（生物医学工程专业论文）原子力显微术对生物分子间相互作用的研究.pdf

东南大学博士论文：摘要 变化。 3 ) 我们用原子力显微镜研究不同浓度的长春新碱和阿司匹林诱导d n a 分 子的结构变化。d n a 分子同这两种药物作用的a f m 图像显示，长春新碱作用于 d n a 分子会产生一些螺旋圈和不同大小的d n a 片段，而阿司匹林作用于d n a 分 子会引起d n a 链宽度变化和构型转化。这两种药物作用于d n a 分子的不同结构 变化可归结为它们同d n a 分子的不同作用机制。本文的工作对小分子引起不同 的d n a 分子结构变化和构型转变提供了一种新颖的表征手段，进一步用实验方 法说明原子力显微镜( a f m ) 作为一种图像分析技术在小分子同d n a 大分子相 互作用的研究中可发挥较大的作用和其它仪器设备无法比拟的直观、清晰的优 势。 4 ) 我们用原予力显微镜( a f m ) 获取了e c o r l 甲基化酶同d n a 双链结合体 的三维形貌图像，图像不仅提供了一个生物样品二维的信息，而且也有力地提 供了三维的高度信息。我们表征了线型化的d b r 3 2 2 和e c o r l 甲基化酶结合物， 并证明两个e c o r l 甲基化酶作为同型二聚体结合在d n a 双链上，即一个e c o r l 甲基化酶作为单聚体结合在d n a 双链的一条单链上。本文的工作显示原子力显 微镜( a f m ) 可在研究d n a 和蛋白质相互关系方面发挥重要作用。 关键词：原子力显微镜( a f m ) ，表面修饰，d n a 分子构象，小分子物质，d n a 蛋白质复合物 查堕查主堡主笙兰! 垫至 a b s t r a c t b a s e do nav e r yl o c a lp r o b eo rt i p ，as t r o n g l yd i s t a n c e d e p e n d e n t i n t e r a c t i o na n dc l o s ep r o x i m i t yo ft h ep r o b ea n dt h eo b j e c t ，a na t o m i c f o r c em i c r o s c o p y ( a f m ) i sc a p a b l et ov i s u a l i z et o p o g r a p h i ci n f o r m a t i o n o fs a m p l e s s i n c et h eb e g i n n i n go ft h eu s eo fa t o m i cf o r c em i c r o s c o p y ( a f m ) ，i th a sb e e nw i d e l yu s e di nt h ef i e l do fp h y s i c s ，c h e m i s t r ya n d b i o l o g y ，n a n ot e c h n o l o g y a n dt h ea p p l i c a t i o no fa f m i ns t u d y i n gt h e s t r u c t u r e so fb i o m a c r o m 0 1 e c u l e si n c l u d i n gd e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ( d n a ) ， p r o t e i n e t c i s p r e s e n t e d n o t o n l y a t o m i cf o r c em i c r o s c o p yc a n v i s u a l i z et h et o p o g r a p h i cs t r u c t u r e so fb i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l e s ，b u t a l s ob i o m a c r o 【f l o l e c u l e sc a nb em a n i p u l a t e da n dc u t t h em a i nc o n t r i b u t i o n sa r ea sf o l l o w i n g ： i ) c e l la d h e s i o n i s i m p o r t a n t t o d e v e l o pc e l lm i c r o a r r a y s a n d b i o c o m p a t i b l em a t e r i a l s c o l l a g e nh a sb e e nr e p o r t e dt ob e a b l et o i m p r o v e c e l la d h e s i o n i nt h i s p a p e r ，t w oc o l l a g e nc o a t i n gm e t h o d s ( c o i l a g e ng r a f t e dd i r e c t l yo nt h es u b s t r a t ea n d1 c h i t o s a n m o d i f i e d s u b s t r a t e ) w e r ec a r r i e do u t a na t o m i ef o r c em i c r o s c o p yi su s e dt o c h a r a c t e r i z em o r p h o l o g i e so ft h e s es u r f a c e s 。i tw a sf o u n dt h a ts u r f a c e t o p o g r a p h yw a sk e yf a c t o rt oc e l la d h e s i o n c o l l a g e n ( 1 m g m l ) g r a f t e d o n1 c h i t o s a n m o d i f i e ds u r f a c es h o w e dt h eb e s ta d h e s i o no fh e l ac e l l t h i sw o r k m i g h t b e h e l p f u l t ot h e p r a c t i c a la p p l i c a t i o n o fc e l l m i c r o a r r a yc h i p sa n db i o c o m p a t i b l em a t e r i a l s 2 ) w ei m m o b i l i z e ds u p e r h e l i c a lp l a s m i dd n aa n d 一d n am o l e c u l e so n 3 a m i n o p r o p y l t r i e t h o x y s i l a n e ( a p t e s ) t r e a t e dm i c a ，a n dm a n i p u l a t e d t h e i rm o l e c u l a rc o n f o r m a t i o nt ob e c o m e c i r c u l a r a n dw e l l e x t e n d e d s h a p e st h r o u g hc h a n g i n gp h s t h ea t o m i c f o r c em i c r o s c o p y ( a f m ) d a t a s h o w e dt h a tt h es u p e r h e l i c a lp l a s m i dd n a sb e c a m eb - f o r md n a o p e nc i r c l e s 变塑查兰堡主笙苎! 塑茎 一 a n df o r m e dal a t t i c en e t w o r ko na p t e st r e a t e dm i c aa tp ho - i 0 6 0 nt h e o t h e rh a n d ，九- d n a ss h o w e da l i g n e dl i n e a rs h a p ea n dam e s hn e t w o r ko n a p t e st r e a t e dm i c aa tp ho - 1 0 6 d n ac o u l dn o tb ed e p o s i t e do na p i e s t r e a t e dm i c aa tp h 1 0 6 o u rr e s u l t si n d i c t e dt h a tt h ev a r i a t i o no fd n a c o n f o r m a t i o n sm a yd e p e n do nt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nha n dc h e m i c a l g r o u po ft h es u b s t r a t e sw h e nd e p o s i t e d o na p t e s t r e a t e dm i c a o u rw o r k s h a da l s od e m o n s t r a t e dt h a ta f mi m a g i n gt e c h n i q u ec o u l db eu s e da sa p o w e r f u lt o o l i ns t u d y i n gt h ec o n f o r m a t i o no fd n am o l e c u l ea tv a r i o u s p h s 3 ) a f mh a db e e nu s e dt os t u d yt h es t r u c t u r a lv a r i a t i o n so fal i n e a r p l a s m i dd n ai n t e r a c tw i t hv a r i o u sc o n c e n t r a t i o n so fv i n c r i s t i n es u l f a t e a n da s p i r i n t h ed i f f e r e n tb i n d i n gi m a g e ss h o wt h a tv i n c r i n s t i n es u l f a t e b i m i n g d n ac h a i n sc a u s e ds o m el o o p sa n dc l e a v a g e so ft h ed n af r a g m e n t s ， w h i l ea s p i r i ni n t e r a c t i o nc a u s e dt h ew i d t hc h a n g e sa n dc o n f o r m a t i o n a l t r a n s i t i o n o ft h ed n a f r a g m e n t s t w o d i f f e r e n td n a s t r u c t u r a l a l t e r n a t i o n sc o u l db e e x p l a i n e db yt h ed i f f e r e n tm e c h a n i s m so ft h e i n t e r a c t i o n sw i t ht h e s et w oc o m p o n e n t s o u rw o r k sp r o v i d e dad e t a i l i n s i g h ti n t ot h ed n as t r u c t u r a lv a r i a t i o n si n v o l v e di nt h e s et w ob i n d i n g p r o c e s s e sa n d h a sd e m o n s t r a t e df u r t h e rt h e v e r s a t i l i t yo fa f ma s a l l i m a g i n gt e c h n i q u ef o rs t u d y i n gt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nd n aa n ds m a l l m o l e c u l e s 4 ) w eh a v es u c c e e d e di n u s i n gt h ea t o m i cf o r c em i c r o s c o d vt o v i s u a l i z et h ee c o r l m e t h y l a s e b i n d i n g t o d n a d u p l e x t h e t h r e e d i m e n s i o n a lt o p o g r a p h i ci m a g e sw e r eo b t a i n e dw i t ht h ea f m ，w h i c h p r o v i d en o to n l yt h el a t e r a ld i m e n s i o n so fas a m p l eb u ta l s od r o v i d e h e i g h ti n f o r m a t i o n i nt h i s r e p o r t ，w e d i r e c t l ya p p l i e da f m t o i n v e s t i g a t el i n e a r i z e dp b r 3 2 2 一e c o r l m e t h y l a s ec o m p l e x e s ，a n dd r o v e d 东南人学博上论文：摘要 t h a tt w oe c o r lm e t h y l a s ea s h o m o d i m e rb o u n dt h ed n ad u p l e x ，i e o n e e c o r lm e t h y l a s ea sam o n o m e rb o u n do n es t r a n do fd n ad u p l e x o u rw o r k i n d i c t e dt h a t t h e a f mo f f e r e da p o w e r f u l t o o lf o r i n v e s t i g a t i n g b i o l o g i c a l l yi m p o r t a n tm o l e c u l a ri n t e r a c t i o n st h a tw e r er e l e v a n tt ot h e d n ab i n d i n gp r o t e i nc o m p l e x e s k e yw o r d s ：a t o m i cf o r c em i c r o s c o p y ( a f m ) ，s u r f a c em o d i f i c a t i o n ，d n a c o n f o r m a t i o n ， s m a l l m o l e c u l e c o m p o u n d ，d n a p r o t e i n c o m p l e x 东南大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不 包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教 育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 签名：上堑乏一日期： 东南大学学位论文使用授权的声明 东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学 位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 木人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外， 允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包括刊登) 论文的全部或部分内容。论文的 公布( 包括刊登) 授权东南大学研究生院办理。 签名： 查塑查兰堡主笙兰! 兰二至堕笙 第一章绪论 1 1 引言 上世纪5 0 年代，自w a s t o n 和c r i c k 阐明d n a 分子双螺旋结构以来，使人 们对生物现象的研究手段从原始的生物组织、器官、细胞结构的观察、形态构 造的比较飞跃到生物分子问相互作用的分析研究，这不仅得益于生物化学分析 技术的快速进步，也得益于生物分子分析仪器如x 一射线衍射仪和核磁共振 ( n m r ) 仪的发明和使用。然而，分子尺度处于1 0 2 0 0 n m 的生物材料和比分子 尺度更小的生物样品x 一射线衍射和核磁共振( n m r ) 技术的适用性就会受到限 制。电子显微镜( e m ) 和扫描隧道显微镜( s t m ) 虽然是分析分子尺度和比分 子尺度更小生物样品的有效工具，并且也取得了许多举世公认的成就。但是电 子显微镜( e m ) 和扫描隧道显微镜( s t m ) 在观察和分析生物样品时也遇到一 系列困难：首先，电子显微镜( e m ) ( t s k h o v r e b o v al e ta 1 ，2 0 0 1 ) 和扫描 隧道显微镜( 8 t m ) 适用于研究电子性导体，而生物大分子几乎都是非导体或 离子性导体，不适用于电子显微镜和扫描隧道显微镜直接观测，需要对样品表 面镀一层金属膜或制备成金属复合物来进行成像观测，因此所成图像的分辨率 就会大大地降低。样品预处理过程复杂，在处理过程中有时会损坏样品，至使 所成图像失真。其二，扫描隧道显微镜( s t m ) 可以在石墨等载体上，直接在 空气或溶液中对生物大分子进行观测，但所得图像分辨率差，而且重复性差， 这主要是由于探针扫描过程中同观测样品间的相互作用而引起所测样品分子 漂移，使得被测部分落在视野之外。1 9 8 6 年b i n n i n g 在扫描隧道显微镜( s t m ) 的基础上发明了原子力显微镜( a f m ) ( b i n n i n gg e ta 1 ，1 9 8 6 ) 。原子力显微 镜( a f m ) 自发明以来，被很快用于生物大分子样品的观测研究领域。它较电子 显微镜( e m ) 和扫描隧道显微镜( s t m ) 有许多优点，对样品是否电子性导体 无特殊要求，不会由于所测样品是绝缘体，无法形成隧道电流而不能观察，故 而无需在样品表面镀一层金属膜或制备成金属复合物后再进行成像观测；可以 在空气或各种溶剂和溶液中对样品进行成像观测，这点对生物大分子而言特别 东南大学博士论文：第一章绪论 重要，因为生物大分子只有在接近生理条件下才表现其活性。原子力显微镜 f a f m ) n - t 以在液体环境下对生物大分子问的相互作用做现时跟踪观测。通过控 制成像操作力的大小，使用合适的成像模式，不会对样品分子产生漂移和损坏， 所得图像分辨率高，而且重复性好。此外。所用对生物大分子进行成像观测的 载体，选择范围广，不要求其是否导电。这样就可以对生物膜进行成像观测。 云母、硅片、石墨、玻璃片等等，都可以作为生物大分子的成像观测载体。 1 2 原子力显微镜( a f m ) 的成像原理 原子力显微镜( a f m ) 一般是用硅或氮化硅、氧化硅做成探针扫描待测样 品。探针附在一根可活动的微悬臂的底端上，当探针与样品接触时的微小作用 力引起微悬臂的偏转，通过光电检测系统对微悬臂的偏转进行检测和放大，信 号经过转换可得到样品表面的三维立体图像。原子力显微镜( a f m ) 对样品的扫 描方式有：轻敲模式( t a p p i n gm o d e ) 、接触模式( c o n t a c tm o d e ) 、非接触模 式( l i f t o f f m o d e ) 。接触成像模式( c o n t a c t m o d e ) ：在对样品的扫描过程中， 探针一直与样品紧密接触( 探针尖端原子与样品表面原子间的作用力是微弱的 排斥力) ，操作力和探针与样品间的作用力易使样品分子漂移和损坏。轻敲模 式( t a p p i n gm o d e ) 采用高频振动的探针( 如3 0 0 k h z ) 来扫描样品，反馈线圈 通过调节样品的上下来控制探针与样品表面的距离从而保持振动频率恒定，记 录样品的上下移动来获取图像。由于探针的高频振动使探针与样品表面的接触 时间很短，也使探针对样品的侧向推力得以消除，这样就大大地减少了在扫描 过程中探针导致样品分子漂移和损坏的机会。 1 3 探针技术 扫描探针是原子力显微镜( a f m ) 的核心部分，一般是用硅或氮化硅、氧化 硅做成探针，探针尖端的曲率半径在5 - 2 0 n t o 之间。当待测样品的尺寸大小同 扫描探针尖端的曲率半径相当或更小时，会出现扫描探针对被测样品的所谓 “放大效应”a “放大效应”使得观测到的图像比样品真实值大，造成扫描图像 东南大学博士论文：第一章绪论 失真( v a nn o o r ts j t e ta 1 ，1 9 9 9 ) 。扫描探针的几何物理特性客观上制 约了图像分辨率和准确度。这也从客观上决定了原子力显微镜( a f m ) 自身需要 不断地完善，而且也决定了原子力显微镜( a f m ) 最终能否在生物学领域大面积 推广。因此，近年来有许多科学家为消除扫描探针尖“放大效应”进行了卓有 图1 1 原子力显微镜( a f 岣工作原理图示。( 来源于： h t t p ：h o m e r h s r o r n l g o v c b p s ) 成效的工作。一是改善扫描探针的制造和加工工艺，寻找新的制造扫描探针材 料，如使用电子沉积法制造探针，探针尖端的曲率半径可缩小在5 - l o n m 之间， 虽然准确度有所提高，但距离样品真实值仍有一定的差异。二是对扫描探针进 行生物化学法或化学法修饰，至今的报道是效果不太理想。 1 4 成像环境 东南大学博士论文：第一章绪论 d n a 、r n a 、蛋白质和多糖等生物大分子，按其不同的实验要求，可在空 气和液体环境中成像。在空气中成像，对周围环境的湿度具有一定的要求 ( 3 0 ) ，否则会严重影响图像的质量。因此，在湿度较大的环境下，空气中 成像，往往封闭通过滤的氮气后操作。原因是湿度较大，探针与样品表面会有 一层水膜，致使扫描时探针必须穿过这层水膜而产生较强的毛细力( 几个n n 至几百n n ) ，易损坏被测的生物分子和使待测的样品分子漂移。在液体环境中 成像，因为生物大分子在接近生理条件下才能表现出其活性，故而在缓冲液体 中才能对其进行实时跟踪观察。但是，在液体环境中成像，图像的分辨率较差， 存在水分子氢键力的干扰：此外样品分子的固定也有一定的困难。 1 5 成像载体 用作原子力显微镜( a f m ) 对生物大分子进行成像观测的载体，选择范围 广，不要求其是否导电。这样就可以对生物膜进行成像观测。云母、硅片、石 墨、玻璃片等等，都可以作为生物大分子的成像观测载体。但是，生物大分子 在载体表面的吸附受载体表面与生物分子间的1 ) 静电相互作用2 ) 疏水相互 作用3 ) 脱水效应等因素制约。其中最为常用的载体是新鲜剥离的云母片，因其 是原子级的平整。对其表面进行不同的化学处理，不仅可以较好地观测生物大 分子( 如d n a 、r n a 分子) ，而且也可以很直观地测量生物大分子( 如d n a 、r n a 分子) 的构型、构象变化。玻璃片因其表面有1 - 2 r i m 的粗糙度，这种表面是很 难适合对生物大分子进行观测的，通过对其表面进行化学处理或生物化学处 理，可作为蛋白质、多糖、脂蛋白等生物大分子的成像观测载体。 1 6d n a 分子和d n a 结合蛋白 1 6 1 d n a 分子的原子力显微镜成像观测和显微操纵 自从l i n d s a y 等第一次成功地用原子力显微镜( a f m ) 观测到d n a 分孑： 来，a f m 已经成为研究d n a 分子结构的重要工具和手段( l i n d s a ys m e t a l - ，1 9 8 9 ) 。在正常的生理条件下，质粒d n a 分子通常显现超螺旋状，这种状 4 查堕查竺堕兰堕奎：堑二兰堕堡 况不利于人们在分子水平上研究质粒d n a 分子的生物作用和生理功能( m e l n y k s e ta 1 1 9 9 9 ) 。1 9 9 2 年b u s t a m a n t e 小组在室温和空气环境下( 湿度 4 0 ) 用原子力显微镜( a f m ) 得到可重复的质粒d n a 分子图像，图像分辨率高， 清晰地显示了d n a 分子的三维环状结构，并可测算d n a 分子的高度和宽度 ( b u s t a m a n t ec e ta 1 ，1 9 9 2 ) 。l y u b c h e n k o ( l y u b c h e n k oy e ta 1 ，1 9 9 7 ) 和 n a g a m i ( n a g a m if e ta 1 ，2 0 0 2 ) 随后在a p t e s 修饰过的云母上通过改变缓 冲液的离子强度观测到稳定的质粒d n a 分子超螺旋和环状构象，而t a n i g a w a ( t a n i g a w am e ta 1 ，1 9 9 8 ) 在精胺和亚精胺修饰的云母表面上运用拓扑酶转 变质粒d n a 分子构象并用原子力显微镜( a f m ) 也清晰地观测到超螺旋和环状 构象变化。t h u n d a t 小组用双价阳离子( m g ”) 作为媒介帮助带负电荷的d n a 分 子结合到带负电荷的云母表面，在云母表面构建一个“阳离子桥”，从而获得 了清晰的单、双链d n a 分子图像( t h u n d a tt e ta 1 ，1 9 9 3 ) 。m a r s h 等用原子 力显微镜( a f m ) 清晰地观测到新的d n a 分子构象一四螺旋g - d n a ( m a r s ht c e t a 1 ，1 9 9 5 ) 。z h a n g 等清晰地观测到质粒d n a 分子中t ，。a j 重复序列( z h a n gp c e ta 1 ，1 9 9 9 ) 。f a n g 和r i v e t t i 分别用原子力显微镜( a f m ) 快速、灵敏地确 定固体d n a 分子的大小和d n a 分子的长度，并设计了一套独特的计算方法来获 得d n a 分子轮廓长度，且准确度很高( f a n gy e ta 1 ，1 9 9 8 ：r i v e t t ic e t a 1 ，2 0 0 1 ) 。w a n g 和l i 在化学处理过的云母表面将d n a 分子定向排列得到线 形d n a 分子图像，通过测量d n a 分子轮廓长度，可得出组成d n a 分子链的核苷 酸数目，较琼脂糖胶电泳直观，且无溴化乙锭( e b ) 的污染( l ij e ta 1 ，1 9 9 8 ： w a n gw e ta 1 ，1 9 9 8 ) 。h u 等用原子力显微镜( a f m ) 的扫描探针，轻敲模式 ( t a p p i n gm o d e ) ，室温和空气环境下将沉积在云母片上网络状的d n a 分子显 微操纵、切割成“d n a ”字母图案( h uj e ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 h a n s m a 等在丙醇体系中用轻敲模式( t a p p i n gm o d e ) 研究小片段d n a ( l o o b p ) 和双链d n a ( 2 0 0 b p s ) 的分子结构，得到2 n m 高分辨率的清晰图 像，可估算d n a 分子的螺距( h a n s m ah g e ta 1 ，1 9 9 6 ) 。n a g a m i 在液体环境 中逐步改变溶液的盐度实时跟踪观察质粒d n a 分子构象变化( n a g a m if e t 东南大学博士论文：第一章绪论 a 1 ，2 0 0 2 ) 。 原子力显微镜( a f t ) 在研究和实时跟踪观察d n a 分子的立体结构、空间 构象，如d n a 分子轮廓长度、d n a 分子超螺旋、环状、扭结等等构象方面发挥 着重要的作用。 1 6 2d n a 和蛋白质复合物的原子力显微镜成像观测 d n a 一蛋白质的相互关系在正常的细胞功能调节方面发挥显著重要作用。 为了获取d n a 结合蛋白结合体上蛋白结合位点的初步信息，人们常常使用凝胶 阻滞实验( e m s a ) ( t a g a s h i r ah e ta 1 ，2 0 0 2 ) 和d n a 足迹分析实验( d n a f o o t p r i n t i n g ) ( f e c h t e re j e ta 1 ，2 0 0 3 ) 。但是，这两种方法不仅耗费人 力和时间，而且只适用于单一的、小片段的d n a 序列分析。核磁共振( n m r ) 和x 射线晶体衍射图谱法需要耗时耗力的解谱过程，和获取d n a 结合蛋白复合 体的结晶体( j a s e j am e ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 原子力显微镜( a f m ) 不仅可用来研究d n a 和蛋白质的相互关系，并且能 够在三维空间内对生物大分子的天然结构进行分析并可以在液体缓冲环境中 对蛋白质结合d n a 分子的动力学过程实时跟踪观测( a l l i s o nd p e ta 1 ，1 9 9 7 h o y tp r e ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 a 1 1 i s o n 是用原子力显微镜( a f m ) 观察d n a 和蛋白质结合体较成功的一位 科学家。他用独特的样品处理技术( 临界点干燥法) ，消除图像的背底噪声， 获得了清晰的e c o r l 限制性内切酶突变物结合质粒d n a 分子、粘粒d n a 分子 ( c o s m i d ) 和l a m b d a d n a 分子图像，向人们直观地展示了限制性内切酶对d n a 分子的酶切图谱( a l l i s o nd p e t a 1 ，1 9 9 6 和1 9 9 7 ) 。r i v e t t i 用高清晰 的原子力显微镜( a f m ) 图像并结合生物化学方法证明e c o l ir n a 聚合酶在行 使其转录功能开始时，启动子区域的d n a 序列缠绕e c o l ir n a 聚合酶约3 0 0 。， 对研究g c o l ir n a 聚合酶的转录功能意义重大，该发现被国际重要期刊引用达 4 0 次以上( r i v e t t ic e ta 1 ，1 9 9 9 ) 。m o r e n o h e r r e r o 用原子力显微镜( a f m ) 6 查塑查兰堡主笙兰：塑二皇竺丝 一一一 准确地将m i g i p 蛋白定位于h x k 2 基因的核苷酸序列长度、数目测算出来，经 生物化学技术验证，完全j 下确( m o r e n o h e r r e r o f e ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 e 1 1 i s 用原子力显微镜( a f m ) 实时跟踪观测了l 型限制性修饰酶系统： g c o k l 酶结合和酶切质粒p r h 3 的全过程，液体环境中所成a f m 图像清晰，分辨 率高，第一次直观、生动、准确地描绘了1 型限制性修饰酶系统中e c o k l 酶 的作用机制( e l l i sd j e ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 然而，原予力显微镜( a f m ) 同其它仪器一样，也有它的缺陷。它虽然能 反映出d n a 分子的立体结构、空间构象，如d n a 分子轮廓长度、d n a 分子超螺 旋、环状、扭结等等构象方面信息，但是它不能确定d n a 分子的核苷酸序列构 成碱基，也不能测定蛋白结合的核苷酸序列构成碱基。 1 6 3d n a 和小分子化合物相互作用的原子力显微镜成像观测 小分子同d n a 大分子相互作用机制主要可归纳为静电作用，插入作用和 大、小沟槽结合作用( c o u r yj e e ta 1 ，1 9 9 6 ) 。小分子同d n a 大分子相互 作用，传统实验技术是用光谱分析方法表征，如x 射线晶体结构分析( g a or e ta 1 ，1 9 9 1 ) ，核磁共振仪( n m r ) 分析( p i e t r a s a n t al i e ta 1 ，2 0 0 0 ) 和振动光谱分析( n e a u l tj f e ta 1 ，1 9 9 6 ) 等等。虽然传统实验技术能够检 测小分子诱导d n a 大分子结构变化，然而大多这些实验技术费时、费力，而且 只能给出小分子改变d n a 较短片段结构变化的有限信息。 c o u r y 用原子力显微镜( a f m ) 观测到溴化乙锭( e b ) 单插入到d n a 大分子 链中引起的d n a 分子构象变化( c o u r yj e e ta 1 ，1 9 9 6 ) ，b e r g e 观测到 d i t e r c a l i n i u m 分子双插入到d n a 大分子链中诱导d n a 分子构象变化( b e r g e t e ta 1 ，2 0 0 2 ) 。原子力显微镜( a f m ) 能被成功地用来研究d n a 大分子同分子基 团间的相互作用信息，并且能够有效地观测小分子诱导d n a 分子大片段的结 构变化。 1 。7 蛋白质分子 东南大学博士论文：第一章绪论 蛋白质分为结构蛋白和功能蛋白。自原子力显微镜( a f m ) 发明和被使用以 来，就丌展了对蛋白质结构和功能的研究，大量文献集中在对结构蛋白的观察 和研究。因为结构蛋白制样简单、方便、易固定，适合于用原子力显微镜在空 气和液相中观察。结构蛋白的研究又以对膜蛋白的观察和研究为甚，b u t t 对 h a l o b a c t e r i u mh a l o b i m 上的视紫红蛋白进行了观察和研究，所得图像表明视 紫红蛋白在h a l o b a c t e r i u mh a l o b i m 膜上成二维六角形排列，每个六角形为一 个晶胞，晶胞间距6 2 n m ，相当于视紫红三聚体( b u t th j e ta 1 ，】9 9 0 ) 。 c h e r n o f f 用原子力显微镜最先对胶原蛋白进行了成像，观察到胶原蛋白分子的 有序排列构象( c h e r n o f fe a g e ta 1 ，1 9 9 2 ) 。 1 8 细胞器 植物细胞拥有细胞壁，细胞壁在构造上有许多多糖分子，多糖分子往往带 有支链，分予均一性较差：但近年来，用原子力显微镜( a f m ) 对植物细胞壁的 观察，取得了很大的进展。g u h a 成功地用原子力显微镜观察到绿豆种子表面的 超微结构，对指导农业生产具有重要价值( g u h at e ta 1 ，2 0 0 1 ) 。k i r b y 等 对苹果、马铃薯、胡萝b 等植物的薄壁组织用原子力显微镜( a f m ) 进行了研究， 得到了具有多层结构的植物细胞壁三维立体图像( k i r b ya r e ta 1 ，1 9 9 6 ) 。 h a g a 成功地用原子力显微镜观察了纤维细胞的三种细胞骨架纤维一微管蛋白 丝( 2 5 n m ) ，肌动蛋白丝( 6 r i m ) 和中间丝( 1 0 n m ) ，并对它们的弹性系数进行了测 量。 1 9 本文研究目标和内容 将原子力显微镜( a f t ) 这个仪器运用于生物学基础理论研究中，解决具体 的生物学问题，是我的博士论文主要工作。 细胞贴壁对于研究细胞微阵列芯片和生物相容性材料具有十分重要的意 义。胶原蛋白已经被证明有利于改善细胞贴壁环境，本文用原子力显微镜( a f m l 8 东南火学博上论文：第一章绪论 对胶原蛋白修饰的载体表面进行了表征，该工作对细胞微阵列芯片和生物相容 性材料的研究和运用具有较好的参考价值。 我们固定超螺旋质粒d n a 和九一d n a 在3 - a m i n o p r o p y l t r i e t h o x y s i l a n e ( a p t e s ) 修饰过的云母上，通过改变p h 值来将它们的构象变为环状和拉直线状。 本文的工作不仅提供了在固相载面上对d n a 分子构象的详细了解，而且还阐述 了原子力显微镜( a f m ) 图像技术能作为一个强有力的工具来研究d n a 分子在 不同p h 值云母上的构象变化。 我们直接用原子力显微镜( a f m ) 观测出d n a 大分子同两种小分子，长春 新碱和阿司匹林相互作用的图像，研究、探讨两种小分子诱导d n a 分子大片 段，形成的不同结构变化和构象转变，以及这两种小分子同d n a 分子大片段 不同的结合效应和不同的作用过程。本文的工作对小分子引起不同的d n a 分 子结构变化和构象转变提供了一种新颖的表征手段，迸一步用实验方法说明 原子力显微镜( a f m ) 作为一种图像分析技术在小分子同d n a 大分子相互作用 的研究中可发挥较大的作用和其它仪器设备无法比拟的直观、清晰的优势。 我们用原子力显微镜( a f m ) 获取了e c o r l 甲基化酶同d n a 双链结合体的 三维形貌图像，图像不仅提供了一个生物样品二维的信息，而且也有力地提 供了三维的高度信息。从原子力显微镜( a f m ) 获取的图像，我们通过测量并 推论出一个e c o r l 甲基化酶作为一个单体结合在d n a 双链的一条链上。同时， 本文的工作显示原子力显微镜( a f m ) 可在研究d n a 和蛋白质相互关系方面发 挥重要作用。 1 1 0 参考文献 a 1 l i s o nd p ，k e r p e rp s ，d o k t y e zm j ，s p a i nj a ，m o d r i c hp l a r i m e r f w ，t h u n d a tt ，w a r m a c kr j ( 1 9 9 6 ) d i r e c ta t o m i cf o r c em i c r o s c o d e i m a g i n go fe c o r le n d o n u e l e a s es i t es p e c i f i c a l l yb o u n dt op l a s m i dd n a m o l e c u l e s p r o c n a t l a c a d s c i u s a 9 3 ，8 8 2 6 8 8 2 9 a 1j i s o n d - p ，k e r p e rp s ，d o k t y c zm j ，t h u n d a tt ，m o d r i c hp ，l a r i m e r 9 东南大学博士论文：第一章绪论 f w ，j o h n s o nd k ，h o y tp r ，m u c e n s k im l ，w a r m a c kr j ( 1 9 9 7 ) m a p p i n gi n d i v i d u a lc o s m i dd n a sb yd i r e c ta f mi m a g i n g g e n o m i c s 4 1 ， 3 7 9 3 8 4 b e r g et ，j e n k i n sn s ，h o p k i r kr b ，w a r i n gm j ，e d w a r d s o nj m h e n d e r s o nr m ( 2 0 0 2 ) s t r u c t u r a lp e r t u r b a t i o n si nd n ac a u s e db y b i s - i n t e r c a l a t i o no fd i t e r c a l i n i u mv i s u a l i z e d b y a t o m i cf o r c e m i c r o s c o p y n u c l e i ca c i dr e s 3 0 ，2 9 8 0 2 9 8 6 b e z a n i l l i am ，d r a k eb ，n u d l e re k a s h l e vm ，h a n s m ap k ，h a n s m ah g ( 1 9 9 4 ) m o t i o na n de n z y m a t i cd e g r a d a t i o no fd n ai nt h ea t o m i cf o r c e m i c r o s c o p e b i o p h y s j 6 7 ，2 4 5 4 2 4 5 9 b i n