（材料学专业论文）聚乳酸载药纳米微粒的制备与体外实验研究.pdf

中文摘要 恶性神经胶质瘤是常见的神经系统肿瘤，具有复发率高、患者存活期短的 特点。卡氮芥作为最常用的治疗恶性神经胶质瘤的化疗药物，可通过血脑屏 障，由血液循环系统到达瘤灶部位，抑制肿瘤细胞的生长；但其化学性质极不 稳定，在血浆中的半衰期很短；同时全身毒性较大，使其化疗效果受到了很大 的限制。 本实验的目的是采用具有优良生物相容性的高分子材料一聚乳酸作为包载 材料，制备卡氮芥载药纳米微粒，使卡氮芥获得缓释性能，为进一步通过表面改 性方法提高卡氮芥的脑瘤靶向性能以全面优化卡氮芥对恶性神经胶质瘤的化疗 效果提供科学依据。 本文以聚乳酸为基材，采用自乳化溶剂扩散法制各了一系列纳米控释微粒， 以扫描电子显微镜( s e m ) 与透射电子显微镜( t e m ) 观察微粒尺寸与形态，并 通过x 一光电子能谱( x p s ) 进行表面分析，研究了制备条件如聚乳酸浓度、乳 化剂浓度、油水比、温度、溶质体系等对聚乳酸纳米微粒的形态和粒径的影响， 并对乳化理论进行了探讨，确立了制备聚乳酸纳米微粒的实验条件，制备了平均 粒径为4 0 6 0 n m 与1 0 0 n m 2 0 0 n m 两个系列的空载纳米微粒与载药纳米微粒。 为了更好的制备卡氮芥载药微粒，本文首先制备了模型药物消炎痛载药微 粒，并以药典方法测定了相应的载药量、包封率及药物释放性能，在实验范围 内，获得的微粒最高载药率为1 l ，3 7 ，包封率为9 1 7 ，并可获得两周内较稳定的 药物释放，表明此纳米载药系统在药物控释领域可能具有较广泛的应用前景。 在此基础上，制备了卡氮芥载药微粒，并分别通过染色法与紫外分光光度 法测定了卡氮芥载药微粒的载药率与包封率，探讨了两种方法测定卡氮芥载药 率数据可靠性，在实验范围内获得的最高载药率为2 1 3 ，包封率为1 6 7 ；研究 了采用药典方法铡定卡氮芥载药微粒释药性能的可行性，共根据卡氮芥特殊的 理化性质，提出了相应的改进方法，获得了载药微粒五天内较为稳定的药物释 放数据；在对胃癌、乳腺癌、大肠癌三种肿瘤细胞的抑制率测定实验中，卡氨 芥载药纳米微粒的抑制率分别可以达到5 1 3 、7 1 3 与6 9 3 ，接近或达到了 游离药物的抑制率。在作用时间上，载药纳米微粒也显示出一定的缓释效应。 实验结果表明实验室制备的卡氮芥载药纳米微粒粒径小，粒径分布较为均 匀，具有一定的微粒载药率与包封率，并可获得一定时间范围较稳定的药物释 放，释药性能较游离药物显著改善，体外实验对三种肿瘤细胞有一定的抑制 率；为进一步通过表面改性方法提高卡氮芥脑靶向性能提供了科学依据。 关键词：卡氮芥聚乳酸纳米微粒 载药率药物控释细胞抑制率 a b s t r a c t t h ea i mo ft h i ss t u d yi st op r e p a r eb c n ul o a d e dn a n o p a r t i c l e f n p 、w i t hh i g h l y b i o d e g r a d a b l ep o l y m e rm a t e r i a l p l at o r e a l i z et h es u s t a i nc o n t r o l l e d r e l e a s eo f b c n u t h ec o n t r o l l e dr e l e a s eb c n ul o a d e dn pc o u l df u r t h e rb et a r g e t e dt og l i o m a a f t e rs u r f a c em o d i f i e d b y s o m e a c t i v e t a r g e t i n gg r o u p t h er e s e a r c h e r p r e p a r e d b c n ul o a d e dp l a n pb ys e l fe m u l s i f i e d s o l v e n t d i f f u s e dm e t h o d s t u d i e dt h ep a r t i c l es i z ea n do t l l e rc h a r a c t e r i s t i c so fn pw i t hs e ma n d t e m ，a n da n a l y z e dt h es u r f a c ec h a r a c t e ro fn pw i t hx p s d u r i n gt h er e s e a r c h ，t h e a u t h o ra l s os t u d i e dt h ei n f l u e n c eo f p r e p a r i n g i t e m ss u c ha sp l ac o n c e n t r a t i o n ， e m u l s i f i e rc o n c e n t r a t i o n ，r a t i oo fo i lt o w a t e r ，t e m p e r a t u r ea n ds o l u t es y s t e mo nt h e c h a r a c t e r i s t i c so fn p ，p r e s e n t e dt h e o p t i m i z e d c o n d i t i o nt op r e p a r e dn pa n da c q u i r e d d r u g l o a d e dn p w i t ht h ep a r t i c l es i z eo f4 0 6 0 n ma n d10 0 n m 2 0 0 n m i no r d e rt oo p t i m i z i n gt h e p r e p a r i n gc o n d i t i o no f b c n ul o a d e dn p ，t h er e s e a r c h p r e p a r e d i n d o m e t a c i n1 0 a d e dn pf i r s t l y s t u d i e dt h e d r u g l o a d e dr a t i oa n dd r u g e n c a p s u l a t i o ne f f i c i e n c yo f n p t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l ts h o w e dt h a tt h eh i g h e s t d r u g l o a d e dr a t i oo f n pi sl1 3 7 a n do p t i m i z e dd r u ge n c a p s u l a t i o ne f f i c i e n c yi s9 1 1 i n a d d i t i o n t h ed r u g - l o a d e dn pc o u l dr e l e a s ed r u gc o n t i n u a l l yw i t l la p p r o x i m a t e l yt h e s a m er e l e a s es p e e d a n dt h e n ，t h er e s e a r c hp r e p a r e db c n ul o a d e dn pa n dd e t e r m i n e dt h e d r u g l o a d e dr a t i oo fn pb yt w om e t h o d s t h e h i g h e s td r u g l o a d e dr a t i oa n d d r u g e n c a p s u l a t i o ne f f i c i e n c yo fn p a r e2 13 a n d16 7 t h ea u t h o ra l s os t u d i e da n d i m p r o v e do n t h ed r u gr e l e a s ed e t e r m i n i n gm e t h o do fb c n ul o a d e dn p b yt h en e w m e t h o d ，t h e r e s e a r c h e rm e a s u r e dt h ei nv i t r ob c n ur e l e a s ec h a r a c t e ro fn p ， d e t e r m i n e dt h es u s t a i n e dd r u gr e l e a s eo fn pd u r i n g5d a y s t h r e ek i n d so ft u m o rc e l l s w e r eu s e dt od e t e r m i n et h ec y t o - t o x i c i t yo fd r u gl o a d e dn p t h ed r u g - l o a d e dn p d e m o n s t r a t e dh i g hc y t o t o x i c i t y ，w h i c hi sc l o s et ot h eu n l o a d e db c n u ，a n dr e v e a l e d s u s t a i n e dd r u gr e l e a s ec h a r a c t e ra sw e l l t os u m u p ，t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tb c n u l o a d e dn ph a st h e s m a l lp a r t i c l es i z ea n dn a r r o ws i z ed i s t r i b u t i o n t h en pc o u l d1 0 a dc e r t a i na m o u n to f b c n ua n dr e l e a s ed r u gs u s t a i n e dr e l e a s ed u r i n gs e v e r a ld a y s i na d d i t i o n ，t h en p s h o w e dc e r t a i nc y t o - t o x i c i t yi nv i t r oe x p e r i m e n t t h es t u d ys e taf o u n d a t i o no nt h e f u r t h e rb r a i nt a r g e t i n go f n p b y s u r f a c em o d i f i c a t i o nm e t h o d k e y w o r d s ：b c n u p o l y l a t i ca c i d ( p l a )n a n o p a r t i c l ed r u gl o a d e dr a t i o d r u g c o n t r o l l e dr e l e a s ea n t i - t u m o re f f e c t s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特另l j j j r l 以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得盘盗盘生或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名 签字日期：2 r 寺弓 年f 月l 2 同 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解鑫盗盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权墨壅盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名： 签字日期? 啊j 年 新躲一、节芊 签字f 1 期：k 年白砂r n ；，、 “， ，夕 ，1日 7 0 ，才能够在延长n p 血液循环时间的应用中取得较明显的效果。m o g h i 等 指出投药间隔时间对于维持在较长的m 液循环时间相当重要。d a v is 等的研究 则表明，p o l o x a m e r 改性微球的循环时间与微粒尺寸密切相关。同时p o l o x a m in e = l p o o x a m e r 在避免n p 被肝扑捉的应用中更为有效。 采用此类聚醚对n p 进行表面改性的特殊优点是此方法的广泛的适用性：改 性方法的灵活性：即可此类活性剂为稳定剂制各n p ；也可先制备载药微球，再将 微球溶于p o l o x a m e r 或p o l o x a m i n e 溶液进行实现活性剂吸附；此外，先将适量 p o l o x a m i n e 一9 0 8 静脉注射，定时间后再将将聚苯乙烯微球静脉投药， p o l o x a m in e 一9 0 8 或p o o x a m i n e 一9 0 8 一蛋白质联合体同样可以在体内吸附到微球表 面，抑制微球对血浆成分吸收，获得微球的长效循环，并且此方法改变微球在各 器官分配的效果与活性剂用量及p o l o x a m i n e9 0 8 微球投药时间间隔密切相关。 对不同高分子微球的广泛适用性：j a c k s o n 等的实验以d l 一聚乳酸、聚己内酯 ( p c l ) 、聚甲基丙烯酸酯( p m m a ) 及聚乳酸与乙烯一乙烯醇共聚物( 5 0 ：5 0 ) 为 材料制得微球，采用f 1 2 7 为表面活性剂对各微球进行表面改性后，活性剂均能够 抑制蛋白质在微球上的吸附及免疫球蛋白对载药微球的调理作用，最终延长药物 的血液循环时间并降低噬菌作用产生的相应的炎症反应。 1 1 4 2 微球表面改性与包载药物控释 第一章绪论 实现药物控释是载药n p 作为新剂型的中心任务，药物控释包括空间控释 ( 即靶向释放) 与时效控释，从时效控释的角度讲，大部分载药微球的药物释放 包括先后两个阶段：药物突释阶段及稳定释放阶段。药物突释是载药微球一直难 以解决的问题，由于突释剂量无法控制，短时间内血药浓度急剧上升甚至超过中 毒极限浓度，同时靶向部位的有效浓度相应减少，极大的限制了载药n p 的应用。 由于n p 包载药物的释放在n p 降解解体前必须经由n p 表面，n p 的表面性质对包 载药物释放性能的多方面的影响，影o j n p 释药性能的表面性能主要包括表蕊形貌 与表面药物两个方面。表面形貌：包括表面的粗糙程度与微孔分布等。在其它 影响因素不变得前提下，微球表面的粗糙度越高，则表面积越大，有利于药物的 加速释放：微球表而的微孔越多，孔径越大，则体液渗入微球与药物溶液向外扩 散越容易，药物突释越显著，释放速度加快。同时表面形貌对药物释放的影响也 与药物在微粒中的分布( 贮存式结构或基体式结构) 有关。药物在n p 表面的分 粕：包括药物附着j 。微球外表面与包载部分的比例，药物在表的刚着方式以及 药物在微球表面的存存形式( 结晶或无定形态) 。微球外表面的附着药物与游离 药物释放相似，是引起的突释的重要因素，这部分药物占微球包载药物的比例越 高，突释效应越显著。 研究者已尝试采用一定的方法载药n p 的表面改性，从而引起n p 释药性能的改 变。t z e w e nc h u n g 等通过改变微球制备过程中的溶剂挥发方法获得了不同表而 性能的k p 。此研究小组以利多卡冈为模型药物，在相同的温度下，对比常压挥发 ( 7 6 0 m m l t g ) 与减压挥发( 4 6 0 m m h g ，1 6 0 m m h g ) 对o w 型p l a 载药微球表面形貌的影 响：对，半品形的刚。a 微球，常压挥发得到的微球表面光滑，而减压挥发得到了 表面粗糙或多孔的微球；对于无规i 约p d i 。l a 微球，两种方法均得到较为光滑的微 球。由于采用减压挥发的另一个效果是引起无规与半晶微球载药量减少，粒径减 小，( 相对于常压挥发) ，最终结果表明常压与减压的对药物的释放影响并不显 著。 e 1i a r i al e o 等则通过对己制备的微球采用不同的洗涤方法获得了不同的微球 释药性能：对溶剂挥发法制得的微米级载布洛芬p l a 微球的分别用去离子水与可 以溶解布洛芬的碳酸钠溶液进行洗涤，采用n a c o 。洗涤后，在体外释放中相对于 去离子水洗涤得到的微球药物突释明显降低；而稳定阶段释放的变化与微粒尺寸 相关，在几个微米的范围内，微球较小时，n a c o ；洗涤使得释放速度明显加快， 微球相对较大，影响并不明显。以上结果可以用布洛芬在微球中分布状态加以解 释：d s c 分析表明，布洛芬在微球中有无定形和结晶两种形态，微球内部的药物 绝大多数以结晶态分布，只有靠近微球表面的少量药物：而吸附于微球外表面的 药物以无定形态存在，药物溶出过程中无定形药物容易快速释放出形成突释。由 第章绪论 于此部分药物可溶解于n a c o 。溶液，因此，通过n a c o 。洗涤除去无定形药物，可达 到抑制突释的目的；同时微球内靠近表面微球的药物在洗脱过程中引起表面孔隙 的形成及表面粗糙度增加，加速了稳定释放阶段前期的释放速度，尺度的影响可 归结为；微球越小，表面积越大，附着于内表面的药物比例越大，洗脱引起表面 形貌改变越显著，增速效应越显著。 1 1 4 3 微球表面改性与药物的血脑屏障的穿透能力 血脑屏障( b r a i nb l o o db a r r i e fb b b ) 是由脑毛细血管内皮及连接、内皮 基膜和星形细胞终足形成的胶质膜，将血液循环系统与脑液分离。b b b 只允许分 子量小于2 0 0 6 0 0 d 的亲脂性营养物质和药物以自由扩散方式通过，对分子量大 于1 8 0 d 的离子化或亲水性药物、重组蛋白、单抗和反叉寡核营酸具有屏障作用。 b b b 的这种屏蔽效应极大的限制了大量抗癌药物在脑肿瘤治疗中的应用，因此， 药物载体系统研究中一个重要的方向就是提高包载药物穿过b b b 的能力。 表越改性n p 为药物获得良好的b b b 穿透能力提供了新的可能。研究表明“， 吐温类表面活性剂( 尤其是吐温8 0 ) 改性的聚j 氰基丙烯酸脂( p b c a ) 载药n p ， 对包载药物通过b b b 能力，有显著的改善作用。 吐温8 0 等改性的p b c a n p 通过b b b 过程中的作用机制，还没有完全确定，最有 可能的机理是通过腑毛缔f 管内皮细胞的内吞作用”：存组成b i ；b 的内皮细胞 中中存在着活性受体系统，包括亲脂性物质在内的一些化合物可以通过此类受体 系统通过b b b 进出脑部；此类系统中铁传递蛋白通过细胞摄入系统与低密度脂蛋 白( l o l ) 受体可用于胶：佚载药系统的b b b 传递；在改性载药即注入血液循环系统 后，血浆中的阿扑脂蛋白e ( a p o e ) 吸附于n i ，表面，而吐温8 0 类似锚的作用， 使得a p o e 矛d 其它一些物质结合于n p 表面；吸附a p o e 的n p 成为了模拟f 1 d l 微粒， 可被l ，d l 受体系统识别并与其相互作用，使得n p 被内皮细胞内吞，从而使得药物 由内皮细胞向脑内扩散，( 图13 一a ) 也可能n p 术身携带药物穿过内皮细胞进入 脑部( 图l - 3 - b ) 。 六肽d a a r g i n 、二肽k y t o r p h i n 、l o p e r a m i d e 、阿霉素t u b o c u r a r i n e 、 等难以通过的亲水性药物通过此类n p 载药系统投递，均显著改善了其b b b 通透 性，提高药物在脑部浓度。 镇痛药d a l a r g i n ( 亮氨酸脑啡肽的类似物) 是上述载药系统应用的一个成功 例子。一系列研究通过对游离药物，药物与吐温的混合物，药物与n p 混合物，药 物吐温n p 的三元混合物( 混合后立刻进行投药) ，以及载药n p 和吐温改性载药n p 的体内镇痛作用进行比较，表明采用改性载药n p 具有较好的镇痛作用，从而证明 了改性n p 对d a l a r g i n 体内b b b 通透能力的改善作用。u l r i k es c h r o e d e r 等”3 则 第一章绪论 考察了载d a l a r g i n n p 静脉给药后的体内分布，证明n p 减少了药物在肝脏中的首关 消除，使药物更加稳定，并提高了药物在脑部的浓度。 游离药物 o o o o o 0 0o 。o o l o 0 0 0 鼹 b b b载药n p 1 3 a o 0 剧1 - 3 吐漏- 8 0 改性p b c a n p 改善药物b b b 穿透能力机理 j 一3 - a ：游离药物( 被动扩散) 1 3 - b ：内皮细胞对n p 内吞后促进药物穿过b b b ( 受体介导) 1 3 - c ：n p 内吞后携带药物穿过b b b ( 受体介导) 阿霉素也通过此类n p 包载获得良好b b b 穿透能力，c , u l y a e v 等对阿霉素，阿 霉素叶温8 0 混合溶液，载阿霉素n p 及吐温改性载阿霉素n p 的药代动力学进行了 比较，结果表明改性微球包载明显有利于阿霉素通过b b b 从而提高在脑部的浓 度，此外，吐温改性微球与未改性微球均可以将阿霉素在心脏的浓度降低到察 觉极限以下，大大减弱了其高心脏毒性。 p b c a 微球对中枢神经系统用药的促进作用同样体现在一些本身可穿过血脑屏 障药物的应用中，游离的5 , j - 密曲替林( 一种三环抗抑郁剂) 可穿过b b b ，采用吐 温一8 0 改性的p b c a n p 包载后静脉投药，脑部a u c 得到提高，而血液a u c 值下降，表 明更多的药物穿过b b b ，到达脑组织。 o 护o 第一章绪论 1 2 脑靶向药物研究进展 1 2 1 脑靶向研究进展 纳米控释系统最有发展的应用之一是应用于脑靶向，尤其用作抗肿瘤药物的 输送系统，实现对脑肿瘤的靶向治疗。 脑组织是一个非常精密的器官，经过几十万年的进化，脑组织自身建立了一一 种完整的保护机制，即防止除营养成分外其它物质的进入，而这种保护机制的功 能单元就是血脑屏障( b l o o db r a i nb a r r i e r ，b b b ) 。血脑屏障( b l o o db r a i n b a r r i e r ，b b b ) 是由脑毛细缸管内皮及连接、内皮基膜和星形细胞终足形成的胶 质膜，将血液循环系统与脐液分离。b b b 只允许分子量小于2 0 0 6 0 0 d 的亲脂性 营养物质和药物以自由扩散方式通过，对分子量大于1 8 0 d 的离子化或亲水性药 物、重组蛋白、单抗和反叉寡核苷酸具有屏障作用。b b b 这种精密的保护作用 一方面维持内环境稳定，使脑组织免受毒素、细蔺等有害物质的损害，另方而 也限制了药物进入脑病变部位发挥疗效，事实上，现行的药物中大约9 5 以上 的药物都难以通过b b b ，这使得中枢神经系统疾病的治疗变得非常困难。因 此，药物载体系统研究中一个重要的方向就是提高包载药物穿过b b b 的能力。克 服b b b 的阻碍并取得良好的疗效一直是载药系统基础和应用研究中的大课题 【2 i 2 迄今为止，脑组织的药物投递从不同的方面可以有不同的分类。按投药方法 可以分为三个方面：神经外科法脑组织介入性直接用药，避丌b b b ；利用 药理学改性使药物通过b b b ：利用血脑屏障卜理学特征使药物通过b b b 。按 药物与载体的结合方式r q 分为前约和微球( 囊) ；而按对脑组织的创伤性i u 分为 介入性和非介入性。介入性疗法是最早采用的增强药物通过b b b 作用于脑组织 的方法，包括颅腔内灌注和颅内埋植等，这种方法一直沿用至今，在一砦疾病的 治疗中取得了一些新的突破。近二十年来，有关脑组织的传质动力学、代谢、细 胞和分子生物学的研究进展极大的促进了人们对b b b 功能的了解，并为新的药 物治疗方法提供了理论基础。研究人员提出集中模型药物从血液到脑组织的传递 机理，包括被动扩散、载体介导传质、吸附介导的胞吞作用等，除此之外，人们 还利用毛细血管内皮细胞表面中的p 一糖蛋白的流出泵作用，限制细胞毒性药物 的积聚。根据这些机理，人们确定了影响药物从血液循环系统经过血脑屏障进入 脑部的基本因素，包括脂溶性、分子量和电荷性质。脂溶性越高，渗透或扩散通 过b b b 能力越强。根据这些机理，人们开发了不同的方法使药物有效通过 b b b ，包括针对药物亲脂改性而设计的化学投递系统，以蛋白或单抗受体介导 的胞吞作用和以小分子肽引导的细胞渗透“3 3 。 第一章绪论 总之，脑组织靶向药物投递技术需要各学科的交叉合作，而这一合作必将为 这一领域的发展起到积极的推动作用。 1 2 。2 神经胶质瘤及治疗研究进展 神经胶质瘤是发生于神经外胚层的各种肿瘤的统称”。在脑瘤患者中，恶性 神经胶质瘤患者占4 0 5 0 。与其它肿瘤相比，恶性神经胶质瘤具有复发率高、 患者存活期短的特点，是神经外科中难治疾病之一。尽管已有许多治疗方法被探 讨并用于临床，但其效果仍然t 一分有限。主要原因是手术治疗难以切除肿瘤的浸 润区域，血脑屏障( b l o o d - b r a i nb a r r i e r ，b b b ) 阻止亲水性和分子量较大的化疗药 物由血液循环系统到达脑部的病变部位，司时一些理化性质和分子量适宜的药物 ( 如卡氮芥) 虽可通过b b b ，但全身用药毒性使其应用受到。 神经胶质瘤9 0 术后复发部位在原位的2 c m 范围内，因此这种患者的术后 化疗应灾施脑病变部位的集中氏效用药，即在较长时间内维持术后瘤灶部位药物 的高浓度。实现此r 标需要解决两方面的问题：约物有效通过b b b ，靶相作 用于痛灶及浸润部位的癌细胞；药物长效缓释。 为了实现上述目标，国内外研究主要集中在以下几方面：采用神经外科方 法绕丌b b b ，如药物采用颅腔内药物灌输、基因工程细胞注入，但注入药物只 在脑组织表而起作用，对深部肿瘤无效。以聚酸酐为基材制备含卡氮芥的药物 缓释片剂，手术切除肿瘤后植入痛灶部位，大剂量局部缓释用药，此方法只适用 于可接受手术治疗的部分患者。丁扰b b b ，士f l ： 加b b b 两侧渗透压，并引起内 皮细胞短暂收缩，但采用的甘露醇等药物进入脑室，被证明会引起长期的神经病 理学变化： 1 2 3 化疗药物b c n u 的理化性质及药理学作用 神经胶质瘤是中枢神经系统最常见的肿瘤，也是神经外科中难治疾病之一。 由于手术治疗无法根治，药物化疗已成为神经胶质瘤治疗中的重要一环。其中卡 氮芥是治疗神经胶质瘤最常用的化疗药物。 1 2 3 1 卡氮芥概述