（生物医学工程专业论文）原核表达重组人骨形态发生蛋白6的条件优化及活性分析.pdf

a b s t r a c t a b s t r a c t b o n em o r p h o g e n e t i cp r o t e i n s ( b m p s ) b e l o n gt ot h et r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r ( t g f ) - b e t as u p e r f a m i l y m a n yi nv i t r oa n di nv i v os t u d i e sd e m o n s t r a t e dt h a tb m p s c o u l di n d u c ec a r t i l a g ea n db o n ef o r m a t i o n , i n d u c ee c t o p i cb o n ef o r m a t i o n ，h e a lb o n e f r a c t u r e s ，a n ds o0 1 1 b m p 6i sa ni m p o r t a n tm e m b e ro ft h eb m p sf a m i l y , i tn o to n l y i n d u c e se n t o c h o n d r o s t o s i sa n di n t r a m e m b r a n o u so s s i f i c a t i o n ，b u ta l s oh a sf u n c t i o n s i nt h ed e v e l o p m e n to fh e a r t , l i v e r , s t e a p i n , s m a l li n t e s t i n e sa n dm a n yo t h e ro r g a n s a st h e r ei sl i t t l eb m p si nb o n et i s s u e ，w ec a l lp r e p a r er e c o m b i n a n th u m a n b m p 6 ( r h b m p 6 ) b yg e n er e c o m b i n a t i o nt e c h n o l o g yt om e e tt h en e e d so fb a s i c r e s e a r c h a n d c l i n i c a l a p p l i c a t i o n r e c o m b i n a n te s c h e r i c h i ac o b b l 21 ( d e 3 ) p e t l5 b - b m p 6c e l l s e x p r e s s i n g r h b m p 6h a db e e n s u c c e s s f u l l y c o n s t r u c t e di no u rl a b o r a t o r y , a n dr h b m p 6e x i s t sa si n s o l u b l ei n c l u s i o nb o d i si n c y t o p l a s m f o rl a r g e s c a l ep r o d u c t i o no fr e c o m b i n a n tp r o t e i nf o ri nv i v ot h e r a p y , w e o p t i m i z et h ec o n d i t i o n so fi n d u c e de x p r e s s i o n ，p u r i f i c a t i o na n ds o l u b i l i z a t i o no f r h b m p 6i n c l u s i o nb o d i e s a f t e rt h er e n a t u r a t i o no fr h b m p 6m o n o m e r , w ec o m p a r e d t h ea c t i v i t yd i f f e r e n c eb e t w e e no u i r h b m p 6a n dt h eh b m p 6s t a n d a r ds a m p l eb ya l p a c t i v i t ya n a l y s i s 1 o p t i m i z i n gp r o k a r y o t i ci n d u c e de x p r e s s i o nc o n d i t i o n so fr h b m p 6 t h eb e s te x p r e s s i o nc o n d i t i o n sw e r et h a tt h ei n d u c t i o ns t a r ta so d 6 0 0 衄r e a c h e d a b o u t1 4b ya d d i n gi p t gt oaf i n a lc o n c e n t r a t i o no f1 0 m m o l la n dt h e nc o n t i n u e d i n c u b a t i o nf o r4h o u r sa t3 7 。c ( 2 0 0r m i n ) i nt h el bm e d i u mc o n t a i n i n g10 0 m g l a m p i c i l l i n t h em a x i m u my i e l do fr e c o m b i n a n tp r o t e i nw a sa b o u t8 0 o f t h et o t a l m a s so fc e l lp r o t e i n s 2 o p t i m i z i n gt h ep u r i f i c a t i o na n ds o l u b i l i z a t i o nc o n d i t i o n s o fr h b m p 6 i n c l u s i o nb o d i s w ei n v e s t i g a t e dt h ep u r i f i c i a t i o no fr h b m p 6i n c l u s i o nb o d i s ，a n dt h ey i e l do f r h b m p 6w a s5 0 m gr h b m p 6 ll b t h es o l u b i l i z a t i o nc o n d i t i o no fr h b m p 6i n c l u s i o n b o d i sw a s0 1 m m o l lt r i s h c l ( p h 8 0 ) + 0 2 5 m o l ln a c l + o 4m o l lg d n h c l ，w e c o u l dg e t10 m gr h b m p 6 ll b i i a b s t r a c t 3 a l pa c t i v i t ya n a l y s i so ft h er h b m p 6p r e p a r e d a f t e rt h er e n a t u r a t i o no fr h b m p 6m o n o m e r , t h er h b m p 6d i m e rc o n s i s t e do f 11 6 8 o ft h et o t a lp r o t e i n i ns u m m a r y , w eo p t i m i z e dt h ei n d u c e de x p r e s s i o nc o n d i t i o n so fr h b m p 6i n e c o l i ，p u r i f i c a t i o na n ds o l u b i l i z a t i o nc o n d i t i o n so fi n c l u s i o nb o d i e s t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h em o n o m e rp r o t e i np u r i t yw i l t sm o r et h a n9 6 10 m gr l m m p 6 ll b ， a l pr e s u l ts h o w e dt h a tt h er h b m p 6d i m e rp r e p a r e dw a sf u n c t i o n a l l ya c t i v e t h e b i o l o g i c a la c t i v i t yw a sl0 15 o f t h es t r a n d a r ds a m p l e k e yw o r d s ：b o n em o r p h o g e n e t i cp r o t e i n 一6 e s c h e r i c h i ac o l ii n c l u s i o nb o d i s p u r i f i c a t i o n a l p i i i 南开大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解南开大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、 扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提供 本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国家有 关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目的的前 提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名：廖犯 伽叩年伽日 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在年解密后适用 本授权书。 指导教师签名：学位论文作者签名： 解密时间：年月日 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下： 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 学位论文作者签名：亳造， p 7 年月日 南开大掌学位论文电子版授权使用协议 ( 请将此协议书装订于论文首页) 论文 系本人在 南开大学工作和学习期间创作完成的作品，并己通过论文答辩。 本人系本作品的唯一作者( 第一作者) ，即著作权人。现本人同意将本作品收 录于“南开大学博硕士学位论文全文数据库”。本人承诺：已提交的学位论文电子 版与印刷版论文的内容一致，如因不同而引起学术声誉上的损失由本人自负。 本人完全了解直五丕堂图壹焦苤王堡在：焦旦堂鱼诠塞的笸理壶这! 同意 南开大学图书馆在下述范围内免费使用本人作品的电子版： 本作品呈交当年，在校园网上提供论文目录检索、文摘浏览以及论文全文部分 浏览服务( 论文前1 6 页) 。公开级学位论文全文电子版于提交1 年后，在校园网上允 许读者浏览并下载全文。 注：本协议书对于“非公开学位论文在保密期限过后同样适用。 院系所名称： 作者签名： 学号： 日期： 年月 日 第一章引言 第一章引言 b m p s 最初被认为是脱钙骨基质的主要成分，异位植入脱钙骨基质可使新骨 组织形成或者修复骨折。1 9 6 5 年u r i s t 1 j 将脱钙骨基质及其提取物植入大鼠和兔 的皮下或肌肉内，发现植入部位出现异位成骨现象，推测脱钙骨基质中可能含 有一种活性蛋白，这种活性蛋白具有使未分化的间充质细胞定向分化为成骨细 胞和形成骨组织的能力，这就是后来命名的骨形态发生蛋白( b o n em o r p h o g e n e t i c p r o t e i n s ，b m p s ) 。u r i s t 实验的成功使骨诱导理论得到证实，为骨折修复研究起到 了重要作用。r e d d i 和h u g g i n s 2 j 对去矿物质骨基质在皮下的异位骨形成进行了 分期描述。1 9 8 8 年w a n g 3 】等从牛脱钙骨基质中分离出纯度更高、活性更强的骨 形态发生蛋白，经非还原性s d s p a g e 电泳后，其活性片段分子量为3 0k d a 。 但还原后其生物活性消失，该片段分离出分子量为3 0k d a 、1 8k d a 和1 6k d a 三 个蛋白多肽。将这些蛋白多肽混合物进行胰蛋白酶消化后，用高效液相层析分 离获得数个小肽链，并测出氨基酸序列。w o z n e y 4 】等以上述肽段为依据，合成 数个寡核苷酸片段，并以这些寡核苷酸片段为探针，从人的e d n a 文库中筛选 出b m p 1 、b m p 2 、b m p 3 和b m p - 4 的e d n a 克隆。1 9 9 0 年c e l e s t e 5 l 等亦用 上述分子生物学技术路线克隆出b m p 5 、b m p 一6 、b m p 7 。同期o z k a y n a k 6 】也 用设计的基因探针从人基因文库中筛选出成骨蛋白i ( o p 1 ) 的基因克隆，即 b m p - 7 。1 9 9 2 年o z k a y n a k 7 等用0 p 1 探针从小鼠的e d n a 文库中筛选到o p 2 ， 即b m p 8 的克隆。1 9 9 4 年c e l e s t e 8 】等克隆出b m p 9 。同年c h a n 9 9 】等将部分纯 化的新生牛关节软骨提取物植入大鼠皮下，诱发软骨及骨形成。以牛关节软骨 r n a 为模板，以此提取物的部分氨基酸序列设计引物，通过逆转录聚合酶链反 应合成e d n a ，以此e d n a 为探针在人基因文库中筛选出软骨衍生骨形态发生蛋 白1 和软骨衍生骨形态发生蛋白2 ，即b m p 1 4 ( g d f 5 c d m p 1 ) 和 b m p 1 3 ( g d f 一6 ，c d m p 2 ) 。从氨基酸序列分析来看，除b m p 1 是一种蛋白酶外， 其余的b m p s 均属于转化生长因子( t r a n s f o r m a t i o ng r o w t hf a c t o r ，t g f ) p 超家族 的成员，与t g f - p 同源性达2 0 3 0 ，并且是t g f d 超家族中成员最多、增加最 快的一个蛋白家族。目前，已经有4 0 多个b m p s 基因相继被克隆【l o 】，b m p s 家 族至少包括2 0 个成员，根据结构的相似性，b m p s 家族可以分为以下五个主要 亚族以及其他一些尚不十分明确的亚族：( 1 ) 果蝇的d e c a p e n t a p l e g i c 基因产物 第一章引言 ( d p p ) ，b m p 2 ，b m p 4 ；( 2 ) 6 0 a ，内含短耳等位基因( b m p 5 ) ，b m p 6 v g r - 1 ， b m p 7 o p 一1 ，b m p 8 a j o p - 2 ，b m p 8 b o p - 3 ；( 3 ) b m p 3 o s t e o g e n i n ，g d f 1 0 ；( 4 ) b m p 9 ， b m p i o ，d o r - s a l i n 1 ；( 5 ) b m p l 2 g d f 7 ，b m p l 3 g d f 6 ，g d f 5 1 0 1 。b m p s 是结 构类似的高度保守的功能蛋白质族，其c 端有一个高度保守的结构域，内含7 个位置保守的半胱氨酸。b m p s 合成时是一个大的前体蛋白，包括一个信号肽部 分，一个前结构域( p r o d o m a i n ) 及一个约含有1 0 0 1 2 5 个氨基酸的羧基末端区。 其中在羧基末端区含有的7 个保守的半胱氨酸残基对于形成正确的二聚体结构 有重要意义。当羧基末端区经蛋白水解酶作用从前体蛋白上释放出来后，便产 生成熟的、有活性的同源或异源b m p s 二聚体复合物。 许多b m p s 的体外( i i lv i t r o ) 和体l 为( i nv i v o ) 实验表明b m p s 具有调节成骨细 胞和成软骨细胞的分化，诱导异位骨形成，促进骨折愈合，以及具有控制哺乳 动物骨骼不同形态特征形成的功能【1 1 1 ，因此在治疗骨损伤和骨疾病方面有广泛 的应用前景。b m p s 在例如哺乳动物、鱼类、两栖类、鸟类等多种物种中存在。 b m p 1 i k e 分子途径在果蝇和线虫等无脊椎动物体内被发现【1 2 以6 1 。b m p s 被认为具 有多效性，以多种方式作用在不同的组织。b m p s 在不同生物过程如组织愈合、 再生和维持；小鼠发育突变分析；斑马鱼和爪蟾胚胎发育和人类发育异常分析 中起重要作用【r 卜2 2 】。事实上，目前的研究结果表明：b m p s 的广泛生物学作用不 仅限于骨的发育和生成，还在胚胎发育、神经发育和修复、造血组织发育及诱 导细胞凋亡过程中也起着重要作用。目前，b m p s 在临床的主要应用思路是作为 骨再生的诱导因子，b m p s 将被应用于脊柱融合、长骨缺损、选择性骨折修复、 颅颌面部疾病以及牙与牙周疾病，具有广泛的应用前景。 b m p 6 是b m p s 家族中发现较晚的一员，最初是从鼠胎盘c d n a 文库中分 离得到的，并根据其与爪蟾属相类似，被命名为生长相关苍白基因( v g r - 1 ) 。1 9 9 0 年c e l e s t e 5 】等从人胎盘和胎脑c d n a 文库中分别克隆到v g r - 1 的同源基因，根据 它与b m p 家族的同源性定名为h b m p 6 。b m p 6 是b m p s 中6 0 a 亚族中的一员， 根据氨基酸序列同源性，b m p 5 、b m p 6 、b m p 7 组成b m p s 的一个亚族，其中 h b m p 5 和h b m p 6 定位于人第6 号染色体上。h b m p 6 基因位于6 p 2 4 p 2 3 ，c d n a 全长为2 9 4 3 b p ，开放读码框为1 5 3 9b p ，编码一个5 1 3 氨基酸残基的多肽，其 中包括一个n 端信号肽( 2 3 个氨基酸) 和一个b m p 6 前肽( 4 9 0 个氨基酸) 。 b m p 6 前肽中含有4 个保守的双碱性氨基酸残基的酶切位点- r n r ，在蛋白 水解酶的作用下产生含1 4 0 个氨基酸残基的成熟肽，相对分子量约为1 5 6k d a ， 2 第章引言 为8 6 。成熟的b m p 6 被分泌到细胞外，含有7 个绝对保守的半胱氨酸残基和 3 个潜在的n 一连接糖基化位点【5 】。作为一种骨诱导因子，b m p 6 能启动软骨细胞 成熟，诱导间充质细胞向成软骨细胞方向分化，是软骨细胞分化的一个自分泌 刺激因子。与b m p s 家族其他成员相比，b m p 6 以软骨内和膜内成骨方式产生 很强的骨诱导作用 2 3 , 2 4 。b m p 6 的生物学作用不仅限于骨的生成，还参与心脏、 肝脏、胰腺及小肠等多个器官的发育。一些研究表明，b m p 6 受雌激素选择性上 调，在治疗妇女绝经后期原发性骨质疏松症方面具有独特优势。另外，b m p 6 还 参与抑制乳腺癌上皮细胞间质转化过程，发现b m p 6 的表达与某些肿瘤细胞的 分化程度有关，并可作为预后不良的一个指标。 b m p 6 有如此广泛的生物学作用，如果单纯地将b m p 6 植入体内，扩散太快， 也易被蛋白酶分解，因而不能在有效的时间内作用于更多的靶细胞，其诱骨活 性难以得到充分发挥。另外，对于较大的骨质缺损，它不能提供支架作用。因 此，人们在应用r h b m p 6 进行骨缺损修复的研究时，常将它与一些能充当其缓释 载体并能发挥支架作用的材料进行复合移植。迄今为止研究报道的b m p s 载体已 有许多种，包括有机材料( i 型胶原、可溶性胶原海绵、纤维蛋白、脱矿骨基 质、同源松质骨、可溶性非胶原蛋白、胎儿骨、骨基质明胶等) 和无机材料( 多 聚乳酸、微孔纯钛、钙磷类无机物如羟基磷灰石、磷酸三钙、珊瑚、石膏等) 两大类。b m p s 的理想材料应当具备：( 1 ) 良好的生物相容性，能保持适当的空隙 率，起到支架作用，利于细胞生长，血管生成；( 2 ) 能够在一定时间保持b m p s 蛋 白的活性，并向周围缓慢释放b m p s ：( 3 ) 无细胞毒性，无免疫原性，有生物可降 解性，与b m p s 复合简便；( 4 ) 载体材料易于获取、消毒和储备。近年来一些大的 材料制造厂家所生产的材料，c o p o l y m e r ，c h a ，a l g i p o r e ，t c p ，b i o o s s ，胶 原基质( i c b m ) ，胶原，珊瑚等，用作b m p 的载体，也有人将上述不同的材料作 成复合材料，用作b m p s 的载体，都显示出良好的应用前景。 然而b m p s 在骨组织中含量微小( 1 - 2 n g g 骨组织) ，为了得到临床够量的 b m p s ，常常需要许多动物骨头来提取。因此天然b m p s 存在来源受限的缺点。 另外，动物来源的b m p s 毕竟不是人类自身的蛋白质，尽管其免疫原性弱，在人 体内还是会引起一定的免疫反应，而且它与人类自身的b m p s 在诱导成骨作用上 可能不尽相同。因而，在临床上应用人b m p s ( h b m p s ) 应是最理想的。但是，人 新鲜骨质来源有限，难以满足提取h b m p s 的需要。无论从动物还是从人的骨质 中提取b m p s ，步骤繁杂，各批提取物的纯度和活性常不相同，质量难以保证。 3 第一章引言 通常情况下克隆基因可以放在不同的宿主细胞中表达，可用大肠杆菌、枯 草杆菌、酵母、昆虫细胞、培养的哺乳类动物细胞、以至整体动物。要表达真 核生物的蛋白质，常用酵母、昆虫、动物和哺乳类细胞等表达系统。真核表达 载体至少要含两类序列：( 1 ) 原核质粒的序列，包括在大肠杆菌中起作用的复制 起始序列、能用在细菌中筛选克隆的抗药性基因标志等，以便插入真核基因后 能先在很方便操作的大肠杆菌系统中筛选获得目的重组d n a 克隆、并复制繁殖 得到足够使用的数量。( 2 ) 在真核宿主细胞中表达重组基因所需要的元件，包括 启动子、增强子、转录终止和加p o l y a 信号序列、m r n a 剪接信号序列、能在 宿主细胞中复制或增殖的序列，能用在宿主细胞中筛选的标志基因、以及供外 源基因插入的单一限制性内切酶识别位点等。由哺乳动物细胞翻译后再加工修 饰产生的外源蛋白质，在活性方面胜于原核表达系统及酵母、昆虫细胞等真核 表达系统，更接近于天然蛋白质，但表达量低、生产成本高、周期长、操作繁 琐。 大肠杆菌具有遗传背景清楚、易于操作、生长迅速、表达量高、培养成本 低等优点，再加上多年来外源基因表达的经验使其在大多数科研与应用中成为 高效表达外源蛋白最常用的原核表达系统。利用大肠杆菌成功表达的重组蛋白 包括工业酶类( 凝乳酶、淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等o h e 治疗性蛋白( 非格 司亭、生长激素、胰岛素、干扰素等) 。 大肠杆菌是目前基因工程中应用最为广泛的宿主细胞，可以以极高的水平 表达外源蛋白，但外源蛋白往往错误折叠以没有生物活性的包涵体形式存在， 必须将其经过变性复性的处理才有可能得到具有生物活性的目的蛋白 2 5 】。 l o n g 2 6 1 构建工程菌e c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) p e 2 1 a b m p 2 ，蛋白经复性后，可从每克 湿细胞中得到高达2 9 4 m gr h b m p 2 二聚体，其活性与从中国仓鼠卵巢( c h i n e s e h a m s t e ro v a r y ，c h o ) 细胞中纯化得到的r h b m p 2 活性相同。v a l l e j o 2 7 利用e c o l i t g l 表达r h b m p 2 ，进行高细胞密度培养( h c d c ) 后，细胞生物量可达7 5 9 l 培 养基，8 6 9r h b m p 2 l 培养基，经复性后可得10 m gr h b m p 2 二聚体克干细胞， 7 5 0 m gr h b m p 2 二聚体升培养物，复性率超过5 0 。其活性与从c h o 细胞中纯 化得到的r h b m p 2 活性相同。 鉴于以上研究结果，本实验室尝试利用基因工程技术表达重组人骨形态发 生蛋白6 。在前期工作中，本实验室构建了表达r h b m p 6 的重组大肠杆菌细胞株 e c o i lb l 2 1 ( d e 3 ) p e t l 5 b b m p 6 【z 川。本文的研究工作主要是：( 1 ) l l 较m 9 、l b 、 4 第一章引言 r m e d i u m 三种培养基中细菌生长水平及蛋白表达水平，选择l b 为最适r h b m p 6 生产的培养基。优化诱导时机、诱导时间、诱导温度、诱导剂浓度及氨苄青霉 素( a m p i e i l l i n ) 浓度。( 2 ) 简化r h b m p 6 包涵体纯化步骤；分析缓冲液p h 、金属阳 离子、阳离子螯合剂及g d n h c l 对包涵体溶解度的影响，选择合适的包涵体溶 解缓冲液。( 3 ) 通过s d s p a g e 和w e s t e r nb l o t 鉴定纯化后的r h b m p 6 ，最终通过 碱性磷酸酶活性分析比较所制备的r h b m p 6 与h b m p 6 标准品间的活性差异。本 文的研究工作为原核表达系统中生产r h b m p 6 及其他性质相似蛋白提供前期基 础。 5 第二章实验仪器与材料 第二章实验仪器与材料 第一节主要实验仪器 t h z 8 2 b 气浴恒温振荡器 c e n t r i f u g e 5 4 1 5 台式高速离心机 u n i v e r s a l3 2 r 台式高速冷冻离心机 m i l l i p o r e 纯水器 u 2 0 0 1 紫外分光光度计 紫外凝胶成像分析系统 g w - i 型高精度双路双稳电泳仪 d y y - i i i 垂直电泳仪 电转仪 b p l 2 1 s 电子天平 l a b c o n c o 超净台 a f 2 0 0 p s c 制冰机 5 3 4 6 摇荡空气仪 c r 2 1 e 冷冻高速离心机 n a p c o 细胞培养箱 低温循环水浴 细胞高压灭菌锅 d c l 0 0 荧光倒置显微镜 6 江苏省金坛市医疗仪器厂 德国e p p e n d o r f 公司 德国h e t t i c h 公司 美 m i l l i p o r e 公司 日本h 1 1 a c h i 公司 华粤企业公司 北京新技术应用研究所 北京六一仪器厂 美 i n v t r o g e n 公司 瑞士s a r + o r s 公司 美国c o l e p a r r n e r 公司 美国c o m e l i v e s 美 e p p e n d o r f 公司 日本h i m c h i 公司 美国f i s h e r 公司 美国p h a r m a c i ab i o t e c hc o 美国h a r v e y 公司 美国l e i c a 公司 第二章实验仪器与材料 2 1 细胞系、菌株 第二节细胞系、菌株、载体 c 2 c 1 2c e l l 本室保存 e s c h e r i c h i ac o l id h 5 a 本室保存 e s c h e r i c h i ac o l ib l 2 1 ( d e 3 ) 本室保存 2 2 载体 p e t - 1 5 b b m p 6 本室构建 7 第二章实验仪器与材料 第三节主要实验材料 2 3 1 分子生物学试剂盒 p r o t e i na s s a ye s l 蛋白定量试剂盒购自p i e r c e 公司；e c lw e s t e r nb l o t 检 测试剂盒购自p h a r m a c i a 公司。c e l lc o u n t i n gk i t 8 试剂盒购自日本同仁化学研究 所。 2 3 2 培养基及抗生素 d m e m 细胞培养基购自g i b c o 公司；胎牛血清购自g i b c o 公司；细胞消 化液t r y p s i n e d t a 购自g i b c o 公司：细菌培养基成分蛋白胨、酪蛋白水解物、 酵母提取物购自o x o i d 公司。 氨苄青霉素购自t a k a r a ( 大连) 公司；细胞培养用青霉素一链霉素购自 g i b c o 公司。 2 3 3 主要生化试剂 2 3 3 1蛋白质电泳试剂 丙烯酰胺和双甲基丙烯酰胺购自g i b c o b r l 公司；蛋白分子量标准： m u l t i m a r km u l t i c o l o r e ds t a n d a r d 购自i n v i t r o g e n 公司。 2 3 3 2 杂交试剂 a n t i - b m p 一6 抗体购自r & d 公司，a n t i m o u s ei g g - h r p 二抗购白天津血研 所。 2 3 3 3 其它试剂 r h b m p 6 购自美国r & d ，碱性磷酸酶底物、b s a 、d o c 、d t t 、g l y c i n e 、 t r i t o n x 1 0 0 、i p t g 等购自s i g m a 公司，透析袋、超滤膜、超滤管等购自美国 m i l l i p o r e 公司，i p t g 购自t a k a r a ( 大连) 公司，各种化学试剂均为国产分析 纯。 2 3 4 主要溶液配制 2 3 4 1 细菌培养基及其相关溶液 8 第二章实验仪器与材料 l b 培养基：1 0 9 胰化蛋白胨，5 9 酵母提取物，1 0 9n a c l ，用5 m o l ln a o h 调p h 到7 4 ，加去离子水至1 l ，1 0 3 4 x 1 0 5 p a 高压灭菌2 0 分钟。 r m e d i u m 2 8 】：柠檬酸3 9 ，k h 2p 0 46 7 5 9 ，f n i - h ) 2 s 0 45 9 ，n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 3 9 ，m g c l 21 5 9 ，n h 4 c 1o 1 9 ，g l u c o s e2 0 9 ，酵母提取物2 0 9 ，胰化蛋白胨3 0 9 ， 6 m l 仃a c em e t a ls o l u t i o n 。 t r a c em e t a ls o l u t i o n ：( p e rm lo f 5 m o l lh c l ) f e s 0 4 7 h 2 01 0 m g ，z n s 0 4 7 h 2 0 2 2 5 m g ，c a c l 2 。2 h 2 01 3 5 m g ，m n s 0 4 。5 h 2 00 5 m g ，c u s 0 4 5 h 2 0l m g ，p d c l 3 。6 h 2 0 0 3 r n g ，( n h 4 ) 6 m 0 7 0 2 4 4 h 2 0o 1 m g ，h 3 8 0 30 2 m g ，t h i a m i n e - - h c l2 m g m 9 培养基： 配制1 l 培养基，应在7 5 0 m l 无菌去离子水( 冷至5 0 或5 0 以下) 中加 入： 5 x m 9 盐溶液 2 0 0 m l 1m o l l m g s 0 42 m l 2 0 ( w ) 葡萄糖2 0 m l ! 里q ! 坐g 垒9 1 2q ：! 里垦 灭菌的去离子水至9 8 0 m l ，之后定容到1 l 。 5 x m 9 盐溶液配制：用无离子水溶解下列盐类，终体积为1 l ： n a 2 h p 0 4 7 h 2 0 6 4 9 k h p 0 4 1 5 9 n a c l 2 5 9 n h 4 c 1 5 0 9 分装成2 0 0 m l 一份，在1 5 p s i ( 1 0 5 k c m 2 ) 高压下蒸汽灭菌1 5 r a i n 。 分别配制m g s 0 4 溶液和c a c l 2 溶液，高压灭菌。用无菌水将5 x m 9 盐溶液 稀释至9 8 0 m l 后，加入m g s 0 4 和c a c l 2 溶液。葡萄糖溶液在加到稀释的m 9 盐 溶液之前，用0 2 2 1 a m 滤器过滤除菌。 s o b 培养基：2 0 9 胰化蛋白胨，5 9 酵母提取物，o 5 9n a c l ，加去离子水至 8 0 0 m l ，然后加入1 0 m lk c l 溶液( 2 5 0 r e t o o l l ) ，用5 m o l l n a o h 调p h 值至7 4 ， 加去离子水至1 0 0 0 m l ，1 0 3 4 x 1 0 5 p a 高压灭菌2 0 分钟。 s o c 培养基( 新鲜) ：i m ls o b 培养基中加入5 儿1m g c l 2 溶液( 2 m o l l ) ，8 0 i t l 葡萄糖溶液( w v5 0 ) 。 9 第二章实验仪器与材料 n z r 培养基：1 0 9 酪蛋白水解物，5 9 酵母提取物，5 9n a c i ，加去离子水至 8 0 0 m l ，用5 m o l ln a o h 调p h 值至7 5 ，加去离子水至1 0 0 0 m l ，1 0 3 4 x 1 0 5 p a 高压灭菌2 0 分钟。使用时每l m ln z y 斗培养基加入1 2 5 9 lm g c l 2 溶液( 1 m ) ， 1 2 5 t lm g s 0 4 ( 1 m ) ，2 0j - t l 葡萄糖溶液( w v2 0 ) 。 2 3 4 2s d 8 一p a g e 相关溶液 t r i s t r i c i n e 系统阳极缓冲液：1 2 1 1 9t r i s 碱溶于5 0 0 m l 去离子水，用浓盐 酸调校至p h 8 9 ，用水稀释至5 l ，t r i s c l 终浓度能达0 2 m o l l ，于4 c 可保存达 1 个月。强s t r i c i n e 系统阴极缓冲液：1 2 1 9 阿s 碱，1 7 9 2 9t f i c i n e ，l gs d s 溶于 l l 水，不必调校p h 。2 x t r i c i n e 样品缓冲液：2 m l 4 t r i s c l s d s ，p h 6 8 ( 0 0 8t o o l l ) ， 2 4 m l ( 3 0 9 ) 甘油 2 4 ( v v ) ，0 8 9s d s 8 ( w v ) 】，0 3 1 9d t t ( 0 2t o o l l ) ，2 m g 考 马斯蓝g 一2 5 0 0 0 2 ( w v ) 】，加水至1 0 m l ，并混匀。 t r i c i n e 多肽分离凝胶的配制： 贮液分离胶基层胶 3 0 丙烯酰胺o 8 亚甲基双丙烯酰胺 9 8 0m l1 6 2m l t r i s c l s d sp h 8 4 5 1 0 0 0m l3 1 0m l h 2 07 0 3m l7 7 8m l 甘油4009 10 ( w v ) 过硫酸铵 5 0 9 l2 5 山 t e m e d1 0 u l 5 9 l oo_o_1_。_o_ooo_o_o_oo_一i i _ - _ - _ _ 一 2 3 4 3r h b m p 6 提取及溶解相关缓冲液 r h b m p 6 包涵体洗涤缓冲液a ( p h 7 9 ) ：2 0 m m o l lt r i s h c l ，0 5 m m o l le d t a ， 5 0 m m o l l n a c l ，5 甘油，使用时加入终浓度为0 1 b 巯基乙醇。 r h b m p 6 包涵体洗涤缓冲液b ( p h 8 5 ) ：2 0 m m o l lt r i s h c l ，0 5 m m o l le d t a ， 2 ( w ) t r i t o nx 1 0 0 ，使用时加入终浓度为0 1 p 巯基乙醇。 衄m p 6 包涵体溶解b a s i cb u f f e r ： 5 0 m m o l l 乙酸乙酸钠缓冲液p h 3 0 5 0 m m o l l 乙酸乙酸钠缓冲液p h 4 0 5 0 m m o l l 乙酸乙酸钠缓冲液p h 5 0 1 0 第二章实验仪器与材料 5 0 m m o l l 0 1 m o l l 0 1 m o l l 0 1 m o l l 0 1 m o l l 0 1 m o 儿 0 1 m o l l m e s n a o h 缓冲液p h 6 0 ir i s h c l 缓冲液p h 7 0 t r i s h c l 缓冲液p h 8 0 i r i s h c l 缓冲液p h 9 0 碳酸钠碳酸氢钠缓冲液p h l o 0 磷酸氢二钠氢氧化钠缓冲液p h i 1 0 磷酸氢二钠氢氧化钠缓冲液p i l l 2 0 2 3 4 4w e s t e r nb i o t 相关溶液 t r i s g l y e i n e 电转移缓冲液：3 0 3 9t r i s 碱( 2 5 m m o l l ) ，1 4 4 1 9 甘氨酸 ( 1 9 2 m m 0 1 ) 溶于8 0 0 m l 水，加入2 0 0 m l 甲醇至总体积为1 l 。 t b s t ：6 0 5 9t r i s 碱( 5 0 m m o v l ) ，8 0 6 5 9n a c i ( 13 8 m m o l l ) ，0 2 0 1g k c i ( 2 7 m m o l l ) ，o 5 9t w e e n2 0 用浓盐酸调p h 至8 o ，定容至1 l 。 杂交封闭液：3 9 脱脂奶粉溶于1 0 0 m lt b s t 。 2 3 4 5 碱性磷酸酶检测相关溶液 碱性磷酸酶底物缓冲液：1 8 8 9 甘氨酸，1 0 2 9m g c l 2 溶于5 0 0 m l 去离子水， 用l m o l l n a o h 调p h 至1 0 5 。 碱性磷酸酶底物反应液：碱性磷酸酶底物( s i g m a # 1 0 4p h o s p h a t a s es u b s t r a t e ) 底物溶于3 7 5 m l 底物缓冲液。 2 3 4 6t c a + d o c ( 1 0 m l ) 4 0 m g 的脱氧胆酸钠( d o c ) 溶于1 0 m l 三氯乙酸( t c a ) ( 1 0 0 ；w v ) ，保存于 室温。 2 3 4 7 细胞培养基及其相关溶液 细胞培养基d m e m 参照产品说明书配制。 细胞冻存培养基：正常细胞培养基中再加入胎牛血清使其浓度为普通培养 基的2 倍，并加入d m s o 使其含量达到5 1 0 。 p b s ：n a c l8 9 ，k c lo 2 9 ，n a 2 h p 0 41 4 2 9 ，k h 2 p 0 40 2 7 9 ，加入去离子水 至8 0 0 r a l ，充分搅拌溶解，滴加浓盐酸将p h 值调至7 4 ，然后加入去离子水将 溶液定容至1 l 。1 0 3 4 x 1 0 5 p a 高压灭菌2 0 分钟。室温保存。 第三章r h b m p 6 在大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) q b 诱导表达条件的优化 第三章r h b m p 6 在大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) 中诱导表达条件的优 化 本实验室前期工作已经构建了表达r h b m p 6 的重组大肠杆菌细胞株e c o l i b l 2 1 ( d e 3 ) p e t l 5 b b m p 6 。本章比较在m 9 、l b 、r m e d i u m 三种培养基中细菌 生长水平及蛋白表达水平，选择l b 为最适r h b m p 6 生产的培养基。优化诱导时 机、诱导时间、诱导温度、诱导剂浓度及氨苄青霉素( a m p i c i l l i n ) 浓度，利用 s d s - p a g e 分析以上条件的改变对r h b m p 6 产量的影响，确定培养条件为 l b a m p i c i l l i n ( 1 0 0 p g m l ) ，o d 6 0 0 咖1 4 0 0 时加入1 0 m m o l li p t g ，3 7 诱导4 小时。可获得高效表达的r h b m p 6 蛋白，其表达量占菌体蛋白的8 0 以上。 关键词：r h b