（皮革化学与工程专业论文）胶原纤维的分散及酶催化交联的研究.pdf

摘要 再生胶原纤维的应用是目前生物质资源化利用的一个重要的研 究课题之一，而探索纤维化高值利用的新途径和新技术将成为今后 的研究重点和发展方向。本研究采用球磨法对从皮革固体废弃物中 提取的胶原纤维进行分散处理，探讨了球磨因素对胶原纤维分散性 的影响，用难交试验优化工艺。采用微生物转谷氨酰胺酶( m t g a s e ) 催化明胶交联成膜以及胶原纤维的交联，研究了p h 、酶用量、时间 和温度等因素对明胶膜的物理特性以及胶原纤维交联改性的影响。 用激光粒度仪对纤维的长度和分布进行了表征，用扫描电镜 ( s e m ) 并t l 差热一热重同步热分析仪( t g s d t a ) 分别对纤维的微观形 貌和热效应进行表征和研究，对产物的平均粒径、蓬松密度和感观 进行极差分析和方差分析。结果表明：通过筛分提高原料的均一性， 采用一定级配的研磨介质，可以获得粒径分布更为集中的胶原纤维。 球磨机转速是影响研磨效果的主要因素，其它因素的影响相对较小。 最佳球磨工艺为：球料比1 0 ：1 ，球磨机转速8 0 0 r m i n ，球磨时间 9 0 m i n 。研磨后，团聚的大颗粒被粉碎呈蓬松的纤维态，分散性明显 提高。 通过吸水率和透水汽性的测定反映明胶( 纤维) 活性基团的交 联程度，用紫外吸收光谱探讨酶与纤维( 明胶) 的相互作用。结果 表明：酶与明胶反应的粘度变化远远高于与纤维反应的粘度变化； m t g a s e 可使明胶膜吸水性降低；m t g a s e 用量为5 ，p h 在5 5 6 0 之间反应2 h ，膜具有较低的吸水率和较高的透水汽性。m t g a s e 和胶原纤维之间存在着一定的相互作用；纤维分布影响酶交联反应： 最适工艺为：酶纤维质量比为2 0 ，介质p h8 ，搅拌速度6 0 0 r m i n ， 反应温度4 2 ，时间3 h 。反应结束后用三氯乙酸调p h 灭酶活，再 用碱法将溶液p h 调至中性。 关键词：胶原纤维微生物转谷氨酰胺酶球磨机分散酶催化交联 a b s t r a c t t h er e u s eo fc o l l a g e nf i b e r sisa ni m p o r t a n tr e s e a r c hp r o j e c ti nt h e u t i l i z a t i o no f b i o l o g yr e s o u r c e ，a n dt h ea d v a n c e da p p r o a c ha n d t e c h n o l o g ya b o u ta d d i n gv a l u et ot h e f i b r o s i sw i l lb e c o m ea nr e s e a r c h a s p e c ta n dt h ed e v e l o p i n go r i e n t a t i o n t nt h i sp a p e r ，t h ec o l l a g e nf i b e r s e x t r a c t e df r o ml e a t h e rw a s t ew a st r e a t e db yb a l l m i l l i n gm e t h o d t h e i n f l u e n c eo fb a l l m i l l i n gc o n d i t i o n so nt h e d i s p e r s i b i l i t yo fc o l l a g e n f i b e rw a ss t u d i e da n dt h eo r t h o g o n a le x p e r i m e n tw a su s e dt od e t e r m i n e t h e o p t i m a lc o n d i t i o n s t h e nt h em i c r ot r a n s g l u t a m i n a s ew a su s e dt o t r e a tg e l a t i nt om a k ef i l ma n dc o l l a g e nf i b e r st of o r mc r o s s l i n k t h e e f f e c t so fs u c hf a c t o r sa s p h ，e n z y m el e v e l ，r e a c t i o n t i m ea n d t e m p e r a t u r eo nt h ep r o p e r t i e so fg e l a t i nf i l ma n dt h ec r o s s l i n kr e a c t i o n o fc o l l a g e nf i b e r sd u r i n gt h ep r o c e s so fm o d i f i c a t i o nw e r es t u d i e d t h ep a r t i c l es i z ea n dd i s t r i b u t i o no fc o l l a g e nf i b e rw a sd e t e r m i n e db y l a s e rp a r t i c l ea n a l y z e r t h em i c r o c o s m i ca p p e a r a n c ew a ss t u d i e db y s c a n n i n g e l e c t r o nm i c r o s c o p y ( s e m ) a n dt h et h e r m a lb e h a v i o rw a s s t u d i e d b yt h e r m o g r a v i m e t r y a n dd i f f e r e n t i a l t h e r m a l a n a l y s i s ( t g s d t a ) t h e nt h er a n g ea n a l y s i sa n dt h eh o m o l o g o u sv a r i a n c e a n a l y s i sa b o u ta v e r a g ep a r t i c l es i z e ，p u f fd e n s i t ya n ds e n s ee v a l u a t i o n o ft h em i l l e d p r o d u c t s w a sm a d e t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a t t h e s i e v e - f r a c t i o np r o c e s st oi m p r o v et h eu n i f o r m i t yo fr a wm a t e r i a la n db y t h ep r o p o r t i o n i n go fm i l l i n gb a l e r sg a v ep r o d u c t sw i t hm o r ec e n t r a l i z e d p a r t i c l ed i s t r i b u t i o n t h er o t a t a t i o ns p e e do ft h eb a l l m i l l e rw a st h e m a i nf a c t o ri n f l u e n c i n gt h ee f f i c i e n c yo fm i l l i n g ，w h i l eo t h e rf a c t o r s w e r eo nt h es m a l ls i d er e l a t i v e l y b e s i d e s ，t h eo p t i m u mc o n d i t i o n so f m i l l i n gw e r ed e t e r m i n e dt h a tt h ep r o p o r t i o no fb a l lt os t u f fw a s 10 ：1 ， t h er o t a t i o ns p e e dw a s8 0 0 r m i na n dt h em i l l i n gt i m ew a s9 0 m i n a f t e r a p p r o p r i a t ed i s p o s a lo fm i l l i n g ，t h eb u l k yc o n g l o m e r a t i o nc r u s h e dt o p u f ff i b e ra n dt h ed i s p e r s i b i l i t yi m p r o v e dm a r k e d l y t h ew a t e ra b s o r b a b i l i t ya n dv a p o u r p e r m e a t i o na b i l i t yc a nr e f l e c tt h e c r o s s l i n kd e g r e eo fa c t i v eg r o u p sa n dt h ev i o l e ts p e c t r o s c o p i ca n a l y s i s s h o w e dt h ei n t e r a c t i o no fe n z y m ea n df i b e r s t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a t t h ea c t i o no fg e l a t i na n dm t g a s ec a u s e dm o r eo b v i o u s l yv a r i e t yo f v i s c o s i t yc o m p a r e dw i t hc o l l a g e nf i b e r s m t g a s er e d u c e dt h ew a t e r a b s o r b a b i l i t yo ff i l m ，i ts h o w e dt h a tw h e nt h ed o s a g eo fe n z y m ew a s 5 a n dt h em e d i u mp hw a sb e t w e e n5 5a n d6 0f o r 2h o u r s t h e o p t i m a lc r o s s l i n kw h i c hm e a n sf i l mw i t hl o wr a t i oo fw a t e ra b s o r b i n g a n dh i g hp e r m e a t i o nf o rw a t e rv a p o ra p p e a r e d s o m ei n t e r a c t i o ne x i s t s i nt h em i c r o b i a lt r a n s g l u t a m i n a s ea n dc o l l a g e nf i b e r sa n dt h ep a r t i c l e d i s t r i b u t i o no ff i b e r sh a v ei n f l u e n c eo nt h ee n z y m i cc r o s s l i n k f u r t h e r ， t h eo p t i m u mm o d i f i c a t i o nc o n d i t i o nw a sp u tf o r w a r d ，t h a tw a st h er a t e o fe n z y m et of i b e r sa t2 0 ，t h em e d i u mp ha t8 ，a g i t a t i o ns p e e da t 6 0 0 r m i na n dt h e a p p r o p r i a t et e m p e r a t u r e a t4 2 f o r3 h o u r s t r i c h l o r o a c e t i ca c i d ( t c a ) w a su s e dt of i n i s ht h ea c t i o na n dt h e nt h e s o l u t i o nw a sa d j u s t e dt on a t u r eb ya l k a l iu l t i m a t e l y k e yw o r d s ：c o l l a g e nf i b e r ；m i c r o b i a lt r a n s g l u t a m i n a s e ( m t g a s e ) ： b a l lm i l l e r ：d i s p e r s i b i l i t y ；e n z y m a t i cc r o s s l i n k 附件三 学位论文独创陛声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成 果。文中引用他人的成果，均己做出明确标注或得到许可。论文内容未包含 法律意义上已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学 位申请的论文或成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在 论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东 轻工业学院。山东轻工业学院享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅 以及申请专利等权利，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复 印件和电子版，本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术 论文或成果时，署名单位仍然为山东轻工业学院。 论文作者签名： 导师签 本囡鲡 严 日期：型! 年互月i z _ h 日期：! 竺三兰年兰二月二乙z r 山东轻工业学院硕l 学位论文 第一章绪论 1 1 概述 1 1 1 皮革固体废弃物的利用现状 制革工业是以动物皮为原料的以高投入、低产出为特征的传统 工业。我国每年产生的皮革固体废弃物1 4 0 多万吨，含铬固体废弃物 5 0 多万吨【lj 。如果不能将这些固体废弃物进行合理的处理，一方面会 严重污染环境，另一方面也会造成胶原纤维蛋白的大量流失。因此， 皮革固体废弃物的资源化，已成为国内外制革和环境保护工作者关注 和致力研究的重要课题之【2 1 。 皮革废弃物的利用早在1 9 2 8 年就有报道，当时意大利人将含铬 的下脚料用作人造革原料1 3 】。几十年来国内外学者对此进行了广泛深 入的研究，已在食品、饲料、化妆品、肥料和医疗保健等领域开展应 用1 4 。皮革固体废弃物的来源和主要利用途径如图1 1 所示 5 1 。其中， 从皮革固体废弃物中提取胶原纤维进行资源化再利用是有效的途径 之一。 铬鞣一削匀屑 r 脱铬+ 工业明胶、饲料 t 篓二篡芸：凳布 制革废物+ 燃烧一铬氧化 图1 1 皮革固体废弃物的来源和主要利用途径 1 1 2 再生胶原纤维的提取方法 油 废 ； 澍 厂k 龋 撒 肛 胶批 肄 一 一 一 崴 一 卜 毛 势 鄯 一 一 埔 一 一 一 一e 第一章绪论 从皮革圆体废弃物中提取胶原纤维的方法通常有：酸法、碱法、酶 法、氧化法、机械法等，每种方法各有利弊h j 。 酸、碱、酶法脱铬是普遍使用的方法。采用酸法处理铬革屑时，胶原的 水解程度较大，只能得到小分子的胶原降解产物，而且色氨酸全部被破 坏，丝氨酸和酪氨酸部分被破坏，产品得率降低，设备腐蚀严重【6 j 。碱法脱 铬多用c a ( o h ) 2 ，n a o h 和m g o 【7j ，脱铬率与酸法相比较高，且操作简 便，但采用该法只能得到分子量较小的胶原产物，应用价值并不太高。 酶法脱铬能弥补上述两种方法的各种缺点，具有一定的优越性，如反应 速度快，时间短，条件温和，无环境污染，对蛋白质的成分破坏较小等， 但酶处理法对胶原的降解程度较大，胶原被降解为很小的肽，产率较低， 铬的去除率也不高，而且过程不容易控制1 8 , 9 1 。 氧化法是用h 2 0 2 等氧化剂，对铬革屑处理，将革屑中的c r 3 + 氧化成 c r 针，使铬革屑脱鞣，再经过漂洗、过滤，将胶原和铬分离。j a i m ec o t 等人对用不同的过氧化物处理铬革屑进行过系统的研究 10 , 1 。在国内， 王远亮等人也进行过此类的研究【i 引。氧化法脱铬速度快，对胶原结构的 破坏程度小，获得的胶原产物色泽好且分子较大，含铬量较低，脱铬效果 好，但在处理过程中会产生有毒的六价铬，对环境产生不良的影响， 在工业生产中应该加强环境保护和六价铬的回收利用【2 】。 将二层皮或含铬皮屑用碱法或酸膨胀法处理后，交织的胶原纤维 变得蓬松，然后用解束机胶原纤维进一步的松弛，再用带有针布卷的滚 筒解纤机，使它们以纤维状态被回收 1 3 1 。另外，将削匀屑经过浸泡、中 和处理后，用循环热风干燥至含水率4 0 左右时，用捣碎机解纤进行粉 碎，再用丙酮或甲醇等溶剂对粉碎物进行纤维分解，可以制成胶原短纤 维而得以回收利用l l4 1 。 由于以上几种方法各有其优缺点，因此目前常把几种结合起来使 用。例如：采用酸一碱交替处理法，不仅脱铬效率要比酸处理法的高，而 且所得到的胶原产物的稳定性和质量都要比碱法处理的高”j ；采用碱 一酶处理法( 二步法) 既可得到分子较大的胶原产物，又可增加胶原的 提取率 1 5 - 17 1 。化学一机械相结合的方法不仅可以降低化学药品的使用 量而且还可以使胶原纤维得到充分的疏解、分散，使其侧链的活性基团 充分的暴露出来，有利于提高胶原纤维复合产品的强度i l 。 1 1 3 再生胶原纤维的利用现状 山东轻t 业学院硕l 学位论文 胶原纤维是真皮的主要纤维，其特点之一是能形成纤维束，真皮就 是由胶原纤维束的相互穿插交织而成的极其复杂的编织物，因而具有 很高的机械强度。胶原蛋白纤维具有蚕丝般的光泽、羊绒般的手感， 纤维本身无色透明并且可以生物降解，是一种“绿色纤维”【1 9 , 2 0 1 。 皮革圆体废弃物在经处理变成胶原纤维的过程中，大分子侧链中 羟基、氨基、羧基等活性基团暴露得更多，有较强的化学活性【2 ”。利 用机械或化学机械联合法将废革屑分解生成的胶原纤维或含铬胶原纤 维，仍具有天然高分子的化学、物理性质及组织构造特征，其再利用 主要是根据其纤维特征进行的睁j 。 1 1 3 1 制造再生革、非织造布 制造再生革很早就已商业化生产，一般的方法为湿式成形法由削 匀蓝革屑制造革板，近年来又进行了多种技术改造形成了各种新产品。 但是，出于再生革制品的卫生性能和强度都不及天然皮革，在实际应 用中难以推广 5 1 。 使用含铬胶原纤维制成非织造布时，一般先将含铬胶原纤维织成 纱棉网。这里所用的含铬胶原纤维，是指回收的纤维长度在2 c m 以下时， 加入量为4 0 ；2 c m 以上时，加入量为2 0 。使用含铬胶原纤维制成非 织造布工艺如下： 纤维混合一中廷一纱网一针刺一浸渍一干燥一熟化一喷涂一磨革一无 纺布底基。 以胶原纤维为主体的非织造布柔软性好，进一步用各种鞣剂处理， 还可以提高其耐热性，进一步可以用做人造革基底材料、滤材或者吸 收布1 2 2 1 。例如：用二层皮屑进行2 d 复灰，脱灰、软化后，用福尔马林进 行化学修饰，之后解纤处理。机械方法使皮胶原纤维膨松，再用氧化鱼油 处理，再一次解纤处理，得到修饰胶原纤维。用这种胶原4 0 6 0 制成 的混合无纺布，具有吸水性、吸油性的特点。h i r a s h io k a m u r a 等用这种 化学修饰的胶原短纤维和聚氨酯的混合物再浸渍涂布，制备出了高吸 水布 2 3 1 。 另外，以烷基化胶原纤维为主要成分的无纺布，可以作为吸收丹宁 的材料，而用甲烷化和氧化鱼油修饰的胶原纤维为主要成分的毛毡，可 以除o w 型的油滴i l4 1 。 1 1 3 2 制造复合材料 将从废革屑回收的胶原短纤维和具有一定活性的合成高分子进行 修饰，可以制成复合材料，这种新型的复合材料兼有二者的特性。例 第一章绪论 如：含铬削匀屑及废革屑回收的胶原短纤维，可以做为绒毛原料用于静 电植绒中的合成树脂复合材料中。含铬胶原短纤维也可以作为塑料填 料和橡胶增强材料【2 “，或者作为原料与硬质材料苯酚树脂或尿素树脂 制成硬质复合材料。日本的冈村浩等利用革纤维多孔材料独特音响特 性，选用含铬胶原纤维和乙撑醋酸乙烯制成复合材料，研制出扬声喇 叭，在低音段的再生音质效果最佳。另外，由于含铬胶原短纤维和合 成橡胶的片状复合材料的摩擦系数很大，利用这种性质，含铬胶原短 纤维在自行车闸皮、特殊胶辊及隔音器材方面已有实用化的报道。但 是此类产品的市场需求量有限，附加值都不高，经济价值也不大【2 ”。 1 1 3 3 在造纸工业中的应用 胶原纤维与植物纤维都是天然线形高分子，分别普遍存在于动物 和植物体内。由于形态相似，可混性强，可用于高档纸的开发。胶原纤维 具有微弹性和良好的吸湿透气性，还有许多诸如高耐磨性、绝热性和 柔韧性等独特性质，是一种良好的绝热、吸声、过滤材料 2 6 1 。可用于 制造胶原纤维纸，或与植物纤维、化学纤维等配抄，可生产出应用于特 殊领域的纤维复合材料，如壁纸、妇女卫生巾、高档生活用纸、多孔 吸附性材料、农副产品包装材料、复合生物降解材料等【27 2 8 】。因此， 胶原纤维用于造纸不仅丰富了造纸种类，给造纸业提供丰富的、高质量 的原料和新型助剂，而且大大提高了皮革边角废料的附加值，为皮革 固体废弃物的回收利用开辟了新路。 胶原以纤维形态应用于造纸主要将皮革固体废弃物处理后与纤维 素混合抄造，这方面的研究早在2 0 世纪3 0 年代德国已开始研究，之后日 本、美国、中国等相继进行了不少的研究。其相同之处是利用了造纸 的成型方法，并用粘合剂使之结合，因而几乎不具备纸的性质，尤其是成 品粗糙，利用价值低【l9 1 。近1 0 年来，皮革固体废弃物的处理技术日益成 熟，美国在铬的分离、胶原的提取技术上处于领先地位，日本的皮革固 体废料主要用于油脂、粘胶、明胶、肥料和皮制板材的生产，但国外将 胶原纤维应用于造纸方面的研究，除了2 0 世纪9 0 年代初日本在喇叭纸 盆、壁纸的研究报道外，之后极少见。 目前，我国已经从皮革固体废弃物的制浆方法、浆的性能、胶原 纤维的提取方法以及氨基酸的分析、胶原的纤维形态、动植物纤维的 结合机理、纸的性能、纸的结构等方面进行了较为系统的研究1 2 “”j ， 为胶原纤维在造纸中的广泛应用提供了理论依据，在造纸中的应用研 究方面处于优势地位。随着研究的深入，胶原纤维在造纸工业中必将得 山东轻工业学院硕士学位论文 到更加广泛的应用，其中如何采用更加有效的方法从皮革固体废弃物 中提取胶原纤维，合理利用胶原纤维对纸浆纤维的各种性能的改良以 及胶原纤维的化学改性，使其在制浆造纸工业中得到更加广泛的应用， 不断丌发出具有低投入、高附加值的产品将成为今后的研究重点和发 展方向【3 3 】。 1 1 4 球磨粉碎技术及其在胶原分散中的应用 球磨粉碎技术是在球磨机中利用研磨介质之间的挤压力与剪切力 来粉碎、分散物料的【3 4 j 。行星式球磨属于高能球磨3 5 】，是在普通球磨 机的基础上发展而来的一种新颖的粉碎设备，运行时球磨简体作既有 公转也有自转的行星运动，由此带动磨腔内磨介构成对粉料的强烈撞 击、碾压与搓擦作用而使物料被粉碎。与传统球磨机相比，具有高效、 低耗，便于实验研究等优点 3 6 1 。行星式高能球磨机的结构如下图1 2 所 示： l 一调速电机2 一小皮带轮3 一皮带4 一大皮带轮5 一转盘 6 一中心转轴7 一球磨罐8 一中心带轮9 一行星带轮1 0 一皮带 图1 2 行星式高能球磨机示意图 图中行星式高能球磨机中，与调速电机1 固联的小皮带轮2 通过 皮带3 与大皮带轮4 构成皮带传动机构，与大皮带轮4 固联并同轴运 转的转盘5 上对称布置有两个球磨罐7 ，每个磨罐的中心转轴6 都与 转盘5 构成同转副，并且转轴6 的下部固联有行星带轮9 ，带轮9 又 通过皮带1 0 与同机座围联的中心带轮8 构成皮带传动。当调速电机启 动后，转盘便会转动起来，球磨罐7 便开始作行星运动，从而带动球 磨罐中的磨球在罐底上作复杂运动，对粉体产生强烈的碾压与搓擦， 使得简内原料能在较短时间内得到粉碎 3 7 1 。 第一章绪论 物料粉碎是一个直到完全破坏为止的固体变形过程。宏观上，似 乎仅仅是颗粒粒度的变化，但是微观上将伴随着一系列颗粒理化特性 的改变。机械力给颗粒输入了大量机械能，出现了晶格畸变、缺陷等 一系列物理化学变化，新生表面上有不饱和价键和高表面能的聚集， 呈现较强的化学活性。由于上述特点，超细粉碎技术在很多的领域中 得到了应用 3 8 1 。如：机械力合金法( m a ) 合成新材料；非金属矿物超细 改性作为填料改善橡塑制品性能等领域。粉碎技术也应用于固体废弃 物的粉碎再生与综合利用领域，但是主要集中在废旧线路板、电缆、 汽车轮胎等废物的回收处理、再生方面，而针对皮革领域中胶原纤维 的球磨粉碎研究报道很少。 美国w i d e n e r 大学的m a f f i ag j 等人【39 曾将牛皮胶原纤维原料在 水的稀溶液中球磨7 天，获得了理想的目标产物。扫描电镜( s e m ) 分析表明：球磨使稀溶液中的纤维束缓慢教开，由明显可见到最终消 失( 放大倍数：1 0 0 ) ；纤维束尺寸由最初的1 4 2 7 0 n m 变为8 0 2 4 5 n m ；在整个过程中，组成纤维束的小纤维从母体中被拆出，小纤 维直径不变，仍保持完整( 放大倍数：1 0 ，0 0 0 ) 。原子力显微镜( a f m ) 分析表明：球磨各阶段的纤维仍然具有6 0 7 0 n md 周期性横纹特征， 胶原分子的轴向聚集未发生改变，即胶原分子结构没有变化。聚丙烯 酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ) 分析表明：蛋白质条带保持不变，胶原的 分子量没有发生改变，因此球磨过程中没有降解发生，采用球磨拆开 纤维束的过程纯粹是一个物理过程。对于产物的成份测定表明：球磨 过程中脂含量和氮含量没有明显的变化，但灰分含量随着时间的延长 明显升高，这是由研磨介质受到磨损进入了原料粉体所致。另外，在 胶原没有发生任何化学改变或变性的前提下，单位质量纤维具有活性 ( 即与介质溶液相互作用) 的表面积由初始的0 0 1 o 3 m 2 g 增加至 15 5 0 m 2 g ，即胶原的活性表面增加了2 0 0 多倍。在m a f f i a g j 等人 【 9 j 的研究中，球磨被作为主要的预处理步骤，使胶原纤维束分散成单 根纤维而纤维结构仍保持完整，获得的小纤维具有较高的表面积和显 著的保水性能，可以应用在环境和生物技术领域。另外，也可以制备 出多孔结构的胶原基质材料，应用在生物材料领域。但是由于该方法 需要在极稀薄溶液中进行而且处理时间长，故处理能力受到限制，每 升磨的处理能力仅为l g 天。 1 1 5 转谷氨酰胺酶的性质及应用 6 山东轻工业学院硕士学位论文 1 1 5 1 转谷氨酰胺酶概述 转谷氨酰胺酶( t r a n s g l u t a m i n a s e ，全称r g l u t a m i n y l - p e p t i d e ： a m i n e c - g l u t a m y l t r a n s f e r a s e ，简称t g a s e ，e c 2 3 2 13 ) 又称谷氨酰 胺转胺酶，是一种催化酰基转移反应的转移酶，主要作用是在蛋白质 之间架桥生成s 一( t 一谷氨酰基) 赖氨酸异肽键，形成分子内和分子浏的网 状结构【4 叭。 转谷氨酰胺酶广泛存在于动、植物以及微生物机体组织中，其主 要生理作用有：作为血液凝固的f x i i i 因子促进凝血作用，参与伤口的 愈合过程；促使表皮细胞在分化末期中形成角质层；参与毛囊蛋白质 的架桥：促进胰岛素的分泌，诱导细胞分化，催化介导细胞的凋亡或 程序化死亡以及识别癌变细胞组织等，在机体多种生化反应及生命代 谢过程中发挥着重要的作用 4 1 】。 ( 1 ) 转谷氨酰胺酶的来源 自2 0 世纪6 0 年代以来，人们对转谷氨酰胺酶已做了大量研究。 目前，研究或工业用转谷氨酰胺酶的主要来源有：( 1 ) 从动物( 豚鼠、 猪、牛、鱼) 的组织、体液、屠宰血液或者植物组织中提取；( 2 ) 采用 转基因方法培养基因工程菌生产：( 3 ) 筛选能生产该酶的微生物，用发 酵方法生产1 4 2 。 动植物组织来源的转谷氨酰胺酶因其分离纯化过程复杂，来源稀 少，价格昂贵，限制了它在工业上的应用。微生物法生产t g a s e ，具 有生产成本低、产酶周期短和不受环境制约等优点，因此微生物t g a s e 的研究和应用进展相当迅速，目前研究对象已遍及细菌、放线菌、酵 母和霉菌各大类微生物中。而采用转基因方法生产的转谷氨酰胺酶， 在分子量大小和免疫性方面与微生物来源的转谷氨酰胺酶是一致的， 但酶活性较低1 4 ”。各种来源的转谷氨酰胺酶的制备流程如图1 3 所示 1 4 4 1 。 第一章绪论 豚鼠肝脏 l 植物组织ij 鱼组织l微生物组纠 i 土兰i 卤：黑i 离季交换l ：摹i 中 i 第二蒜b 南掣i 离季交换l卤 过滤 转谷氨酰胺酶 ，i 转谷氨酰胺耐 离子交换i l( 胁。鼽1 9 9 3 年) 峰刚( g e r b e r 鼽1 9 9 4 年) i 骡旁面李鐾爿申恢僦i l回 转谷氨酰胺酶j 羟基磷灰石 f a n d n 冬# i o r q 弁 吸附转谷氨酰胺酶l i ( y a s u e d a 等a , ，。舛年， i 亲和力层析i i 转谷氨酰胺酶 0 第二二章胶原纤维原料分散性能的研究 分布曲线基本保持不变，纤维温度升幅缓慢。 可见，球料比应该保持在一定合适的范围内，才能保证磨球的有 效工作。故选择球料比为1 0 ：1 ，此时产物的平均粒径仍较大，产物 分散性能较好，并且球磨能量的累积也较小。 2 3 6 球磨机转速的影响 图2 1 0 和图2 1 1 为不同转速下，所得产物的粒径及其分布情况和 纤维温度的变化情况。 霪 鲁 0 图2 1 0 转速对球磨的影响 ! l 。+ l l l ， ： t 一 ， l | | _ ，_ | 曩， i ! 。量叠 一- 一牟襞 甭 - ：f 1 01 09 ，花 a r t i c l es iz e ( p _ 1 1 ：对照样；2 ；3 0 0 r m i n ；3 ：4 5 0 r r a i n ； 4 ：6 0 0 r m i n ；5 ：7 5 0 r m i n ； 6 ：9 0 0 r m i n 图2 1 1 转速对粒径分布的影响 由图2 1 0 和图2 1 l 可以看出，转速对于物料研磨的影响主要分为 哪哪m m 啪嘲咻 b r 6 5 4 3 2 1 0 山东轻 = 业学院硕士学位论文 三个阶段：当转速低于6 0 0 r m i n 时，随着转速的提高，产物的平均 粒径基本呈逐渐下降的趋势，粒径分布逐渐宽化，球磨前后纤维温升 值逐渐呈直线上升。当转速由6 0 0 r m i n 进一步升高至7 5 0 r m i n 时， 中长纤维( 大于o 5 5 m m ) 所占的比例由3 7 2 5 骤降至1 0 ，7 7o 6 0 ，同时， 粒径低于0 1 m m 的小纤维迅速增多( 由2 9 4 0 增至4 6 0 5 ) ，平均 粒径迅速变小( 由0 4 7 m m 变为o 2 2 m m ) ，产物粒径分布明显宽化， 研磨前后纤维温升继续上升。当转速超过7 5 0 r m i n 后，产物的粒径 分布仍较宽化，平均粒径略有上升，球磨前后纤维温升略有下降。 在行星高能球磨机中，磨球在磨罐内的运动方式是十分复杂的。 磨球脱离磨罐壁后，并不象普通球磨机那样在空间作抛落运动而是贴 附于罐底擦动( 既有滚动也有滑动) ，因此其运动受到罐底的相对牵连， 从而引起一相对哥氏加速度，这样便又引起一相对附加惯性力。由于 上述牵连惯性力、相对惯性力、附加惯性力、相对附加惯性力以及磨 球与罐底的摩擦力同时出现，造成对粉体的强烈碾压及搓擦作用，有 利于提高研磨能力。一般情况下，转速越高，获得的粉料越细，粒径 分布更均匀j 。这是因为：一方面，磨球撞击惯性力的大小与转速的 平方成正比，转速的提升将使得磨球的撞击力迅速增大，并对粉体产 生强烈撞击，另一方面，随着球磨机转速的提高，磨球与球罐、磨球 之间的相对运动速度不断地增加，磨球对物料的撞击频率增加。总之， 转速的提升使磨球对粉料的冲击和研磨作用以及球磨的能量都将不断 的增加口7 。，表现为纤维平均粒径减小，粒径分布宽化和纤维最大温升 增大。但是当转速提高到一定程度后，可能存在部分磨球贴附在罐底 部随着粉料做高速空运转的情况，对于粉料的撞击作用有所减少，导 致在较高转速下，产物的平均粒径反而略有增加，纤维温升也略有下 降。 考虑机械损耗以及产物的粒径不宜过小，选择球磨机的转速在 6 0 0 r m i n 左右比较合适。 2 3 7 球磨时间的影响 图2 1 2 和图2 1 3 为球磨不同时间后，所得产物的粒径及其分布情 况和纤维温度的变化情况。 第二章胶原纤维原料分散性能的研究 图2 1 2 时间对研磨的影响 1 ：对照样： 2 1 09 9，9 5 p t r t ie l es i z e ( um ) 3 0 m i n ：3 ：6 0 m i n ：4 ：1 2 0 m i n ； 5 ：l8 0 m j n 图2 1 3 时间对粒径分布的影响 由图2 1 2 和图2 13 可以看出，时间对于物料球磨的影响可以分为 三个阶段：球磨时间在6 0 m i n 以内时，大于o 5 5 m m 的中长纤维显 著减少( 由7 5 3 5 降至2 1 4 3 ) ，产物平均粒径迅速减小( 由0 8 9 m m 降至o 3 9 m m ) ，粒径分布曲线逐渐向小粒径方向平移并略有宽化( 曲 线1 、2 和3 ) ，研磨前后纤维温度差基本呈直线上升。球磨时间在 6 0 1 2 0 m i n 之间时，产物的平均粒径和粒径分布基本保持不变，大约 6 0 的纤维集中分布在0 1 0 5 5 m m 之间，球磨前后纤维温升的趋势 变缓。当球磨时间超过1 2 0 m i n 后，产物中粒径低于0 1 m m 的小纤 维迅速增多( 由13 7 3 增至4 0 9 1 ) ，平均粒径迅速变小，粒径分布 明显宽化( 曲线4 和5 ) ，球磨前后纤维温升仍缓慢增加。 在研磨初期，原料中较为粗大的颗粒由于占据的空问大，承受磨 !i 5 i i 2 ；1 03 2 0 8 6 4 2 9 l l 0 毒o-写_f蔷 札 山东轻工业学院硕士学位论文 球碰撞的几率大，得以较好的粉碎。因此，与对照样相比，中长纤维 显著减少，产物的平均粒径迅速减小，粒径分布曲线向小粒径方向明 显偏移，球磨前后纤维温度差基本呈直线上升。当研磨时问超过6 0 m i n 后，研磨对象以中小颗粒为主，此时由于细小颗粒占的空间较小，承 受的冲击、研磨等作用较微弱，微裂纹的产生与扩展相对缓慢，粉碎作用 进行得不充分，平均粒径减小的趋势和纤维温升增加的趋势均明显变 缓，粒径分布仅略有宽化。随着时间的继续延长，由于磨球的反复作 用，颗粒内部微裂纹的产生与扩展变快，断裂破碎与疲劳破坏作用加剧， 颗粒充分细化，产物中的小纤维迅速增多，平均粒径进一步变小，粒 径分布趋于均匀，宽化明显。 另外，通过对产物进行的分散性实验表明：随着球磨时间的延长， 样品在水中的分散情况也越来越好。综合以上各指标，最佳研磨时间以 6 0 1 2 0 m i n 为宜。 2 3 8 正交实验的结果与讨论 正交实验的结果见表2 3 ；各项极差分析结果分别见表2 4 、表2 6 和表2 8 ；各项方差分析结果分别见表2 5 、表2 7 和表2 9 。 2 3 8 1 按平均尺寸分析 由表2 4 和表2 5 极差和方差的分析结果表明：对球磨后物料尺寸 影响最大的因素是球磨机转速，达到了显著水平，其次是球磨时间，最后 是球料比，但是后二者的影响不显著。并且球磨机转速越大、球磨时 间越长、球料比越大，原料所受的作用力越大，所得到的纤维越细小。 得出的这一规律从侧面说明了借助于激光粒度仪来表征纤维尺寸的可 行性。 由于获得纤维长度越长越好，按平均粒径分析，最佳的一项为 a 1 8 1 c 1 ，即l “。受到的作用力最小，产物尺寸最大，但实际上l “与 原粉相比外观相差不大，只有表面有受到轻度摩擦纤维外露的痕迹。 第二章胶原纤维原料分散性能的研究 b 1 b 2 b 3 b 4 b l b 2 b 3 b 4 b 1 b 2 b 3 b 4 b l b 2 b 3 c 1 c 2 c 3 c 4 c 2 c 1 c 4 c 3 c 3 c 4 c 1 c 2 c 4 c 3 c 2 4 9 4 5 5 4 4 1 5 9 3 1 1 8 8 2 0 3 7 2 4 7 0 5 7 4 6 6 0 1 1 3 9 8 4 1 2 6 ，3 4 4 8 9 6 4 1 0 8 4 0 3 9 7 8 6 1 6 5 1 9 4 8 6 3 9 1 4 3 0 6 2 0 6 7 0 6 8 7 6 6 7 9 3 4 1 1 2 3 7 1 5 7 13 1 0 9 8 l o 4 7 7 3 5 7 3 6 9 1 l o 0 6 7 0 1 6 2 2 7 5 2 a 4 b 4 c 1 2 2 4 2 88 6 5 4 表2 4 正交试验平均粒径的极差分析结果 项目料球比a转速b 时间c k 13 6 2 9 3 4 8 5 2 93 9 5 6 8 k 2 k 3 k 4 3 0 0 6 9 2 9 0 2 7 2 6 5 1 1 2 8 9 7 6 2 6 4 0 7 1 7 9 8 8 3 2 1 o l 2 6 7 7 3 2 3 4 5 9 堡差! ! ! ：! ! ! ! ：! ! ! ! ：! ! 查兰三! ! ! ! 1 5 5 5 5 5 5 5 5 眦置t c ；，5 5 m l 复5 m 2 3 蛆舭舭m舵舵舵们船们船船勰斛斛m渤仰鼢 山东轻t 业学院硕 学位论文 显著性说明：+ + ：影响高度显著；+ ：影响显著；( o ) ：影响不显著 表2 6 正交试验蓬松密度的极差分析结果 表2 7 正交试验蓬松密度的方差分析结果 显著性说明：+ + ：影响高度显著；+ ：影响显著；( o ) ：影响不显著 第二章胶原纤维原料分散性能的研究 表2 9 正交试验感观评价的方差分析结果 显著性说明： + ：影响高度显著；t ：影响显著；( 0 ) ：影响不显著 2 3 8 2 按蓬松密度k 分析 由表2 6 和表2 ，7 极差和方差的分析结果表明；因素对样品蓬松 密度的影响从大到小的排列顺序为：球磨机转速、球磨时间和球料比， 这与以上按平均尺寸进行分析的结果相一致。其中，球磨机转速达到 了高度显著水平，球磨时间和球料比均达到了显著水平，这一点和上述 按照平均尺寸分析的略有不同。 得出的较优水平为a 2 8 4 c 4 ，此时样品的蓬松密度达到最大，样品 应处于球磨的最佳状态。但该样品在已做过的实验中没有出现，最为 接近的为4 号样品，它只有球料比不是在最好水平，但是球料比的影 响是3 个因素中最小的，从实际做出的结果可以看出，它的蓬松密度 也是最大的( 见表2 3 ) 2 3 8 3 按感观进行分析 由表2 8 可知：r b r c r a ，因此因素对产物外观影响的主次顺序 山东轻工业学院硕士学位论文 为b c a ，最优方案是a 2 8 4 c 4 ，这与用蓬松密度分析所得的结果相 一致，因此可以得出最佳的球磨工艺条件为料球比1 ：l o ；球磨机转速 8 0 0 r m i n ；球磨时间9 0 m i n 。 另外，从表2 9 方差的分析结果可知，转速的影响达到了高度显著 水平，它是影响团块多少和分散性能优劣的主要原因，转速升高，产物的 团块变少，颗粒变细，在水中的分散性提高。其它因素的影响不显著， 这与以上按平均尺寸进行分析的结果相一致。 2 3 9 球磨过程分析 球料比1 1 4 ：1 ，转速6 0 0 r m i n 的研磨条件下，样品粒径及分布、 纤维温升和蓬松密度随时间延长的变化情况见图2 1 4 和图2 1 5 。 123 样a 号 1 ：球磨3 0 r a i n ；2 ：球磨6 0 m i n ；3 ：球磨18 0 r a i n 图2 1 4 样品随时间延长的变化情况 l ol 01 09 t p t r t l c les lz e ( um ) 1 ：球磨3 0 m i n ；2 ：球磨6 0 m i n ；3 ：球磨1 8 0 m i n 图2 1 5 粒径分布随时间延长的变化 i 4 4 4 4 4 4 4 7 i i 5 5 5 5 5 5 5 0 3 i 3 3 3 3 3 3 3 5 5 l 0 s 0 5 o 5 0 3 3 5 0 ) s 4 4 3 3 2 2 1 1 0 0 第二章胶原纤维原料分散性能的研究 由图2 1 4 和图2 1 5 可以看出，随着时间的延长，变化趋势为：平 均粒径逐渐下降；分布逐渐宽化并均匀；纤维温升呈逐渐增加；蓬松 密度先上升后下降。因此，