（发酵工程专业论文）高产monacolin+k红曲菌的诱变选育及其固态发酵条件的优化.pdf

缩略语 缩略语 m 1 6 m 1 6 - 4 o b 6 m 匣s y e s r r 2 r s d u v t l c c e d m s o m e k c h p l c m f r c z e s d s r s m 缩略语 a b b r e v i a t i o n s 英文名中文名 m o n a s c u s r1 6 红曲菌1 6 号 t h em u t a n ts t r a i no f m o n a s c 淞，1 6 红曲菌1 6 号的突变株 d e g r e eb a u m e波美度 m a l te x t r a c ts u c r o s em e d i u m 麦芽汁培养基 y e a s te x t r a c ts u c r o s em e d i u m 酵母浸膏蔗糖培养基 r e g r e s s i o nc o e f f i c i e n t回归系数 d e t e r m i n a t i o nc o e f f i c i e n t 决定系数 r e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n s 相对标准偏差 u l t r a v i o l e tr a d i a t i o n 紫外线 t h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y 薄层层析 c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s 毛细管电泳 d i m e t h y ls u l f o x i d e 二甲基亚砜 m i c e l l a re l e c t r o k i n e t i cc a p i l l a r yc h r o m a t o g r a p h y 胶束电动毛细管色谱 h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y高效液相色谱 m o n a s c u s - f e r m e n t e dd e e 红曲米 c a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i s 毛细管区带电泳 s o d i u md o d e c y ls u l f a t e 十二烷基硫酸钠 r e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y 响应曲面法 摘要 摘要 m o n a c o l i nk ( 莫纳可林k ) ，也称l o v a s t a t i n ( 洛伐他汀) 是红曲霉的次级 代谢产物，能有效抑制胆固醇生物合成中的关键酶h m g c o a ( 3 羟基3 甲基- 戊二酰基辅酶a 还原酶) 的活性，从而调节人体内血脂的水平。m o n a c o l i nk 对 人体具有降血脂、保护肾脏、抗癌等生理作用。含m o n a c o l i nk 的红曲米被作 为天然药物中抑制胆固醇合成和降血脂的首选药物，受到世人瞩目。 本文以筛选高产菌株和优化发酵条件为主要目的，建立了检测红曲米中 m o n a c o l i nk 的m e k c 方法，采用紫外线l i c l 复合诱变方法获得一株高产 m o n a c o l i nk 红曲菌m 1 6 4 ，并对其固态发酵培养基及培养条件进行了系统研 究。主要研究内容和结果简述如下： l 、建立了测定红曲米中m o n a c o l i nk 含量的胶束电动毛细管色谱( m e k c ) 方法。考察了运行缓冲液的种类、p h 及其浓度、有机添加剂、十二烷基硫酸钠 ( s d s ) 的浓度和分离电压等实验条件对电泳分离效果及检测灵敏度的影响。在 优化的实验条件下，以2 0m m o l l 硼砂( p h = 1 0 6 ，含1 0 ( 体积分数) 乙醇 和4 0m m o l ls d s ) 作为缓冲溶液，m o n a c o l i nk 能在2 3m i n 内实现很好的基 线分离，检测线性范围为5 0 0 1 0 0 0 0m g l ，线性相关系数r 2 为0 9 9 7 6 ，检出 限( 以信噪比( s n ) 为3 计) 为o 1 3m g l ，加标回收率为9 8 5 9 9 5 。 精密度和稳定性试验中，峰面积和迁移时间的相对标准偏差均小5 ，表明重 复性良好。该方法简便、快速、灵敏，可用于红曲米中m o n a c o l i nk 含量的测 定。 2 、对实验室保存的3 2 株红曲菌进行了初筛，得到4 株相对高产m o n a c o l i n k 的红曲菌：m 1 6 、m 2 0 、m 2 5 、m 2 9 。分别以上述4 株红曲菌为出发菌株，采 用紫外l i c i 复合诱变方法，用含l o v a s t a t i n 的抗性筛选平板培养对诱变株进行 筛选，最终筛选出一株红曲菌突变株m 1 6 4 。该菌株m o n a c o l i nk 的产量为 2 5 0 5 4i _ t g g ，比出发菌株提高了2 0 3 倍，连续传代4 次后产量为2 4 7 8 3 “g 。 3 、采用单因素实验、p l a c k e t t b u r m a n 实验和b o x - b e h n k e n 响应面实验优 化得到了红曲菌m 1 6 4 产m o n a c o l i nk 的最优培养基：甘油5 、玉米浆2 、 硝酸铵1 、乙酸钠l 、甲硫氨酸0 5 、k h 2 p 0 40 2 、m g s 0 4 7 h 2 00 2 。 以最优培养基为条件，采用单因素实验优化出得到的较佳发酵条件为培养基初 始含水量5 0 ，接种量1 0 ，变温培养( 3 0 培养3 d 后，2 6 。c 培养1 2d ) ， i i 摘要 培养时间1 5 d ，培养基初始p h 5 5 ，装米量2 5g 2 5 0 n = l l 锥形瓶。在此条件下 m 1 6 4 的m o n a c o l i nk 产量达3 8 0 4 t g g ，桔霉素含量为o 2 8 t g g 。 关键词：红曲菌，m o n a c o l i nk ，胶束电动毛细管色谱，红曲米，固态发酵 i i i a b s t r a c t a b s t r a c t m o n a c o l i nk ( l o v a s t a t i n ) i sas e c o n d a r ym e t a b o l i t eo fm o n a s c u s ，w h i c hc a l l e f f e c t i v e l yi n h i b i tc h o l e s t e r o lb i o s y n t h e s i sk e ye n z y m eh m g c o a ( 3 一h y d r o x y - 3 一 m e t h y l g l u t a r y l c o e n z y m ear e d u c t a s e ) a c t i v i t y , a n dr e g u l a t et h eb o d ya b n o r m a lb l o o d l i p i dl e v e l s i th a sm a n yp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n ss u c ha s ：l o w e r i n gb l o o dp r e s s u r e ， p r o t e c t i n gt h ek i d n e y , i n h i b i t i o n i n go fc a n c e re ta 1 m o n a c o l i nk i nr e df e r m e n t e dr i c e w a sak i n do fn a t u r a ld r u g st oi n h i b i tc h o l e s t e r o ls y n t h e s i s ，l i p i d - l o w e r i n gd r u go f c h o i c ea n dt h es p o t l i g h t t h em e t h o df o rm o n a c o l i nkd e t e r m i n a t i o ni nr e dy e a s tr i c ef e r m e n t e db y m u t a t e ds t r a i nw a se a t a b l i s h e d t h eu v - l i c lw a su s e dt om u t a t eh i 曲一p r o d u c t i v e m o n a s c u ss t r a i n ，a n dt h es o l i d s t a t ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e d t h e m a i nr e s e a r c hr e s u l t ss h o wa sf o l l o w s ： 1 、m i c e l l a re l e c t r o k i n e t i cc a p i l l a r yc h r o m a t o g r a p h yf o rm o n a c o l i nkd e t e r m i n a t i - o ni nr e df e r m e n t e dr i c ew a sd e v e l o p e d t h ea s s a yc o n d i t i o n si n c l u d i n gp ha n dt h e c o n c e n t r a t i o no fn m n i n gb u f f e r , t h eo r g a n i ca d d i t i v e ，t h ec o n c e n t r a t i o no fs o d i u m d o d e c y ls u l f a t e ( s d s ) ，a n dt h es e p a r a t i o nv o l t a g ew e r eo p t i m i z e d u n d e rt h e o p t i m i z e dc o n d i t i o n s ( 2 0m m o l lb o r a t eb u f f e r ( p h10 6 ，c o n t a i n i n g 10 ( v v ) m e t h a n o l ，4 0m m o l ls d s ) ，t h em o n a c o l i nkc a nb es e p a r a t e dw i t h i n2 3m i n ，w i t l la l i n e a rw o r k i n gr a n g eo f5 0 0 1 0 0 0 0m g l ( r 2 = o 9 9 7 6 ) a n dad e t e c t i o nl i m i t ( s n = 3 ) o f0 13m g l t h er e c o v e r i e sw a sv a r i e db e t w e e n9 8 5 a n d9 9 5 a n d t h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n sw e r el o w e rt h a n5 2 、m o n a c o l i nki nt h er e dr i c ef e r m e n t e db y3 2m o n a s c u ss t r a i n sw e r es c r e e n e d a n df o u rs t r a i n s 谢t hh i g hy i e l dw e r ec h o o s et om u t e db yu v - l i c l f i n a l l y , ah i 曲a n d s t a l ep r o d u c t i v es t r a i nm 16 - 4w i t ht h ep r o d u c t i v i t y2 5 0 5 4p g 3 、e f f e c to fd i f f e r e n tc u l t u r em e d i u mo ny i e l do fm o n a c o l i nkw a ss t u d i e db y s i n g l ef a c t o rt e s ta n dr e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y ( r s m ) e x p e r i m e n t s t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h eb e s tc u l t u r em e d i u mf o rm 16 - 4w a sa sf o l l o w s ：g l y c e r o l5 ，c o r n s t e e pl i q u o r2 ，n h a n 0 31 ，s o d i u ma c e t a t e1 ，m e t h i o n i n eo 5 ，k h 2 p 0 40 2 ， m g s 0 4o 2 b a s e do nt h e s em e d i u ma n dt h eb e t t e rc u l t i v a t i n gc o n d i t i o n sw e r e ：5 0 i n i t i a lw a t e rc o n t e n to ft h ec u l t u r em e d i u m ，s e e d i n gv o l u m e10 ，c h a n g i n gc u l t u r e i v a b s t r a c t t e m p e r a t u r e ( 3 0 cf o r3d a y s ，2 6 cf o r1 2d a y s ) ，f e r m e n t a t i o nt i m e1 5 d ，i n i t i a lp h 5 5 ， f i l l e dr i c ea m o u n t2 5g 2 5 0 m lf l a s k u n d e rc o n d i t i o n s ，t h ep r o d u c t i o no fm o n a c o l i n kf o rm o n a s c u sm16 - 4w a si m p r o v e dt o38 0 4p g ，a n dt h ec o n t e n to fc i t r i n i nw a s o 2 8p g 儋 k e y w o r d s ：m o n a s c u s ，m o n a c o l i nk ，m i c e l l a re l e c t r o k i n e t i cc a p i l l ac h r o m a t o g r a p h y ， r e df e r m e n t e dr i c e ，s o l i d s t a t ef e r m e n t a t i o n v 目录 目录 缩略语i 摘要i i a b s t r a c t 目录v i 第一章文献综述l 1 1红曲菌概述1 。1 1 1 红曲菌的发现1 1 1 2 红曲菌的特征1 1 1 3红曲菌的主要代谢产物2 1 2m o n a c o l i nk 的概述3 1 2 1m o n a c o l i nk 的发现。3 1 2 2m o n a c o l i nk 的理化性质一3 1 2 3m o n a e o l i nk 的药理作用和应用价值4 1 3 m o n a c o l i nk 产生菌的选育6 1 3 1菌种筛选6 1 3 2 诱变菌种一6 1 4 m o n a c o l i nk 的检测7 1 5 红曲中m o n a c o l i nk 的发酵工艺8 1 5 1发酵工艺8 1 5 2 培养基9 1 5 3 发酵条件1 0 1 6研究的内容、目的和意义1 l 第二章m e k c 法分析红曲中m o n a c o l i nk 的研究1 3 2 1 引言13 2 2 材料与方法13 2 2 1 仪器与设备1 3 v i 目录 2 2 2 试剂1 4 2 3 实验方法1 4 2 3 1 电泳条件1 4 2 3 2 电解液的配制1 4 2 3 3 标准溶液的制备1 4 2 3 4 电泳条件的优化1 4 2 3 5 样品的前处理1 6 2 3 6 方法学考察17 2 3 7 数据处理1 7 2 4 实验结果一18 2 4 1 电泳条件的优化1 8 2 4 2 样品的前处理2 3 2 4 3 方法学考察2 4 2 5 讨论2 7 2 6 小结2 8 第三章高产m o n a e o l i nk 菌株的复合诱变选育一2 9 3 1 材料与方法2 9 3 1 1菌种2 9 3 1 2 主要试剂和缓冲溶液2 9 3 1 3 主要仪器设备2 9 3 1 4 培养基3 0 3 2 实验方法3 0 3 2 1菌株的活化与保存3l 3 2 2 培养方法31 3 2 3原始出发菌株的筛选3 l 3 2 4 诱变条件及方法31 3 2 5 筛选方法3 2 3 2 6 诱变菌株的稳定性试验3 3 3 2 7 分析方法3 3 v i i 目录 3 3实验结果3 4 3 3 1原始菌出发菌株的筛选3 4 3 3 2l o v a s t a t i n 抗性筛选平板的抑制浓度的选择3 5 3 3 3 紫外线诱变剂量的选择3 5 3 3 4 紫外线l i c l 复合诱变剂量的选择3 6 3 3 5 紫外线l i c l 复合诱变筛选结果3 7 3 3 6 高产m o n a c o l i nk 诱变菌株产桔霉素情况4 0 3 3 7 诱变菌株的稳定性试验4 1 3 4 讨j 沧。4 2 3 5 小结4 3 第四章红曲菌m 1 6 4 固态发酵培养基及其培养条件的优化4 4 4 1 材料4 4 4 1 1菌种4 4 4 1 2 培养基4 4 4 1 3 试剂4 4 4 1 4 主要仪器设备4 5 4 2 实验方法。4 5 4 2 1红曲固态发酵工艺流程4 5 4 2 2 红曲菌孢子悬液的制备4 5 4 2 3 种子液培养4 5 4 2 4 培养基优化实验设计4 5 4 2 5 培养条件实验设计4 6 4 2 6 测量方法4 7 4 3 实验结果4 8 4 3 1种子生长曲线的制备4 8 4 3 2 优化培养基的单因素实验4 9 4 3 3 培养基优化的p l a c k e t t b u r m a n 实验51 4 3 4 培养基优化的b o x b e h n k e n 实验5 5 4 3 5 单因素实验优化发酵条件6 1 v i i i 目录 4 3 6 较佳发酵条件实验结果。6 6 4 4 讨论6 6 4 5 1 氮源对m 1 6 - 4 固态发酵产m o n a c o l i nk 的影响6 6 4 5 2 无机盐对m 1 6 4 固态发酵产m o n a c o l i nk 的影响6 7 4 5 3 培养条件对m 1 6 4 固态发酵产m o n a c o l i nk 的影响6 8 4 6 小结6 8 参考文献6 9 致谢7 4 攻读学位期间的研究成果7 5 i x 第一章文献综述 第一章文献综述 1 1红曲菌概述 1 1 1 红曲菌的发现 红曲菌最早是在1 8 8 4 年由法国科学家v a nt i e g h e m 分类和命名【l 】。红曲菌 ( m o n a s c u s ) 是一种小型丝状腐生真菌，在真菌分类学上属子囊菌亚门 ( a s c o m y c o t i n a ) ，子囊菌纲( a s c o m y c e t e s ) ，真子囊菌亚纲( e u a s c o m y c e t e s ) ， 曲霉目。( p l e t a s c a l e s ) ，曲霉科( e v r o t i a c e a e ) 。主要种类有安卡红曲菌( m o n a s c u s a n k a ) 、烟色红曲菌( mf u l i g i n o s u s ) 、紫红曲菌( mp u r p u r e u s ) 和红色红曲 菌( mr u b e r )等【2 1 。红曲菌有8 种4 8 个菌株，分别为：紫红红曲菌 ( m p u r p u r e u s ) 2 2 株，安卡红曲菌( m a n k a ) 1 1 株，红色红曲菌( m r u b e r ) 2 株，巴克红曲菌( m b a r k e r ) 1 株，烟色红曲菌( m f u l i g i r l o s u s ) 7 株，发 白红曲菌( m a l b i d u s ) 1 株，锈色红曲菌( m r u b i g i n o s i s ) 1 株，变红红曲霉 菌( 必s e r o r u b e s c e n s ) 3 株【3 i 。 红曲菌在欧洲一度被视为一种腐败菌，但在许多亚洲国家特别是东亚地区 却是传统食品加工的微生物。红曲菌在我国代代相传已逾千载，随着现代发酵 工业的突飞猛进，微生物应用技术的不断创新，特别是在1 9 7 9 年日本远藤章教 授从红色红曲菌中分离出胆固醇合成抑制剂m o n a c o l i nk 后，红曲菌生理活性物 质得到了广泛而深入的研究【4 。 1 1 2 红曲菌的特征 红曲菌属的形态学可分为个体形态和群体形态( 即菌落) 等的特征。红曲 菌属的菌丝有横隔的多细胞构造，无色透亮或含深浅不同的红色色素，或含深 浅不同的褐色色素；细胞多核，用姬姆萨染色时清晰可见；细胞中大都具黄色 油滴，细胞壁光滑，但往往附有结晶的疣状物；菌丝具不规则的分枝，菌丝直 径3 6 “m ；菌丝之间常有网结联合现象。在培养过程中，红曲菌属的无性生 殖和有性生殖几乎同步发生，唯分生孢子发育快而子囊孢子发育慢而已【2 。 红曲霉生长最适生长温度为2 7 3 3 ，最适生长p h 3 5 - - 5 0 ，可耐p h 2 5 ， 尤嗜乳酸。能耐1 0 的乙醇，能以糖类、有机酸、醇类为碳源，能利用硝态氮、 第一章文献综述 氨态氮和有机氮，能合成多种维生素，可在无维生素的合成培养基中生长。 1 1 3 红曲菌的主要代谢产物 1 1 3 1 红曲色素 红曲菌以其能产生大量的天然红曲色素而著称【5 1 。红曲色素是多种色素的混 合物，主要有红色系和黄色系两大类 6 1 。它们由化学结构不同、性质相近的红黄 紫三类色谱组成。已探明结构的有1 0 种，其中6 种为醇溶性色素，4 种为水溶 性色素。醇溶性色素有红斑素、红曲红素、红曲素、红曲黄素、红斑胺和红曲 红胺等【7 】。水溶性色素有n 戊二酰基红斑胺、n 戊二酰基红曲红胺、n 一葡糖基 红斑胺和n 葡糖基红曲红胺等【8 】。 红曲色素( m o n a s c u sp i g m e n t ) 是红曲菌的主要次级代谢产物之一，在红曲 菌的生长过程中被认为具有能量储存物和氮源捕获剂的作用【6 】。红曲色素是一种 优良的天然食用色素，性质稳定，着色性好，安全无毒，在肉制品、糖果、糕 点、饮料的加工着色上应用广泛 9 1 。 1 1 3 2 桔霉素 1 9 7 7 年有学者通过菌种诱变而从红曲霉的发酵产物中分离出一种黄色的 抑菌物质，并将其命名为m o n a s c i d i n a t l 0 】。1 9 9 5 年，法国人p h i l i p p eb l a n c 通过 大量实验证实m o n a s c i d i na 即是桔霉素，这种毒素在曲霉和青霉的代谢物中早 已发现【l 卜1 2 】，桔霉素( c i t r i n i n ) 是一种西方各国食品中严加控制的真菌毒素 ( m y c o t o x i n ) ，具有肾毒性，也被称为肾毒素( n e p h r o t o x i n ) 。它能引起试验动 物的肾脏肿大、尿量增多、肾小管扩张和上皮细胞变性坏死等症状。经口喂小 鼠半致死量为11 0m g k g 【l 引。c i e g l e r 等人报告，在给发育4 d 的鸡胚胎注射桔霉 素后，胚胎中的脚发生了变形【1 4 1 。桔霉素的存在严重限制了红曲产品的应用，如 何控制产品中桔霉素的含量成为红曲菌研究中的一项重要内容。 1 1 3 3m o n a c o l i nk 及其它代谢产物 除了红曲色素和桔霉素外，红曲菌还能产生m o n a c o l i nk ( 莫纳可林k ) 、 丫氨基丁酸、麦角固醇等其它多种次级代谢产物。m o n a c o l i nk 是1 9 7 9 年日本学 者远藤章教授在红色红曲菌中首次发现的一种具有抑制胆固醇合成作用的化合 物【1 5 1 ，其生理功能是阻碍胆固醇合成酶系统中的3 羟基3 甲基戊二酸单酰c o a 还原酶( h m g c o a 还原酶) 的活性。m o n a c o l i n 类药物m o n a c o l i nk 和普伐他 汀是目前治疗高血脂症的特效药。 2 第一章文献综述 用红曲发酵物喂养先天性高血压大鼠，结果显示红曲中的生理活性物质对降 血压有明显作用i i6 。经研究发现，红曲发酵物中的有效成分为y 氨基丁酸 ( y a m i n ob u t y r i ca c i d ，g a b a ) 和葡萄糖胺。红曲菌还可产生维生素d 2 的前体 一麦角固酣 】。在紫外线的照射下麦角固醇转化为维生素d 2 。维生素d 2 可以促 进人体对钙和磷的吸收，对防治婴幼儿佝偻病有明显效果。维生素d 2 在日常食 品中的含量很少，因此适当的摄入含维生素d 2 或麦角固醇很有必要l l 引。 1 2m o n a c o l i nk 的概述 1 2 1m o n a c o l i nk 的发现 - 1 9 7 6 年，日本远藤章教授从桔青霉( p e n i c i l l i u mc i t r i n u m ) 中发现了具有胆 固醇合成抑制作用的m l 2 3 6 a ，m l 2 3 6 b 和m l 2 3 6 c ，结构式如图1 所示， 其中活性最强的化合物是m l 2 3 6 b0 9 1 。同年，b r o w n 等从p e n c z l m b r e v i c o m p a c t u m 中筛选到一种抗真菌物质，将之命名为c o m p a c t i n 2 0 1 。1 9 7 9 年 远藤章【1 5 】又从红色红曲霉属( m o n a s c u sr u b e r ) 的培养液中获得一种胆固醇合成 抑制剂m o n a c o l i nk 。1 9 8 0 年美国的a l b e r t s 等人 2 1j 也从土曲霉( a s p e r g i l l s t e r r e u s ) 中发现了相似的h m g c o a 抑制物质，起名为m e v i n o l i n 。m o v i n o l i n 即 洛伐他汀( l o v a s t a t i n ) ，与m o n a c o l i nk 为同一种物质，这些物质都能有效抑制 胆固醇生物合成中的关键酶h m g c o a 还原酶( 3 羟基一3 甲基戊二酰基辅酶 a 还原酶) 的活性，从而能阻断人体内胆固醇的合成，进而调节人体内血脂的 水平。其后，远藤章教授又从红色红曲菌中( m r u b e r ) 培养物中分离到了 m o n a c o l i nj 和m o n a c o l i nl 1 2 2 ，既而从这种菌的变种分离到d i h y d r o m o n a c o l i nl 和m o n a c o l i nx 。1 9 8 6 年，他们又从红色红曲菌( 肱r u b e r ) 的培养液中分离得 到了新的m o n a c o l i nm ，这些物质统成为m o n a c o l i n s 【引，但抑制胆固醇合成最有 效的物质是m o n a c o l i nk 。 1 2 2m o n a c o l i nk 的理化性质 m o n a c o l i nk 的主要结构为氢化萘母核、1 3 羟6 。内酯环和2 。甲基丁酸。 根据母核上两处支链结构的不同，可以形成多种m o n a c o l i n 类物质( 图l ，1 ) 。 m o n a c o l i nk 为白色针状晶体，熔点为1 5 7 , - - 一1 5 9 c ，在甲醇中的旋光度值为+ 3 0 7 6 0 ，在甲醇中紫外线光谱显示最大吸收波长为：2 2 9n l n 、2 3 7n l n 、2 4 6n l t l 。红外 第一章文献综述 线光谱吸收波长分别为3 5 5 0 、2 9 7 0 、6 9 6 、1 2 2 0c m 1 2 2 。m o n a c o l i nk 在酸性条 件下存在内酯型和酸型两种构型，如图1 2 所示。通过元素分析和高效质谱分 析得知其分子式为c 2 4 h 3 6 0 5 ( 内酯式) ，相对分子量为4 0 4 5 5 。能溶于甲醇、 乙醇、丙酮、氯仿及苯等有机溶剂，但不溶于正已烷和石油醚。 m l - 2 3 6 a 肌- 2 3 6 b ( c o m p a c ti n ) m l 一2 3 6 c m o n a c o l i nj m o n a c o l i nk ( m e vi n o ii n l o v a s l a t i n ) l i o n a c o li nl r ；h r = i t 亿= i t r i = 0 1 ； r 。爿= h ； r 。 图1 1m o n a c o l i nk 及其结构类似物的结构图 f i g1 一lt h e s t r u c t u r eo fm o n a c o l i nka n dr e l a t e dc o m p o u n d s o o h 融= 0 8 0 。o p 、 l i ： ：h 咿 & = o t i 8 - 。少伦 = h 邺 o 图1 - 2 酸式m o n a c o l i nk ( a ) 和内酯式m o n a c o l i nk ( b ) f i g1 - 2 s t r u c t u r a lf o r m u l a t eo fa c i d ( a ) a n dl a c t o n e ( b ) o fm o n a c o l i nk 1 2 3m o n a c o l i nk 的药理作用和应用价值 红曲菌所产生的降胆固醇物质主要是m o n a c o l i n 类物质。在人体内胆固醇 生物合成途径中【2 3 1 ，h m g c o a 还原酶是控制胆固醇合成速度的关键酶( 见图 1 3 ) 。它可以有效减少或阻断内源性胆固醇的合成，其中以m o n a c o l i n k 的抑制 活性最为显著。 现在有人提出红曲中的真正降脂物质是酸式m o n a c o l i nk ，它无需人体内的 4 第一章文献综述 羟基酸酯酶参与水解，即能直接发挥降脂作用。这种酸式m o n a c o l i nk 只存在 于少数天然发酵的红曲米中【2 4 1 。天然红曲中的酸式m o n a c o l i nk ，其空间结构与 体内h m g c o a 更为接近，无需水解，直接发挥抑制体内胆固醇合成的作用， 其活性较内酯式高约一倍【2 5 j 。但红曲米中的酸式结构的m o n a c o l i n k 很不稳定， 在实际生产、提取过程中很容易被氧化，生成相对稳定的内酯式结构的形态存 在于红曲米中。所以通常以样品中内酯式m o n a c o l i nk 含量的多寡来判断红曲 产品降脂性能的优劣【z 引。 临床试验表明【2 7 】，当血液中m o n a c o l i nk 的浓度达到0 0 0 1 - - 一0 0 0 5p g m l 时，体内胆固醇的合成就会受阻。含m o n a c o l i nk 的发酵红曲米添加到烘烤的 鸡肉中和含胆固醇的食物中，可以很好的调节血清中甘油三酯、高密度脂蛋白、 低密度脂蛋白的水平【2 引。红曲米除了可以用在传统的烹饪外，还可以激活骨质 的生成用于骨质疏松的治疗【2 9 1 。天然红曲中m o n a c o l i n 类化合物的发现使红曲 被作为天然药物中抑制胆固醇合成和降血脂的首选药物，并受到世人瞩目。 m o n a c o l i nk 具有明显抑制肾小球系膜细胞的增生和细胞外分泌的作用，即具有 保护肾脏的生理功能【3 0 1 。体外研究表明，m o n a c o l i nk 能降低生长的肿瘤和路易 士肺癌细胞的新陈代谢，天然红曲米有望用于抗癌辅助剂p 。因此，近年来对 m o n a c o l i n 类化合物的抗肿瘤研究亦为红曲在肿瘤和白血病的治疗应用方面提供 了实验依据。 (a乙cet酰yl辆co孵aa+a乙ce酸toa乙ce醯ty辅c酶oaa)一3羟一3一hmg壤-c戊oattl 二，：酰辅酶a _ 溜t l e l 嚣t ：5 j l 嬲l ，； ( 乙酰辆孵a + 乙醚乙醯辅酶a )7 3 羟一3 一壤戊二，：酰辅酶a 矗磊： ) 一f 缕磷g 酸e r 牦a n 牛y l - 一p p j i 隧- 1 毒篙甏誊麓器隧 - 一( 甲m 羟e v 戊a l 酸o n 臻a t c 磷- p 陵p 隆) 。一一厂( 熊磷酸牦牛一儿隧) ( 舜戊烯孵熊磷酸隧) 投脱簸熊瞬簸臆) f d o l i c h o i 7 长l l j c 、焦f a 磷m e 睃s y i l 玉- p 呢p 酝) ，s q 堵u 伪a l e n e1 譬茗蕊l 1 毒渊嚣e 瞄 ( 焦磷酸法呢酝) p搋烯 。 擎毛甾醇 。鹏嘲酩 、 c o q ，。 图1 3 胆固醇的生物合成途径 f i g1 - 3t h ec h o l e s t e r o lb i o s y n t h e t i cp a t h w a y 第一章文献综述 1 3m o n a e o l i nk 产生菌的选育 1 3 1 菌种筛选 所有的微生物育种工作都离不开菌种筛选。尤其是在诱变育种工作中，筛 选是最为艰难的也是最为重要的步骤。微生物是否产或高产目的产物，出发菌 株的优劣则是最重要的原因。工业微生物产生菌的筛选可从以下几种途径进行 分离筛选：向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株；由自然界分 离所需要的菌株；从一些发酵制品分离目的菌株。 远腾章【1 9 l 从收集的泰国食品中分离到红曲霉，接种于由6 葡萄糖、2 5 蛋白陈、0 5 玉米烈酒、0 5 氯化铵组成的5 l 培养基中。在2 5 下好气条 件培养1 0 d ，得到8 7m gm o n a c o l i nk 结晶。此后他又从世界各地保藏机关收 集红曲菌，发现收集的1 2 株红色红曲霉中的9 株、2 株多毛红曲菌中的2 株、 9 株紫色红曲菌中的3 株都具有较强的m o n a c o l i nk 生产能力【3 2 】。童振宇等【3 3 】 采用液态发酵法从7 株红曲菌中筛选出一株相对高产m o n a c o l i nk 的红曲菌w x 号。 韩梅【3 4 】从红曲霉培养物中筛选出产生h m g c o a 还原酶的菌种红曲菌，在 培养基组分为甘油9 0g , l 、大米粉水解液2 0g l 、蛋白膝1 0g l 、硝酸钠5g l 、 m g s 0 44g l 、z n s 0 42g l 、k h 2 p 0 42 5g l 时，每l l 培养物提取液约含 m o n a c o l i nk5 6m g 。俞进等【3 5 】选用产红色素量大的紫红曲菌( m o n a s c u s p u r u r e u sw e n t ) 产m o n a c o l i nk ，当液态培养基为6 0e , l 葡萄糖、6 0g l 蛋白胨、 m g s 0 41 l 、n a n 0 32e f t , 、k h 2 p 0 4lg l 、玉米浆1 0m l l 、p h 5 0 时， m o n a c o l i nk 的产量为8 7 7m g m l 。马美荣等【3 5 】对4 0 株红曲菌产m o n a c o l i nk 性能进行研究，采用薄板层析法初筛和高效液相色谱对菌株进行检测，其中3 株 具有较