（生物医学工程专业论文）一体化管盖基因芯片检测系统光学与控制研制.pdf

摘要 摘要 基因芯片技术是一种基于核酸分子杂交技术的高通量现代生物检测技术，在生物和 医学等领域具有广泛的应用。基因芯片的操作技术流程非常复杂，容易因为操作的原因 而带来检测结果的不稳定。 管盖基因芯片技术将基因探针固定在特制的管盖内表面，与内置杂交贮液池的 e p p c n d o r f 管一起构建的基因检测器件，可以避免扩增产物的外泄而引起的后续样品检 测的假阳性信号，具有操作简单、容易控制实验室污染、结果重现性好等特点。由于目 前的商业扫描仪并不适用于管盖基因芯片，管盖基因芯片相对于标准的玻璃基片是一个 异型器件，尚没有合适的基因芯片扫描仪对其图像进行采集，因此我们研制和开发了用 于管盖基因芯片的信号检测的光学系统和扫描系统。 光学系统的设计借助了实验室的荧光显微镜和n i k o nd 9 0 相机，并采用了激光作为 光学系统光源的方案，由于激光的光束细，能量呈现高斯分布，相应的设计了用于激光 扩束和匀束的光学器件。管盖基因芯片的扫描系统包括电子控制单元部分和三维运动系 统( 机械手) ，用于完成9 6 孔板上每个管盖的扫描和对焦。电子控制单元部分选用2 0 0 0 系列d s p ( t m s 3 2 0 f 2 8 1 2 ) 作为控制的主芯片，t m s 3 2 0 f 2 8 1 2 集成了多种先进的外设，为 电机及运动控制领域应用的实现提供了良好的平台。其与p c 机的通讯采用通用串行总线 u s b 通信方式，本系统选择符合u s b 2 0 协议的芯片c y 7 c 6 8 0 1 3 ( 5 6 弓1 脚) ，实现小规模 主从式系统中主机与d s p 间的高速通信，d s p 应用程序和u s b 固件程序已经调试通过， 机械手能够精确的完成9 6 孔板上每个管盖的定位。其电子控制系统同样适用于其它的三 维运动控制场合中。机械手主要由滚珠丝杠，直线导轨，滑块构成，具有定位精度高， 摩擦阻力小，易于维护和保养等特点。 通过光学系统的测试实验和三维扫描平台的测试实验，管盖基因芯片的光学系统和 扫描系统符合芯片检测的要求，和常规的基因芯片扫描仪相比，该检测仪具有通用性强， 成本低、体积小、低功耗、操作简单等优点。 关键词：基因芯片荧光检测技术，电子控制，运动扫描平台 a b s t r a c t t h em i c r o a r r a yt e c h n i q u e , ah i g h t h r o u g h p u td e t e c t i o nm e t h o d ，h a sb e e nw i d e l y a p p l i e d t h ec o r et e c h n i q u ei n v o l v e di ng e n ea r r a y si st h er e v e r s eo ft h es o u t h e r nb l o t t e c h n i q u e t h em i c r o a r r a yp r o g r e s si sq u i t ee a s yt oc a u s eu n s t a b l er e s u l tb e c a u s eo fi t s c o m p l e xp r o c e s sa n dm u l t i s t a g e t h em i c r o a r r a y - i n - a - t u b es y s t e mi sas e a l e ds y s t e mf o rt h em i c r o a r r a yt e c h n i q u e i nt h e s y s t e m ，a no l i g o n u c l e o t i d em i c r o a r r a yi sa r r a n g e do nt h ei n n e rs u r f a c eo fas p e c i a ld e s i g n e d o fe p p e n d o r fc a p 、析t haf l a to p t i c a l l yt r a n s p a r e n tw i n d o w a ni n n e rv e s s e lf o rt h es t o r a g eo f t h eh y b r i d i z a t i o ns o l u t i o ni sp l a c e di nt h es e a lt u b e t h em i c r o a r r a ys y s t e ms i m p l i f yt h e c o m p l e x i t ya n dp e r f o r mn o n ec o n t a m i n a t i o nm i c r o a r r a y d e t e c t i o nb e c a u s eo ft h ee n c a p s u l a t e d s y s t e m h o w e v e r , c o m m e r c i a ld e t e c t i o ns y s t e mi s n ts u i t a b l ef o rt h em i c r o a r r a yd e t e c t i o n s y s t e m ，b e c a u s s et h em i c r o a r r a y - i n - a - t u b ei sas t r a n g ed e v i c ec o m p a r e dw i t ht h es t a n d a r dg l a s s m i c r o a r r a ys l i d e a sar e s u l t , ad e t e c t i o ns y s t e mw i t ha no p t i c a ls y s t e m , a l la u t o m a t i c s c a n n i n gs y s t e mh a sb e e nd e v e l o p e df o rt h em i c r o a r r a y - i n a - t u b ed e t e c t i o ni nt h el a b o r a t o r y t h eo p t i c a ls y s t e mw a sd e v e l o p e db ym e a n so ff l u o r e s c e n c em i c r o s c o p ea n dn i k o nd 9 0 c a m e r a l a s e rw a ss e l e c t e da si l l u m i n a t i o ns o u r c ea n dal a s e rb e a me x p a n s i o n & e n e r g y h o m o g e n i z a t i o ns y s t e mw a sd e s i g n e d a u t o m a t i cs c a n n i n gs y s t e mc o n s i s t so f ac o n t r o lc i r c u i t a n da3 - dm o b i l ep l a t f o r mt op e r f o r ms c a nd e t e c t i o no fm u l t i m i c r o a r r a y - i n a t u b e s t m s 3 2 0 f 2 812 d i g i t a ls i g n a lp r o c e s s o rw h i c hi sh i g h l yi n t e g r a t e d ，h i g h p e r f o r m a n c e s o l u t i o n sf o rd e m a n d i n gc o n t r o la p p l i c a t i o n sw a ss e l e c t e da sh o s tc o n t r o l l e ri nt h ec i r c u i t , t h e c y p r e s ss e m i c o n d u c t o rc y 7 c 6 8 0 13 a - 12 8i su s e d8 su s bi n t e r f a c ec h i pt od e a l sw i m c o m m u n i c a t i o nb e t w e e np ca n df 2 812i n t h e s y s t e m t h e 3 - dm o b i l e p l a t f o r m s t r a n s m i s s i o nm e c h a n i s mc o n s i s t so f b a l ls e r e w s ，l i n e a rg u i d et r a c k sa n ds l i d e s t e s tr e s u l t si n d i c a t et h a tt h eo p t i c a ls y s t e ma n da u t o m a t i cs c a n n i n gs y s t e ma r ec a p a b l eo f s a t i s f yd e t e c t i o nr e q u i r e m e n t s c o m p a r et oo t h e rc h i ps c a n n e r , a d v a n t a g e so fo u rd e t e c t i o n s y s t e ma r em u c he v i d e n t , f o ri ti sl o w - c o s t ，s m a l l s i z e ，l o wp o w e r ，p o r t a b l ea n de a s yt o o p e r a t e k e yw o r d s ：m i c r o a r r a y ；f l u o r e s c e n c ei m a g i n gd e t e c t i o n ；e l e c t r o n i cc o n t r o l ；m o b i l e p l a t f o r m i i 目录 目录 摘要i a b s t r a c t i i 目录i i i 第一章绪论1 1 1 基因芯片的发展概况l 1 1 1 基因芯片的简介1 1 1 2 基因芯片的制备方法l 1 1 3 基因芯片的应用2 1 1 4 基因芯片检测仪3 1 1 5 基因芯片技术存在的问题与展望3 1 2 管盖基因芯片及检测系统设计4 1 2 1 管盖基因芯片的原理和结构4 1 2 2 管盖基因芯片自动检测系统4 1 3 本课题研究的意义和内容5 第二章管盖基因芯片荧光成像系统设计7 2 1 荧光检测技术的特点7 2 2 激光诱导的荧光成像检测系统讨论8 2 2 1 半导体激光器及其在生物医学检测中的应用8 2 2 2 激光扩束、匀束问题的研究进展。9 2 2 3 激光器作为光源时的设计方案一1 0 2 3 激光扩束、匀束系统的设计。1 l 2 3 1 单透镜扩束。l l 2 3 2 双透镜扩束l5 2 3 - 3 多透镜扩束方案研究。1 9 2 4 激光扩束、匀束实验2 2 2 5 扩束实验结果分析2 2 2 6 本章小结。2 3 第三章电气执行机构设计2 4 3 1 三维运动扫描平台。2 4 3 1 1 滚珠丝杠副2 5 3 1 2 直线导轨副2 6 3 2 交流伺服电机与伺服运动控制系统2 7 3 2 1 交流伺服电机的结构和工作原理2 7 3 2 2 交流伺服电机与步迸电机的性能比较。2 8 3 2 3 伺服运动控制系统( 伺服驱动器) 3 0 3 3 霍尔式接近开关。3 4 3 4 本章小结3 6 第四章基于d s p 2 8 1 2 的电子控制单元设计3 7 4 1 电子控制单元的硬件设计3 7 4 1 11 m s 3 2 0 f 2 81 2 的最小系统电路3 7 4 1 2u s b 通讯接口电路4 0 4 1 3 键盘接口电路4 1 4 1 4 霍尔原点限位开关信号接口电路4 2 i 6 1 工作总结5 7 6 2 展望。5 7 参考文献6 0 攻读硕士学位期间发表的论文6 3 i v 第一章绪论 1 1 基因芯片的发展概况 第一章绪论 1 1 1 基因芯片的简介 生物检测是2 1 世纪最热门的高端技术之一，发展十分迅速，目前已经朝着实时、高通量 和单核苷酸测序方向发展【l ，2 1 。作为一种实时的高通量的测序技术和定性、定量检测分析手段 的生物芯片【3 】，是8 0 年代发展起来的- - n 新兴技术，它是指利用微细加工技术并结合有关的 化学合成技术，将大量探针分子固定于载体即微小的基片【4 ，5 】( 如玻璃、硅片、有机材料薄膜 等) 上，然后与标记的样品分子进行杂交，通过检测杂交信号的强弱，对靶分子的序列和数 量进行分析检验的微型器件【6 】。它可以将成千上万乃至几十万个与生命相关的信息集成在一 块厘米见方的芯片上，对基因【7 ，引、蛋白质【9 】、抗原活体细胞和组织等进行检测分析。目 前生物芯片技术正向着更加连续化、微型化和集成化方向发展，应运而生的微全分析系统即 芯片实验室【1 2 ，1 3 】代表着生物芯片技术发展的更高阶段。 近年来，以基因芯片为代表的生物芯片( b i o c h i p ) 技术得到了迅猛发展，目前已有多种芯 片出现，从生物芯片的结构来说有【l 7 】：微阵列芯片、过滤分离芯片、介电电泳分离芯片、 生化反应芯片和毛细管电泳芯片、及其它生物组分的微阵列。从生物芯片固定的生物材料种 类来分有：基因芯片【1 8 j ( g e n e c h i p ，d n ac h i p ，d n am i c r o a r r a y ) ，蛋白质芯片【19 2 0 ( p r o t e i n m i c r o a r r a y ) 、细胞芯片【2 1 , 2 2 】( c e l lm i c r o a r r a y ) 、组织芯片【2 3 ( t i s s u em i c r o a r r a y ) 等。狭义的生物 芯片即微阵列芯片，主要包括c d n a 微阵列、寡核苷酸微阵列、蛋白质微阵列和小分子化合 物微阵列；广义的生物芯片是指能对生物成分或生物分子进行快速并行处理和分析的厘米见 方的固体薄型器件，其主要种类有微阵列芯片、过滤分离芯片、介电电泳分离芯片、生化反 应芯片和毛细管电泳芯片等。 基因芯片( g e n ec h i p ) 是上世纪9 0 年代产生并发展的一项生物技术，属于生物芯片的一种， 又称d n a 芯片( d n ac h i p ) 或d n a 微阵列( d t q am i c r o a r r a y ) ，基因芯片也可以叫做r e v e r s e n o r t h e r n - d o tb l o t s 2 4 1 ，基因芯片的工作原理是应用已知核酸序列作为探针与互补的靶核苷酸序 列杂交，通过扫描系统检测探针分子杂交信号强度，并配以计算机对信号进行综合分析后， 即可获得样品中大量基因序列及表达信息，以对之作出定性及定量的研究【2 5 1 。它采用了微加 工和微电子技术，在一平方英寸的固相表面组装固定若干、几十、成千甚至上万个不同的分 子识别探针，以形成生物分子高密、二维阵列的微型生物化学分析系统，实现了对基因分子 信息在同一时间内进行大规模的分析和检测【2 6 】。 1 1 2 基因芯片的制备方法 基因芯片的原理并不复杂，按基因制备时d n a 微阵列探针合成顺序的方法可分为，原 位合成与合成后点样的基因芯片，原位合成法目前应用主要是指利用光导合成的等方法在载 体表面逐个合成寡核苷酸；形成寡核苷酸探针阵列，适合制作大规模d n a 探针芯片，实现 高密度芯片的标准化和规模化生产，使得基因芯片的表达差异研究得到了广泛应用。合成后 东南大学硕上学位论文 点样法【2 7 , 2 8 可以将十几至几十个碱基的寡核苷酸或几百个碱基的e d n a 片段固定到载体上制 成寡核苷酸芯片或c d n a 微阵列。载体多选择玻片或尼龙膜，尼龙膜表面多孔、具有渗透性、 所需试剂体积大，背景荧光高，可重复使用，目前应用较为广泛的是玻璃基片，其表面无渗 透作用，加样量低，在芯片制备过程中易除去非特异性杂交产物，可以平行分析样品。如何 将寡核苷酸或e d n a 稳定地固定在玻片表面是合成后点样法制备基因芯片过程中的一个关键 问题，国内外关于芯片制备的方法很多，大体分为以下几种情况：玻璃基片表面的修饰和寡 核苷酸、e d n a 的末端修饰。点样法的优点在于成本较低，制作方便，只用一个点样器和一 个检测仪来制造芯片，使得可在任何实验室中制备。其它主要的基因芯片制备方法还有化学 喷射法【2 9 】和压电喷射原位合成澍3 0 】。基因芯片主要技术流程如图1 1 所示： 图1 1 基因芯片主要技术流程包括：芯片的设计与制备、样品的处理、芯片杂交与杂交信号的检测l j i j 1 1 3 基因芯片的应用 基因芯片技术已越来越广泛地被用于分子生物学及医学研究中，主要可以归纳为以下几 个方面： ( 1 ) 基因的表达分析 基因芯片已被用来测定植物、酵母菌和人类样品中的基因表达水平，是人类基因组工程 的重要组成部分，它提供了从整体上分析细胞表达状况的信息，而且为了解与某些特殊生命 现象相关的基因表达提供了有力的工具，定量监测大量基因表达水平在阐述基因功能、探索 疾病原因及机理、发现可能的诊断及治疗的靶基因等方面具有重要价值【3 2 1 。 ( 2 ) 基因组多态性分析 以往多态性检测手段，i p c r - - s s c p 、异源双链分析等都不适应大规模、低消耗和自动 化的要求，实践证明，基因芯片恰好能满足这一要求。而且随着芯片技术的不断发展，其检 测速度、特异性和敏感性也不断提高。基因芯片技术可大规模地检测和分析d n a 的变异及 多态性。基因芯片的另一重要应用是基因多态位点及基因突变的检测，基因组多样性的研究 对阐明不同人群和个体在疾病的易感性和抵抗性方面表现出的差异具有重要意义【3 3 蚓。 ( 3 ) 在疾病诊断中的应用 目前，基因诊断是基因芯片中最具有商业价值的领域。由于许多疾病( 如癌症、遗传病、 传染病等) 都与基因相关，利用基因芯片技术，可以找到与该疾病相关的基因，实现对该疾病 快速、简便、高效的诊断。其中主要有遗传性、传染性疾病检测型基因芯片，基因芯片的优 2 第一章绪论 势在于一次能做许多种传染病或遗传病的检测，将已知的多种传染病或遗传病的基因作为靶 基因点于芯片上，就可以对一个标本同时进行多种病的检测，并且具有灵敏度高、特异性好、 结果快速可靠的优点。而在病原体检测基因芯片中，基因芯片利用核酸杂交的特异度高的特 点，通过平行分析p c r 扩增产物来快速、准确地鉴别多种病原体，可用于高通量、大规模的 病毒分型【3 5 】。 另外基因芯片在药物研究中【3 6 】和环境保护监测方n t ”】也有很广泛应用。 1 1 4 基因芯片检测仪 基因芯片检测仪的方法是样品热变性或碱变性后直接加到芯片上进行杂交反应，清洗后 加入双链d n a 特异结合荧光染料，再清洗后通过基因芯片检测仪检测。根据检测手段可分 为两种：( 1 ) 利用电子摄像器件和计算机等构成的生物基因芯片检测仪器。( 2 ) 利用激光共聚焦 扫描原理研制的基因芯片检测仪。当前，国外的生物芯片及其检测仪器获得了长足的发展， 各生物芯片公司或相关仪器公司均推出了各自的生物芯片扫描仪如a f f y m e t r i x 公司 g e n e c h i p 扫描仪( t 3 c s ) ，这种扫描仪具有扫描更小的芯片功能，范围从2 5 0 r a n 0 5 1 1 t i n ，支持 最新的高密度g e n e c h i p 芯片，从t i l i n g 、全外显子到单核酸多态性基因分型研究；t e c a n 公 司扫描仪，支持多平台的芯片扫描，双色荧光同时进行扫描，可调扫描光路的入射角以满足 不同用户的需要。有l s 2 0 0 、l s 3 0 0 、l s 4 0 0 等型号。最大扫描面积为9 6 孔板。分辨率有4 1 t m ， 1 0 l x m ，2 0 1 m a ，3 0 1 x _ r n ，5 1 0 1 x m 的分辨率，快速扫描时间约5 分钟；美国p a c k a r d 公司于2 0 0 0 年 开发的基因芯片扫描s c a n a r r a y 4 0 0 0 ，采用激光共聚焦光路；用户可选配2 5 个激光器，多块 发射滤光片，用户可通过软件在扫描过程中实时控制激光器的输出功率和p m t 增益，可以 分辨多种荧光样品，用户可定义的最大扫描面积为2 2 m m x 7 3 m m ，灵敏度为0 1 荧光分子每平 方微米，用户可根据需要可选择5 1 t r n ，1 0 i n n ，2 0 1 t m ，3 0 1 t m ，5 0 1 t m 的，快速扫描时间约5 分 钟。近年来，国内的基因芯片扫描仪也取得了很快的发展。如北京博奥公司开发了 l u x s c a n - 1 0 0 k a 基因芯片扫描仪，中科院成都光电所研制的是s e a n e r - 3 系列扫描仪。 1 1 5 基因芯片技术存在的问题与展望 目前，基因芯片技术在医学、分子生物学领域应用越来越广泛，受到人们的普遍重视， 但要成为实验室研究或临床可以普遍采用的技术仍有一些关键问题亟待解决，如研究成本相 对较高，无法普及、待测定的靶探针标记方法对比较繁琐等基础问题，及在临床检测中操作 的严格性与过程的复杂性，如样品的纯化准备、酶促反应、扩增产物杂交、芯片清洗和荧光 信号检测判定均需要复杂的知识及严格的操作步骤。同时这些操作步骤都是分离的步骤，费 时费力，并且在样品扩增产物的杂交、清洗和荧光信号采集过程中容易造成样品间的污染。 微流体的检测技术与基因芯片的检测技术的有机结合为减少这种费时费力的基因芯片检测提 供了一种可能。这些方法将基因的扩增与基因芯片的杂交分别在器件上不同的区域中实现。 但由于其仪器的复杂性，尚无商业化的仪器走向市场。因此发展一种通用的综合基因扩增与 基因芯片一体化的器件，能够进行多种病原体的检测，于是我们设计了一体化管盖基因芯片 检测系统来用于多基因的检测。 3 东南大学硕士学位论文 1 2 管盖基因芯片及检测系统 1 2 1 管盖基因芯片的原理和结构 管盖基因芯片是一种集基因扩增、扩增产物荧光标记、基因芯片杂交、清洗与荧光检测 于一体的管盖基因芯片，其主要特点是将基因检测探针固定在特制的e p p e n d o r f 管盖的内表 面，同时在管体的中部内置一个杂交缓冲液贮液池。管盖基因芯片对多基因检测时所需要的 基因扩增荧光标记芯片杂交及信号检测均可在同一封闭的e p p e n d o r f 管中完成，可以避免扩 增产物的外泄而引起的后续样品检测的假阳性信号，具有操作简单，容易控制实验室污染结 果重现性好等特点，因此具有广泛的应用前景【3 引。 管盖基因芯片是将标准的基因扩增管2 0 0 u le p p e n d o r f 管原来的穹窿型的管盖，经特别的 加工后，将管盖形成了一个平面窗口的管盖。新加工的管盖能够与e p p e n d o r f 管形成紧密的密 封，并且在管盖的内表面上经过改性，固定了多种核酸探针，形成了探针微阵列基因芯片，并 且在基因扩增管内置了一个小的杂交缓冲液贮液池，用于贮存杂交液，如图1 2 所示： 【二 劳 c a p m i c m a r r a y 图1 2 管盖基因芯片结构图 1 2 2 管盖基因芯片自动检测系统 基因芯片检测过程是通过对荧光标记过的芯片进行x - y 移动实现二维点阵扫描，检测器是 p m t ( 光电倍增管) 或c c d ( 电荷耦合器件) ，通过上一节介绍，我们知道在荧光信号检测方 面，主要研究仍然集中在提高检测分辨率和拓宽荧光光谱的检测范围。芯片扫描仪的研究推 动了包括基因芯片在内的微阵列芯片的广泛应用。目前商业扫描仪的设计主要有两大类，一 类是用于以标准玻片为载体的基因芯片扫描仪，另一类为其自己产品研制的专用基因芯片扫 描系统。但这两种都不适用于管盖基因芯片，管盖基因芯片相对于标准玻片是一个异型器件， 目前尚没有合适的基因芯片扫描仪对其图像进行采集：因此我们研制和开发了用于管盖基因 芯片的扫描系统和信号检测的光学系统。 目前管盖内探针的固定和杂交缓冲液的设计已经是相当成熟的技术，芯片的制作已经取 得了专利，而检测系统还有待开发。管盖基因芯片检测系统分为硬件系统和软件系统。其硬 件系统由荧光成像系统、三维运动控制系统和信号传输系统等3 个部分组成，如图1 3 所示。 软件系统分为图像采集、图像矫正、图像预处理、半自动匹配、有效性验证、杂交强度计算 及结果判定等7 个子系统，l i u 等人【弼】对软件图像处理的工作已取得很大进展。硬件部分需 要借助荧光显微镜来实现，其工作原理是：汞灯光源经过聚光，滤除红光及红外线后，经入 射滤光片选择特定波长的光，$ - - 色镜反射至物镜组，通过物镜后的光被聚焦到e p p e n d o r f 八 p 苜 第一章绪论 管的管盖上并透射到内表面，杂交点的荧光基团被入射光激发并发射荧光，通过物镜收集部 分荧光信号，经由二色镜和发射滤色片滤除部分背景光之后，聚焦到目镜或者c c d 上，c c d 将捕获的荧光信号经过模数转化，通过u s b 数据线传输到计算机，图像信号被计算机所读取 后存贮于计算机硬盘中，然后由图像分析软件对图像进行图像矫正、图像预处理、半自动匹 配、有效性验证、杂交强度计算及结果判定等步骤的处理，并可输出相应的检测结果。 图1 3 管盖基因芯片自动检测系统的结构示意图 1 3 本课题研究的意义和内容 前文中主要对基因芯片的研究方法和检测方法做了主要介绍，它们在目前的基因芯片研 究中发挥了巨大的作用，但由于传统的这种方法与管盖基因芯片相比存在着实验消耗大，周 期长，易造成交叉污染，过度依赖于高级商业扫描检测仪器等缺点，限制了基因芯片在临床 检测中的应用。在此基础上，提出了实验室发明并申请有专利的管盖基因芯片技术，管盖基 因芯片具有操作简单，操作中不易造成交叉污染，避免扩增产物外泄等特点，具有很好的临 床应用前景。但由于管盖基因芯片相对于标准玻片是一个异型器件，目前尚没有合适的基因 芯片扫描仪对其图像进行采集，因此我们非常有必要研制和开发用于管盖基因芯片的扫描系 统和信号检测的光学系统，其中扫描系统选用了d s p 芯片作为控制和驱动伺服电机的核心单 元，所以具有运行性能稳定，控制精度高，检测速度快的优点。光学系统简化了荧光显微镜 的光路设计，其检测灵敏度虽然有所下降，但在保证采集所得的荧光图像质量符合系统检测 要求的基础上，该光学系统的设计成本和功耗均大大降低了。 本论文的主要研究内容有： ( 1 ) 管盖基因芯片荧光成像系统的光路搭建及两种实现方案的讨论。 5 东南大学硕士学位论文 ( 2 ) 管盖基因芯片检测仪电子控制系统硬件设计和软件设计。 ( 3 ) 对我们搭建的荧光成像系统采集的图像和三维自动控制运动系统的测试结果分别进 行讨论。 ( 4 ) 建立一个标准的三维平台控制系统研制开发平台。 ( 5 ) 对本文的工作任务进行总结，及对今后的课题研究提出建议和设想。 6 第二章管盖基因芯片荧光成像系统设计 第二章管盖基因芯片荧光成像系统设计 目前，管盖基因芯片的荧光成像系统仍然需要借助荧光显微镜来实现。用于荧光成 像n i k o n 显微镜的具有稳定、可靠和易于操作和调节等特点，但是成本相对较高，体 积庞大，许多部件都需要适时更换，种种不利的因素限制的了管盖基因芯片的应用和推 广。因此，开发一个专门用于管盖基因芯片检测而体积小、成本低、操作简单、方便快 捷的光学荧光成像系统迫在眉睫。本项目正是应于这样的需求而提出的，我们设计了一 个体积小、成本低、重量轻、能够用于管盖基因芯片自动检测系统的光学平台。该平台 借鉴了荧光显微镜和激光共聚焦的原理【3 引，简化一些复杂的设计，省去如目镜等一些部 件，从光源、滤色片、物镜、场镜、c c d 等各个部件出发考虑成本，进行方案优化， 整个系统基本达到了设计要求。 2 1 荧光检测技术的特点 我们此次研制的管盖基因芯片检测仪采用荧光成像检测。相对而言，荧光作为分析 手段主要有灵敏度高、选择性好、能获得更多的定性信息等优点，但得到的信息是相对 的，受外界影响较大，温度、p h 值、溶剂和其他因素都可能显著影响分析结果【删。基 因芯片荧光成像检测要求能获得高质量的荧光图像，但是荧光信号一般较弱，普通光学 成像仪器难以捕获到荧光光子，这就需要把检测仪器的灵敏度等性能和质量提到了一个 很高的而要求。 表2 1影响荧光图像质量的因素 可能因素对荧光图像质量的影响及图像质量改善方法 荧光团吸收系数和量子产欷尽量越大；图像越清晰 荧光浓度浓度越高，信号越强，图像质量越高 激发光强度光密度越大，信号( 和背景) 图像越亮 受光面积 票嚣薏霎蒿筹嬲戮等紧燃0 越直照度 激发光波长除非要避免光谱交叉，一般选择激发带宽较广的波长，图像会更好 发射滤色片 通透率高的效果好，图像和背景信号随着带宽的增大而同步增大 物镜数值孔径 数值孔径越大，收集荧光效率越高，图像质量越好 放大倍数放大倍数越高，单位像素的荧光越弱，图像越模糊。 羹霖对荧 尽量减少样品中的金属离子 荧光漂白尽量保持低氧环境，使用抗退色剂保护荧光 背景荧光 羹萋羹莴象篓纂蒹糍恭鲅背景荧光减背 光程特性 对于紫外激发的荧光染料，一般使用不透明玻璃；对于深层组织成像，使 。 用长波长的红外或者近红外 荧光寿命 低温避光保存，尽量延长荧光寿命 探测器灵敏度詈篙尝；恭嚣= ：曝光悯短选择帕帅快、好效率高 聚焦程度位于物镜焦平面的荧光分子更能成像 7 东南大学硕上学位论文 影响荧光图像质量的因素很多，包括激发光源、荧光本身的特性、荧光浓度、消光 系数、物镜的数值孔径和各光学元件的通透率、像差消除和校正、滤色片的带宽以透过 率、c c d 的灵敏度、响应时间以及分辨率等各个方面都可能对荧光图像造成影响。根 据相关资料的查阅总结如表2 1 所示。 2 2 激光诱导的荧光成像检测系统讨论 激发荧光辐射的光源通常有紫外光、氖灯、卤钨灯、氨灯等宽光谱光源以及激光光 源。相比之下，激光最适宜于用作毛细管电泳、扫描共聚焦等荧光检测器的光源，因为 它光束非常细，宜于聚焦到一个非常小的对象，这种聚焦甚至已接近光的衍射极限，大 大提高了检测灵敏度【4 l 4 2 1 。另外，由于它的单色性好，易于校准并减小散射。 然而，除了共焦扫描外，激光作为基因芯片荧光成像的激发光源的报道还很少见， 主要原因是： ( 1 ) 光虽然有单色性好、聚焦度高、易于校正等优点，但是由于光束太细，一般小于1 m m ，照射面积非常有限，用作荧光成像时，会使整个光源的能量集中在很小一块 区域而不能观察整个视场内的图像，同时由于局部能量过高也容对样品产生破坏， 即发生“光刻”和光腐蚀现象。 ( 2 ) 正是由于激光带宽较窄，单色性非常好，所以光谱范围较窄，成为某些荧光分子 的理想激发光源。但是现有的激光波长种类太少，而许多荧光分子的激发要求有特 异性波长的光谱，因此并不是每一种荧光分子都能找得到合适的激光作为荧光的诱 导光源，这就限制了激光在荧光检测中大规模使用。 ( 3 ) 使用激光光源时，激光器本身的成本和附加器件( 如驱动电路和扩束镜) 的成本 都比较昂贵。 ( 4 ) 激光的光强通常具有高斯型分布，均匀性不佳，使用激光诱发荧光成像时会由于 光源本身强度的不均匀而产生系统误差。 因此，用激光光源作为荧光成像的首要问题，是进行激光扩束和匀束，获得能量均 匀光束较宽的激发光，才能保障检测结果的准确性。 2 2 1 半导体激光器及其在生物医学检测中的应用 半导体激光器是指以半导体材料为工作物质的一类激光器，亦称为半导体二极管或 激光二极管( 简写为s l d - - - s e m i c o n d u c t o rl a s e r d i o d e ) ，是六十年代初发展起来的一 种新型固体激光光源。它是通过正向偏压下p - n 结中空间电荷区附近形成的载流子( 电 子) 反转分布的“激活区”的自发发射感应受激辐射而发出相干光。发射波长范围在 0 3 3 - 1 0 0i i m 。激励方式有p - n 结注入电流激励、电子束激励、光激励和碰撞电离激励等 4 种。 半导体谐振腔的质量优劣用品质因素q 来描述。对于所给模式的q 值定义为： q = 2 z ：v w 。( 1 ) 式中，1 ，是模的频率；形是集中于某一模的辐射能量；是模的总损耗，包括单位时间 第二章管盖基因芯片荧光成像系统设计 内从谐振腔发射到腔外去的光辐射。品质因素q 与谱的线宽v 有关，即： q = v a v( 2 ) 随着驱动电流密度的增加，激光器有源区的粒子数反转增强，集中在某一模式的光 功率增加。这首先对那些最有利的模式，即具有高q 值的模的激射。这些模的频率接近 于增益谱特性的峰值处，因而对应光谱的峰宽度就减少。谐振腔的品质因素q 值增加， 这一过程一直持续到总的光功率集中到几个最有利的模式。 以激光器为核心的半导体光电子技术在生命科学和生物医学检测领域取得很大的 发展【4 3 4 4 1 ，发挥着重要的作用。由于激光单色性好，聚焦程度大，发光强度高，功率小， 热量小，平行度高，空间稳定性好等性质，利用激光作为光源激发荧光的芯片检测显示 出许多优点，但是激光一般寿命短( 3 0 0 0 h ) ，价格相对昂贵，而且光束很细，照射面 积有限，因此利用激光作为荧光激发光源的检测主要限于共聚焦显微成像和基因芯片扫 描仪上，作为一种大面积的荧光成像激发光源还未见报道，这可能是由于激光的扩束和 匀束问题比较麻烦所限制。 2 2 2 激光扩束、匀束问题的研究进展 一般光源发出的光通常具有高斯型分布的能量，激光是一种比较典型的高斯光束， 利用激光检测荧光时，为了保证照明的均匀性，减少系统误差，通常需要进行光束整形 和能量均一化设计。近年来，在激光扩束和光束整形方面的研究已经有多篇报道。 田兆硕等人【4 5 】在在标量衍射理论的基础上，应用柯林斯公式数值计算了高斯光束 经过通光口径较小的扩束光学系统后的光强分布，结果表明出射激光光束的束散角虽然 可以压缩，但往往不是高斯光束，而是具有亮暗相间的多个环状光束。z h a a 等人m 】利用 液晶平板作为空间放大调制器，将高斯型光束进行整形，得到超高斯型的方波，相位调 制可以忽略；但是缩小了有效光束的直径。fzf a n g 等人【4 。7 】则利用两个阶梯型步进棱进 实现了激光光束整形，但这种每级高度在0 5 p m 以下的阶梯棱镜的制作工艺和控制流程 非常困难，很高精度的机械加工装置，不适合大规模推广。 随着加工技术的不断进步，非球面光束整形器的研究也逐渐兴起，孔梅梅等人【4 8 】 的用z e m a x 模拟人眼结构研究发现，非球面透镜和梯度分布的折射率能够明显改善图 像质量。z h a n g 等人【4 9 】设计了一种双凸的非球面透镜，能够把高斯光束整形为均匀的平 行光，但这种结构复杂，非球面的表面在研磨过程中很难制作相应的玻璃磨具，即使有 磨具，操作过程中也很难实现，不好把握曲面的程度。另一方面，采用单透镜进行激光 扩束匀束时要求折射率很高的玻璃，透镜厚度需要达到一定的数值才能实现，然而厚的 透镜不仅研磨困难，而且使光能量损失很大。cz h a n g 等人t s o j n 采用多级扩束的思想， 使用了三个透镜，前两个透镜将高斯型光束扩柬成超高斯型的光束，第三个透镜则将高 斯型光束聚焦成双叉型光束。 在综合参考现有研究成果的基础上，根据现有的加工技术和已经采购到的透镜参 数，我们重新设计用于管盖基因芯片检测仪的激光扩束匀柬系统。分别对单个透镜、双 透镜和多透镜的情况进行了z e m a x 模拟，最终在现有透镜的基础上，筛选了一套基于 伽利略原理的合理系统，不但进行了光束直径的扩大，而且使激光能量得到很大的均衡， 9 图2 2 以激光器作为光源时的设计原理图 根据c y 3 荧光染料的光谱特征，如图2 1 所示，c y 3 激发光带宽主要集中5 3 0 h m 左 右，本仪器所配置的激光器为波长在5 3 2 n m a ：2 n m 的利普激光器，功率为5m w 。发射 滤色片是带宽在2 0 - 3 0i 姐左右的带通滤光片，选择发射滤光片要根据荧光所发射的中 心波长和荧光光谱之间的可分离度决定，一般是选择从发射光主波长的向后2 0 h m 这个 波段为通带，其他波长为阻带，对于c y 3 ，可以配置5 7 0 6 0 0 n m 的带通滤色片。 激光器作为光源的设计方案如图2 2 所示：由单色激光器器发出的极细平行光束， 经过一组透镜的扩束和能量均一化后，得到光强均匀分布的平行光，平行光通过斜射方 1 0 第二章管盖基因芯片荧光成像系统设计 式入射到e p p e n d o r f 管的管盖上，折射到内表面，激发微阵列探针上与杂交片段相连接 的荧光分子发射荧光信号，荧光信号透过管盖，部分被物镜收集，成为平行光，通过发 射滤色片的选频，可以降低背景信号，再经过场镜聚焦到c c d 面积上，在c c d 上成像。 图像采集后传输到计算机，然后用专门的软件进行分析和处理。 2 3 激光扩束、匀束系统的设计 我们实验中所使用的激光器，型号为p f 0 0 1 ，各项参数如下： 品名：大功率绿光工业打点激光器 标准尺寸：9 1 2 0 x 6 6 0 m m 最小尺寸：9 1 2 0 x 6 6 0 m m 输出波长：5 3 2n n l 输出功率：5 m w 工作电压：2 7 v - - 3 2 v 工作电流：i 2 8 0 m a 工作温度：1 5 3 5 贮存温度：2 0 + 6 0 光斑直径：最小光斑直径鲫1 0 m m 光束发散角：2 4 m r a d 单价：1 6 0 0 0 元 激光扩束镜可以是一个透镜、两个透镜和多个透镜，本项目对各种情况分别做了讨 论。 2 3 1 单透镜扩束 可用于扩束的单个透镜的有球面系统和非球面系统两种表面，非球面系统需要采用 复杂的多项式进行曲面拟合，在设计时存在很大难度：( 1 ) 并非每个非球面都有对应 的多项式，因此确定合适的参数很复杂，( 2 ) 非球面玻璃的研磨和加工非常困难，没 有相应的磨具，各个点的曲率半径也很难精确控制，即使设计出来也不能加工出来，对 于本项目没有实际意义；三是非球面透镜对扩束光束形状有特殊要求，通常每一种非球 面只能对与其相对应的光束进行扩束和匀束，而对于其他形貌的光束则效果不佳，因此 不具有通用性，很难推广使用，因此本实验