研究是一个有发展前景的研究方 向，导电的纳米粒子使酶分子连接起来，还可以起到“导线”作用，并且其自身 也可缩短酶分子活性中心与电极表面的距离，从而可以进行直接的、无媒介体的 电子转移。这种酶与电极表面的直接电子转移，对于多组分酶中继体的体系更有 效，具有潜在的发展前景。 1 3 2 导电聚合物在固定化酶中的应用 1 3 2 1 导电聚合物生物传感器研究概况及工作原理 自从1 9 8 6 年f o u l d s m l 首次将葡萄糖氧化酶( g o d ) 固定在聚吡咯上制成了聚 吡咯葡萄糖传感器后，许多研究工作陆续开展起来，先后用各种导电聚合物作为 载体材料制作了多类酶传感器、免疫传感器、微生物传感器等。 导电聚合物生物传感器主要是用导电聚合物为载体或包覆材料固定生物活 性成分( 酶、抗原、抗体、微生物、细胞等) ，并以此作为敏感元件，再与适当的 信号转换和检测装置结合而成的器件。其基本组成和工作原理如图1 - 3 所示。 图1 - 3 中的敏感物是指生物活性物质，它被固定在导电聚合物膜中。当敏感物与 待测物( 通常是其底物) 发生反应后，会产生一些物理或化学变化：这些变化进一 步被信号转换装置( 换能器) 转换成可检测的信号( 例如：电信号、光信号) ，最后 通过信号检测器检测。 图1 - 3 导电聚合物生物传感器工作原理示意图 1 3 2 ，2 导电聚合物固定生物分子的原理 t 9 十o 蝴和 七扣 图1 - 4 聚吡咯，聚苯胺，聚噻吩结构图 用于固定生物活性分子的导电聚合物主要有聚吡咯、聚苯胺和聚噻吩。它们 8 第一章绪论 处于导电状态时的电子结构如图卜4 1 2 7 1 所示。在上述这些聚合物中，均具有较长 的共轭链结构，从而使聚合物显示了导电性能。聚合物导电性能的差异取决于聚 合物的主链结构、掺杂的对阴离子的种类和掺杂程度等因素。通过改变外加电位， 可改变聚合物的状态，聚吡咯和聚噻吩一般只有氧化态和还原态两种状态；而聚 苯胺的电化学过程则伴随着电子和质子的得失，随着外加电位的变化，聚苯胺可 发生可逆的氧化和还原，并表现出三种状态：完全氧化态、完全还原态、半氧化一 还原态。前两种状态均不导电，而最后一种状态为导电态。三种状态的相互关系 十。中。下0 1 ：一0 1 戋 + o 善d 二0 4 二。穗七 嚣罐： + o o - l o o 嗡 当导电聚合物处于导电状态时，分子骨架带正电，必须有对阴离子存在才能维持 整个体系的电中性。根据这一特性，可利用导电聚合物固定生物活性分子。在电 解聚合过程中，导电聚合物被氧化，氧化态聚合物膜的正电荷通常呈分散分布， 而许多生物活性分子( 如：酶) 在一定酸碱度的缓冲液中带负电( 缓冲溶液的p h 值 必须大于酶的等电点) ，这使得生物活性分子能以离子键与导电聚合物结合，以 保持聚合物链的电中性。因此，在电解聚合液中加入生物活性分子，随着导电聚 合物的形成，生物活性分子能以离子键与导电聚合物结合，同时也可被周围的聚 合物链缠结包埋，从而被固定。 1 3 2 3 导电聚合物生物传感器的制备 通常，导电聚合物酶传感器的制备有两大类方法：一是直接聚合一沉积法( 又 称一步法) ，另一是聚合一再固定法( 又称两步法) 。聚合所使用的电解池通常为三 电极体系：工作电极( w ) 、辅助电极( c ) 、参比电极( r ) ，聚合装置如图1 6 所示： 9 第一章绪论 图1 石制备导电聚合物生物传感器的电分析装置 1 直接聚合一沉积法 导电聚合物( 例如：聚吡咯、聚苯胺、聚噻吩等) 通常以电解法聚合到惰性电 极上( 铂、金、玻碳、石墨、碳糊、碳纤维电极等) ，酶的固定为生物传感器制作 的关键步骤。直接聚合一沉积法是指在聚合前，将酶与单体、支持电解质混合， 在电解聚合生成导电聚合物膜的同时，酶被包裹到聚合物中1 2 a l 。f o u l d s 2 6 1 和 a i z a w a l 2 9 1 等首先采用此法分别制得了聚吡咯和聚苯胺葡萄糖传感器。酶传感器的 制备中所使用的聚合方法通常有三种：恒电位聚合法、恒电流聚合法、扫描电位 聚合法。 ( 1 ) 恒电位聚合法恒电位聚合法在电化学生物传感器的制作中使用较为广泛。 它是指在单体聚合过程中工作电极始终维持在某一恒定的电位。一般聚苯胺生物 传感器制备的电位为0 6 5v ( v s s c e ，s c e 为饱和甘汞电极) ，聚吡咯生物传感器制 备的电位为0 9 0 v ( v s s c e ) 。由于聚合过程中电位不变，所以聚合物的导电状态 不会发生变化，从而使得带负电荷的酶的掺杂一直进行。在聚合过程中，可以采 用库仑计来记录电解时通过的电量，从而控制膜的厚度。这样，生物传感器制备 的重现性将大大增高。 ( 2 ) 恒电流聚合法恒电流聚合法是指在单体聚合过程中体系的电流始终维持在 某一恒定值。因为聚合电流恒定，所以聚合物在电极上沉积的速率是恒定的，膜 的厚度可通过聚合时间来控制。通过恒电流聚合法制备的活性膜可具有多孔结 构，这对于提高生物传感器的选择性是有利的【3 0 】( 3 ) 扫描电位聚合法扫描电位 聚合法是指在单体聚合过程中体系的电位随时间而线性改变，通常采用循环扫 描。这种方法的优点是制备的速度较快，对于那些在聚合单体中易失活的酶的固 定较为适用。 采用直接聚合一沉积法固定酶过程中，由于酶能同时被包埋在聚合物链中， 从而得到的酶电极较稳定，酶不易从聚合物中脱落。但由于酶被加入到聚合液中 与单体共存，使得作为有机物的单体可能对酶有去活化作用，导致了在制备过程 中酶的部分失活。同时，由于强酸性溶液、有机溶剂和高的聚合电位会导致酶的 失活，因此采用直接聚合一沉积法大多集中在聚吡咯生物传感器上，聚苯胺和聚 1 0 第一章绪论 噻吩的则相对较少。主要原因是聚吡咯的电合成可在中性的水溶液中进行，而聚 苯胺的合成通常在酸性条件下完成，聚噻吩的制备一般在有机溶剂和较高电位下 实现。这样，限制了导电聚合物在生物传感器中的应用。而两步法正好弥补了直 接聚合一沉积法这一不足之处。 2 聚合一再固定法【3 l j 在图卜7 中， i a 为合成聚苯胺时所加入的酸，一般使用盐酸和硫酸：b s 为缓冲 液。首先，在强酸性溶液中用电化学氧化法将聚苯胺修饰在电极上，然后将聚苯 胺电极浸入缓冲液中还原( 一般需还原2 0m i n ) 以移去聚合物膜中的酸根离子。最 后将电极浸入含酶的缓冲液中氧化( 一般须2 0r a i n ) 使酶掺杂到聚合物膜中酶掺 杂时需注意所用缓冲液的p h 值应高于酶的等电点，以使酶带负电荷。 h 伽m 南峭 a n + h a 一 时詈嗤时f 图l - 7 电化学聚合一再固定法制备酶生物传感器 1 3 2 4 导电聚合物生物传感器的优点和发展趋势 利用导电聚合物制备生物传感器具有以下优点： ( 1 ) 采用电聚合法，生物活性分子可作为对阴离子包埋在聚合物膜中。制得的生 物活性膜厚度均一、不易从电极上脱落。 ( 2 ) 由于膜的厚度、生物活性分子固定的量可通过电解时间、电解电位、电解电 量来加以控制，因此传感器制备具有较好的重现性。 ( 3 ) 生物活性分子由于不是简单吸附在导电聚合物中，而是与聚合物链问存在着 离子键力，因此不易脱附，有利于传感器的稳定。 ( 4 ) 可用不同的生物活性分子方便地构建多层结构，使生物传感器多功能化。 ( 5 ) 电聚合方法有利于生物传感器的微型化。 但导电聚合物传感器仍有一些方面需改善： ( 1 ) 具有电化学活性的导电聚合物( 特别是聚苯胺) 很难消除电活性物质对安培生 物传感器的干扰( 在较高电位使用时) 。 ( 2 ) 通常，具有电化学活性的导电聚合物在低电位下具有较大的背景电流，所以 由其直接制备的生物传感器不能在负电位下操作，这限制了其在生物传感器 制备中的适用范围。 ( 3 ) 一些导电聚合物生物传感器的灵敏度和寿命还不能满足实际使用的需要。以 上这些有待改善的方面也是导电聚合物生物传感器今后研究的方向之一，同 时导电聚合物与生物活性分子之间的电子转移反应机理的研究还有待深入。 第一章绪论 因此寻找有效的改进方法来制各性能优越、可靠的导电聚合物生物传感器并 使之实用化( 特别在环境监测和医学检验领域) ，开拓导电聚合物在生物传感 器制各上的新应用，构建导电聚合物生物传感器阵列是这一领域的发展趋势。 1 3 3 聚合物基金属纳米复合材料固定化酶 1 3 3 1 聚合物基金属纳米复合材料的性能 聚合物基金属纳米复合材料引起了诸多领域科技人员越来越浓的兴趣。在聚 合物基体中分散金属纳米粒子，把金属纳米粒子性能和聚合物性能有机地结合在 一起，增强了纳米复合材料的电磁性能、光学性能、催化性能和传感性能等，从 而开启了纳米复合材料在功能材料领域新的应用。 聚合物基金属纳米复合材料作为功能性高分子材料的重要分支，是当今研究 的热点。( 1 ) 传感特性聚合物基金属纳米复合材料可作为低价、高度专一敏感 的化学传感器。这种传感器可用于常规或有毒环境气体的检测，以及工业化学品、 材料储备、食品储藏、生物和化学反应品等方面的监测【3 2 - 3 3 。( 2 ) 催化性能纳 米复合材料催化剂是以聚合物为载体，以纳米粒子为催化活性中心的高效催化复 合体系，既能发挥纳米粒子催化的高效性和高选择性，又能通过高聚合物的稳定 作用使之具有常效稳定性。常用作催化活性中心的纳米金属粒子主要有p t 、a u 、 a g 、i d 、n i 、f e 、c o 等。纳米粒子可以通过填充、吸附、沉积而负载在多孔树 脂上或聚合物膜上或包裹在聚合物基体中，从而得到聚合物基纳米复合材料催化 剂，可用于烯类单体的聚合、有机废物的降解、处理废气，废水、净化环境等。 ( 3 ) 电磁性能金属纳米粒子的电磁性能赋予纳米复合材料磁性质、电学性质等。 1 3 3 2 聚合物基金属纳米复合材料的制备 为了使合成的纳米复合材料具有期望的性能，科学工作者不断努力开发了许 多制备方法。常用的方法有原位合成法和直接分散法，原位合成法一般是在含有 聚合物的溶液中，原位合成纳米粒子，然后蒸发溶剂或共沉积( 聚合物和纳米粒 子同时沉积) 获得纳米复合材料。直接分散法往往把聚合物基体和纯的纳米粒子 或经表面修饰的纳米粒子直接混合，这两种方法简单易行在制备聚合物基金属 纳米复合材料中被广泛采用。但是，这两种方法都有各自的缺点比如在第一种方 法中，纳米复合材料不能显示很好的力学性能( 耐冲击性能、韧性和强度) ，并且 从实际观点看不宜于加工。在第二种方法中，由于纳米粒子具有很高的表面能， 很难控制纳米粒子的团聚和尺寸分布【3 4 1 。 1 3 3 3 壳聚糖基金属配合物的性质和应用 壳聚糖是纤维素的衍生物，糖元的2 位为- n h c o c h 3 或游离的n h 2 ，3 位为仲 第一章绪