（微生物与生化药学专业论文）基因阻断技术鉴定streptomyces+hygroscopicus+17997中geldanamycin生物合成相关基因.pdf

中文摘要 、 吸水链霉菌s t r e p t o m v c e sh y g r o s c o p i c u s1 7 9 9 7 所产生的格尔德霉素 ( g e l d a n a m y c i n ) 具有良好的抗肿瘤和抗病毒活性0 本研究旨在该菌- f 1 建立 噬菌体转染系统，以便用基因阻断技术研究与g e l d a n a m y c i n 生物合成有关基 因。 首先研究g e l d a n a m y c i n 产生菌s t r e p t o l n y c e sh v g r o s e o p i c u s1 7 9 9 7 的 硫链丝菌素( t s r ) 抗性特征。对噬菌体o c 3 l 繁殖过程中各因素进行优化， 建立了高效的噬菌体增殖、噬菌d n a 提取实验体系。通过对s t r e p t o m v c o s h v g r o s c o p i c u s1 7 9 9 7 转染实验中影响转染效率的各种因素进行优化试验， 建立了最佳的s t r e p t o m v c e sh y g r o s c o p i c u s l 7 9 9 7 转染条件，转染效率可达 l o l1 0 1 g g d n a ，为噬菌体中c 3 l 介导的g e l d a n a m y c ir l 生物合成基因簇基 因阻断系统的建立创造了条件。士 ， 根据i 型p k s 基因序列设计简并性引物，以s t r e p t o m v c e s h y g r o s c o p i c u s1 7 9 9 7 总d n a 为模板，扩增出0 9 k b 片段作为探针，筛选 s t r e p t o m v c e sh v g r o s c o p i c u s1 7 9 9 7 基因组d n a 文库，得到1 2 个阳性克隆。 f 经s o u t h e r n 分析、亚克隆及部分测序后，以g e n b a n kb l a s t 软件比较确认 其中6 个与i 型p k s 有较高同源性。以其中5 个亚克隆质粒p s c i1 6 、p s c l 2 3 、 p s c l 2 4 、p s c l 3 0 和p s c l1 5 上的基因组d n a 作为目的d n a 片段来源，插入中 c 3 1 衍生载体k c 5 1 5 ，构建重组噬菌体k c l 6 、k c l 0 5 、k c l l l 、k c 2 5 8 和 k c 2 8 7 ，分别转染s t r e p t o m v c e sh v g r o s c o p i c u s1 7 9 9 7 宿主菌，l 1 的d n a 片 段与s t r e p t o m v c e sh v g r o s c o p i e u s1 7 9 9 7 基因组d n a 以同源重组的方式将重 组噬菌体整合入s t f o p t o l l l v c e sh y g z o s c o p c u s1 7 9 9 7 基因组。井转导其t h i o ( 硫链丝菌素) 抗性。以t h i o 抗性进行筛选，得到个重组噬菌体的溶源荫 分别命名为g 1 6 、g 1 0 5 、g 1 2 4 、g 2 5 8 和6 2 8 7 。从溶源菌g 1 6 一l 、g 2 5 8 一l 、g 2 5 8 2 和g 2 8 7 1 3 中提取d n a 以l s r 基因为探针进行s o u t h e r n 杂交；结果最示， 除( ；2 5 8 一l 为自发t h i 0 抗性，其余3 株菌中都有重组噬菌体的整合。对附胜 克隆进行发酵试验，产物以t l c 和h p i 。c 进行检测，其巾一株g 1 6 一i ( 岔重组 噬菌体k c l 6 的溶源菌) 不产生g e l d a n a m y c i n ，表明重组噬菌体k c l 6 中柬f ：_ l 亚克隆质粒p s c i1 6 的2 0k bb a m h i 片段与g e l d a n a m y c i n 生物合成基因相关。手 将p s c i l 6 原始来源的基因文库质粒p c ( ；b k l 0 与本室利用a i i b a ( 3 - 氨尽 一5 一羟苯甲酸) 探针杂交得到的5 个阳性柯斯质粒p c g b al ，p c g b a 3 ，p c ( ；l a 8 ， p c g b a l 5 和p c g b a l7 分别转化 i v i d a n s t k 2 4 原生质体，得到转化予t k 一1 0 ， t k l ，t k 一3 ，t k 一8 ，t k 一15 和t k l7 。将两个或三个转化子，t k - l 和t k 1 7 ， t k 1 5 午口t k 一1 7 ，t k 一3 平口t k 一8 ，t k l 、t k 1 7 口t k 一1 0 ，t k 1 5 、t k 1 7 矛口t k 1 0 ， ， y l 一3 、t k 一8 和t k l 0 进行联合共培养，产物以t l c 和h p l c 检测。( 结果显示， 只有柯斯质粒p c g b k i o 、p c g b a i 和p c g b a l 7 的转化子( t k 一1 、t k l7 和t k 1 0 ) 共发酵产物在h p l c 检测的5 3 6 3 分钟处有一明显的吸收峰，与标准品的出 峰时删( 5 3 6 1 分钟) 和野生型sh y g r o s c o p i c u s l 7 9 9 7 的出峰时间( 5 3 6 9 分 钟) 相一致，表明这三株转化子的共培养发酵确实有g e l d a n a m y c i n 的产生一 本实验结果直接证明了p s c l l 6 中的2 k b 片段与g e l d a n a m y c i n 生物合成相关， 同时也表明本室已经克隆到完整的g e l d a n a m y c i n 生物合成基因簇，为下一步 分机各基因在生物合成中的作用以及该抗生素的组合生物合成研究奠定了基 础。 关键词：吸水链霉菌；格尔德霉素；基因阻断i 共培养 4 a b s t r a c t g e l d a n a m y c i n ，a na n s a m y c i na n t i b i o t i cw i t hh i g ha n t i v i r a l a n da n t i t u m o r a c t i v i t y , w a sp r o d u c e db yag r a m p o s i t i v eb a c t e r i u ms t r e p t o m y c e sh y g r o s c o p i c u s 17 9 9 7 a s y s t e mf o rp h a g et r a n s f e c t i o nb a s e do nas t r e p t o m y c e st e m p e r a t ep h a g e v e c t o r 中c 31 一k c 515w a sd e v e l o p e dt oi n d e n t i f yg e n e si n v o l v e di ng e l d a n a m y c i n b i o s y n t h e s i so f s t r e p t o m y c e sh y g r o s c o p i c u sl7 9 9 7b yg e n ed i s r u p t i o n t h er e s i s t a n c el e v e l o f g e l d a n a m y c i n - p r o d u c i n g s t r a i n s t r e p t o m y c e s h y g r o s c n p i c u s 17 9 9 7t o t h i o s t r e p t o n w a s p r i m a r i l yi n v e s t i g a t e d t h ef a c t o r s i n f l u e n c i n gt h ep h a g em u l t i p l i c a t i o nw e r eo p t i m i z e d t h ee f f i c i e n te x p e r i m e n t a l p r o t o c o l s f o r p h a g em u l t i p l i c a t i o n a n dd n ai s o l a t i o nw e r ee s t a b l i s h e d t h e o p t i m a ls t r e p t o m y c e sh y g r o s c o p i c u s 17 9 9 7 t r a n s f e c t i o n s y s t e m w a sa l s o e s t a b l i s h e db yi n v e s t i g a t i n gt h ev a r i o u sf a c t o r sw h i c hi n f l u e n c e dt h et r a n s f e c t i o n e f f i c i e n c y i ng e l d a n a m y c i n p r o d u c i n gs t r a i ns t r e p t o m y c e s h y g r o s c 。( ) p i e u s 17 9 9 7 t h et r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c yw a sr e a c h e dt o10 2t o10 3 g g d n a a0 9k bd n af r a g m e n tw a sa m p l i f i e d b y t h ep c rm e t h o d ，u s i n gt h e d e g e n e r a t e dp r i m e r s ，w h i c hw e r ed e s i g n e da c c o r d i n gt ot h ec o n s e n s u ss e q u e n c e o f t y p e1 p k s b i o s y n t h e t i cg e n e ss e q u e n c e t w e l v ep o s i t i v ec o s m i dc o l o n i e sw e r e o b t a i n e db yh y b r i d i z i n gg e n o m i cl i b r a r yw i t ho9 k bd n a p r o b e s o u t h e r nb l o t a n a l y s i sa n ds u b c l o n i n gw e r ep e r f o r m e d ，g e n b a n kb l a s t s e q u e n c ea l i g n m e n t 1 e v e a l e dt h a ts u b c l o n e dd n af r o ms i x p o s i t i v e c o s m i dc l o n e sh a v e h i g h s i m i l a r i t yw i t ht y p ei p k s g e n e s f h eb a m h lf r a g m e n t so f t h ef i v ep o s i t i v ec o s m i dc l o n e sp s c l l 6 、p s c l 2 3 ， p s c 12 4 ，p s c13 0a n dp s c115w e r es e p a r a t e l yi n s e r t e di n t ot h eb e t m h ls i t eo ft h e ( | lc 31 p h a g ed e r i v a t i v ek c 5 15 rc a t t d e l e t e d c a r r y i n gt h i o s t r e p t o na n dv i o m y c i n r e s i s t a n c eg e n e ) ，t h el i g a t e dd n aw a su s e dt ot r a n s f e c tf l e s hp r o t o p l a s to t ： l i v i d a n s13 2 6r e s u l t i n gi no b t a i n i n go fr e c o m b i n a n tp h a g e sk c i6 ，k c10 5 ，k ci11 k c 2 5 8 ，a n dk c 2 8 7 ，t h e nc o n s e q u e n t l y t r a n s f e c t e dt h e s t r e p t o m y c e s h y g r o s c o p i c u s 17 9 9 7s p o r e st h er e c o m b i n a n tp h a g e s ，w h i c hw e r ea b l et oe n t e r t h e l y s o g e n i c s t a t e o n l yb yh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o nw i t ht h eh o s t ，w e r e s e l e c t e db y t h i o s t r e p t o nr e s i s t a n c em a r k e r i nt h ev e c t o r t h eg e n o m i cd n ao fr e s i s t a n tc l o n e sg 1 6 1 ，g 2 5 8 - 1 ，g 2 5 8 - 2a n dg 2 8 7 13 w e r ei s o l a t e d s o u t h e r n h y b r i d i z a t i o n w e r e p e r f o r m e du s i n gt h i o s t r e p t o n r e s i s t a n c eg e n e ( t s r ) a sa p r o b e ，t h er e s u l ts h o w e dt h er e c o m b i n a n tp h a g e sk c i6 ， k c 2 5 8 ，k c 2 8 7h a v ei n t e g r a t e db yh o m o g o u sr e c o m b i n a t i o nb e t w e e nt h ec l o n e d f r a g m e n t sa n dg e n o m i cd n ae x c e p tas p o n t a n e o u st h i o s t r e p t o nr e s i s t a n c ec l o n e g 2 5 8 。1 h p l ca n a l y s i so ft h ef e r m e n t a t i o np r o d u c t so ft h el y s o g e n ss h o w e dt h a t o n l y gi6 - 1f a i l e dt o p r o d u c eg e l d a n a m y c i n ，w h i c h d e m o n s t r a t e dt h a tt h e i n t e g r a t i o no f r e c o m b i n a n tp h a g ek c16r e s u l t e di nd i s r u p t i o no ft h ee x p r e s s i o no f t h eg e n ei ng e l d a n a m y c i nb i o s y n t h e t i cp a t h w a y t h ee v i d e n c es u g g e s t e dac l o n e d b a m t t i20 k bd n as e g m e n ti n p s c 116w a si n v o l v e di n g e l d a n a m y c i n b i o s y n t h e s i s c o s m i dp c g b k10c o n t a i n i n gs u b c l o n ep s c l16a n df i v e p o s i t i v e c o s m i d c l o n e sp c g b a 1 ，p c g b a 3 ，p c g b a 8 ，p c g b a 15a n dp c g b a17 d n a w h i c h w e r eo b t a i n e db yh y b r i d i z i n gs t r e p t o m y c e sh y g r o w o p i c u s17 9 9 7g e n o m i cl i b r a r y w f l ha h b a g e n ep r o b e ，w e r eu s e dt ot r a n s f o r ms l i v i d a n st k 2 4 p r o l o p l a s t s s i x f a n s f o r m a n t st k l 0 ，t k l ，t k 3 ，t k 8 ，i k 1 5a n d f k l 7w e r eo b t a i n e dt w oo r t h r e et r a n s f o r m a n t s t k 1a n dl7 ，t k 一15a n d17 ，t k 一3a n d8 ，i k 一1 、17a n d f k 1 0 、t k 15 、1 7a n d1 0 ，t k 3 、8a n d1 0 w e r e m i x c u l t u r e d f h e f e r n r e n t a t i o n p r o d u c t sw e l c a n a l y s i z e db yt l ca n dh p l c t h er e s u l t s h o w e dt h a t o n l yt h e c o m b i n a t i o nc u l t u r i n go ft k - 1 17a n d10c o u l dp r o d u c e das u b s t a n c ew i t hs a m e r fi nt l ca n a l y s i sa n ds a m er e t e n t i o nt i m ei nh p l ca st h e g e l d a n a m y c i n s t a n d a r d t h a tw a sf u r t h e rc o n f i r m a t i o no ft h ei n v o l v e m e n to fp s c l16s u b c l o n e i ng e l d a n a m y c i nb i o s y n t h e t i ca n dt h et h r e ec o s m i dc l o n e sp c g b k l 0 ，p c g b a i a n dp c g b a17d n a p o s s i b l yc o v e r e dt h ei n t a c tg e l d a n a m y c i nb i o s y n t h e t i cg e n e c l u s t e r t h i ss t u d yw i l lf a c i l i t a t et h ef u r t h e ri n v e s t i g a t i o n g e l d a n a m y c i ng e n e s k e y w o r d ：s t r e p t o m y c e sh y g r o s c o p i c u s ，g e l d a n a m y c i n ，g e n e d i s r u p t i o n m i xc u l t u r e 7 前言 格尔德霉素( g e l d a n a m y c i n ) 是t 9 7 0 年从吸水链霉菌g e l d a n u s 变种 ( s l r e p t o m y c e sh y g r o s c o p i c u sn r r l 一3 6 0 2 ) 分离的安莎类化合物，具有抗肿 瘤和抗原虫活性。我所在筛选过程中获得一株产生g e l d a n a m y c i n 的放线菌 17 9 9 7 ，经鉴定为吸水链霉菌，由于发现其具有较好的抗病毒作用而受到关注。 已知安莎类抗生素的生物合成起始于一个特殊的芳香族分子| ：3 一氨 基一5 一羟苯甲酸( a h b a ) ，而安莎链( 脂肪链) 是一种聚酮结构，这种聚酮 链的合成途径与大坏内酯类中的聚酮体合成极其相似，都是在聚酮合酶( i 型p k s ) 作用下由二碳或三碳单位脂肪酸缩合而成。我们拟对g e l d a n a m y c i n p k s 基因簇和生物合成基因簇进行克隆和研究，以了解其p k s 基因装配、生 物合成的特点和关键步骤，为基因工程定向结构改造g e l d a n a m y c i n 打下基础。 本实验室根据p k si 型基因同源性高的特点，依据p k si 型k s a t 区域， 设计兼并性引物，以g e l d a n a m y c i n 产生菌s t r e p t o m y c e sh y g r o s c o p i c u s1 7 9 9 7 总 d n a 为模板，在高严谨条件下，p c r 扩增得到0 9k b 和1 3 k b 片段，和预 期相符。以正向和反向引物进行测序，分析发现二者均与典型的p k si 型基 因簇有较高的同源性。其中0 9k b ( p s c l 0 9 ) 与o l e a n d o m y c i np k sm o d u l e5a n d 6 的i d e n t i t i e s = 1 4 3 2 8 6 ( 5 0 ) ，p o s i t i v e s = 1 7 3 2 8 6 ( 6 0 ) ，1 3k b ( p s c l l1 ) 与 e r y t h r o m y c i np k sm o d u l e la n d2 的i d e n t i t i e s = 7 1 1 9 6 ( 3 6 ) ，p o s i t i v e s = 9 5 1 9 6 ( 4 8 ) 。 以o 9 k b 片段为探针，非放射性同位素地高辛标记后与本实验室构建的 g e l d a n a m y c i n 产生菌基因文库在严谨条件下进行菌落杂交，获得2 0 个信号较 强的菌落。提取质粒d n a ，b a m h l 酶切后，以o 9 k b 片段为探针s o u t h e m 杂交1 2 个克隆显示杂交信号，将8 个克隆d n a 以b a m h l 酶切片段排序， 发现不能完全重叠，初步分析s t r e p t o m y c e s h y g r o s c o p i c u s l 7 9 9 7r i l 可能含有1 个以t p k si 型基因簇，此现象在细菌q | 很普遍。对这8 个克隆的部分b a m h i r 片段进行测序，发现其中6 个克隆的d n a 均与p k si 型基因有较高的同源 性( 尚广。东，结果未发表) 。 本论文的目的是首次在g e l d a n a m y c i n 产生菌s t r e p t o m y c e s h y g r o s c o p i c u s l 7 9 9 7 中建立以中c 3 l 噬菌体的基因转染系统，利用基因阻断技 术确证与g e l d a n a m y c i n 生物合成相关基因。本研究对于g e l d a n a m y c jn 生物 合成基因簇的克隆、并最终阐明生物合成途径具有重要意义。 9 第一部分噬菌体k c 5 1 5 的纯化、增殖及d n a 制备 材料与方法 1 材料部分 1 1 菌种 变铅青链霉菌sl i v i d a n s1 3 2 6 ，噬菌体感染指示菌。 1 2 噬菌体 k c 5 1 5 ，链霉菌温和噬菌体巾c 3 l 衍生载体，可转导溶源菌硫链丝菌素 抗性( t h i o ) 和紫霉素抗性( v i o ) 。 1 3 特殊试剂 p e g 一6 0 0 0 ，为美国m e r c k s c h u c h a r d t 公司产品： b a c t on u t r i e n tb r o t h 为d i f c o 公司产品： 琼脂，购自青岛水产品加工厂。 噬菌体d n a 提取k i t 购自q i a g e n 公司 1 4 培养基 ( 1 ) d i f i c o 营养琼脂( d b a ) 用于噬菌体的繁殖。 n u t r i e n tb r o t hl5 9 琼脂 1 5 9 蒸馏水 1 0 0 0 m l d i f i c o 营养软琼脂( s n a ) n u t r i e n tb r o t h 8 9 琼脂5 9 蒸馏水 1 0 0 0 m l s n a d b a 使用时加入2 0 葡萄糖伞终浓度o 5 ， 0 加入m g s 0 4 1 0 m 至终浓度1 0 m m 加入c a ( n 0 3 ) 2 0 8 m 至终浓度8 m m d i f i c o 营养肉汤( d n b l n u t r i e n tb r o t h 8 9 蒸馏水 1 0 0 0 m l 以上均为自然p h ，1 0 磅2 0 分灭菌 1 5 噬菌体d n a 提取用缓冲液及试剂 b u f f e rl i ：n a c i3 0 0 r a m ；t r i s c i1 0 0 r a m ；p h7 5 e d t a 1 0 m m ；b s ao 2 m m l ； r n a s ea 2 0 m g m l ；d n a s e i 6 m g m l b u f f e rl 2 ：p e g6 0 0 0 3 0 ：n a c l3 m b u f f e rl 3 ：n a c i1 0 0 m m ；t r i s c i1 0 0 m m ，p h7 5 ；e d t a 2 5 m m b u f f e rl 4 ：s d s4 b u f f e rl 5 ：k a c 3 m ，p h 5 5 b u f f e rq b t ：( e q u i l i b r a t i o nb u f f e r ) n a c l7 5 0 m m ；m o p s5 0 m m ，p h7 o ； i s o p r o p a n o l15 ：t r i t o nx - 1 0 00 15 b u f f e rq c ：( w a d hb u f f e r ) n a c i1 0 m ，m o p s5 0 m m ，p h 7 o ；i s o p r o p a n o l 1 5 b u f f e r q f ：( e l u t i o nb u f f e r ) n a c i 1 2 5 m ，t r i s c i5 0 r a m ，p h8 5 ； i s o p r o p a n o l 1 5 t e ：t r i s c i1 0 m m p h8 0 ：e d t al m m s m ：( s u s p e n s i o nm e d i u m ) t r i s c i5 0 m m ，p h 7 5 ；n a c l0 1 m ； m g s 0 4 8 m m ；g e l a t i n 0 01 m tb u f f e r ：y r i s c il mp h7 5 】m 1 m g c l 2 1 m0 1 m l ，h 2 01 0 0 m l s d sm i x e ds o l u t i o n ：t r i s c i2 m ( p h9 , 6 ) ，e d t a - n a0 5 m ( p h7 4 ) ， l i s d s1 0 ( 1 v 2 v l v ) k a c 8 m ：不凋p h 用w h a t m a n1 号滤纸过滤 2 方法部分 2 1 噬菌体k c 5 1 5 的滴度测定及分离 取0 1 m l 噬蔚体原液用d n b 按1 0 倍稀释法做系列稀释，分别吸取0 1 m l 各稀释度及原液的样品，置于直径9 c m 平皿底层d b a ( 含葡萄糖0 5 和 m g s 0 4 1 0 m m ，c a ( n o ，) ? 8 m m ) ：加入3 m l 上层营养软琼脂s n a ( 含指示菌 冀l i v i d a t s1 3 2 6 孢子，浓度1 0 m 1 ) 于每个平皿，旋转平皿，使h 层s n a 覆盖整个底层培养基，静置5 一1 0 分钟，培养皿倒置，3 0 培养过夜，进行噬 菌斑计数。 2 2 单个噬菌斑的纯化“ 无菌玻璃滴管挑取新鲜的上层s n a 分隔良好( 需至少l c m ) 的单噬菌斑， 挑至i m l d n b 中，室温放置2 h ，浸出液做1 0 倍系列稀释。取0 1 m l 稀释和原 液的噬菌体悬液，分别置于2 个直径9 c m 的培养基平皿上，加入3 m l 上层s n a ( 含指示菌孢子) 于每个平皿，旋转混匀，静止l o 分，3 0 c 培养过夜，翌闩 于几乎形成汇合噬菌斑的平皿上，加入2 5 m l d n b 使其浸没表面，其删或旋摇， 置于室温2 h ，5 m l 注射器吸 = 平皿上的d n b ，以0 4 s u m 的硝酸纤维素膜过滤 二j | e p p e n d o r f 管，胃4 避光保存。 2 3 噬菌体的保存 噬菌体通常用d n b 制成悬液，置于4 f 避光保存。也可用滤纸芯蘸悬 液后制成真空干燥样品保存。最好的保存方式是提取d n a 于一2 0 。c ，可长期保 存。 2 4 噬菌体k c 5 1 5d n a 的提取 2 4 1 方法l 准备3 个琼脂平皿，上面倒有2 5 m l 接种有0 1 m l 含2 1 0 l 成斑单位噬 菌体的d n b 营养液的顶层软琼脂( 含有矗1 i v i d a n s1 3 2 6 孢子) 。培养噬菌体 过夜。用玻璃刮铲将顶层软琼脂刮下，将其倒入装在5 0 m l 离心管中的1 2 m l d n b 中，用l o m l 吸管吸吹2 次，罨于室温2 小时。在4 ，以1 0 ，0 0 0 转分( 1 6 ， 0 0 0 9 ) 离心1 0 分钟去除琼脂。缓慢将上清液倒入3 0 m 离心管，4 c 、2 5 ， 0 0 0 r m i n ( 5 5 ，0 0 0 9 ) 离心7 5 分钟以沉淀噬菌体。弃上清，将噬菌体沉淀重 新悬浮在4 0 0 u l 核糖核酸酶溶液中，3 7 。c 摇床培养2 0 分钟。转移到e p p e n d o r f 管中，加入8 0 u l s d s 混合液，在7 0 。c 水浴中放置3 0 分钟。立即加入1 0 0 m8 m k a c ，放在冰浴中1 5 分钟。微型高速离心机在4 c 离心1 0 分钟。小心将上清 转移至一个新的e p p e n d o r f 管中，与等体积的苯酚氯仿( p b8 0 ) 混合， 手摇5 分钟。微型高速离心机离心5 分钟，将= 相分丌，并将上层液相转到 新的微量离心管中。加入5 0 0 u l 的异丙醇，混匀置于室温5 分钟。高速离心 5 分钟以沉淀d n a ，倾干上清，再离心2 秒钟，用微量移液器除去所有液体。 以7 0 乙醇洗涤沉淀，重复离心，去除所有上清，沉淀溶解在2 5 - l o o u l 的t e 缓冲液中置于4 储存。 2 4 2 方法2 于l o m l 噬菌体裂解液中加入3 0 u lb u f f e rl 1 ，3 7 。c 培养3 0 分钟。加入 2 m l 冰浴的b u f f e rl 2 混匀，冰上放置6 0 分钟。大于1 0 ，0 0 0 9 离心1 0 分 钟弃上清。沉淀重悬于l m lb u f i e fl 3 ，加入1 m l b u f f e r1 , 4 ，混匀，7 0 培养1 0 分钟：加入l m l b u f f e rl 5 ，立即混匀，反转离心管4 6 次，大于 1 5 ，0 0 0 94 c 离心3 0 分钟，转移上清。大于1 5 ，0 0 0 94 c 再次离心1 0 分钟， 转移 ：清至新管。用l m l b u f f e rq b t 平衡q i a g e n t i p ，将上述上清液倾入 平衡后的t i p ，使其自然流下；2 m l b u f f e r q c 洗涤：1 5 m l b u f f e rq f 沈脱d n a 1 3 于一个新管中。室温异丙醇l m l 沉淀，混匀，大于1 5 ，0 0 0 94 离心3 0 分 钟，弃上清。l m l 7 0 乙醇室温沉淀，大于1 5 ，0 0 0 9 离，1 1 , 1 0 分钟，弃上清， 室温于燥5 一1 0 分钟，溶解于适量体积t e ( p h 8 5 ) 中。( 按q i a g e nk i t 说明 1 i ) 2 5k c 5 1 5d n a 小量提取鉴定( 重组子鉴定) 转染后单噬菌斑挑取于2 0 0 u ld n b 中，室温浸泡2 h 或4 过夜， 1 0 ，0 0 0 r m i n 离心2 分，取上清备用。 耿曼1 i v d a r t s1 3 2 6 浓孢子悬液接种3 m 1r 2 y e 液体培养基，2 8 、2 2 0 r p m 摇床培养过夜，翌同于每中管培养液加入各不同单噬菌斑悬液i o o u l ，继续 培养5 6 h ，培养液1 0 ，0 0 0 r p m 离心1 分钟，转移上清，加等体积预冷2 0 p e g 和2 mn a c i ，冰浴1 h ，大于1 0 ，0 0 0 r m i n 离心1 0 分钟，将噬菌体沉淀悬浮于 4 0 0 u l 核糖核酸酶溶液，3 7 培养2 0 分钟，转移至e p p e n d o r f 管，加入8 0 u l s d s 混合液，7 0 水浴3 0 分钟，立即加入l o o u l8 mk a c ，冰浴1 5 分钟，1 0 ，0 0 0 r m i n 微型高速离心机离心l o 分钟，上清以等体积酚氯仿( p h 8 0 ) 抽提， 1 0 ，0 0 0 r m i n 离一i i , 1 0 分钟，上清转移新e p p e n d o r f 管，加等体积异丙醇沉淀， 7 0 乙醇洗涤，溶于2 0 u lt e ，b a m hi 酶切鉴定。 2 6 链霉菌孢子悬液的制备 加9 m l2 0 甘油( 含0 1 吐温8 0 ) 至菌种平板或大斜面上，用无菌接种 环刮取表面的孢子制成悬液，将此悬液倒入加有玻璃珠的无菌大试管中。剧 烈振荡2 5 分钟，用装有脱脂棉的无菌试管过滤，3 0 0 0 r m i n 离心7 分钟沉淀 孢子，立即倒掉上清，振荡使孢予分散于残留液，加入1 5 m l2 0 t t 油使孢 子悬浮，一7 0 储存备用。 4 二、结果与讨论 本实验所用载体为链霉菌温和噬菌体中c 3 l 之衍生载体k c 5 t 5 ( c + ， a t t p ) ，k c 5 1 5 的基因组全长约3 8 2 k b ，是双链d n a 分子，在k c 5 1 5 噬菌 体粒子内，浚d n a 为一线状双链分子，其两端具长为1 0 个核苷酸的互补c o s 粘端j ，当噬菌体进入宿主细胞后，c o s 粘端通过碱基配对而结合，形成环 状分子，并在相隔1 0 b p 处形成两个交错切口，随后在宿主体内的d n a 连接 酶作用下很快将切口封闭形成闭环d n a 分子。该d n a 分子在感染的早期充 当转录模板。 k c 5 1 5 为插入型载体，含有6 个单克隆位点，以t h i o 和v i o 抗性为筛选 标记。在k c 5 1 5 载体中具有完整的阻遏基因，位于其d n a 分子的中部， 噬菌体整合到宿主染色体上后，由于阻遏基因的表达产物抑制了裂解途径， 故可维持噬菌体处于溶源状态。其相应的a t t p 位点已被缺失，为外源d n a 的插入留有更多的空问。受噬菌体包装限制，k c 5 1 5 最大插入片段为4 k b ， 由于k c 5 1 5 上有两个相邻的s s t l 位点，其问相邻o 5 k b ，因此用s s t l 位点进 行克隆时，可插入4 5 k b 大小的外源片段。噬菌体k c5 1 5 单克隆位点限制性 图谱“： ic o s b g l 1 噬菌体纯化 图1 k c 5 i5 载体克隆位点限制性| 1 6 | 谱 对于本实验室现存的i 鉴菌体k c 5 1 5 原液进行了滴度测定，结果每毫升悬 液中仅存8 0 、1 0 3 p f u ，由于保存时| 日j 长温度不稳定等原因，其活力单位、 1 5 纯度均明显下降，不能满足下一步实验要求，故对其进行了多轮单斑分离纯 化。 1 1 铺平板孢子的制备 接种s 1 i v i d a n s l 3 2 6 于合成五号固体斜面培养基，2 8 。c 培养7 天，根据方 法2 6 制各链霉菌孢子悬液，以2 0 的甘油悬浮，孢子浓度达1 0 8 m l ，储减 在一2 0 备用。 1 2 噬菌体k c 5 1 5 的铺平板培养 在固体平板上，单个噬菌体粒子感染一个细菌后就可形成一个噬菌斑， 它的子代继续感染邻近的细胞，后者可再释放下一代噬菌体颗粒。出于在固 体平板上生长噬菌体的扩散受到限制，此时，个噬菌体的连续感染就形成 一个不断扩大的噬菌斑，由于每个噬斑含单个噬菌体的子代颗粒，因而就可 以获得遗传学上一致的大量噬菌体颗粒。 根据方法2 2 ，挑取分隔良好的噬菌体单斑，于d b a s n a 双层平皿连续 分离，至所出现的噬菌斑大小较为均匀，出斑时间基本一致为e ，然后将多 轮纯化的单斑浸液通过孔径为o 4 5 p m 的硝酸纤维素滤膜过滤除菌，进行不 同倍数的稀释，调整用于铺平板的噬菌体的数量，以使经过约1 2 小时的培养 后逐渐扩大的噬斑外缘刚好相互接触，噬菌体k c 5 1 5 在常用的9 m m 平皿上， 通常接种1 0 4p f u 就足以使菌苔发生汇合裂解，取形成汇合噬斑之平皿，制 备噬菌体原液，过滤除菌，滴度可达1 0 8 1 0 9 p f u m l ，于d n b 中4 0 保存。 2 噬茵体k c 5 1 5 的增殖 本试验以噬菌体k c 5 1 5 作为克隆载体，必须提取噬菌体的d n a ，首先需 要收获高滴度噬菌体粒子，据测算，每个k c 5 1 5 病毒粒子约含4 x l o 。i t g d n a ， 荇要得到2 0 n g 一5 0 n g d n a ( o 8 琼脂糖凝胶电泳可见条带为准) ，则需噬菌 体粒子数至少为： 2 0 5 0 n 2 4 x 1 0 川= 0 ，5 x 1 0 1 2 1 2 5 x 1 0 1 2 ( 提取过程中的损失尚不计算) 也就是说，用来提取d n a 的噬菌体裂解液滴度应达至1 - l o ”个数量级，爿 能有效的提取。然而，于2 8 。c 双层汇合平皿中收获的噬菌体裂解液，其滴度 一般仅在1 0 8 1 0 9 个数量级，考虑到沉淀及提取过程中的损失，单纯提高噬 菌体裂解液体积无法满足d n a 提取要求，必须提高单位体积内噬菌体的滴 度，爿能达到高效、大量的提取。 噬菌体吸附宿主菌时，过高的感染复数会导致宿主菌瞬阳j 裂解，达不到增 殖的目的，太低的感染复数又会使培养时间延长。为最大限度地提高噬菌体 的产量，我们将感染指示菌sl i v i d a n s1 3 2 6 孢子接种量调整为1 0 7 m l ，噬 菌体接入浓度为1 0 8 m l 。据文献报导1 ，k c 5 1 5 病毒粒子的每一轮营养噬菌 体感染大约需要5 0 分钟，每个细胞裂解后释放1 0 1 0 0 个噬菌体，如果最初 接入的噬菌体量为1 07 p f u ，5 个小时后，( 约5 轮营养繁殖) ，滴度应达到 1 0 ”p f u ，以此为依据，我们考察了不同培养基及固、液两种状态下，噬 菌体在不同温度中的裂解情况。 2 1 培养基对噬菌体k c 5 1 5 繁殖的影响 2 1 1 以最常用的b a c t o n u t r i e n t b r o t h 为基础，首先考察了在液体培养和固体 培养时噬菌体k c 5 1 5 的繁殖情况，培养温度3