（遗传学专业论文）mhc+Ⅰ肽复合体及其多聚体简便高效制备方法的研究.pdf

删g f a n - y a n s u p e r v i s e db y p r o z h a n g j i a n - q i o n g m e d i c a ls c h o o l s o u t h e a s tu n i v e r s 时 j u n e2 0 0 9 。尽我所 究成果， 同志对本 印件和电 的内容相 一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包括以电子信息形式刊登) 论文的全部内容或中、英文摘要等部分内容。论文的公布( 包括以电子信息形式刊登) 授权东南大 学研究生院办理。 一签名拙名赳期：等上幻 2 方法 3 结果 4 讨论 第三节同尾酶技术在p 一胆m 重组质粒构建中的应用 l材ji斗 2 方法 3 结果 4 讨论 本章小结 第二章m h c 重链和轻链蛋白表达形式及制备的研究 日u 舌 第一节m h c 重链和轻链蛋白表达形式的研究 l 材料一 2 方法 3 结果 4 讨论 第二节m h c 重链和轻链包涵体蛋白的提取、纯化和鉴定 l 材料 2 方法 3 结果 4 讨论 第三节蛋白杂交洗脱仪的设计、制备及效果评价 l 原理与制备 2 效果评价方法 3 结果 4 讨论 本章小结 第三章利用p e 科i d e - p 2 m 融合策略构建m h c - c e 氏9 7 0 2 和m h c h b c l 柚7 复合体 刖晶 第一节h l a c e a 删7 0 2 复合体的制备和鉴定 1 材誊斗一一4 l 抖药拍 拍拍打勰汐 如 如如如弘 驺弘弱 强”柏 叭 2 方法 3 结果 4 讨论 第二节m h c h b c i 睨7 复合体的制备和鉴定 l 材拳斗一一一 2 方法 3 结果 4 讨论 本章小结 第四章色谱复性法制备m h c c e 9 47 0 2 和m h c h b c l 鸵7 复合体 刖吾 第一节同时结合式l m a c 复性法制备m h c c e a 6 9 4 - 7 0 2 复合体 l 材料一一 2 方法 3 结果 4 讨论 第二节p u l l d o w n 式i m a c 复性法制备m h c c e a 6 9 4 - 7 0 2 复合体 l 材j | l 斗一一一二 2 方法 3 结果 4 讨论 第三节p u i l d o w n 式i e c 复性法制备m h c c e a 6 9 4 - 7 0 2 和 m h c h b c i 睨7 复合体 l 材j i 一一一 2 方法 3 结果 4 讨论 本章小结 第五章p m h c 多聚体的简便制各方法的研究 月u 舌 第一节b m p - 和体内生物素化的b s p - 吨与链霉亲和素的亲和力 及多聚化能力的比较 l 材卷斗 2 方法 3 结果 4 讨论 第二节抗体型m h c 衄c 1 8 ”多聚体的制备及在抗原特异性c 1 1 l 检测中的应用 1 材米斗 2 方法 3 结果 4 讨论 本章小结 全文总结 致谢 参考文献 作者简介 5 8 5 8 5 9 6 3 6 3 6 5 6 5 6 5 6 6 7 2 7 2 7 3 7 4 7 6 7 6 7 7 7 9 8 0 8 8 驼躬甜 必筋拍船钞 卯 钮豇轮 钌弱钳 中文摘要 m h ci 一肽复合体及其多聚体简便高效制备方法的研究 中文摘要 ， 细胞毒性t 淋巴细胞( c t l ) 在清除和控制病原体的感染和传播，监视和杀伤肿瘤细胞以及介 导免疫排斥反应的发生中起着十分重要的作用。m h ci 肽( p m h ci ) 网聚体技术因其具有很高的 灵敏度和特异性；受检c t l 不需体外增殖、无损伤性；能同时直接对特异性c t l 进行定性、定量 分析和分离纯化等优点而成为抗原特异性t 细胞定量的金标准。传统的p m h ci 四聚体制备包括以 下三个过程：m h ci 重链、6 2 m 蛋白的表达和抗原肽的合成：m h ci 肽复合体的制备与纯化；m h c i 肽复合体的生物素化和多聚体的制备。在这三个过程巾存在三个技术局限，分别是：m h ci 一肽 复合体的制备需要合成抗原肽，步骤繁琐；复性过程所用时间较长，复性产量低；基于生物素 和链酶亲和素系统的m h ci 一肽四聚体法需要生物素化及多聚化过程，试剂昂贵，操作较烦琐，需要 后继的纯化与浓缩等步骤。以上技术局限限制了p m h cl 四聚体技术在免疫学和分子生物学等研究 领域的应用。 以上三个技术局限中，有六个具体的问题有待研究和解决：p m h ci 四聚体的技术改进之一 是u g e r 等研究者建立的肽和d 2 m ( p d 2 m ) 融合表达策略制备p m h ci 复合体的方法，但在p b 2 m 重组质粒的构建中其基凶第位核苷酸受插入位点的限制：重组蛋白能否在大肠杆菌中以可溶性 的形式表达；蛋r 1 鉴定中w b s t e mb l o t 实验的仪器化操作；p m h cl 复合体浓缩和纯化简便方法 的研究；高效简便复性方法的开发；p m h ci 多聚体简便制备方法的研究。 本研究选取一段肿瘤抗原肽c e a 6 9 47 0 2 和一段病毒抗原肽h b c l 8 1 2 7 ，采用肽和p 2 m 融合表达的 策略制备m h c c e 氏7 0 2 和m h c h b c l s ”复合体及其多聚体，并对以上6 个方而的问题进行较全 面的研究。结果如下： 1 所设计的j 司尾酶酶切一连接策略克服了插入基因序列第一个核苷酸的限制，使构建肽和胆m 融合 基因更加灵活方便。在p _ d 2 m 基因中不含所涉及的酶切位点时，结合不对称酶方法，可以将任 意p b 2 m 基因捅入到任意质粒的任意酶切位点中，而没有日的基凶起始核苷酸的限制。通过常 规酶切连接方法成功构建了5 种重组质粒，分别是：p e t 3 2 a - t r x - h i s h c b s p 、 p e t 2 8 a - h c - b m p - h i s 、p e l r 2 8 a - h c h i s 、 p e l 2 8 a - c e 氏睥7 0 2 陀m h i s 和p e 佗8 a c e 氏悼7 0 2 一b 2 m ；通过同尾酶技术构建成1 种重组质粒 p e t 2 8 a - h b c 博2 7 陀m 。这6 种重组质粒含有序列正确的目的基因，可以在b l 2 l ( d e 3 ) 中诱导出 相应的蛋白。 2 在宿主菌b l 2 1 ( d e 3 ) 中三种m h c 重链蛋白( 1 权一m s h c b s p 、h c b s p - h i s 和h c b m p h i s ) 和两种p p 2 m 蛋白( c e 氏蚪7 0 2 p 2 m h i s 和c e 氏蚪7 0 2 一p 2 m ) 在各诱导条件下均主要以包涵体形 式表达，且诱导条件的4 i 同对胞质可溶性形式表达的目的蛋白的绝对量影响不大。以包涵体形 式表达的目的蛋白的量随着诱导时间的增加而增加。采用高压均质法破菌提取包涵体并经初步 纯化后，三种m h c 重链蛋白( h c - b s p h i s 、h c b m p h i s 和h c - h i s ) 的产量在2 5m g ，l 培养 基以上，三种p _ 陷m 融合蛋白( c e 氏7 0 2 一陀m h i s 、c e a 6 9 47 0 2 - p 2 m 和h b c l 8 _ 2 7 一胆m ) 的产量在 5 0m g ，l 培养基以上；六种蛋白的纯度均在8 5 以上：经w ：t e mb l o t 鉴定蛋白表达正确。 3 所设计并申请专利的蛋白杂交洗脱仪具有节省时间和人力、节省抗体、可规模操作、结果重复性 好和杂交效率高等优点，是一种w b s t 哪b l o t 试验很好的丁具。 4 运用c e 凡蚪7 0 2 b 2 m h i s 和h b c l 睨7 - 胆m 蛋白分别制备出结构和构象正确的m h c c e a 6 9 47 0 2 复合 体和m h c h b c 协2 7 复合体，与常规的m h ch c 、陀m 和抗原肽三个单位的复合体制备方法相比， 这种肽和胆m 融合策略更简便易行，节省成本。利用离子交换色谱同时浓缩和纯化了 m h c h b c i 睨7 复合体，方法快速方便，处理效率高。 5 将h c b s p h i s 和c e a 6 9 4 7 0 2 b 2 m h l s 同时结合在i m a c 色谱上进行复性不能得到纯的 m h c - c e 氏7 0 2 复合体。利用p u l l d 0 、帅式复性力| 法，通过i m a c 复性了两种m h c c e 氏9 4 - 7 0 2 复合体：m h c c e a ( b s p ) 和m h c c e a ( b m p ) ，其中m h c c e a ( b s p ) 复合体通过尺寸排阻色谱、 离子交换色谱和反相高效液相色谱二种色谱方法分析结果表明复合体结构正确。进一步，利用 东南大学博t 学位论文 我们已申请专利的p u l l 曲w n 式复性方法，通过i e c 复性了两种p m h ci 复合体：m h c c e 氏7 0 2 复合体和m h c h b c l 8 2 7 复合体：通过尺寸排阻色谱分析，这两种复合体结构证确，纯度分别为 8 8 和8 2 ；通过d o t - e l i s a 和f a c s 进行构象鉴定，结果表明m h c c e 氏9 4 7 0 2 复合体构象止 确。 6 实验发现h c b m p - h i s 可以结合链酶亲和素( s a ) ，并初步表明带b m p 一切g 的蛋白分子可以在 s a 的作用下形成多聚体。h c b s p h i s 蛋白在大肠杆菌中表达时被部分生物素化；在2 y t 培 养慕中培养时h c b s p h i s 包涵体的广：量较高，而在l b 培养基中培养时h c b s p - h i s 的生物素 化效率较高；当培养基中n a c l 浓度为1 0m m l 时，h c b s p h i s 的包涵体产量和生物素化效 率最高；培养摹中生物素的浓度对h c b s p h l s 的包涵体产量和生物素化效率均无明显影响：在 3 7o c 和2 4o c 时，h c b s p h l s 的包涵体的产量均随着诱导时问的增加而增加，其中3 7o c 诱导 2 4h 时包涵体产量最高，而在3 7 ”c 诱导6h 时h c b s p h i s 生物素化效率最高，为2 5 ；多聚 体形成实验初步表明，部分生物素化的b s p - t a g 比b m p t a g 与s a 的多聚化能力要高。通过抗 h i s ，t a g 抗体及p e 标记的抗i g g 抗体可以将稀释复性法制备的m h c h b c l 睨7 复合体制备成 m h c h b c l 8 _ 2 7 多聚体，并能成功地检测到乙型肝炎病毒患者p b m 中的h b c i 髓7 - 特异性c t l 。这 种抗体型p m h c 多聚体的方法简单，制备方便，是一种具有应h j 潜力的多聚化方法。p u i l d o w n 式i e c 复性法通过抗体作用形成m h c h b c l 啪7 多聚体后也可以成功地榆测到乙型肝炎病毒患者 p b m c 中的h b c l 蚰7 一特异性c t l ，其柃测结果与稀释复性法制备的m h c h b c l 睨7 多聚体检测结 果一致，说明p u l l d o w n 式i e c 复性法复性可得到具有功能活性的m h c h b c l 睨7 复合体。 以上结果提示：利用同尾酶技术可以解决p - 胆m 构建中的基冈序列第一个核苷酸的限制，拓 宽了肽和b 2 m 融合表达策略的应用范同；p u l l d o w n 式复性方法可以成功地制备p m h ci 复合体， 方法简便，复性效率高，复性、浓缩和纯化过程集合在一起：抗体型多聚体技术是一种简单有效 的多聚化方法，可以成功制备出具有功能活性的p m h ci 多聚体。这些研究不但简化了肽和b 2 m 融合表达策略下的p m h ci 多聚体的构建并提高其制备效率和降低了制备成本，而且为优化常规 的p m h ci 多聚体制备提供了一定的方法和启示。我们的研究为基于p m h ci 复合体及其多聚体 基础上的人工抗原递早细胞和人工抗原递呈芯片的研究提供便利，也为其在基础和临床研究中得 到全面应用奠定坚实的基础。 关键词：m h c 肽复合体；m h c 肽多聚体；稀释复性；色谱复性；包涵体 c o m p l e x e si i l v o l v e st h el o w y i e l d ，h i 曲一c o s t 卸dt i m e c o n s 岫i i l gp r o d u c t i o n ；1 抽吐p m h cc o m p l e x e s n e e dt ob eb i o t i l l y l a t e dw 袖b i r ae 吻佃eb e f o r et e 缸a m 丽z 嘶o n t h e r ea 陀s i ) 【i s s u e st ob er e s o l v e di nm e s er e s t r i c t i o n s f i i 瓯醛锄e r d l 觚c e ds t i 锄e 舒，t l l e p e p t i d e p 2 mf l l s e d 2 一c 咖p o n e n t ( 2 c ) p m h cc o m p i e x e sh a v eb e e nd e v e l o p e db yt a f u f os e t a 1 i nt l l i s s 触：t c 鼢t h e 删g e n i cp e p t i d e 锄d 胆mc 锄b ee x p r e s s e d 弱ep r o t e i i l ，w i t l l o u ts y n 恤娟cp e p t i d e h o w e v c r ，l ea p p l i c a t i o no f t i l ep - p 2 ms t r a t e g yi sl i l i l i t e di i is 响ec 弱e sd u et o 廿l ei l l c o m p a t i b i l i 妙b 吐w e m es e q u 明c e so fm ep e p t i d e s 锄dn l e 咒s t r i 甜o ns i t e so ft i l ep l 勰m i dv e c t o 体s e c o n d ，w h e t h e rm h ci h e a v yc h 血( h c ) 肌dp d 2 mc 狮b ee x p r e s s c di ne c 础舔l es o l u b l ep m t e i n si ss t i l laq u e s t i 伽1 1 h i 嗵 廿l ep r o c e s so fw e s 咖b i o t 雏s a yn d st ob es i i i l p l i f i e d f o l l r t l l 廿l es i i i l p l em e m o d sf o r t h ec 啪t r a t i 衄dp i l r i f i c a t i 蚰o fp m h cic o m p l e x e sa r en d e dt 0b ed e v e i o p e d f i 胁，t l l ec 蚰v e n i e n t 锄de 币c i e n t r e f o l d i n gs 劬l t e g i e sa r cn e e d e dt og 即e r a ；t ep m h c ic o m p l e x 龉f i n a l ，t l l ec o n v 锄i 印tm 毹b o d st 0g e n e m t e p m h c im u l t 砷e r sn e e dt 0b ed e v e l o p e d i n 血i ss t u d y 劬0 r 锄t i g e n i cp e p t i d ec b k 蚪7 0 2 柚dv i n 坞a 而g e n i cp e p t i d eh b c l 睨7w 嬲a d o p t e dt o g 明e r a t em h c c e 氏* 7 0 2 锄dm h c - 鹏c l 柚7c 锄p l e x e s 锄d 廿l e i rm u i t i i l l e 巧w i 也p _ p 2 ms 眦e g y 1 而ea p p l i c a t i o ft h ep e p t i d c - l i i l l ( e d 胆- m i c 蕾o g l o b u l i n ( p 2 m ) s 仃a t e 留i s1 i m i t e di i ls o m ec 雒e sd u et o t l l e 毗o m p 撕b i l 时b e m e c n l es e q u e n c e so f 廿1 ep 印t i d e s 孤dt l l er e s t r i c t i 叫s i t e so ft l l ep l 雒m i d v e c t o 巧a ni s o c 鲫d a i n e r 眦l l i l i q u ew 豳a d 印t e dt oo v e 似珊et h i sr e 矧c t i 伽t h i ss 眦科f a c i l i t a t e s t h ec o l l s 劬c t i o no fp e p t i d e i i n k e dp 2 mm o l e c u l e s 锄dw i l ls i m p l 诹t h ep r e p 锄t i 0 i lo fm h c p e p t i d e c o m p l e x e s f i v er e c 锄b i n 锄t p l a s m i d s ( p e t 3 2 a - t - h i s h c b s ep e l 2 8 a - h c - b 加p m s ， p e l 2 8 a - h c h i s ，p e l r 2 8 a c e a o 7 0 2 p 2 m m s 锄dp e 亿8 a _ c e 氏蛘7 0 2 一陀m ) w e r ec o n s 仃u c 锄w i 血 也e 嘴u l 盯m e m 咀柚d 伽er e c o m b i i l a n tp l 嬲m i dp e t 2 8 a - 船c l 柚7 - p 2 mw 嬲c o 雌仃u c t e dw i m 血e i s o c 叫d 锄e rt e c l l l l i q u e 2 n r clh v yc h a i np r o t e i 璐f n x - h i s h c b s p 、h c b s p - h i s 锄dh c b m p - h i s ) 卸d 铆o p _ p 2 mp m t e i l l s ( c e 氏蚪_ 7 0 2 一胆m h i s 锄dc e a 6 舛7 0 2 - p 2 m ) w 骶o v * e x p r e s s c di nb l 2l ( d e 3 ) 蕊 i i i c l 吣i o nb o d i e s t h e 锄。明t so fm es o l u b l et a 唱e tp r o t e i i l sw e 他v e 哕s t a _ b l eu n d e rm ed i 行e r e n t i l l d u c i n gc o n d i t i o 略1 1 h e 锄。哪t so fm ei r l c l u s i o np m t e i i l sw e r ee 1 1 l l 锄c e dw i mt h ei n c r 哪i i 培i i l d u c e t i m e i i l c l 吣i o nb o d yp r o t e i i l sw e r cp r e p a r e dw i mh i g l lp r e s s u r eh o m o g 协i 伽1 1 h ey i e l d so fm h c h c 锄dp b 2 mw e r co v e r2 5m g lc u l t u r e 锄d5 0m g lc u l t l 鹏，r e s p e c t i v e l y t h ep 嘶t i e so fm h ch c i w i t l l a n d a n d c 9 4 撇一p 2 m h i sb i l l d i i 玛t 0i m a cs i l n u l t 锄e o u s l y - m h c c e a ( b s p ) 鲫dm h c c e a ( b m p ) c o m p l e x 懿w e mp r 印a r e db yp u l l d o w nm f o i d m gs 眦e g yw i mi m a c m h c c e a ( b s p ) c o m p l e xw 勰 c o 盯e 衙i i ls 仃u c t u 咒，v e r i f i e d b ys e c ，m c 锄dr p - h p l c m h c c e 氏蚪7 0 2 觚dm h c - h b c l 啦7 c o m p l e x e sw e r eg 朗l t e db yp u l l d o 帅r e f o l d i n gs t m t e 影w i 仇i e c t h ep u r i t i e so ft l l e 硎p l e x e s w e r e8 8 锄d8 2 ，r e s p e c t i v e l y 1 h ec 锄f o 咖a t i o no fm h c c e 凡9 枷2c 咖p l e xw 硒v 甜矗e d b y d o t _ e l i s aa n df a c s 6 h c b m p h i sc o u l db i n dt os 仃e p t a v i d i n ( s a ) ，粕di t sm u l t i m e rc o u l df o 咖w i ms a h c b s p h i s w 私p 酬yb i 胡n y l a t e db yb i r ai nb l 2l ( d e 3 ) t h eb i o t 时l a t i o ne f f i c i 即c i e so fh c b s p h i sw e 佗 h i g h e rw h 曲b 1 2 l ( d e 3 ) w 舔f e 姗e n t e di n l bc u t t u r e m e d i u m ，w i t l l 1 0m g n 1 ln a c l t 1 l e c o n c e n 缸t i o no fb i o t i ni i lt l l ec u l 眦h a dn oi n f l u e n c e m eb i o t i i l y l a t i o ne 衢c i e n c y t h e 锄o u n t so f t 量l ei i l c i u s i o np r o t e i n si i l c r e 弱e dw i lt l l ei i l d u c et i m e ，柚dw 嬲h i 曲e s t 心e r2 4 - h o u ri n d u c ea t3 7o c t h eb i o t i i l y l a t i o ne f f i c i e n c y ，2 5 ，w 鹤h i 曲e s ta f i e r2 4 - h o u ri i l d u c ea t3 7u c c o m p a r e dw 仙b m p t a g ， p a r t l yb i o t i i l y l a 砌b s p t a gw 弱p 唧】et o b cm u l t i i i l 丽z e dw 油s a d i l u t i o n - r e f o l d e d 锄d p u l l - d o 、m - r e f o l d e dm h c h b c l 譬c o m p l e 舶sc o u l df 0 咖m u l t i m e 璐w i 也a 埘一h i s - 协gm a b 锄dp e l a b l e da 埘- i g gm a b h b c i 譬一s p e c i f ct l l sc o u l db ed 鼬e c t e dw 油t l l em h c - 衄c l 啦7m u l t i m e r si l l p b m c so fh l a 叫心+ 锄dh b v i n f e c t e dp a t i 印t s t 狄朗蜘t t l 盯，也ei c a u d a m 盯t c c l m i q o v e r c 咖e st l l el i m i t a l i o no ft 量l ei n c o m p a t i b i l 时b e m 黜 t h ec 呔so f 吐l ef i i 髓锄i n o i di nt h ep 印t i d e s 锄d 廿l e 州c t i o ns i t 船i i i 廿l em u l t i p l ec l 彻i n gs i t c so f t h e p l 嬲m i dv e c t 吣，锄d i l i t a t e s l ec o n s 咖c t i 肌o fp e p t i d e n n k e dp 2 mm o l e c u l e s ；l ep u i l d o 、】y n 豫f 0 1 d i n g s 仃劬尉斟铋a b l e s 廿l er e f o l d i i l g ，c 伽c 即枷0 n ，锄dp 嘶f i c a t i o f l em h c - p e p t i d ec o m p i e x e si l l e 他p ， l e a d i l 玛t 0as h o r t e rp r o c e s st i m e 柚di i i c t e 勰e d 他f o l d i n gy i e l d ；锄d 廿l ef i l n c t i 伽a lp m h cm u l t i i i l e 塔c 觚b e s i m p l y 鲴l 盯砌w i 也锄t i b o d i e s t h e s es t u d i e sf a c i l i t a t em ep r 叩锄t i o fp m h c 咖h i n l 粥，卸dw i l l o 仃醯n l ec o n v e n i e n t 锄de 伍c i 饥tm e i o d st 0 昏m e m t e 硎f i c i a l 锄t i g 明p 他s e n t a t i c e i l s 锄da n i f i c i a l 鲫t i 窘即p r e s e n t a t i c h i p s k e yw o r d s ： m h ci 巾印t i d ec o m p l e x ；m h ci - p e p t i d em u l t i m e r ；d i l u t i 锄r e f o l d i n g ；c h m m a t o 脚h j c 他f o l d i n g ；i i l c l 吣i o nb o d y e be t h i d i u mb r o m i d c e d l ae t l l v l 朗e d i a m i n et e 仃越i c e t i ca c i d e l i s a e n z y m e - l i n k e di m m 硼o s o r b e n ta s s a y f a c sf l u o r c s c 即c e a c t i v a t e dc e l is o r t i n g f c s f 如lc a l f s e 咖 f i t cf l u r e s c e i i li s o t h i o c v a n a 眦 f p l cf i 弱tp e r f b h n 锄c el i q u i dc h m ma _ t o g r a p h y h i c h y d r d p h o b i ci i l t e m c t i o nc h r o m a t o g m p h y h l a h 岫a nl e u k o c y t ea n t i g e n h r ph o r s er a d i s hp e r o x i d 嬲e i bi i l c l u s i o nb o d v i e c i e x c h 卸g ec h r o 】n a t o 鲫h y i gi m m u n o g l o b u l i l l i m a ci m m o b i l i z c dm e t a li 衄a 伍n i t yd a t o 妒l p h y i y r g i s o p r o p y l t l l i 伊b - d - g a l a c t o s i d e l d al i m i t e dd i i u t i o n 瓠s a v m a bm o n o c l o n a la n t i b o d i e s m h c m a j o rh i s 妣伽p a t i b i l 毋c 鲫p l e x o do p t i c a id e i l s i t y p b m c p e r i p h e m lb l o o dm 伽o n u c l e 盯c e l l s p b sp h o s p h a t e b u f f e r e ds a i i n p c r p o l y m e r 嬲ec h a i n 陀a c t i p e r - p h y c o e r y t h 血 p e g 2 0 0 0 0 p o l y e t h y l e n eg l y 0 0 12 0 0 0 0 p m h cm h c p e p t i d ec 锄p l e x p m s f p h e n y l m e m y l s pl p h o n y l a u o r i d e 巾m r e v o l u t i o n sp c rm i n u t e s c f v s i n g l ec h a i n 卸t i b o d yv 撕a b l er e g 明确g m 即乜 s d s 一队g es o d i u m d o d e c y l s u l f a t e p o l y a c r y l 锄i dg e l e l e c t r o p h o r e s i s s e c s s a t c r t e m | e d 喇s w b s i z ce x c l u s i o nc i l l o m a t o ；m p h y s t r e p t a v i d i n s h i f ta s s a y tc e l lr e c e p t o r n ，n ，n ，n - t e 廿a m e t l l y i e l y i e n e d i 椰i i l e t n s h y d m x y m e t 量l y l 锄洫o m e i a n e w b s t e mb l o t 溴化乙锭 乙二胺四乙酸 酶联免疫吸附试验 流式细胞分析技术 胎牛血清 异硫氰酸盐荧光素 快速液相色谱 疏水相互作用色谱 人类白细胞抗原 辣根过氧化物酶 包涵体 离子交换色谱 免疫球蛋白 金属螯合亲和层析 异丙基硫代肛d 半乳糖苷 有限稀释法 单克隆抗体 主要组织相容性复合体 光密度 外周血单个核细胞 磷酸盐缓冲液 多聚酶链式反应 藻红蛋白 聚乙二醇2 0 0 0 0 m h c 肽复合体 苯甲基磺酰氟 每分钟转数 单链抗体可变区片段 变性聚内烯酰胺凝胶电泳 尺寸排阻色谱 链酶亲和素迁移实验 t 细胞抗原识别受体 四甲基乙二胺 三羟甲基氨基甲烷 免疫蛋广1 印迹 v 文献综述 文献综述 综述一包涵体蛋白复性研究进展 一包涵体的形成 随着对生物重组蛋白的大量需要，重组蛋白表达系统得到了越来越广泛的应用。根据宿主类型 的不同，重组蛋白表达系统可分为细菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞及植物细胞等表达系统。 其中细菌表达系统具有价廉、快速和产量高等优点，成为重组蛋白最常用的表达系统之一。在细菌 表达系统中，表达的外源蛋白常常以包涵体( i n c l u s i o n b o d v ) 的形成存在。包涵体是密度较高 ( 1 0 3 1 2 6m 卧n l ) 、无定形、具有特殊折光性且呈非水溶性的蛋白聚集颗粒，颗粒长度介于o 3 5 1 2 8 u m 之间( 图1 ) 【l 制。在合适的条件下，以包涵体形式表达的重组蛋白在菌体总蛋白中的含量可以达 到5 0 或更高。包涵体的主要成分是过量表达的日的蛋白，另外还可能含有核糖体元件、r n a 聚合 酶、内毒素、外膜蛋白o m p a 和o m p c f 、环状或缺口的质粒d n a 、磷脂( 占包涵体的0 5 一1 3 ) 和脂多糖等。这些杂质成分并非在发酵过程中参与到包涵体的形成，而是在细胞破碎过程中吸附到 包涵体上r 丌。对包涵体蛋白的结构分析表明，菌体内的蛋白聚集体含有一定量的- 二级结构，这和体 外蛋白聚集所形成的聚集体是一样的削。 图l 包涵体的电镜照片 a 含有胞内包涵体的大肠杆菌的投射电镜图( a l o i sj 岫g b 绷2 0 0 7 ) 。b 纯化后的人类生长激素( 1 l g h ) 包涵体的扫描电镜图( s u r i n d e rm o h 龃s i i l g i l ，2 0 0 5 ) 。 f i g 1e l e c t r o nm i c r o g r a p ho fi n c l u s i o nb o d i e s a e l e c t r o nm i c r 0 灯a p ho fe c d ，fc e l l sc o n t a i n i n 2c y t o s o l i ci i l c l u s i o nb o d i e s ( a l o i sj u n 曲a u e r ，2 0 0 7 ) b s c a n n i i l ge l e c 仃d nm i c m g r a p ho f p u r eh g hi n c i u s i o nb o d i e s ( s u r i n d e rm o h 觚s i n 曲，2 0 0 5 ) 1 包涵体形成的主要原因： ( 1 ) 蛋白在宿主菌内的高水平表达。动力学模型分析表明，活性蛋白的产量主要取决于蛋白的合 成以及折叠和聚集的速率，当蛋白聚集的速率超过折叠的速率时就形成了包涵体纠。采用减缓 细胞乍长和蛋白表达速率的方法，例如降低温度或改变培养基的p h 等，可以使一些容易形成 包涵体的蛋白部分或全部地以可溶性蛋白的形式表达【l 们。 。 ( 2 ) 二硫键的错配。大肠杆菌的胞质是一个高度还原的环境，不利于正确二硫键的形成l l 。实验 表明，将宿主菌胞质的还原性环境转变成氧化性环境，例如将大肠杆菌内的硫氧还蛋白还原 酶突变失活l l2 】或是在宿主菌胞质内过表达内源性的二硫键异构酶d s b c l l 引，将有利于二硫键的 形成，进而减少了包涵体的产生。 东南大学博士学位论文 ( 3 ) 折叠辅助分子的缺乏。宿主菌胞质内缺乏一些蛋白折叠过程所需的蛋白质二硫键异构酶p d l 【1 4 】 和分子伴侣g r o e l g r o e s 等酶和辅助分子，不能辅助翻译后的蛋白折叠成正确的空间构象， 从而引起蛋白的聚集。 ( 4 ) 所表达目的蛋白本身的性质。蛋白的电荷分布和转角形成残基对包涵体的形成有着重要的影 响【1 6 1 。 2 蛋白以包涵体形式表达的主要优点【i 卜1 9 】： ( 1 ) 目的蛋白表达水平很高，能达总菌体蛋白的3 0 以上。 ( 2 ) 所表达的目的蛋白可以避免宿主菌酶介导的水解酶降解。 ( 3 ) 破菌及初步纯化过程更易操作，而不用担心蛋白变性或失活。 ( 4 ) 收集制备简单，利用离心，过滤或分子筛可将其与宿主菌可溶性蛋白方便地分开，从而简化 了制备步骤，提高了纯化产物的产量。 ( 5 ) 在待表达的目的蛋白对宿主菌有毒性的情况下，形成包涵体能减少表达产物的毒性，从而增 加目的蛋白的表达产量。 蛋白以包涵体的形式表达的缺点之一是蛋白不具有生物活性，必须通过复性的过程使其形成具 有天然构象和生物活性的蛋白l 加j 。包涵体蛋白的复性成为分子生物学下游工艺的瓶颈技术。 二包涵体蛋白的分离制备 包涵体蛋白的分离制备包括细胞破碎或裂解、包涵体的洗涤和包涵体蛋白的溶解等过程。细胞 破碎或裂解是包涵体制备的第一步，常用的方法有化学裂解法和物理破碎法【2 。化学裂解法是利用 溶菌酶或其它破坏细胞壁的化学试剂如_ t o nx 1 0 0 和e d l a l 2 z j 来裂解细胞，适用于实验室小规模 制备。此方法的优点是可以直接从培养基中提取包涵体，简化了操作步骤；缺点是高分子量的d n a 的释放导致了溶液粘度的增加，这对目的蛋白产物的捕获带来了困难，并且提取物中会混有大量宿 主细胞蛋白成分。细胞的物理破碎法是通过高压均质或超声波等机械力破碎细胞，细胞破碎后形成 了可溶性蛋白、包涵体和细胞碎片的混合物，通过离心将包涌体和细胞碎片沉淀。破碎细胞条件的 优化，例如反复高压均质处理，可以得到较好的包涵体颗粒和细胞碎片，从而增加了包涵体的纯度 【2 3 】。 细胞破碎后外部的细胞膜成分释放出来并可能附着在包涵体表面。这些杂质成分可能影响后继 的包涵体蛋白的复性，使蛋白的复性率明显下降1 2 4 j ；相反，在蛋白复性前用反向色谱等纯化手段进 行包涵体蛋白的纯化可以使蛋白复性率有明显的增加1 25 | 。另外，一些蛋白对与细胞外膜相关的蛋白 酶特别敏感，从包涵体中利用去污剂去除细胞壁成分后可以使包涵体蛋白的得率提高1 0 0 倍1 2 酬。去 除包涵体杂质的试剂有e d l a 、低浓度的变性剂如l - 4m 尿素、弱去污剂如t r i t o nx 1 0 0 、脱氧胆 酸钠( d e o 珂c h o l a t e ) 、正辛基葡萄糖苷( o c 哆l g l u c o s i d e ) 等【2 7 七u 。但有时去污剂的使用会影响后继 的下游操作，这时就要避免使用。 常用溶解包涵体蛋白的试剂是变性剂盐酸胍和尿素，另外还有强离子型去污剂如n 十二烷基肌 氨酸( n 1 a u l l o y l s a r c o s i l l e ) 和s d s 等。盐酸胍虽然价格稍昂贵，且不利于s d s p a g e 分析，但其变 性能力强，性质稳定，是目前首选的包涵体溶解试剂。尿素价格较低，用尿素溶解的包涵体蛋白也 可以直接进行s d s p ：a g e 分析，但其一大缺点是性质不稳定，在溶液中可自发产生能对蛋白质的氨 基进行修饰的氰酸盐( c y a l l a t e ) 1 3 l j 。另外，尿素对包涵体蛋白的溶解能力与溶液p h 相关，对每种 蛋白要选最佳p h 条件f 3 2 】。极端p h 条件也可溶解菜砦包涵体蛋白【3 3 l ，但在此条件下容易引起蛋白 的不可逆修饰，例如脱胺基作用( d e 锄i d a t i o n ) 和半胱氨酸残基的脱硫作用( d e s u l m r a t i o n ) 等，所 以应用较少。包涵体也可用小同类型的去污剂、低浓度的变性剂或聚集抑制剂精氨酸等溶解瞰j 。 三复性过程与复性动力学 目前对蛋白复性途径的研究仍然只限于假说，这些假说普遍认为在蛋白折叠复性到天然结构的 过程中存在着或多或少不同的不稳定构象产物，即中间体( i n t e m e d i a t e s ，i ) 。这些中间体在没有变 性剂的情况下容易由于分子间的相互作用而形成蛋白分子的聚集和沉淀。根据k i e f h a b e r 等研究者【9 1 提出的复性与聚集反应的竞争动力学模型可以用图2 表示。由变性蛋白( u n f o l d e dp r o t e i n ，u ) 和 天然蛋白( n a t i v ep r o t e i i l ，n ) 所形成复性中间体的反应涉及分子内相互作用，是一级反应( n = 1 ) ： 而聚集体蛋白( a g g r e g a t e s ，a ) 的形成则涉及分子问相互作用，是二级或二级以卜的反