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p n a 大环多胺配合物的合成及d n a 裂解研究 有机化学专业 研究生王晓燕指导教师余孝其教授 化学核酸酶是当今化学生物学中发展迅猛、富有挑战性的新领域之一。p n a 以其生物稳定性高，与核酸杂交特异性及亲和力强，成为生物学研究的有利工 具，在基因治疗，分子杂交，p c r 扩增，核酸捕获和基因分离等领域有广泛的 应用前景。大环多胺化合物是一类性质独特的优秀配体，具有良好的金属配位 能力。其金属配合物在分子识别，特异性化，荧光探针，自组装方面有着广泛的应 用。本文致力于将p n a 和大环多胺结合起来，构建新型人工核酸酶。 我们通过1 ，4 ，7 ，1 0 一四氮杂十二烷与肽核酸单体合成了一个新的化合 物，并测定其对p u c l 9d n a ( f o r mi ) 的水解能力，结果表明，其c u 配合物能 在生理条件下较好的促进d n a 的裂解，选择性生成开链环状d n a ( f o r mi n ， 对其裂解机理进行了探讨，其裂解可能是通过水解途径。并采用液相法和固相法 合成了一些含多个p n a 的寡聚p n a 。 关键词：大环多胺合成p n ad n a 裂解 s y n t h e s i so fp n a c y c l e nc o m p o u n d a n dd n a c l e a v a g eb y t h e i rm e t a lc o m p l e x e s x i a o y a nw a n g ( o r g a n i cc h e m i s t r y ) d i r e c t e db y p r o f e s s o rx i a o q iy u c h e m i c a ln u c l e a s e sa r ean e wc h a l l e n g i n gf i e l dt h a ti sq u i c k l yd e v e l o p i n gi n c h e m i c a lb i o l o g y p n a ( p e p t i d en u c l e i ca c i d ) i st h ef a v o r a b l et o o li nb i o l o g y b e c a u s eo fi t s h i g hs t a b i l i t y a n dh i 曲a f f i n i t yw i t hn u c l e i ca c i d i th a sw i d e a p p l i c a t i o ni ng e n et h e r a p y , m o l e c u l a rh y b r i d i z a t i o n ，p c re n h a n c e m e n t ，n u c l e i c c a p t u r ea n dg e n es e p a r a t i o n m a c r o c y c l i cp o l y a m i n e i sat y p eo fu n i q u ea n d e x c e l l e n tl i g a n df o rc o o r d i n a t i n gm e t a li o n s m a c r o c y c l i cp o l y a m i n e m e t a l c o m p l e x e sa se n z y m em o d e l sa r ew i d e l yu s e di nm o l e c u l a rr e c o g n i t i o n ，c a t a l y s t ， f l u o r e s c e n tp r o b e ，s e l f - a s s e m b l i n g i nt h i sd i s s e r t a t i o n ，w ef o c u so nc r e a t i n gn e w c h e m i c a ln u c l e a s e st h r o u g hl i n k i n gp n aa n dc y c l e n w es y n t h e s i z e dan o v e lc o m p o u n dw h i c hp n am o n o m e rl i n k e dw i t hc y c l e n ( 1 ，4 ，7 ，1 0 t e t m a z a c y c l o d o d e c a n e ) ，t h ec a t a l y t i ca c t i v i t y o nd n ac l e a v a g ew a s i n v e s t i g a t e d t h er e s u l t ss h o w e d t h a tc o p p e r ( i i ) c o m p l e x e sc a nc a t a l y z et h ec l e a v a g e o fs u p e r c o i l e dd n a ( p u c1 9 p l a s m i dd n a ) ( f o r mi ) u n d e rp h y s i o l o g i c a l c o n d i t i o n st op r o d u c es e l e c t i v e l yn i c k e dd n a ( f o r mi i ) ，t h em e c h a n i s mw a ss t u d i e d t h ec l e a v a g ep r o m o t e db yt h ec o m p l e xm i g h tt a k ep l a c eb yah y d r o l y t i cp a t h w a y w ea l s os y n t h e s i z e d0 1 i g o p n a sb yl i q u i da n ds o l i dp h a s em e t h o d k e yw o r d s ：m a c r o c y c l i cp o l y a m i n e s ，s y n t h e s i s ，p n a ，d n ah y d r o l y s i s 四川大学硕士学位论文 第一章肽核酸及其类似物的合成与性质研究进展 1 1 引言 1 9 9 1 年，丹麦科学家n h e s e n i l l 首次报导了p n a ，以中性的n - ( 2 一氨乙 基) 甘氨酸为结构单元，代替了天然核酸中带电的磷酸二酯骨架。它的碱基 部分则通过亚甲羰基连接于甘氨酸中的n 原子上。因其结构介于多肽和核酸 间而被命名为肽核酸( p e p t i d e n u c l e i c a c i d ，简写为p n a ) 。其结构式如下： f i g u m l o h n i e l s e n 等的研究表明，一定长度的p n a 类聚合物能以相当高的亲和力、 序列特异地与互补的d n a 、r n a 杂交，其结构参数与d n a 或r n a 中的相 应参数基本相同，保证了p n a 与d n a 等结合时的牢固性；同时，由于其结 构的特殊性，使其不易受核酸酶或蛋白酶降解，在体内具有很好的生物稳定 性，从而有希望成为一类新的以基因为靶向的制剂而得到广泛应用。 但是，由于p n a 结构的特殊性，它自身也存在着一些缺陷。电中性的链 使得水溶性变差，不易穿透细胞膜，同时p n a 与d n a 的杂交作用局限于一 定的离子强度下，而且p n a 与d n a 的杂交是以平行或者反平行的方式进行， 没有特异性。所以，近年来化学家们进行了广泛的结构修饰，其中包括基于 原p n a 分子骨架的修饰 2 】，如链的延长，手性的引入等；还包括以完全不同 的含氨基和羧基化合物来构建结构单元，如以天然氨基酸作为主链单元等【3 j 。 这些修饰的结构都能在一定程度上改善p n a 的性质和功能。 2 m ) t l 大学硕士学位论文 p n a 的水溶性可以通过连接阳性离子得到增强，如在p n a 的c 端或者 n 端连接多胺h 、赖氨酸嘲或者在骨架中引入胍基旧。细胞穿透能力可以通 过连接不同的转移分子如细胞穿透肽达到增强m 。由于p n a 与d n a 结合时 采取平行和反平行的机会均等，这造成它在治疗应用上的极大障碍。把手性 引入p n a 非手性骨架中，可以使得同d n a 结合时有取向上的选择性。 1 2p n a 及其类似物的合成 经典p n a 单体的合成： b 刚舢h ，船一1 一一n h 一 1 d 。r k u m e ra n dg a n e s h 小组在p n a 单体的修饰上作了很多杰出的工作，他们 合成了一系列骨架各异的p n a 单体，这些p n a 含有五员或六员环田，结构 牢固，他们期望通过增加结合强度但不丢失结合的精确性来达到p n a 和 d n a 的特异性杂交。如下图： p y r r o l i d i n e p n a f i g u r e 3 构型限定的pn a 铲胤p。一p赫 婴型奎堂堕主堂篁丝苎 a p p e l l a 等把三员环的结构引入到p n a 骨架中”，如图4 b ，同五员环相比， 三员环的刚性更强，顺式取代的二面角( 大约1 4 5 0 c ) 大于五员环中的二面 角( 大约7 0o c ) 】n 】l 】。 魏刀斌b a s e 舰?x _ ，h a e g p n at c p r p n a 4 a4 b f l u r e 4 v a nb o o m 小组合成了环状的p n a ，他们顺利地在液相中把线性的二聚 体转变成环状的二聚体【1 2 】如图4 c 。 余孝其课题组设计并合成了新型的手性肽核酸单体5 1 1 3 1 。如图，它同经 典的p n a 相比有如下特点：这种单体不仅在主链的构建上以天然氨基酸作为 基本单元，而且在碱基连接主链的位置和方式上与传统p n a 相比，都有很大 的改变，即碱基不再连接在主链原子上，而是连接在主链氨基酸的侧链上， 连接方式也由传统的酰胺键变为直链醚键。更为新颖的是，在碱基芳环的连 接位点上也有了新的突破，不再像之前p n a 那样总是连接在尿嘧啶的l 位 原子上，而是连接在了5 位c 原子上。 o 5 f i g u r e5 现在，对碱基的替代工作也引起了人们广泛关注，下图的6 a 1 4 1 ，6 b 15 1 ， 6 c t l 6 1 ，6 d t l 7 1 几个化合物已经被实验用作碱基的替代物，并观察到了与d n a 4 四川大学硕士学位论文 的杂交。 h 6 a 6 bl 、c o o h 6 c 6 1 ) f i g u r e 6 p n a 寡聚物的合成： k o c h 掣1 8 1 在已有的合成工作基础上，发展并优化了合成p n a 所用的肽 固相合成方法，从而建立了适合p n a 本身结构的标准固相合成方法，并使之 应用于自动合成之中，该合成方法可总结如下图。 丫r “m “。凡g 场场。且。 h 印 f i g u r e 7 踺v 键 四l i 大学硕士学位论文 通常p n a 寡聚物的合成采用标准的固相合成步骤，从正交保护的p n a 单体出发依次延长成为寡聚物。关于不同保护基团和偶联试剂有了很多研究 1 9 1 但是，这种策略所费需时。 t a b l e1p n a 合成的保护策略 也有课题组把u g i 反应引入到肽核酸类化合物的合成中，以胺、碱基乙 酸、醛、带保护基的氨基乙基异腈为原料，四组分经一步缩合生成p n a 单体 1 2 0 1 ，p n a 单体经脱保护后，作为一个新的胺组分，加入到下一轮的u g i 反应 中，该循环不断重复，可以不断延长p n a 链。u g i 反应中的醛、碱基乙酸组 分可以灵活变换，通过变换碱基乙酸，可以方便地合成不同碱基序列的p n a ， 通过醛的变换，可以对p n a 进行结构改造。 r 1 n h 2 + b o 【 l - c o o h +r 2 7 r 3 + ： 燃 3 ) r e p e a t1 ，2 n - 1t i m e s r n c ，7 n h 9 g 。4。：，g；i!嚣t。m。， f i g u r e 8 6 堕型查兰堡主堂垡笙壅 在p n a 合成的方法学上，c o n d o ma n dp a t i o n o 课题组作了很多杰出的工 作叫。他们报导了“f u l l y p r o t e c t e d p o l y ( a m i n o e t h y l g l y c i n a m i d e ) b a c k b o n e ”f f p b ) 的方法。这种方法主要在于构建一个f p b ，这个f p b 包含了许多不同的且正 交的保护基团，当选择性和序列性地去保护后，多个等同的碱基乙酰基就可 以一步同时缩合到主链骨架中，这种f p b 的策略避免了麻烦的单体的合成， 而且起始原料易得。这种方法可以广泛的用于液相和固相合成。 p a t ha ：c o n v e r g e n ta p p r o a c h ? 1h 丫 一n v c 0 0 r x d 、v n v c 0 0 h b i里 ；。拙l 。帆甚 】= 。瓠b t 彤b 1 删弋b x p a t h b ：f u l i y p r o t e c t e d p o l y a m i d e b a c k b o n e a p p r o a c h x p a t h c ：d l v e r g e n ta p p r o a c h + r ；姆：_ k 麓岵。地b y 。 ， b i f i g u r e9 l i q u i d p h a s es t a t e g i e sf o r t h es y n t h e s i s o fp o l y p n a s 7 l 斗p k 一 山 四川大学硕士学位论文 l e w i s 发明了一种有效的、方便的固相合成法 2 3 j ，这种方法可以高产率 和高纯度的得到产品。而且不同于以前报导的固相方法的地方是，这种温和 的反应条件既适用于f m o c 又适用于肽化学。 r r 小 ；丫一n b r - - - o t b u ，b = t ( i ) r e s i n ，d i p e a ( i i ) p i p c r i d i n a d m f ( i i i ) f m o c n h c h 2 c h o h o a c n a b h ( o a e ) 3 ( i v ) b - c h 2 c o o h ，d h b t o h ，d i c ( v ) 0 5 t f a d c m f i g u r el o s u t h e r l a n d l 2 4 报导了一种新的对于固相合成和后来的原位s p a ( s c i n t i l l a t i op r o x i m i t ya s s a y ) 使用的方法他用一种新的高分子载体并使用常 规的固相合成法高效的合成了p n a 。这个基于p e g ( p o l y ( o x y e t h y l e n eg l y c 0 1 ) 的载体最重要的特点是除了溶于有剂溶剂还溶于水。 近年来，关于p n a 的研究热点之一是p n a d n a 的嵌合物。瞄】这种嵌 合物能提高p n a 水溶性和细胞吸收性 2 6 】 曰厂f 乱 划。嘭 b f i g u r e1 1p n a d n a - p n ac h i m e r a p n a 和肽的嵌合物也引起了科学家的广泛兴趣t 2 7 ，举例如下 四j | l 大学硕士学位论文 s h n h 2 z f i g u r e1 2 为了增加p n a 对阳离子脂质体的亲和度，许多课题组作了研究。近年来 主要研究趋势是将p n a 连接到脂肪酸上，这种方法最为直接，缺点是其水溶 性差而且易于聚合。n i e l s e n 等发现把p n a 连接到亲酯性多杂芳环化合物( 如 图) 可以大大加强p n a 对细胞质和细胞核的脂质媒介传输能力。 o a c r i d i n e p s o r a l e n c a r b a z o l e 。扩 附 碑量 四川大学硕士学位论文 o o p e r i m i d i n e p y r e n e b e n z i m i d a z o l e 0 a n t h r a q u i n o n ep o r p h y r i n f i g u r e1 2 ：连接到p n a 上的配体结构 1 3p n a 的研究展望 p n a 以其生物稳定性高，与核酸杂交特异性及亲和力强，成为生物学研究 的有利工具，在基因治疗，分子杂交，p c r 扩增，核酸捕获和基因分离等领域 有广泛的应用前景，而且在基因芯片中有取代d n a 成为芯片探针的首选。当然， 由于其细胞摄入率低及在体内的生物物理机制尚不完全清楚，会制约其应用 与发展。但是，相信通过深入地化学修饰和改进p n a 以调整其理化和生物学特 性，及人们对p n a 的研究的不断深入，其应用前景会更加广阔。 i o q 四川大学硕士学位论文 2 1 引言 第二章大环多胺及金属配合物研究进展 自从上世纪6 0 年代以来，人们对多氨杂大环化合物的研究已经有了相当 的积累，其中研究的最多的是大环多胺类化合物为1 ，4 ，7 ，1 0 - 四氮杂环十 二烷( c y c l e n ) ，如图： 八 n h 删 ii n i i 删 u f i g u r e1c y c l e n 多氮杂大环化合物c y c l e n 及其衍生物之所以能激起人们持续的研究兴 趣，是因为它们对金属离子具有很强的配位能力，而且所形成的配合物具有 很多不同寻常的功能。例如，c y c l e n 能用于医药、酶模仿物2 9 】、分离和运载 气体【3 m 、金属阳离子提取3 1 1 等不同方面，如果对c y c l e n 加以适当修饰，其配 位能力和所形成配合物的功能还可大为拓展，如在生物医药中可用作过渡金 属，重金属，镧系和锕系金属的选择性配位剂等。若c y c l e nn 上带有酯，酰 胺，吡啶等侧链基，则可作为碱金属阳离子的配位剂，高选择性的提取n a + 。 c y c l e n 还可以在生理条件下实现自组装。 本章将对大环多胺金属配合物在分子识别，特异性催化，荧光探针，自组 装方面进行概述和讨论。 2 2 大环多胺的分子识别 大环多胺是一类广泛应用的螯合剂，一方面大环多胺可以通过形成配合 物的形式与阳离子结合，另一方面又可以借助于氨基的质子化或季胺化状态 通过氢键或静电作用识别阴离子3 2 1 。c y c l e n 的分子识别主要集中在核酸，氨 基酸，多肽等的小分子识别。 婴型查堂堡主兰垡垒塞 c v c l e n 的金属配合物广泛的用于识别d n a 系列的小分子，由于可以用其 作基因目标药物而受到了巨大关注。这些药物- i h e 改变d n a 的局部结构而阻 止阻遏物或活性剂的进入，达到调整最终基因的表达程序的目的p “。e i i c h i k i m u r a 在这方面作了很多杰出的工作，尤其是c y c l e n - z n 的配合物与核酸的 相互作用作了细致的研究3 4 1 。c y c l e n z n ( 1 1 ) 配厶物在中性介质中可以选择性 地高效地识别t ，u 及含酰胺官能团的类似物3 5 1 。识别是通过z n 阳离子和去 质子的n 负离子和两个酰胺上的氧和c y c l e n 上的两个n h 之间的氢键进行的。 如图： “葛嚣麓d 蛆 t t 4 z a d i n ) f i g u r e 2 在2 5 c ，i - - 0 1 0 ，用电势p h 滴定测得l o g k ( 2 ) = - 4 2 ，其它碱基a ，g ，c 在相同的条件下都不和1 相互作用，所以，1 是一个新的对t ，u 的特异性 识别分子，但是其在生理条件下l 酽的离解常数限制其应用。为了发展能识 别多个t ( u ) 的分子，k i m u r a 又继续研究了以对二甲苯基为桥连基团的双 核和多核的大环多胺锌配体和核酸的相互作用【3 q ( 如图) t p t b i s ( ( z n 2 + - c y c l e n ) t p t p t - t r i s ( z n z + - y c l e n ) f i g u r e 3 1 2 。g ii x硷。一 n h 婴纠奎堂堡主堂垡丝苎 他又设计出可以识别t 和g 的z n 吖啶大环多胺化合物和含两个多芳环的 z n 配合物4 和5 【3 7 】。 4 f i g u r e 4 5 k o i l i g 小组设计合成了不同桥连基团的双核衍生物6 和7 口嘲。后来，他 们又合成了具有识别酰胺基团的z n c y c l e n 配合物8 3 9 1 ，可以应用于识别胸腺 嘧啶t ，巴比妥酸盐和维他命b 2 。 馘。 o 4 c 1 0 4 m = z n 2 + = c u 2 + 6 n h 7 四川大学硕士学位论文 8 f i g u r e5 s c h n e i d e r 等设计了一个基于三氨乙基胺的三核大环多胺铜配体9 ，它 对核酸有很强的亲和力。研究表明这个配体在中性p h 下形成带电荷的多胺 阳离子，在三个大环单元上分布了6 个酸性的质子。可以和铜形成稳定的三 核配合物。配体和配合物均可以增加双连核酸的稳定性。 f i g u r e 6 d n a 和r n a 核苷之间均由磷酸酯键键联。常把磷酸酯看成d n a 和 r n a 的模型物来进行研究。b e n n i s t o n 等人合成了带冠醚的单大环多胺化合 物1 0 和双大环多胺化合物1 1 t 4 1 1 两环协同识别h 2 p o , , - ，形成夹芯配合物。并 且，k h 2 p 0 4 明显高于n a h z p 0 4 ，其结合常数k a = 9 3 2 x1 0 4 。可能是由于该 1 4 _ l 八x _ _ 四川大学硕士学位论文 冠醚对k + 半径的尺寸匹配，其结合力比n a + 强，络合在冠醚中带正电的k + 加强了对带负电的磷酸根的结合。 h 1 0 h o - z n 2 + f i g u r e 7 大环化合物对小分子化合物的识别主要是与主体分子空腔的大小和底物 的长度( 距离互补) 有关m 】。c y c l e n 空腔比较小，很难形成包结物。以尺寸 较大的大环多胺为主体的分子可以对许多生物分子如双羧酸化合物、双胺肽、 氨基酸、多胺等进行选择性识别。 大环多胺及其配合物的超分子识别研究是超分子化学中极富挑战性的热 点领域之一。随着分子识别机制的深入研究，特别是超分子化学的发展，它在 合成化学、生命科学中起着愈来愈重要的作用。通过对主体分子的巧妙设计 和性能研究，对生命过程中的重要物质如核苷酸，d n a 、r n a 进行识别分 析，对于寻找治疗威胁人类生命的一些疾病的药物，阐明生命活动的基本过 程等都具有重要的理论和实践意义。 2 3 大环多胺金属配合物特异催化性能 大环多胺的催化功效主要依靠于初始阶段对底物分子的选择性识别。它 们既可以与正电荷的离子发生配合作用，又可以与带负电荷的有机阴离子发 生配合，以主一客体配合物形式形成超分子。同时又具有能同客体分子匹配的 空腔，不同数目的连接段等，这样不仅有动力学特征，而且具有合适的键合 位置及功能基团。 一：可以通过形成配合物的形式与阳离子结合 二：借助氨基的质子化或季胺化状态通过氢键或静电作用识别阴离子。 o儿九u 瞰(，h 四川大学硕士学位论文 成环氮原子具有强碱性，故能与h + 形成铵离子形式，较易导入羧基，羟基， 磷酸基以及其他亲水基团或功能基团，则可得到一系列水溶性金属配合物的 配体。其中某些金属( 如铜、锌等) 的配合物在人体生理条件下表现出很好的 稳定性，因而在药物试剂如在核磁共振诊断( 人体显像) 、x 射线诊断、超声 波诊断、放射性诊断及放射性治疗等方面有潜在的应用前景【4 3 1 。同时在金属 离子的分离和回收方面也有广泛应用】。在酶模拟研究中，则主要是应用于 羧酸酯、磷酸酯【4 5 1 及核酸的催化水解研究，进而较为深入地阐明酶的作用机 制。在水解或酯基转移反应中，金属离子有两方面的作用：1 ) 同时作为酸和 碱催化剂，作为l e w i s 酸，金属离子与底物的p 一0 结合，降低其负电荷而活 化磷中心，同时它们提供一个金属键合的羟基，以利于发生亲核进攻，因为 m o h 2 的l e w i s 酸性随着金属离子的正电荷密度的增加而增加。2 ) 可以与离 去基团结合而帮助离去基团离去。 2 3 1d n a 水解研究 d n a 是一个天然的稳定的聚合物，在生理条件下，自发水解的半衰期大 约是1 3 0 0 0 0 年。d n a 有较高水解稳定性是由于在磷酸二酯骨架和潜在的亲 核试剂之间的排斥作用造成的，因此对于d n a 的水解或裂解的研究主要集 中于对d n a 中的磷酯键的水解。由于其在生物技术和药物治疗领域潜在的 应用，引起了人们极大的兴趣，许多金属配合物被设计出来以期通过水解晰】 或者氧化途径有效的切割d n a l 4 7 。 c y c l e n 的c o 配合物是至今发现最有效的催化剂之一。c o c y c l e n 配合物 可以把超螺旋结构水解成为开链结构时使速度提高1 0 7 倍娜1 。设想的机理如 下：c o 中心和磷酸二酯键的磷酸根阴离子结合，和c o 配位的相邻的o h 离 j。 冰犬 l “ 四川大学硕士学位论文 二氯一1 ，4 ，7 一三氮杂环壬烷的c u ( 玛配合物 c u ( 1 0 9 a n e n 3 c 1 2 i 拒有效 的裂解单螺旋( m 1 3 d n a ) 和双螺旋d n a ( 质粒d n a ) m 1 。s e r g e s o n 等证明了 用c o ( n ) 的配厶物的确能导致d n a 的有效水解或裂解，如c o ( m ) 的c y c l e n 配合物水解d n a 比e u ( ) 配合物有效d 。 在配合物中带正电荷的侧链能提高催化活性【5 1 1 ，如化合物1 2 对于d n a 的水解在很短时间内( 2h ) 完成5 2 1 。季胺盐的静电作用加强了与带负电的磷酸 根结合，大大提高了b n p p ，n p p ，d n a 的催化水解能力。 f i g u r e 9 余孝其课题组在大环衍生物对质粒d n a 切割方面作了很多工作，设计 了单核配体1 3 ，1 4 ，1 5 ，1 6 ，双核的不同金属配体1 7 ，1 8 ，在生理条件下， 对d n a 水解表现出良好的催化作用巧3 1 。 1 , , 转t i - - ) 1 飞：，“2 。 。亡：。 2 ) 。洲之| j j t 洲 1 4 1 7 姚 a 洗 。郴 吼温 邓 也 、”夕 h参曼 q o 婴型查堂堡主堂堡堡壅 一 h - - ：| ：l j 了i , ) x b 含re 一刚n m 邺 1 5 x r 1 5 a h 2 c 口c h 2 1 5 b h 2 c o c h 2 1 5 c 1 5 d z c 囝 、 c h a 邺囝 一扣囝 1 6 a r = 1 7 a r = c h z m = z n 2 + c 0 2 + , c u 2 + = n = 1 - 3 0 。4 ：o ，1 o 3 h 2 c 飞乡 r 国晰印 1 7 a 1 6 = = 代八 1 7 d r 1 7 f r = c h 2 c h 2 c h 2 c h 21 7 9 r - - c h 2 c h ( o i - i ) c h 2 1 8 a r = c h 2 c h 2 1 8 b r = c h 2 c h 2 c h 2 1 8 c r = c h 2 c h 2 c h 2 c h 2 1 8 d r = c h 2 c h 2 0 c h 2 c h 2 f i g u r e1 0 1 8 啦吼 。 m 翩冷 一 、嗡，c写洲厂卅弋 星l 氯 、g w 扩坞 氛厂卅弋 四川大学硕士学位论文 2 3 2r n a 切割研究 由于2 位羟基的存在，很多试剂都能裂解r n a ，能对d n a 水解的试剂 都对r n a 都有效，目前主要集中于对r n a 的选择性切割问题上。研究认为 r n a 的水解是经历了同轴攻击的历程。假如在转酯过程中，2 位羟基和5 位离去的氧原子调整到顶点的取向，水解就更容易些。但是双螺旋的骨架结 构阻碍了同轴攻击，同时未配对的地方会优先水解。现在已经能够通过人工 “剪刀”实现r n a 水解，例如：大环离子，阳离子胺，味唑衍生物，吖啶衍 生物等等。但是，要限制核苷的选择性切割是很困难的，因为核苷构型上缺 乏刚性，很难作到特异性水解巧“。 k a l e s s e 报导了用t y r o s i n e 和c y c l e n 的配合物1 9 【5 习选择性切割未配对的 尿嘧啶。酪氨酸的侧链可以加速结合而且可以通过提供多余的亲核基团加快 切割反应。c h a n g 用c o 。c y c l e n 的配体2 0 【5 6 】可以实现r n a 的水解和抑制 r n a 的翻译。 厂、 n h h n 、n h 2 n hn h r 以n ：i 。 ) 厂 、 o ， h o 1 9 脚 u 2 , 0 f i g u r e1 1 设计生理条件下有效的人工催化剂最重要的是提高金属中心的催化活 性。可以采用改变微环境的办法加强金属中心的内在活性。在酶一底物体系中， 极化作用，例如底物和酶之间的氢键，偶极作用，静电作用，都非常有利于 过渡态的稳定性。这些极化作用由于因为酶的疏水微环境得到加强。假如催 化中心的微环境得到改进，那么金属配合物的水解活性就会增加。在水中得 到疏水的微环境的最容易的方法是把催化中心连接到一个高分子上。在此基 础上，s u h 把c u c y c l e n 连接到p c d 树脂上，发现其水解活性显著增加u 7 1 1 9 ( 四川大学硕士学位论文 他后来又设计合成了连在树脂上的含c u c y c l e n 的不同配合物2 1 。2 7 5 8 1 ，其 水解活性都很高。如图： 罄 o ：( 四川大学硕士学位论文 f i g u r e1 2 2 3 3 酯的水解研究 a k k a y a 研究了以氧杂蒽为母体的含z n c y c l e n 的不同配合物2 8 ，2 9 ， 3 0 5 9 1 ，并对p - n i t r o p h e n y l a c e t a t e 作了研究，他发现含大环一咪唑的衍生物3 0 有最好的催化效果( 5 7 0 0 倍增加) ，显示了多官能团催化的优势。 2 4 大环多胺金属配合物的荧光及发光性能 荧光分析是一种简单适用的分析方法，可以帮助测定p h 值和水中的金 属阳离子类型。科学家致力于研究具有高选择性和高灵敏度的荧光传感器。 这些传感器包含了个荧光中心。这个荧光中心连接到一个可以结合盯和金 属离子的离子载体上。当离子载体结合h + 或者金属离子后，荧光中心就打 开，当失去h + 和金属离子后，由于n 上的孤对电子转移到光激发了的荧光 中心上，就会被淬灭。连接有葸的大环多胺3 1 【6 0 】是一个常用而且有效的化学 传感器，它可以测定p h 值和水中的过渡金属阳离子。由于3 1 不稳定，s h i r a i s h i 2 1 四川大学硕士学位论文 在此基础上合成了含两个葸环的稳定的化合物3 2 ( 6 ”。 一 f i g u r e1 6 四川大学硕士学位论文 2 5 基于大环多胺的自组装 t z e n g ”“报导，在z n b r 2 仔征r ，配停3 6 目组装威一准刚向竹丁，1 旦是 在固态堆积成一维的平行管道，当配体3 6 和c d b r 2 存在下，生成同晶的三维 q 似p h nn “ 葑矸器b h 一封 n 、“h n、n f i g u r e1 7 j a c k s o n 等报道了含c y c l e n 的下列四个化合物3 7 ，3 8 ，3 9 ，4 0 断1 ，它们可以在 n a b i - g 作用下自组装形成超分子结晶。 翌些b e a u t i f u ls u p r a m o l e c u l e p y r i d i n e o “c 卜o h 。h 毽铅。h 弋甲己n 3 i h o h o 、 四川大学硕士学位论文 第三章肽核酸单体连接大环多胺配合物的合成及性质考察 3 1 合成路线设计 正如第一章所述，近年来，肽核酸以其独特的结构和生物活性，使其在基 因治疗药物开发、基因诊断、生物传感器以及作为分子生物学和生物技术的分 子工具等方面得到广泛的应用，吸引了越来越多的化学家、生物学家的重视， 化学工作者更是不断地从其结构上进行各种修饰，以期获得其更大的应用价值。 另一方面，大环多胺由于其特殊的结构及其同过渡金属离子以及重金属离 子等的络合作用，特别是形成的络合物在生物酶模拟，d n a 切割等方面的应用， 为研究生命活动过程提供了一种良好的手段，引起了人们对其的广泛关注，并 开发出各种有着不同作用的大环多胺及其衍生物。 在大量文献调研的基础上我们设计了一种新的p n a 单体【1 3 1 ，二肽在羧基端 引入大环多胺，由于大环多胺具有良好的配位能力，我们尝试了和z n ( ) ，c u ( ) ，c o ( ) 的配位。我们期望肽核酸上的碱基，大环多胺能够对核酸起到 良好的识别能力。在金属作用下，配体能促进d n a 裂解。考虑到文献报导的具 有良好切割效果的配体大都引入了大的共轭体系，期望通过冗讯相互作用，加强 配体对d n a 的识别能力，我们选择以侧链为苄基的二肽作为考察对象，合成了 含z n ( ) ，c u ( ) ，c o ( ) 的三种配合物。 配体结构如下： | v a 舳 酬 爵丫8 孓 。秽 n 四川大学硕士学位论文 配体合成路线如下 i - c 4 h g o c 0 0b h n 3 2 配合物的性质考察 我们考察了在n a 2 h p o d n a h 2 p 0 4 p h7 0 体系下4 8 小时三个金属配合物对 p u c l 9d n a 的切割效果，发现c u 的配合物效果好于z n 和c o 配合物。如图： 盎甲 p 眦 。 h啦。伽 0 r 0 r o ( ： 毋一 四川大学硕士学位论文 a1 234 f o r m i f i g 1 e f f e c to fd i f f e r e n tc o m p l e x e s7 a cf 0 1 4 3m m ) o nt h ec l e a v a g er e a c t i o n so fp u c1 9 d n a ( 77g m e ) i nan a h 2 p o a n a 2 h p 0 4b u f f e r0 0 0m m ，p h7 o ) a t3 7o cf o r4 8h ( a ) a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i sd i a g r a m ：l a n e1 d n ac o n t r o l ；l a n e2 ，7 a ；l a n e3 ，7 b ；l a n e4 ，7 c ( b ) q u a n t i t a t i o no f p l a s m i d r e l a x a t i o nr e l a t i v et 0p l a s m i dd n a p e rl a n e 选定c u 配合物作为研究对象，考察它在不同时间( f i g 2 ) ，不同浓度( f i g 3 ) 下其切割效果的变化趋势。 a123 4 5 678 f o r m i i f o r m i b 口 d d sl口lt 吣 帕 加 co马器面正p!e点正辞 四川大学硕士学位论文 f i g 2 e f f e c to ft i m eo nt h ec l e a v a g er e a c t i o no fp u c1 9d n a ( 7 删w i t hc o m p l e x7 b ( o 1 4 3m m ) i nn a h z p o d n a 2 h p 0 4b u f f e r ( 1 0 0m m ，p h7 0 ) a t3 7o c ( a ) a g a r o s eg e l e l e c t r o p h o r e s i sd i a g r a m ：l a n e1 d n ac o n t r o l ，4 8h ；l a n e2 ，d n ac o n t r o l ，0h ；l a n e3 ，7 b ，2h ； l a n e4 7 b ，4h ：l a n e5 ，7 b ，8h ；l a n e6 ，7 b ，1 2h ；l a n e7 ，7 b ，2 4h ：l a n e8 ，7 b ，4 8h 0 3 ) q u a n t i t a t i o no f p l a s m i dr e l a x a t i o nr e l a t i v et op l a s m i dd n ap e rl a n e a12345678 f o r m i i f o i t u i b f i g 3 e f f e c to fc o n c e n t r a t i o no fc o m p l e x7 bo nt h ec l e a v a g er e a c t i o n so fp u c1 9d n a ( 7 i _ t r d m l ) i nan a h 2 p o d n a z h p 0 4b u f f e r ( 1 0 0m m ，p h7 0 ) a t3 7o cf o r2 4h ( a ) a g a r o s eg e l e l e c t r o p h o r e s i sd i a g r a m ：l a n e1 。d n ac o n t r o l2 4 h ；l a n e2 ，d n ac o n t r o lo h ；l a n e3 ，7 b ，1 4 3 州： l a n e4 ，7 b ，2 8 6 州；l a n e5 ，7 b ，0 0 7 2m m ；l a n e6 ，7 b ，0 1 4 3m m ；l a n e7 ，7 b ，0 2 8 6m m ；l a n e8 ， 7 b ，0 5 7 2m v l0 3 ) q u a n t i t a t i o no f p l a s m i dr e l a x a t i o nr e l a t i v et op l a s m i dd n ap e rl a n e 为了考察7 b 对d n a 的切割机理，我们在反应体系中加入自由基的抑制剂， 羟基自由基抑制剂d m s o ，甲醇，三甘醇，氧自由基的抑制剂n a n 3 ，实验结 果表明7 b 对d n a 的切割不是按照氧化途径而可能是水解途径。 stroe2e： 四川大学硕士学位论文 f i g 4e f f e c to f r a d i c a ls c a v e n g e r so nt h ec l e a v a g er e a c t i o no f p u c1 9d n a r 7i t g m l ) w i t l l c o m p l e x7 b ( 0 1 4 3m m ) i nn a h 2 p 0 小a 2 h p 0 4 b u f f e r ( 1 0 0m v l ，p h7 0 ) a t3 7 0 cf o r2 4h a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i sd i a g r a m ：l a n e1 ，d n ac o n t r o l ，2 4h ；l a n e2 ，d n ac o n t r o l ，0h ；l a n e 3 ，7 b ；l a n e4 ，7 b + d m s o ( 1 4 3m m ) ；l a n e5 ，7 b + m e t h o l ( 1 4 3r a m ) ；l a n e6 ，7 b + g l y c e r o l ( 1 4 3 r i l m ) ；l a n e7 ，7 b + n a n 3 ( 1 4 3m m ) 3 3 实验部分 3 3 1 仪器和试剂 1 ) 仪器 熔点：x r c l 显微熔点测定仪，温度计未经校正 质谱：f i n n i g a nl c q d e c “a g l i e n te s i - m s 质谱仪，f i n n i g a nm a t4 5 1 0 质谱 仪 核磁：v a r i a ni n o a - 4 0 0 ( o 5 t m s 为内标) 核磁共振仪 比旋光：p e r k i n - e l m e r - 3 4 1