（皮革化学与工程专业论文）制革浸水酶制剂的研制及其应用.pdf

制革浸水酶制剂的研制及其应用 摘要 污染严重已成为制约我国制革工业可持续发展的最主要问题，只有在制 革过程中采用清洁技术才能改变制革污染严重的现状。针对常规浸水方法污 染严重，工艺时间长且目前国内的浸水酶制剂依赖进口等问题，依据浸水的 目的和酶的作用原理，本研究提出了采用多种酶制剂复配研制浸水酶制剂的 方法，以消除常规浸水方法产生的污染严重、工艺时间长等缺陷。 在本论文中，通过分析浸水液中的蛋白质吸光度、羟脯氨酸吸光度、生 皮的回软程度、黄心程度以及浸水后生皮的含水量等指标来确定蛋白酶在浸 水工序中的合适用量，以及不同蛋白酶的应用性能，筛选出合适蛋白酶；将 筛选出来的两种蛋白酶混合后在浸水工序中应用，采用单因素实验来确定两 种蛋白酶混合使用时的最佳配比和使用p h 值；由脱脂效率随脂肪酶用量和 种类的变化来确定浸水时的脂肪酶用量以及合适的脂肪酶种类；通过考察浸 水液中的蛋白质吸光度和羟脯氨酸吸光度等指标来确定浸水时合适的淀粉 酶用量和淀粉酶种类；实验中也考察了各种浸水助剂对酶制剂的影响以及浸 水酶制剂各组分间的配伍性能；最后将自制的浸水酶制剂应用于浸水工序 中，与其它浸水酶制剂作比较，并在工厂中进行小试实验，通过多媒体显微 镜观察浸水后的生皮的微观变化，通过氨基酸分析仪分析浸水液的蛋白质总 量和氨基酸组成。 实验结果表明，浸水时合适的蛋白酶和脂肪酶用量分别为2 0 p g 皮和 1 0 吨皮；从酶制剂的价格、是否易得等方面考虑，本论文将中性蛋白酶2 、 碱性蛋白酶2 和碱性脂肪酶最为最后的筛选结果；当中性蛋白酶2 占蛋白酶 总量的6 0 ，碱性蛋白酶2 占蛋白酶总量的4 0 ，浸水p h 为9 5 时，可以 使蛋白酶在使用性能上得到提高；淀粉酶浸水时，浸水液中的蛋白质吸光度 较小，但是羟脯氨酸的吸光度却很大，说明淀粉酶对生皮胶原的水解能力较 强，不适合用于浸水工序，因此在复配浸水酶制剂时不加入淀粉酶；当浸水 助剂的用量较低时对酶制的活力影响较小；随着用量的增加，阴离子助剂对 酶制剂的抑制作用增强，而非离子和阳离子表面活性剂酶制剂的活力影响较 小，甚至对酶活力有一定的促进作用；浸水酶制剂各组分间具有良好的配伍 性；自制的浸水酶制剂在对生皮间质蛋白的水解能力、生皮的回水能力等应 用性能上接近于对比浸水酶制剂，有的指标甚至更好，但有需要改进的地方； 通过对浸水后生皮的切片观察可以发现自制的浸水酶制剂可以使生皮的脂 肪物质得到部分水解，并对生皮的弹性纤维有一定的作用。 本论文采用了多种酶制剂和其它物质复配后得到一种浸水酶制剂，它可 以降低浸水时表面活性剂的用量、缩短浸水时间、提高浸水效果，是一种广 泛应用前景的浸水酶制剂；在本论文中，通过多种指标的检测方法来考察酶 制剂的应用性能，为如何考察酶制剂在制革上的应用性能提供了一定的参考 价值。 关键词：蛋白酶，脂肪酶，淀粉酶，浸水，酶制剂，应用 i l t h ep r e p a ra t i o na n da p p l i c a t i o n o fe n z y m ei nl e a t h e rs o a l ( i n g a b s t r a c t s e r i o u sp o l l u t i o ni st h ec h a r a c t e ro fl e a t h e rp r o c e s s i n g ，a n dw h i c hh a s r e s t r i c t e dt h es u s t a i n a b l ed e v e l o p m e n to fl e a t h e ri n d u s t r y o n l yt h ec l e a n t e c h n o l o g yc a nc h a n g et h ea c t u a l i t yo fs e r i o u sp o l l u t i o ni n l e a t h e rp r o c e s s i n g t h em e t h o do fp r e p a r i n gak i n do fe n z y m a t i cs o a k i n ga g e n tw i t hm u l t i - e n z y m e s w h i c hw a sa c c o r d i n ga st h ei n t e n t i o na n dp r i n c i p l eo fl e a t h e rs o a k i n gw a sp u t f o r w a r di nt h i sp a p e r i no r d e rt oc h a n g et h es h o r t c o m i n g so ft r a d i t i o n a ls o a k i n g m e t h o d ，s u c ha sp o l l u t i o n ，t i m ea n d s oo n i nt h i sp a p e r , t h ed o s a g ea n dk i n d so fp r o t e a s ei nl e a t h e rs o a k i n gw a s a s c e r t a i nb yt e s t i n gp r o t e i nc o n t e n t ，h y d r o x y p r o l i n ec o n t e n ti nt h ew a s t el i q u o r o fs o a k i n g ，t h ee x t e n to fs o f t n e s sa n dt h ee x t e n to fy e l l o ws t r e a kw e r ea l s ot e s t e d t h es e l e c t e dp r o t e a s e sw e r em i x e da n du s e di nl e a t h e rs o a k i n g t h eb e s t p r o p o r t i o na n du s i n gp h w e r ee n s u r e d t h ed o s a g ea n dk i n do fl i p a s ei nl e a t h e r s o a k i n gw a sc o n f i r m e db y t e s tt h ed e g r e a s i n ge f f i c i e n c yo fl i p a s e t h ed o s a g eo f a m y l a s e i n s o a k i n g w a s a n a l y z e db yc h e c k i n g t h e p r o t e i n c o n t e n ta n d h y d r o x y p r o l i n ec o n t e n ti nt h ew a s t el i q u o r s o m ea g e n t sw e r ea d d e di n t ot h e r e a c t i o ns y s t e mo fm e n s u r a t i n gt h eu n i t so fp r o t e a s e sa n dl i p a s ei no r d e rt os a w a b o u tt h ei n f l u e n c ef r o ms o a k i n ga g e n t st oe n z y m e s l a s tt h es o a k i n ge n z y m e w a sm a d ea n dw a su s e di nl e a t h e rs o a k i n g t h ed i f f e r e n c e sb e t w e e ne n z y m e si n s o a k i n g w e r e c o m p a r e d t h e m i c r o c o s m i c o b s e r v i n g ，p r o t e i nc o n t e n t ， h y d r o x y p r o l i n ec o n t e n ta n do t h e ri n d e xw e r ea l s oi n s p e c t e d t h er e s u l t so ft h i s p a p e rc o u l db eg o t t e na sf o l l o w s t h ed o s a g eo fp r o t e a s ea n dl i p a s ei ns o a k i n g w e r e2 0a n d10u n i t sp e rg r a ms k i n z h o n g x i n g2p r o t e a s e j i a n x i n g2p r o t e a s e a n da l k a l i n e - l i p a s ew e r et h el a s to u t c o m ec o n c e r n e dt h ep r i c ea n dc o n v e n i e n c e s o fe n z y m e s w h e nt h ep r o p o r t i o no fz h o n g x i n g2p r o t e a s ea n dj i a n x i n g2 p r o t e a s ew a s3t o2a n d t h eu s i n gp hw a s9 5 ，b e t t e rp e r f o r m a n c ec o u l db eg o t t e n t h ep r o t e i nc o n t e n tw a sn o ts ol a r g eb u tt h eh y d r o x y p r o l i n ec o n t e n tw a sl a r g e r t h a np r o t e a s e s ，s oa m y l a s ew a sn o tas u i t a b l ee n z y m ei nl e a t h e rs o a k i n g s o a k i n g a g e n t s h a dal i t t l ei n f l u e n c eo n e n z y m e sw h e nt h ed o s a g ew a s s m a l l 1 i i a n i o n - a g e n t sa f f e c t e dt h eu n i t so fe n z y m el a r g e l yi ft h ed o s a g ew a sa d d e d t h e s o a k i n ga g e n t ss u c ha sn o n - i o na n dp o s i t i v ei o na g e n th a dl i t t l ei n f l u e n c eo n e n z y m e s ，w h i c h e v e nc o u l da d v a n c et h ef u n c t i o no f e n z y m e s t h es e l f - r e g u l a t i n g e n z y m a t i cs o a k i n ga g e n th a dab e t t e rb e h a v et h a nc o n t r a s te n z y m a t i ca g e n ti n h y d r o l y z i n gt h ep r o t e i na n dt h ef a ti ns k i n b u tt h ea p p l i c a t i o np e r f o r m a n c en e e d t ob ee n h a n c e d t h es t r e t c hf i b e rw a sp a r t i a lh y d r o l y z e da r e rt h es e l f - r e g u l a t i n g e n z y m a t i cs o a k i n ga g e n tw a su s e di nl e a t h e rs o a k i n g i nt h i sp a p e r , ab n do fs e l f - r e g u l a t i n ge n z y m a t i cs o a k i n ga g e n tw a sm a d e u s i n gs o m e l ( i n do f e n z y m e s w h i c hh a daw e l la p p l i c a t i o nf o r e g r o u n di nl e a t h e r m a k i n g t h es e l f - r e g u l a t i n ge n z y m a t i cs o a k i n ga g e n tc o u l dr e d u c et h ed o s a g eo f s u r f a c t a n t ，s h o r t e nt h et i m eo fs o a k i n g ，a n dc o u l dr e c e d e dt h ee x t e n to fp o l l u t i o n i nl e a t h e rs o a k i n g i nt h i sp a p e r , s o m em e t h o d so fi n s p e c t i n gt h ea p p l i c a t i o n p e r f o r m a n c eo fe n z y m e sw e r ei n t r o d u c e d ，w h i c hp r o v i d e ds o m er e f e r e n c ei nt h e e n z y m ea p p l i c a t i o ni nl e a t h e rm a k i n g k e y w o r d s ：p r o t e a s e ，l i p a s e ，a m y l a s e ，s o a k i n g ，p r e p a r a t i o n ，a p p l i c a t i o n i v 些簦坠墼墅堂堡墼幽 1 日u 舌 1 1 酶 酶是由活细胞产生的、具有催化作用的蛋白质。任何生物体( 包括细胞) 要生长、发 育、繁殖及进行复杂的新陈代谢，需要几千种化学反应，正是由于酶的参与，使得这些 反应可以在常温常压下进行【l j 。 酶作为生物催化剂具有以下特点【2 】： 反应通常在常温下进行； 反应一般在溶液中进行； 反应要求的p h 值通常在中性附近； 具有高度专一性：这就是说，一种酶只能作用于一种底物，或一类分子结构相似的 底物，促使底物进行一定的化学反应，产生一定的反应产物； 反应在酶浓度较低时就可以进行； 通常可以获得较高的反应速度：酶的催化能力远远超过化学催化剂。酶的中间产物 学说认为：酶在催化某一底物时，先与底物结合成一种不稳定的中间产物。这种中间产 物极为活泼，很容易发生化学反应而变成反应物； 对哺乳动物的毒性很小。 酶的催化作用，受到温度、p h 和某些化合物等因素的影响。在一定的温度范围( o 4 0 c ) p q ，酶的催化作用速度随着温度的升高而加快。一般地说，温度每升高1 0 c ，反 应速度大约提高1 倍。但是，超过6 0 c ，绝大多数的酶就会失去活性。酶对环境中的p h 十分敏感。酶只有在一定的p h 范围内才能表现出活性，超过这个范围，酶就失活了。 即使在这个有限的p h 范围内，酶的活性也要随着环境中p h 的变动而有所不同。有些物 质( 大都是离子或简单的有机化合物) ，能够增强酶的活性，这些物质叫做酶的激活剂。 有些物质能够抑制酶的活性，这类物质叫做酶的抑制剂。 酶的种类繁多，来源广泛，可以从动植物的组织中提取，也可以利用微生物分泌、 发酵产生。目前，工业用酶主要来源于微生物，如各种细菌和霉菌等。 1 2 酶在制革工业上的应用及其研究进展 酶在制革中的应用由来已久，历史上主要用于脱毛和软化。早在2 0 0 0 多年前，就有 用粪便的浸液和鸽粪对生皮进行脱毛的记载。早期曾使用过的“发汗法”脱毛也是利用 在温暖潮湿的环境中，皮上的微生物在生长繁殖过程中分泌的蛋白酶的作用而产生脱毛 效果，这两种方法是现代酶法脱毛的前身。1 9 0 7 年，德国r o l u na n dh a a s 公司的创始人 o t t er o h m 首次将胰蛋白酶用于软化皮革，被认为是酶制剂在制革中使用的一个里程碑。 我国对酶的研究是从2 0 世纪5 0 年代开始的。1 9 7 8 年上海新兴制革厂率先使用3 9 4 2 蛋 白酶进行脱毛，获得了成功。2 0 世纪后半叶是我国酶法脱毛应用研究的鼎盛时期。之后， 随着其它酶制剂的不断被开发、应用，使制革生产中酶的使用更容易控制、更趋科学化 3 - s 。 酶制剂在制革生产中的主要应用有： 1 2 1 酶浸水 酶浸水方法就是以酶制剂作为主要浸水助剂并加入其它助剂及防腐剂的浸水方法。 浸水酶主要是细菌或霉菌蛋白酶，一般为白色或灰棕色粉末，也有的为琥珀色液体。 制革专用浸水酶制剂在较低温度( 2 0 一2 5 ) 下对皮纤维间质蛋白具有良好的催化水解作 用，而对胶原纤维几乎没有催化水解作用或作用很小。在浸水时，先经过预浸水使皮初 步回软，使间质蛋白初步润胀，然后加入浸水酶。浸水酶可催化水解皮中的间质蛋白， 特别是糖蛋白，使其很快降解，然后大部分被除去，使皮快速并充分地恢复到鲜皮的状 态。常用的浸水酶作用的最适p h 值范围为8 o 1 1 0 。浸水时一般将平衡后的p h 值控 制在9 o 一9 5 ，这样不仅可使酶发挥较大的活力，而且可增加水对间质蛋白的溶解，也 可促进胶原纤维的充水。此外，也有蛋白酶在中性条件下浸水的报道【6 j 。 此外也有人研究采用胰酶和脂肪酶作为浸水助剂。脂肪酶能够起到水解脂肪，促进 水渗透的作用1 7 】。 1 2 2 酶脱脂 酶法脱脂主要是利用脂肪酶对油脂的水解作用，生成脂肪酸和甘油。然后通过乳化 方法或其它方法将其从皮中除去。酶法脱脂具有以下优点：可减少或消除表面活性剂的 使用：脱脂均匀，促进染料吸收；脱脂废液中油脂易分离回收；可改善绒面革的质量； 易于生产防水革和低雾化值的汽车座垫革。 在脱脂的时候，对于游离脂肪，脂肪酶可以直接和其反应，将脂肪水解。如果遇到 脂肪细胞，因为有细胞膜的存在，就约束了酶与底物之间的反应。有两个方法可以解决 这个问题：一是在特定情况下酶可以渗透到被细胞膜包围的脂肪细胞中，发生界面催化 反应，将脂肪颗粒水解成脂肪酸和甘油酯中间体。在二价钙离子存在的情况下，脂肪酸 被皂化成钙盐从水解部位迁移走，这样使脂肪颗粒不断的被水解掉。二是借助外力破坏 脂肪细胞膜，使脂肪暴露在脂肪酶面前进行脱脂。这种脱脂方法通常用蛋白酶来破坏脂 肪细胞膜，使甘油三酯释放出来。在这个过程中蛋白酶和脂肪酶发挥了协同作用，加速 了脱脂过程。 由于脂肪酶仅能对脂肪起到催化水解作用，不能将水解产物从皮中除去，并且对脂 质中的其它成分也没有去除作用，所以单独使用脂肪酶并不能起到明显的脱脂作用，尤 其对绵羊皮和猪皮这样的多脂皮起不到主脱脂的作用。因此，目前脂肪酶主要用于非多 脂皮的浸水、浸灰工序及蓝湿革的辅助性脱脂。另外，脂肪细胞膜的主要成分是磷脂和 蛋白质，由于脂肪酶对细胞膜无作用，为进一步加强其脱脂效果，可用磷脂酶和蛋白酶 笪墅坠墼墅堂型垫基塑 来分别处理，然后用脂肪酶处理可以达到更理想的效果【8 0 ”。 1 2 3 酶脱毛 目前，酶脱毛方法主要有滚酶堆置酶脱毛和加温有浴转鼓酶脱毛。酶脱毛时，表皮 层随着酶的处理慢慢脱落，一直延伸到毛孔周围，这样当表皮层脱落完之后毛就松动了。 这个过程相当于蛋白酶破坏了毛与真皮之间的间质。酶主要从原料皮肉面渗入皮中，因 此脱毛前原料皮的预处理状态对脱毛效果影响较大。猪皮油脂含量高，在肉面皮下组织 中堆积着大量的脂肪细胞，去肉不尽会使酶液的渗透十分困难。所以猪皮酶脱毛前应加 强去肉脱脂操作。加温有浴转鼓酶脱毛之前，猪皮常进行碱膨胀，脱碱后再进行酶脱毛。 因为碱膨胀使皮蛋白质变性，能提高酶脱毛能力【1 2 。 传统工艺采用的蛋白酶质量不稳定，加之纯度低，专一性差，酶系组分多，作用复 杂，在酶脱毛时，通常毛不能被完全去除。尽管酶脱毛仍存在一些问题，但从环保角度 来讲，酶脱毛有广泛的应用前景。随着专一性强、脱毛效果好、对生皮胶原损害小的高 选择性蛋白酶的研究，酶脱毛必将得到更广泛的应用1 2 0 - 2 2 1 。 1 2 4 酶浸灰 酶浸灰可催化水解硫酸皮肤素中多糖侧链与蛋白核之间的共价键，使其断裂，促进 硫酸皮肤素的溶解，使裸皮的内层和粒面层纤维都得到充分的松散。酶在浸灰工序中作 用是：促进皮纤维的松散，减少其它材料的用量，减少污染，缩短浸灰时间，减少皱纹； 清洁粒面；增加革的柔软性和强度，增加得革率等瞄】。 浸灰时加入的酶通常为碱性蛋白酶，在p h 值8 1 2 间具有较大的活力。它主要是 对间质蛋白发生作用，对胶原纤维作用较弱。除了蛋白酶之外，国外也有采用淀粉酶进 行松散纤维的研究 2 4 - 2 5 l 。在条件控制适当的情况下，可使胶原纤维得到充分的松散，但 不会引起纤维强度的降低。在浸灰过程中一般将温度控制在2 5 - - 2 t c ，对预浸水时已发 现有溜毛和菌蚀的皮应特别谨慎或不采用酶浸灰，否则会引起松面或烂面 2 6 - 2 7 l 。 1 2 5 酶软化 酶软化是制革过程中不可缺少的一个工序。一般可分为中性或弱碱性酶软化和酸性 酶软化【5 1 7 1 1 3 l 。 在酶软化时，酶首先要从皮外向皮内渗透并在皮内均匀分布，然后才能起到均匀软 化的作用。操作时，一般液比为1 o 一2 0 ，温度3 0 - - 3 7 c 。采用低温长时间软化时可将 温度控制在2 4 - - 2 6 。c 。在脱灰液中进行软化时，只需将酶直接加入脱灰液中。在另配的 软化液中软化时，需要在加入酶的同时也加入一定量的对酶有激活作用的缓冲剂，如铵 盐等。软化后应立即水洗降温，停止酶的作用。 胰酶是软化时最常用到的一种酶制剂，胰酶软化可使胶原纤维的编织结构得到一定 程度的松散。但若软化强度过大时，会引起裸皮松面，原纤维纤丝化，成革强度降低2 8 1 。 酸性酶软化是采用在酸性条件下具有较高活力的酶对裸皮或革进行软化的方法。软 化的p h 值为2 0 - - 6 0 。可在浸酸或去酸过程中对浸酸或去酸皮进行软化，也可在复鞣前 对蓝湿革进行软化。主要作为在前工序浸灰和软化不足时，对皮或革的一种补充软化方 法。脂肪酶 2 9 - 3 0 l 和胃蛋白酶也可用于软化，其作用的最佳p h 值为2 0 左右。 软化毛皮常用的酶制剂有1 3 9 8 、3 9 4 2 和3 3 5 0 等。由于这些酶制剂均有脱毛作用， 因而在工艺中要严格控制工艺条件，防止过度处理使皮毛脱落。一般软化到皮毛有松动 时即告完成。在软化过程中若出现掉毛现象，必须马上终止酶活，并将毛皮转入甲醛或 铬鞣液中加固毛根i j ”。 1 2 6 猪皮臀部包酶 猪皮是我国皮革工业的主要原料，猪皮制革的关键问题之一就是解决猪皮的部位差。 国内常用的方法是对猪皮臀部进行化学局部处理及臀部包灰或包酶。猪皮臀部包酶后， 成革臀部的柔软性，特别是起绒效果优于包灰法。猪皮臀部包酶通常在脱脂后或者片臀 部后进行。 目前猪皮臀部包酶主要使用1 3 9 8 蛋白酶。1 3 9 8 酶可以对猪皮臀部的胶原纤维有效 地分离，消除猪皮的部位差。据资料报道：目前市场上已有新的酶制剂，这种酶制剂可 使猪皮臀部的柔软性，起绒效果优于1 3 9 8 蛋白酶，且易控制【5 】【7 l 。 1 2 7 制革废料的酶处理 目前，关于酶对制革废料的处理已有较多的相关报道 3 4 - 4 1 。m m t a y l o r 等人对酶法 水解进行了系统的研究，认为在酶适宜的p h 、温度条件下，用酶液处理铬鞣革屑6 2 4 h ， 可以得到高质量的明胶和小分子水解产物。陈武勇等人也对氧化镁和碱性蛋白酶两步法 处理铬鞣革屑进行了研究，得出了在现有条件下用氧化镁和碱性蛋白酶两步法处理铬鞣 猪皮革革屑工艺的最佳方法。采用此工艺处理铬鞣革屑得到的明胶符合工业明胶q b 5 8 1 1 9 8 1 的标准。此工艺不需要大量的酸碱，能耗低，收率高，且氨基酸不被破坏。四川 大学的胡胜和李志强等人对酶法提取猪皮胶原进行了研究，认为用蛋白酶水解猪皮胶原， 作用条件温和，所需设备简单，可以减少环境污染。尤其重要的是，酶法水解产物分子 量的分布特点，使其有利于开发成高附加值的产品。王方国等人利用中性蛋白酶、碱性 蛋白酶及纤维素酶对羊皮制革下脚料进行了研究，认为酶法提取胶原优于传统的酸碱法， 并且时间快，效果好，污染少 4 2 - 4 5 1 。 1 2 8 酶制剂在制革工业上的应用前景 绿色环保是酶在制革工业中应用的鲜明特点。酶处理工艺作为生化技术在制革加工 中的应用具有广阔的发展前景m l 。酶技术在制革工业中的应用将会在以下几方面得到进 一步的发展： 改善酶制剂的性能：通过基因改性手段，使酶制剂具有良好的储藏稳定性、高的处 4 理效率、较宽的活性处理领域和更高的处理质量。 拓宽酶制剂的应用领域：研究开发新型酶制剂，拓宽酶制剂的应用领域。据有关资 料报道：利用酶既能分解肽键、又能产生新键的特点，可以开发酶法鞣革的新领域 4 7 - 4 8 】。 酶制剂的复配：通过多种功能酶制剂的复配以实现多道工艺的一浴处理，可以提高 加工效率，而且多种酶之间的协同作用，通常有利于酶性能的发挥。 在整个制革过程中，酶可以在制革准备工段中的浸水、脱脂、脱毛、浸灰以及软化 工序上得到应用。而制革准备工段也是整个制革过程中污染的主要来源之一，据统计： 在制革准备阶段，以牛皮为例，b o d 值为整个生产阶段的8 0 ，c o d 值为整个生产阶 段的7 0 ，盐量为8 5 ，固体悬浮物为6 0 。所以对准备工段污染的控制尤为重要【4 9 。5 2 1 。 在准备工段中，最先可以用到酶制剂的是浸水工序。 1 3 常规浸水与酶浸水 1 3 1 浸水的目的 浸水的目的是使失水的原皮充分吸收水分，达到鲜皮状态，为后工序的化学处理打 下良好的基础。另外，通过浸水操作，可以清除生皮的污物，部分除去皮内的脂肪和纤 维间质( 白蛋白、球蛋白、类粘蛋白、蛋白多糖等) 。油脂的去除，可以进一步促进水及 其它材料向皮内渗透；纤维间质的去除，可以使粘接在一起的胶原纤维松散开，有利于 水的渗透和后工序材料对胶原纤维的均匀作用，使成革柔软、丰满5 】【7 】。 7 j 1 3 2 无酶浸水方法对皮革性能的影响及其缺陷 无酶浸水方法通常是在浸水时加入大量的碱性物质和表面活性剂来完成使生皮回鲜 的工作。常规浸水的缺陷是时间长，污染较严重。 如果想改变浸水工序中污染严重的问题，可以通过以下几个办法来实现| 5 3 - 5 4 l ： 在一个转笼内先除去盐粒： 减少浸水时间； 浸水温度不超过2 5 2 6 ： 在主浸水之前先去肉，特别是多脂皮： 把表面活性剂的用量减至最少； 降低液比； 如果预清洁工作做的适当，可把主浸水废液用于浸灰过程。 如果在浸水工序中采用酶浸水，可以达到减少浸水时间、减少表面活性剂的使用量 以及减少水的用量的目的，因此采用酶浸水可以减轻浸水工序中污染严重的问题。 1 3 3 酶作为浸水助剂的优点 酶浸水过程的主要优点是，能去除原料皮中大部分纤维间质；能较大程度疏松皮垢、 减少粒面皱纹：能大大缩短浸水时间；增加浸水的均匀性；能够改善浸灰化工材料的渗 鬯塑丝些堡些雀 透和膨胀作用；可以减少成革血管痕和肥纹的产生【1 5 1 。因而可以为后工序的处理提供更 理想的条件。 1 3 4 酶浸水的国内外发展趋势 近年来加入酶制剂来促进浸水已经较普遍，所用的酶主要是细菌和霉菌蛋白酶，也 有用胰酶或糖酶的研究，浸水中也可以使用脂肪酶f 5 5 】。脂肪酶的作用是水解脂肪，促进 水的渗透。 国外在较早时候就开始研制与开发制革专用酶制剂，他们根据制革的需要，对酶进 行适当的改性，降低其活性，增加其渗透性和在皮内作用的均匀性，拓宽其使用的p h 值和温度范围，使酶在较低的温度下就有较好的作用，提高了酶作用的效果和操作的安 全性。目前国外已有浸水专用酶制剂，如n o w o 公司的n o w o l a s es g 、德瑞公司的 e r h a z y mc 、希伦赛勒赫公司的a g i n t a np r 、汤普勒公司的t r u p ym s 等。另外，科莱恩 公司也有浸水酶制剂的相关产品。 尽管国内制革工作者早已认识到浸水酶制剂的优越性，但皮革浸水酶制剂的研究、 开发工作却很少。上世纪九十年代初缪建【5 6 】研究了蛋白酶在山羊皮浸水中的应用，九十 年代后期西北轻工业学院的卢行芳【5 7 1 研究了2 7 0 9 蛋白酶在黄牛皮浸水中的应用。但采 用多酶体系进行助浸水的报道则不是很多。国内用于浸水的酶制剂几乎是空白，只有少 量用于其它制革工序的酶制剂，需大量进口。 目前制革浸水助剂的发展趋势主要是：新开发的浸水助剂产品不会造成新的污染， 能被生物降解：根据浸水工序的需要，开发多功能的酶浸水助剂，既具有良好的回湿性， 又具有乳化、分散纤维、去除皮内非胶原蛋白以及杀菌防腐等综合性能。 1 4 课题的研究出发点、指导思想及主要研究内容 1 4 1 课题的研究出发点 从上世纪7 0 年代以来，发达国家将污染严重的制革行业移向包括中国在内的发展中 国家。这种形势对我国来说，既是挑战也是机遇。在制革工业不断发展的同时，开发和 应用那些既对环境无污染或少污染，又能够节能、省时等降低生产成本的新材料、新工 艺和新技术，是制革工业可持续发展的关键，也是目前国内外研究的热点之一【1 1 】 5 8 - s 9 。 生物工程是2 l 世纪最有发展前景的学科之一，而酶工程是生物工程中的重要组成部分。 酶是最具有应用潜力、最有可能改变皮革加工过程中污染严重的状况及促进制革过程实 现清洁化生产的材料之一【6 0 - 6 1 。因此酶制剂在皮革工业中的应用研究迫在眉睫。从酶制 剂本身的优势和制革工业发展的要求来看，将生物技术和传统的制革工业二者结合起来， 研制新型皮革酶制剂必将推动制革工业的快速发展。 国外一直在开展制革浸水酶制剂的应用研究并致力于浸水酶制剂的开发。俄罗斯的 k o c h e t o v a , s p ：研究并申请了中性蛋白酶在制革浸水上的专利【1 4 】：西班牙的r p a l o p 等 6 人【15 1 、英国制革技术中心的v l a d d y 等人【1 8 1 分别研究了脂肪酶和蛋白酶在浸水时的脱 脂作用；英国的m t a z o n 等人【6 2 删研究了纤维素复合酶在浸水时去除原皮污物上的应用； 美国农业部东部地区研究中心【6 5 删和印度制革研究中心【2 0 】 3 2 - 3 3 等研究机构也在进行制 革酶技术的研究工作。目前国外已有浸水专用酶制剂。酶浸水在国内研究较少，浸水酶 制剂无产品问世。因此，我们如果能够根据制革浸水工序中的具体工艺要求研制出皮革 浸水酶制剂，将会改变目前我国主要依赖国外的制革专用酶制剂的现状，填补皮革浸水 酶制剂的国内空白。 本研究将采用多种酶制剂种类进行复配，制备浸水酶制剂，将在减少化工材料使用 量、降低环境污染程度、缩短浸水时间、提高制革面积产率等方面上起到一定作用：在 复配过程中通过对酶制剂应用前后浸水液的分析以及其它指标的检测来考察酶制剂的应 用前景，为酶制剂在制革上应用提供一定的参考价值。因此，本论文具有较大的现实意 义。 1 ：4 2 课题的指导思想 本研究的主要指导思想是：从市场上易得的工业用酶中选取不同的酶种类，应用于 制革浸水工序中，筛选出适合用于制革浸水工序的酶种类；通过测定酶活力的前后变化 考察制革浸水工序中常用化料对酶性能的影响；运用蛋白质的显色反应和氨基酸分析方 法测定浸水废液中的蛋白质含量和羟脯氨酸含量以考察不同酶种类的应用效果；采用单 因素实验方法得出最优的酶复配方案；采用多媒体显微镜等手段来表征酶处理后生皮微 观结构的变化。 1 4 3 课题的研究内容 研究内容主要包含以下几个部分： 蛋白酶的筛选：探索浸水时蛋白酶的用量范围以及浸水终点的判断：将不同种类的 蛋白酶用于浸水工序中，通过检测不同蛋白酶在浸水工序中的应用性能来筛选适合用于 浸水的酶制剂种类。 蛋白酶的复配：将筛选出来的两种蛋白酶混合后使用，通过两种蛋白酶的配比和使 用p h 单因素实验来确定合适的蛋白酶配比和使用时的p h 值。 脂肪酶的筛选：将脂肪酶按照一定的用量应用于浸水工序中，通过检测脂肪酶的脱 脂效率与脂肪酶用量之间的关系确定合适的脂肪酶用量；按照同样的检测方法确定适合 用于浸水工序中的脂肪酶种类，筛选脂肪酶；考察蛋白酶对脂肪酶的影响，为最后的浸 水酶制剂的制备提供依据。 淀粉酶的筛选：将淀粉酶应用于浸水工序中，通过考察浸水液中的蛋白质含量和羟 脯氨酸含量等指标来确定浸水时合适的淀粉酶用量。并按照同样的检测方法筛选出合适 的淀粉酶种类；同时考察蛋白酶对淀粉酶的影响。 笪墅邕垄塑鐾墅墼 浸水助剂对酶制剂的影响：将浸水工序中用到的中性盐、表面活性剂和杀菌防腐剂 按照一定的浓度加入到酶制剂中，根据酶活力的变化来考察浸水助剂对酶的影响，研究 浸水助剂与酶制剂的配伍性能。 自制的浸水酶制剂的应用：将自制的浸水酶制剂应用于浸水工序中，并与其它浸水 酶制剂作比较；采用多媒体显微镜观察浸水后生皮的微观结构；采用氨基酸分析仪分析 浸水液的蛋白质总量和氨基酸组成。 丝墼坠墅塑堕型垫墅 2 实验部分 2 1 主要仪器和试剂 2 1 1 主要仪器 7 2 2 型分光光度计上海精密科学仪器有限公司 d j d 一0 3 5 0 型五滚鼓转鼓江苏无锡东北塘矿山机械厂 可调式移液器 热电( 上海) 仪器有限公司 d h g 1 0 1 a - 1 b 型电热恒温干燥箱上海经济区沈荡中新电器厂 t d a - - 8 0 0 2 型电热恒温水浴锅北京化玻联医疗器械有限公司 p h - 2 5 数字式p h 计上海日岛科学仪器有限公司 j j 一2 组织捣碎匀浆机 金坛市金峰仪器有限公司 球形脂肪萃取器 多媒体显微镜上海复申生物有限公司 1 2 1m b 型氨基酸分析仪 贝克曼公司 2 7 0 0 - f r i g o c u t 切片机 r e i c h e r t - j u n g 公司 2 1 2 主要试剂 黄牛盐湿皮西安友谊制革厂 1 3 9 8 蛋白酶海宁市金潮实业有限公司 碱性蛋白酶1陕西酶工程研究所 碱性蛋白酶2 陕西酶工程研究所 中性蛋白酶1 陕西酶工程研究所 中性蛋白酶2 陕西酶工程研究所 中性脂肪酶海宁市金潮实业有限公司 碱性脂肪酶 深圳市绿微康生物工程有限公司 对二甲氨基苯甲醛分析纯天津市科密欧化学试剂开发中心 高氯酸 分析纯天津市东方化工厂 氯胺- t 分析纯天津市科密欧化学试剂开发中心 三氯乙酸 分析纯上海山浦化工有限公司 干酪素 化学纯中国医药公司北京公司 酪氨酸 分析纯西安化学试剂厂 福林试剂 自制 聚乙烯醇 分析纯福建纺织化纤集团有限公司 橄榄油 化学纯 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 磷酸二氢钾 分析纯 天津市天河化学试剂厂 9 磷酸氢二钠 邻苯二甲酸氢钾 无水乙醇 二氯甲烷 麦芽糖 3 。5 二硝基水杨酸 酒石酸钾钠 柠檬酸 柠檬酸钠 淀粉 浸水酶制剂s g 自制的浸水酶制剂 明胶 甲醛 2 2 蛋白酶的筛选 2 2 1 标准曲线的建立 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 西安化学试剂厂 北京市庆盛达化工技术有限公司 天津市富宇精细化工有限公司 天津化学试剂六厂 厦门星隆达化学试剂有限公司 上海忠化化工有限公司 杭州临安金龙化工有限公司 天津市化学试剂六厂 天津市百世化工有限公司 天津市化学试剂六厂 诺维信 自制 西安化学试剂厂 西安化学试剂厂 a 试剂的配制1 7 0 i 1 ) 福林试剂配制 在2 0 0 0 m l 磨口回流装置的烧瓶内，依次加入钨酸钠1 0 0 9 ，钼酸钠2 5 9 ，蒸馏水7 0 0 m l ， 8 5 的磷酸5 0 m l ，浓盐酸1 0 0 m l ，全部加好后装上冷凝器，以小火沸腾回流1 0 h ，取下 冷凝器后加入硫酸锂5 0 9 ，蒸馏水5 0 m l ，混匀后再加入溴水数滴，煮沸约1 5 m i n ，以除 去多余的溴，此时溶液呈黄色( 如仍有绿色则再加几滴溴水，再煮沸以除去过量的溴) 。 冷却后加蒸馏水将此液稀释到1 0 0 0 m l 。混合均匀用玻砂漏斗过滤，滤液应呈金黄色，贮 于棕色试剂瓶中，严防灰尘落入。本试剂可长期保存。使用时按l ：2 稀释。 2 ) 0 5 5 m o l l 碳酸钠溶液 称取无水碳酸钠5 8 3 9 ，溶于1 0 0 0 m l 蒸馏水中。 3 ) l o o g l 三氯醋酸溶液 称取三氯醋酸1 0 0 9 ，溶于1 0 0 0 m l 蒸馏水中。 4 ) 缓冲溶液 ( 1 ) 0 0 2 m o l l 磷酸缓冲溶液( p h 7 2 1 a 液o 2 m o l l n a h 2 p 0 4 2 1 - 1 2 0 溶液：称取n a h 2 p 0 4 2 h 2 0 3 1 2 9 ，以水定容到1 0 0 0 m l 。 b 液0 2 m o l l n a 2 h p 0 4 - 1 2 h 2 0 溶液：称取n a 2 h p 0 4 1 2 i - t 2 0 7 1 7 9 ，以水定容至 1 0 0 0 m l 。 取a 溶液2 8 “，b 液7 2 m 1 。 ( 2 ) 硼砂氢氧化钠缓冲液( p h 值1 0 0 1 a 液：称取硼砂1 9 9 ，以水定容至1 0 0 0 m l 。 b 液：称取氢氧化钠8 9 ，以水定容至1 0 0 0 m l 。 取a 液5 0 m l ，b 液4 3 m l ，以水定容至2 0 0 m l 。 测定时只需根据酶种类的不同，选配上述缓冲液之一即可。 b 标准曲线的制作 为了确定酪氨酸量与吸光度( o d 值) 的对应关系，需要事先以不同浓度的酪氨酸标准 溶液与福林试剂反应显色，测定其吸光度，绘出标准曲线。 1 ) 1 0 0 1 a g m l 酪氨酸标准溶液的配制 准确称取在1 0 5 。c 烘干至恒重的酪氨酸0 1 0 0 0 9 ，用o 1 m o l l h c l 溶液溶解，移入 1 0 0 m l 容量瓶中，并以o 1 m o l l h c l 稀释至标线，即得l m g m l 的酪氨酸溶液。保存于冰 箱中，用时吸取1 0 m l 此液于1 0 0 m l 容量瓶中，以0 1 m o l l h c l 稀释至标线，即得1 0 0 9 9 m l 酪氨酸的标准溶液。 2 ) 不同浓度的酪氨酸标准溶液的配制 取干燥试管7 支，编号后按表所示的量，用刻度移液管加入酪氨酸标准溶液和蒸馏 水，即配成六种不同浓度的酪氨酸溶液的标准系列，见表2 1 。 表2 - 1 酪氨酸标准系列的制备 t a b 2 - 1p r e p a r a t i o no f s t a n d a r ds e r i e sl i q u o ro f t y r o s i n 3 ) 测定 吸取上述不同浓度的酪氨酸标准溶液各l i n l ，于干燥试管中( 每种浓度都做平行实 验) ，分别加入o 5 5 m o l l 碳酸钠5 m l 和福林试剂l m l ，摇匀，再置4 0 。c 恒温水浴中，显 色1 0 m i n 。在分光光度计上用6 8 0 n m 波长，以零号管中的溶液( 即酪氨酸的浓度为零) 作 零点，测定各管中溶液的吸光度( 平行两份之差不得超过0 0 1 ) 。以吸光度值为纵坐标， 酪氨酸浓度( i _ t g m 1 ) 为横坐标，作一标准曲线，此线应该通过零点。 2 2 2 蛋白酶活力的测定 a 样液制备及测定 1 ) 底物的制各1 7 0 l 测定中性、碱性蛋白酶活力可配制2 酪素溶液。称取酪素2 9 ，按不同酶种加适量 0 5 m o l l 氢氧化钠溶液湿润片刻，再加与待测酶种相应的少许缓冲溶液，在沸水浴中加 热到完全溶解，冷却后用精密p h 试纸检查。调节溶液的p h 值到该酶反应的最适p h 值， 然后用相应的缓冲溶液定容至l o o m l ，置于4 c 的冰箱中保存，超过5 天应另行配制。 2 ) 待测酶液的制备 准确称取酶粉2 9 ，以少量与该酶种相应的缓冲溶液溶解，并用玻棒捣研，将上层液 小心倾人l o o m l 容量瓶中，余渣部分加入上述缓冲液。如此反复捣研3 4 次，最后全 部移入容量瓶中，用上述缓冲溶液定容至标线，摇匀。根据酶的活力，吸出一定量，用 上述缓冲液稀释至适当倍数待用。 3 ) 测定步骤 将底物在4 0 c 恒温水浴中预热3 5 m i n ，取干燥试管3 支编号后加入待测酶液l m l 。 放入4 0 c 水浴中预热3 5 m i n 后，按表2 2 的顺序加入各种溶液。 加入三氯醋酸以后立即摇匀，在常温下放置5 m i n ，以干滤纸滤入干燥试管中，分别 吸取滤液l m l 于事先标好号的对照试管中，在加入0 0 5 m o l l 碳酸钠溶液5 m l ，福林试 剂l m l ，摇匀后置4 0 水浴中显色1 0 m i n ，以对照管为空白，在分光光度计( 或光电比色 计)