（遗传学专业论文）昆虫piwi蛋白及microrna的生物信息学预测与进化分析.pdf

中文摘要 摘要 p i w i 蛋白是a r g o n a u t e 蛋白家族的一个亚家族，它通过与一类跟精子发生有关的小 r n a 的相互作用来调控基因的表达。p i w i 蛋白参与干细胞的自我调控及精子的发生。对 p i w i 蛋白的研究有利于我们阐明该蛋白的生物学功能，也能促进对p i r n a ( p i w i i n t e r a c t i n gr n a ) 的了解。我们利用生物信息学同源搜索的方法在昆虫基因组中 搜索p i w i 的同源基因。利用e s t 延伸技术以及最新版本的g e n s c a n 软件预测基因的 结构，进一步拼接出基因的全长或部分e d n a 序列。通过比较基因结构，我们发现脊椎 动物和无脊椎动物中的p i w i 蛋白的外显子数目之间存在差异，哺乳动物的p i w i 基因含有 2 0 个外显子，而昆虫只有6 - 9 个。我们推测p i w i 蛋白在进化过程中可能发生了内含子丢 失或获得的事件。在所有预测的p i w i 1 i k e 蛋白中都发现了两个特征性的结构域：p a z 和 p i w i 结构域。使用m e m e 软件预测蛋白结构，结果获得了6 个保守的基序( m o t i f ) ，这 些基序中包含了一个三联体的催化位点“a s p - a s p h i s l y s ，这个催化位点是p i w i 蛋白 行使剪切活性时所必需的。通过r t - p c r 实验我们进一步验证了家蚕中s i w i l 和s i w i 2 蛋 白的表达。最后，对p i w i 蛋白家族做了系统进化分析，进化树结果显示无脊椎动物中的 p i w i 同源蛋白可以分为三个枝，其中昆虫的a 9 0 3 蛋白与哺乳动物p i w i 蛋白位于相邻进 化枝上。 刚刚测序结束的1 1 种果蝇的基因组为我们进一步分析p i w i 蛋白以及比较相近物种 之间的进化关系提供了很好的材料。果蝇p i w i 蛋白家族可分为三类：p i w i 、a u b 以及 a 9 0 3 。它们因参与一类跟精子发生有关的小r n a 的通路而引起广泛的关注。我们在之 前研究工作的基础上进一步分析了1 1 种果蝇基因组中的p i w i 蛋白，结果获得了3 3 个p i w i 的同源基因，并且发现果蝇的p i w i 和a u b 基因在基因组上相距2 0 k b 以内。利用最新版 本的g e n s c a n 软件预测基因结构，结果获得了2 2 个全长的e d n a 序列，而在我们之 前的工作中只拼接出6 个完整的o r f 。这2 2 个全长的基因主要集中在p i w i 和a u b 基因， 而a 9 0 3 基因因含有较长的内含子导致很难拼接出全长序列。基因结构比较发现，p i w i ( 1 2 8 4 b p ) 和a u b ( 8 4 0 b p ) 基因的第一个内含子的长度明显大于剩余的其它内含子的长 度( 矽咖f 平均为9 3 b p 和a u b 平均为5 4 b p ) 。而这种现象在哺乳动物中没有发现。另外发现 a 9 0 3 基因的内含子和外显子中分布着大量的重复序列。其中有四个果蝇的第三个内含子 中由于长末端重复序列( l t r ) 的插入而显示出很强的保守性。进化分析的结果跟之前 中文摘要 研究工作的结论一致，昆虫的a 9 0 3 基因与哺乳动物的p i w i 基因在进化树上位于相邻的 进化枝中。 m i c r o r n a s 删触) 是一类长度约2 2 n t 的内源性的非编码小r n a ，它通过与 a r g o n a u t e 蛋白家族中的a g o 亚家族结合去调控基因的表达，降解m r n a 或抑制翻译。 从家蚕的卵、幼虫、蛹和成虫四个龄期提取总的r n a 并利用s e q u e n c e b y - s y n t h e s i s ( s b s ) 的方法进行测序。本文利用生物信息学的方法和计算机编程的技术从家蚕的s b s 数据中 预测m i c r o r n a 基因。从家蚕四个时期样本中总计测序得到了2 ，2 2 7 ，9 3 0 个序列，其中 1 ，1 4 4 ，4 8 5 分布于1 7 到2 5 n t 范围内，得到相应的2 5 6 ，6 0 4 单一序列。有9 5 ，1 8 4 序列完全 匹配到家蚕的基因组中。利用生物信息学流程以及r n a f o l d 软件和t r i p l e t s v m 算法， 我们初步得到了3 , 7 5 0 个可能的m i e r o r n a 。利用r n i c r o r n a 芯片，我们验证有3 5 4 个 m i c r o r n a 是真实存在。基因组定位分析发现，s c a f f o l d 0 0 1 8 0 8 上连续分布了1 9 个成簇 分布的m i c r o r n a ，e s t 表达分析暗示着这些m i c r o r n a 是表达的。家蚕不同发育阶段的 m i c r o r n a 表达谱分析，发现有1 0 6 个m i c r o r n a 在家蚕发育中广泛表达，2 4 8 个 m i c r o r n a 是在卵和蛹高表达的，这暗示m i c r o r n a 在昆虫的胚胎和变态发育中起着重要 作用。通过i m p c r 实验，进一步验证了我们预测结果的可靠性。此外我们对人、小鼠、 线虫和已经公布基因组的几种昆虫进行同源比对，发现有很多m i c r o r n a 都是昆虫特有 的，利用这些m i c r o r n a 信息对完全变态的昆虫进行聚类分析，其结果与经典的分类学 亲缘关系相似，说明m i c r o r n a 是研究亲缘关系及物种进化的有力武器。 关键词：p i w i ，m i c r o r n a ，昆虫基因组，结构域，基序，进化，家蚕s b s 数据，昆虫特 异 英文摘要 a b s t r a c t a sas u b f a m i l yo fa r g o n a u t ep r o t e i n s ，p i w ii sp o o r l yu n d e r s t o o dc o m p a r e dw i t ha g o s u b f a m i l y u n t i lr e c e n t d i s c o v e r yo fp i w ip r o t e i ni n t e r a c t i n g w i t hp i r n a m o r e o v e r , i d e n t i f i c a t i o no fp i w is u b f a m i l yi ni n v e r t e b r a t ei sn o to n l yi m p o r t a n tf o re l u c i d a t i n gf u n c t i o n a n de v o l u t i o no fp i w ip r o t e i n sb u ta l s oh e l p f u lf o rp i r n ar e s e a r c h w ed i dal a r g es c a l e s c r e e n i n go fi n s e c tg e n o m e st oi d e n t i f yp i w i - l i k eg e n e s f u l lo rp a r t i a lc d n as e q u e n c e sw e r e o b t a i n e db ye s te l o n g a t i o na n dg e n s c a n w ef o u n dt h a tt h ee x o nn m n b e r sw e r et o t a l l y d i f f e r e n tb e t w e e nv e r t e b r a t e sa n di n v e r t e b r a t e s ，a p p r o x i m a t e l y2 0e x o n si nm a m m a l sb u to n l y 6 - 9e x o n si ni n s e c t s t h i si n f e r se i t h e ri n t r o ni n s e r t i o no rl o s so c c u r r e dd u r i n ge v o l u t i o n c h a r a c t e r i z e dp a z ，e - t e r m i n a lp i w id o m a i n se x i s ti na l m o s ta l lp r e d i c t e dp i w i - l i k ep r o t e i n s w ef o u n ds i xc o n s e r v e dm o t i f s ，w h i c hc o n t a i na c t i v ec a t a l y t i ct r i a d “a s p a s p h i s l y s ” r e q u i r e df o rs l i c e ra c t i v i t y t h ee x p r e s s i o no fs i w i la n ds i w i 2i nb o m b y xm o r iw e r ev e r i f i e d w i t hr t - p c r p h y l o g e n e t i ct r e ei n f e r r e db yb a y e s i a na l g o r i t h mi n d i c a t e si n v e r t e b r a t e p i w i l i k ep r o t e i n sa r ec l a s s i f i e di n t ot h r e ee l a d e s ，o fw h i c ha 9 0 3c l a d ei sc l o s e rt om a m m a l i a n p i w ip r o t e i n s n ec o m p l e t eg e n o m es e q u e n c e so f11 d r o s o p h i l as p e c i e sp r o v i d ea no p p o r t u n i t yt o f u r t h e ri n v e s t i g a t et h ep i w is u b f a m i l ya n dt h eg e n ef a m i l ye v o l u t i o ni nc l o s e l yr e l a t e ds p e c i e s d r o s o p h i l ap 黼s u b f a m i l y , i n c l u d i n gt h r e em e m b e r s ，p i w i ，a u ba n da 9 0 3 ，h a sa t t r a c t e d i n c r e a s i n ga t t e n t i o n sa si tp a r t i e i p a r e si nt h eb i o g e n e s i so fp i r n a h e r e ，f o l l o w i n gt h ef o r m e r w o r k , w ei d e n t i f i e d3 3p i w ih o m o l o g sf r o mt h eg e n o m eo f11d r o s o p h i l as p e c i e s ，i nw h i c h p i w ia n da u bg e n e sa r ew i t h i na v e r a g e2 0 k bi ng e n o m e n ef u l l l e n g t he d n as e q u e n c e so f p i w ia n da u bg e n e sw e r eo b t a i n e db yu s i n gn e wg e n s c a nw e bs e r v e r t h ea 9 0 3 h o m o l o g sw e r ed i f f i c u l tt og e tf u l l - l e n g t hi n f o r m a t i o nb e c a u s et h e yh a dl o n gi n t r o n s 砀e g e n o m i es t r u c t u r eo fp i w is u b f a m i l yg e n e sa l eh i g h l yc o m e r v e da m o n gd i v e r s ed r o s o p h i l a s p e c i e s i n s e c tp i w ia n da u bg e n e sh a v el o n gf i r s ti n t r o n 硼1 ea v e r a g el e n g t ho ft h ef i r s t i n t r o ni s 1 , 2 8 4 b pf o rp i w ia n d8 4 0 b pf o ra u b ，w h i c hi sm u c hl a r g e rt h a nt h o s eo fo t h e ri n t r o n s ( 9 3 b pf o rp i w ia n d5 4 b pf o ra u b ) h o w e v e r , t h i sp h e n o m e n o ni sn o to b s e r v e di nm a m m a l i a n p i w ig e n e s w ea l s of o u n dt h a tt h e r ew e l ea b u n d a n tr e p e a ts e q u e n c e si nb o t he x o n sa n d i n t r o n so fi n s e c ta 9 0 3g e n e s d u et or e c e n ti n s e r t i o n so fl t re l e m e n t si nf o u rd r o s o p h i l a s p e c i e s ，p a r to ft h et h i r di n t r o n se x h i b i th i g h e rc o n s e r v a t i o nt h a na d j a c e n te x o n sa n do t h e r i n t r o n s a ne v o l u t i o n a lt r e ec r e a t e d b ym i n i n l u n l e v o l u t i o nm e t h o di n d i c a t e st h a t m a m m a l i a n p i w ig e n e sa r em o r ec l o s e l yr e l a t e dt oi n s e c ta 9 0 3p i w is u b f a m i l y i i i 英文摘要 m i c r o r n a s ( m i r n a s ) a l ee n d o g e n o u sn o n - c o d i n gg e n e st h a ti n t e r a c t 、砘ma g op r o t e i n t or e g u l a t eg e n ee x p r e s s i o nb ye i t h e r d e g r a d i n gm r n ao rb l o c k i n gi t st r a n s l a t i o n w e c o n d u c t e dl a r g e - s c a l es c r e e n i n gf o rm i r n ag e n e si n t h es i l k w o r mb o m b y xm o r il i s 吨 s e q u e n c e - b y s y n t h e s i s ( s b s ) d e e ps e q u e n c i n go fm i x e dr n a sf r o me g g ，l a r v a l ，p u p a l ，a n d a d u l ts t a g e s o f2 , 2 2 7 ，9 3 0s b st a g s ，1 ，1 4 4 ，4 8 5r a n g e df r o m1 7t o2 5 蝇c o r r e s p o n d i n gt o 2 5 6 ，6 0 4u n i q u et a g s a m o n gt h e s en o n - r e d u n d a n tt a g s ，9 5 ，18 4w e r em a t c h e dt ot h es i l k w o r m g e n o m e w ei d e n t i f i e d3 , 7 5 0m i r n ac a n d i d a t eg e n e s u s i n gac o m p u t a t i o n a lp i p e l i n e c o m b i n i n gr n a f o l da n dt r i p l e t s v ma l g o r i t h m s w ec o n f n m e d3 5 4m i r n ag e n e su s i n g m i r n am i c r o a r r a y sa n dt h e np e r f o r m e de x p r e s s i o np r o f i l ea n a l y s i so nt h e s em i r n a sf o ra l l d e v e l o p m e n t a ls t a g e s w h i l e10 6m i r n a sw e r ee x p r e s s e di na l ls t a g e s ，2 4 8m i r n a sw e r e e g g a n dp u p a 。s p e c i f i c ，s u g g e s t i n gt h a ti n s e c tm i r n a sp l a yas i g n i f i c a n tr o l ei ne m b r y o g e n e s i s a n dm e t a m o r p h o s i s w es e l e c t e de i g h tm i r n a sf o rq u a n t i t a t i v er t - p c ra n a l y s i s ；s i xo ft h e s e w e r ec o n s i s t e n tw i t ho u rm i c r o a r r a yr e s u l t s i na d d i t i o n , w es e a r c h e df o ro r t h o l o g o u sm i r n a g e n e si nm a m m a l s ，an e m a t o d e ，a n do t h e ri n s e c t sa n df o u n dt h a tm o s ts i l k w o r mm i r n a sa r e c o n s e r v e di ni n s e c t s ，w h e r e a so n l yas m a l ln u m b e ro fs i l k w o r mm i r n a sh a v eo r t h o l o g si n m a m m a l sa n dt h en e m a t o d e t h e s er e s u l t ss u g g e s tt h a tt h e r ea r es e v e r a lm i r n a su n i q u et o i n s e c t s 。 k e y w o r d s ：p i w i ；m i c r o r n a ；i n s e c tg e n o m e ；d o m a i n ；m o t i f ；e v o l u t i o n ；s i l k w o ms b sd a t a ； i n s e c t - s p e c i f i c 前言 刖吾 r n a 干扰是一种双链r n a 诱导的基因沉默现象。a r g o n a u t e 蛋白组成了一个高度保 守的家族，它们组成了r n a 诱导的基因沉默复合体的核心元件，是r n a 干扰所必需的。 a r g o n a u t e 蛋白家族可以分为两个亚家族：a g o 和p i w i 。其中a g o 亚家族广泛的表达 于各种动植物以及分裂的酵母体内，并且参与m i r n a 和s i i 矾a 调控的通路。而p i w i 亚 家族只在动物中发现，并且特异性在于细胞和早期的胚胎中表达。黑腹果蝇中p i w i 亚家 族含有三个成员：p i w i 、a u b e r g i n e ( a u b ) 和a 9 0 3 。其中p i w i 蛋白对于于细胞的维持起了 很重要的作用，a u b 蛋白对卵母细胞的繁殖是必须的。据报导，a 9 0 3 基因参与p i r n a 的调节网络并跟转座子沉默有关。由于m i r n a 和s i r n a 的功能的重要性，a g o 亚家 族一直受到广泛的关注。直到2 0 0 6 年，另一个很重要的小r n a ( p i r n a ，p i w i - i n t e r a c t i n g r n a ) 的出现，p i w i 蛋白亚家族才成为关注的热点。 真核生物中已先后发现大量的非编码r n a ，如m i r n a 、s i r n a 、s n o r n a 以及现在 研究较热的p i r n a 。小分子非编码r n a 在基因的调控中起了很重要的作用。其中m i r n a 和s i r n a 这两类非编码的小r n a 与a g o 亚家族结合从而调控基因的表达。据报导这些 小分子非编码r n a 直接参与m r n a 的降解、翻译抑制、异染色质的形成和d n a 的消除 等生命过程，其中m i r n a 来源于d s r n a 的发夹状结构区域，s i r n a 则产生于长链d s r n a ， m i r n a 和s 浓n a 均通过与靶m r n a 结合诱导m r n a 的降解、翻译阻遏以及不依赖于 m r n a 降解的m r n a 衰变等，从而调控基因的表达。p i r n a ( p i w i - i n t e r a c t i n gr n a ) 是 一类最近发现的第三类非编码小砒峨，因与p i w i 蛋白结合而命名。不同于m i r n a 和 s i r n a ，p i r n a 特异性只在生殖细胞中表达，其可能参与配子发生过程中基因表达模式 以及基因组染色体结构的调节。 m i c r o r n a 是内源性、约2 2 个碱基长度、可以通过切割信使r n a 或抑制翻译、对 其靶基因进行调控的一类非编码小r n a 。在昆虫学研究中，m i c r o r n a 主要集中在模式 生物果蝇中。大量的实验表明，m i c r o r n a 参与调控了果蝇一系列的发育事件，包括细胞 凋亡、分化、胚胎发育、模式建成、神经发育等诸多方面。随着许多昆虫全基因组测序 的进行及完成，昆虫m i c r o r n a 研究迎来了一个新的发展阶段。正在从生物信息学预测、 高通量克隆、特定m i c r o r n a 的功能研究等几个方面迅速展开。而这也将为揭示m i e r o r n a 在昆虫生长发育中的作用奠定基础。 昆虫是地球上种类最多、分布最广的动物，其中黑腹果蝇和家蚕是很重要的模式生 物，对它们的研究有利于进行农业害虫防治以及人类疾病治疗。本课题我们利用生物信 息学的方法在家蚕、果蝇、按蚊以及蜜蜂等昆虫基因组中搜索黑腹果蝇的p i w i 亚家族的 同源基因，并对这些同源基因的结构特征以及系统进化关系进行了详细的分析，同时借 助于家蚕的s b s 测序的表达序列，利用生物信息学以及芯片技术对其中m i c r o r n a 基因 进行了预测。现将研究成果汇总成文。本论文分五章：第一章，a r g o n a u t e 蛋白家族的分 类及功能的研究进展；第二章，昆虫p i w i 蛋白的生物信息学预测及结构特征分析：第三 章，1 1 种果蝇p i 谢蛋白的生物信息学预测及进化分析；第四章，家蚕变态发育相关的 m i c r o 对蛆的生物信息学预测；第五章为结论。 学位论文独创性声明 本人郑重声明： 1 、坚持以。求实、创新一的科学精神从事研究工作。 2 、本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果。 3 、本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。 4 、本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构已经发 表或撰写过的研究成果。 5 、其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示了谢意。 a ，k 作者签名：f 锚仔 日期：尘鸯魈旦 学位论文使用授权声明 本人完全了解南京师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权 保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版； 有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被 查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索：有权将学位论文的 枷和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。 作者签名： 圈逝 日 期：皇煎笃妇蛰壁 第一章a r g o n a u t c 蛋白家族的分类及功能的研究进展 第一章a r g o n a u t e 蛋白家族的分类及功能的研究进展 r n a 干扰( r n a i ) 是一种重要的基因调节方式，通过与特定的靶基因互补配对，小 分子m 蛆具有降解m r n a 或抑制翻译而使基因沉默的功能。r n a 干扰现象的研究已经 成为生命科学领域的一个重要热点，从低等生物到高等生物都展开了全面的研究，广泛 应用于基因功能的研究以及疾病的诊断与治疗。r n a 干扰的特征是d r o s h a 负责对具有 d s r n a 结构域的内源性表达的r n a ，主要是细胞核里的微小r n a ( m i r n a ) 前体进行 加工i l 】。d i c e r 进一步对这些细胞质中的前体进行加工成m i r n a 成熟体。d i c e r 也负责将 其他外源性的d s r n a 分子加工成小的双链r n a ，它们具有特征性的2 - - 一3 n t 的3 悬垂， 称小干扰r n a ( s i r n a ) 。经d i e m 加工的r n a 是解旋的，其中一个链被整合到含有 a r g o n a u t e 蛋白家族成员的核糖体蛋白( r n p ) 复合体中。a r g o n a u t e 蛋白是一类高度保 守的家族，该蛋白家族含有许多的成员，其中包括a g o 和p i w i 亚家族。该蛋白质组成 了r n a 诱导的基因沉默复合体的核心元件，是r n a 干扰所必须村2 1 。 1 1 a r g o n a u t e 蛋白家族 a r g o n a u t e 蛋白组成了一个高度保守的蛋白，其成员与数种生物的r n a i 和相关现象 有关。a r g o n a u t e 蛋白除了在r n a i 过程中发挥功能，另外还参与发育调控以及其家族的 。些成员还与干细胞的分化、肿瘤的发生有关。目前的报导表明a r g o n a u t e 蛋白几乎存在 于所有的r i s c ( r n a i n d u c e ds i l e n c i n gc o m p l e x ) 复合体中，通过结合一些小r n a 发挥 各种调节功能。 1 1 1 a r g o n a u t e 蛋白家族的结构 a r g o n a u t e 蛋白是约1 0 0 k d 的碱性蛋白质，其成员含有四个结构域：一个n 末端、p a z 、 m i d 以及c 末端的p i w i 结构域【3 棚。研究p y r o c o c c u s f u r i o s u s 全长的a r g o n a u l e 蛋白的结 构表明，其中的p i w i 结构域与r n a s e h 家族的核糖酶结构具有相似的功能i s 。a r g o t m u t e 蛋白n 端的p a z 结构域含有1 3 0 个氨基酸，在a r g o n a u t e 蛋白和d i c e r 中均发现了该结 构域同。真核生物的p a z 结构域中央是一个1 3 - b a r - r e l ；一侧是两个n 端螺旋：另一侧是 一个保守的组件：该组件由一个p 发夹和一个a 螺旋组成【7 一。p a z 是一种蛋白质与蛋 白质之间结合的结构域，但到目前为止其具体的功能还不是很清楚，推测其功能可能是 调节蛋白质之间的同聚化与异聚化【3 1 。果蝇的两个a 玛o n a u t e 蛋白：a g o l 和a 9 0 2 与d i c e r 第一章a r g o n a u t e 蛋自家族的分类及功能的研冤进展 能发生免疫沉淀反应 9 - 1 0 1 。但是它们之间的反应是否依赖p a z 结构域至今还不是很清楚。 位于a r g o n a u t e 蛋白c 端的p i w i 结构域含有3 0 0 个氨基酸。第一次发现a r g o n a u t e 蛋白 的结构是对黑腹果蝇a r g o n a u t e 2 ( d m a 9 0 2 ) 的p a z 结构域进行n m r 和x 线分析而获得 的【刁。a r g o n a u t e 蛋白的活性位点包含一个d d h 三联体结构域i n 】。人a r g o n a u t e 2 蛋白中 天冬氨酸和组氨酸残基突变后，a r g o n a u t e 蛋白失去活性【1 1 0 2 】。 已有很多报导表明a r g o n a u t e 蛋白的基本结构能与一些r n a 结合。例如果蝇的a g o l 能在体外与核糖核酸同聚体结合【1 3 】。m i w i ，小鼠的p i 硒同源物在体内能与靶m r n a 形 成复合体【1 4 1 。要对a r g o n a u t e 的结构和生物化学的功能有详细的了解就必须揭示它参与 r n a 调控网络的精确的功能。 1 1 2a r g o n a u t e 蛋白家族的功能 a r g o n a u t e 蛋白在r n a i 及其其他相关的现象起了很重要作用：如植物中转录后基因 沉默和真菌中的“压制”的突变筛选等。已经在各种生物中发现了a r g o n a u t e 蛋白家族的 成员，如秀丽线虫中的眈，6 】、脉孢霉中的q d e 2 、拟南芥中的a g 0 1 、a g 0 2 、a g 0 3 1 q 和果蝇中的p i w i 、a u b ( a u b e r g i n e ) 、a 9 0 3 等。a r g o n a u t e 蛋白参与的基因沉默现象也包括 一些核染色质水平基因的转录沉默。例如最近v o l p e 和同事在s a c c h a r o m y c e s p o m b e 中发 现当组成r n a 复合体的a r g o n a u t e 、d i c e r 以及依赖r n a 聚合体的同源物破坏掉以后， 将会导致着丝粒中异染色质重复沉默的丢失。果蝇中的p i w i 突变也会影响到转录水平的 基因沉默【1 7 j 。四膜虫中跟p i w i 相关的基因朋聊，对于d n a 消减是必须的另外还参加活 性巨细胞转录过程中的成熟。这个过程涉及到一类长度约为2 8 m 的r n a 的参与【l 引。 许多真核生物含有a r g o n a u t e 多基因家族，该家族的成员在发挥其生物学功能时具有 特异性。如人4 种a r g o n a u t e 蛋白都能结合s i r n a 和m i r n a ，但只有a g 0 2 能够介导对 靶r n a 的剪切【1 9 - 2 0 1 。小鼠中含有两个p i w i 的同源物：m i w i 和m i l i 。据报道m i l i 在成体 睾丸的精母细胞和精原细胞中都表达，而m i w i 只在精母细胞中表达【1 4 1 。秀丽线虫缺乏 r d e l ( 秀丽线虫a g o 家族的2 3 个成员之一) 的突变体不能进行s i r n a 指导的r n a i ， 但是其m i r n a 途径却是正常的围；而a l g - 1 ( a g o 样基因1 ) 和a l g - 2 的突变体能进行 r n a i ，却缺乏m i r n a 沉默途径。在拟南芥中，与a g 0 1 相结合的r n a 包括m i r n a 、 t a - s i r n a ( t r a n s a c t i n gs i r n a ，t a s i r n a ) 和转基因的s i r n a ，但是却不包括病毒s i r n a 和 与染色质沉默有关2 4 n t 的s i r n a 。 2 第一章a r g o n a u t e 蛋自家族的分类及功能的研究进展 果蝇含有五个特征性的a r g o n a u t e 蛋白( p i w i 、a u b e r g i n e 、a g o l 、a 9 0 2 和a 9 0 3 ) 。 p i w i 、a u b e r g i n e 、a g o l 和a 9 0 2 已报道参与类r n a i 的调控途径。果蝇中的a 9 0 1 对于 s i r n a 双链的产生，s i r n a 引发的r i s c 的形成，或s i r n a 指导的剪切来说不是必须的。 但是a g o l 对于m i r n a 介导的靶r n a 的剪切却是必须的【2 1 1 。也有报道胚胎中的s i r n a 介导的r n a i 需要a g o l 。进一步的研究表明a g o l 与m i r n a 的成熟和稳定性有关。在胚 胎中表达的a r g o n a u t e 蛋白家族之间存在一定程度的功能互补性。果蝇a 9 0 2 基因组成 r n a i 过程中r i s c 的重要组成成份【9 】。a 9 0 2 突变会导致对d s r n a 不产生r n a i 的表型， 也就是说a 9 0 2 对于由外源引入的d s r n a 所产生的r n a i 是必要的【2 2 】。进一步的研究表 明在s i r n a 双链结合到r i s c 前体上之后的r i s c 组装过程中，s i r n a 双链解旋需要a 9 0 2 田】。虽然如前所述a 9 0 2 是s i r n a 指导的r n a i 中的一个重要因素，但是对于由m i r n a 调节的r n a 剪切来说，a 9 0 2 却并不是必须的。综上所述，a 9 0 2 很有可能是s i r n a 进 入r i s c 的一个特异性的解旋和载入因子，并且还可能是s i r n a 引发的r i s c 中的一个必 需组分。 果蝇中的p i w i 基因对于转录后基因沉默或转录水平上的某些基因沉默途径都是需要 的【1 7 1 。a u b e r g i n e ( s t i n g ) j g 艮p t w i 一样，在性腺的早期胚胎发育中表达，其突变体将会影响 到干细胞的发育。p i w i 和a u b e r g i n e 对于卵子形成过程中卵细胞的产生都很重要阳6 】。 a u b e r g i n e 基因另外还行使转录后沉默跟x 染色体有关的微卫星重复，另外对于雄性生殖 也很重要。 一些人类中的a r g o n a u t e 蛋白的基因据研究发现与一些人类的疾病有关。例如人的第 1 号染色体串联排列着三个基因h a 9 0 3 、e i f 2 c 1 h a g o l 和h a 9 0 4 。而这个区域常常导致 w i l m s 肿瘤的发生。w i l m s 肿瘤发生被认为是由于胚肾细胞的缺失而扰乱了生后肾原基 前体细胞分化的能力。e i f 2 c 1 h a g o l 在大多数组织中都是出于低或中水平表达，但它在 胚肾和肺中却高表达。e i f 2 c 1 e 当缺乏w i l m s 肿瘤抑制基因的时候表达也会增加。人中 另一个p i w i 同源的基因h i w i 位于染色体1 2 q 2 4 3 3 也与睾丸生殖细胞肿瘤的发生有关 2 7 - z g 。 1 1 3a r g o n a u t e 蛋白家族的分类 a r g o n a u t e 蛋白家族一般可以分为二个亚家族：a g o 亚家族和p i w i 亚家族。近期又 报导了一个线虫特异性的w a g o 亚家族。a g o 家族广泛的表达于各种动物、植物以及 3 第一章a r g o n a u t e 蛋白家族的分类及功能的研究进展 分裂的酵母体中，并且能与非编码的m i r n a 和s i r n a 特异性结合，从而抑制翻译或降 解蛋白产物。p i w i 蛋白家族只存在于动物中，并且与一种跟精子发生有关的小r n a ( p i r n a ) 相互作用四删。p i w i 亚家族主要与种系特异性时间相关，如胚胎干细胞的维 持和减数分裂等。绝大多数p i w i 蛋白含有一个完整的d d h 铁结合结构域，可能在干细 胞中行使跟a r g o n a u t e 蛋白相似的催化活性。w a g o 亚家族( 也可以称为第三类a r g o n a u t e 家族) 仅仅存在于线虫中，一般在线虫a r g o n a u t e 蛋白家族中占有很大的比例( 2 5 ) 。跟 a g o 和p i w i 亚家族不同的是，w a g o 蛋白缺乏保守性的d d h 金属结合残基，表明了一 个独立剪切的功能。 1 2p i w i 蛋白家族 p i w i 亚家族是a r g o n a u t e 蛋白家族的成员，它只在睾丸和卵巢中表达，是干细胞维 持和分化所必需的，另外p i w i 还负责睾丸中反转座子的沉默。干细胞的维持和分化是 细胞内源因素和外界因子共同作用的结果。内源性调节主要是决定了细胞分裂和分化的 取向，它包括细胞骨架的空间结构、转录因子、转录后调节元件对特定基因的选择和表 达等。外源性调节是一组组织细胞和细胞外基质，通过分泌信号、接触作用可以保存一 个或更多的干细胞，控制它们的自我更新和衍生后代的能力。干纽胞分裂过程涉及广泛 的分子机制，其中许多方面都还是未开发的领域。干细胞的研究对我们研究人类疾病具 有重大的生物学意义。 1 2 1p i w i 蛋白家族的鉴定 l i nh 和s p r a d l i n ga c 于1 9 9 7 年首先在果蝇的生殖干细胞( g e r m l i n es t e mc e l l s ， g s c s ) 内发现了p i w i 蛋白，并且发现其对g s c 的自我更新起了重要的作用。基于序 列特征，已在许多真核生物中鉴定出了p i w i 家族的成员，这些同源蛋白在进化上具有高 度的保守性。目前已在人类中报导了四个p i w i 同源物( h i w i , h i w l 2 、h i w l 3 和h i l i ) t 硼。小鼠中也存在三个p i w i 家族的成员( m j w l , m i w l 2 和m i l d ，大鼠中只存在一个同 源物【3 0 , 3 5 1 。在斑马鱼和线虫中总计报导了5 个p i w i 同源蛋白f 2 5 ，3 6 】。另外，最近在昆虫也 发现了一些p i 丽同源物，家蚕中有2 个p i w i 同源物s i w i l 和s i w i 2 、按蚊中2 个、蜜蜂中 1 个、另外在果蝇其他1 1 个物种中总计发现了3 3 个p i w i 同源物 3 7 1 。p i w i 亚家族主要与 种系特异性时间相关，如胚胎干细胞的维持和减数分裂等，然而该类亚家族蛋白质的生 化功能及其互作分子特别是一类具有重要调控功能的r n a 分子都不清楚。 4 第一章a r g o n a u t e 蛋自家族的分类及功能的研究进展 1 。2 。2p i w i 蛋白家族的保守性特征 目前p i w i 蛋白只发现存在于动物中，同源性分析发现p i w i 蛋白亚家族在进化上具有 广泛的保守性，尤其是它们序列的c 末端。根据它们功能的相似性，p i w i 蛋白亚家族主 要包括下面几类： ( 一) 与精子发生有关的基因果蝇中另一个p i w i 的同源物埘昭( a u b e r g i n e ) 对于 精子发生同样是必需的，它在生殖系中特异表达并且参与了精母细胞的发育和减数分裂， 作为一种胞质蛋白，它可能参与转录的增强。线虫中的两个果蝇p i w i 的同源基因p r g - 1 和p r g - 2 ( p i w i - r e l a t e dg e n e ) ，在生殖系的自我更新中起了很重要作用，研究发现当它们 活性的降低的时将会导致生殖系细胞的巨减；小鼠中两个p i w i 的同源基因m i w i 和m i l i ， 都来自成体睾丸的生