（生物医学工程专业论文）基于双光谱有毒赤潮藻图像自动识别系统的研究.pdf

a b s t r a c t n er e dt i d ei sap h e n o m e n o nt h a ts e a w a t e rc h a n g e sc o l o rc a u s e db yt h ee x c e s s r e p r o d u c eo ra s s e m b l i n go fh a r m f u la l g a e b a c t e r i aa n dp r o t o z o a n t h er e dt i d ei sa s e r i o u sg l o b a lm a r i n ed i s a s t e rc a u s i n gb i l l i o n so fd o l l a r s e c o n o m i cl o s st ot h ew o r l d s oi ti sv e r yi m p o r t a n tt op r e v e n ta n dm o n i t o ri t h o w e v e r , a tp r e s e n t t 1 1 e i d e n t i f i c a t i o na n dm e a s u r e m e n tm a i n l yo b s e r v e da n da n a l y z e di nt h el a ba r t i f i c i a l l y b u tt h ea r t i f i c i a lo b s e r v a t i o na n da n a l y s i sc a nn o ts a t i s f yt h ep r e d i c t i o no f t h er e d t i d e 。 t h ep a p e l i u s tb a s e so nt h ef a c t ，a n da i m sa t t od e v e l o pa na u t o m a t i cs y s t e m r e c o g n i z i n ga n dc l a s s i f y i n gt h eh a r m f u lm i c r o a l g a ，w h i c hw i l lb ev e r ys i g n i f i c a n ta n d m a k et h ep r e d i c t i o nw o r ko fr e dr i d em u c he a s i e r a c c o r d i n gt ot h ea u t of l u o r e s c e n tl l a t u r eo fh a r m f u la l g a e 也ep a p e rd e v e l o p e da l l a u t o m a t i cs y s t e mo fr e c o g n i z i n ga n dc l a s s i f y i n gh a r m f u la l g a eb a s e do nt h e d o u b l e s p e c t r u mt e c h n o l o g y t h es y s t e mi n c l u d e st w op a r t s ，h a r d w a r ea n ds o f t w a r e t h eh a r d w a r es y s t e mi n c l u d e sm i c r o s c o p e ，f l u o r e s c e n c es w i t c hd e v i c e ，c c d ，i m a g e c a r d , c o m p u t e r n e s o f t w a r e s y s t e m i n c l u d e si m a g e p r e - p r o c e s s i n g ，i m a g e s e g m e n t a t i o n , i m a g ef e a t u r ee x t r a c t i o n , i m a g ef e a t u r es e l e c t i o n ，e s t a b l i s h m e n to f h a r m f u la l g a ei n f o r m a t i o nd a t a b a s e r e c o g n i z i n ga l g a eu s i n gn e u r a ln e t w o r k t h e s o f t w a r ei st h ec o r eo ft h es y s t e m t h es o f t w a r ea c c o m p l i s ht h er e c o g n i t i o no fa l g a e u s i n ga r t i f i c i a ln e u r a ln e t w o r kb a s e do nt h ed i f f e r e n c eo ft h es h a p e ，t e x t u r e ，a n d c o n t o u rb e t w e e nd i f f e r e n tk i n d so fa l g a e t h ed o u b l e s p e c t r u mt e c h n o l o g yi sv e r yi m p o r t a n ti nt h ep a p e r , w h i c hm e a n s f l u o r e s c e n ti m a g ea n dg r e y - s c a l ei m a g eo fh a r m f u la l g a e i ti sa ne r i e c t i v em e t h o dt o e l i m i n a t eb a c k g r o u n dy a w pc o m b i n i n gt h ea d v a n t a g e so ft w ok i n d so fi m a g e t h e a d v a n t a g eo ff u o r e s c e n ti m a g ei st h a tt h eb a c k g r o u n di sc l e a r t h ea d v a n t a g eo f g r e y s c a l ei st h a tt h ec o n t o u ra n dt e x t u r eo fh a r m f u la l g a ei si n t a c t 1 1 m s i nt h e p r o c e s so fi m a g ea n a l y s i s ，f i r s t l yw e t a k ef l u o r e s c e n ti m a g ea n dg r e y s c a l ei m a g eo f h a r m f u la l g a eu n d e rs a m ef i e l do fv i e w ，t h e nw ep r o c e s st h ef l u o r e s c e n ti m a g ea n d m a r kt h ep o s i t i o no fa l g a e t h e nc o m b i n i n gt h ep o s i t i o ni n f o r m a t i o no ff l u o r e s c e n t i m a g ew i 伍t h ec o n t o u ra n dt e x t u r ei n f o r m a t i o no fg r e y - s c a l ei m a g e w ec a l lu s e c o m p u t e rt or e c o g n i s ea n d c o u n ta l g a ea u t o m a t i c a l l y t h ep a p e rd i dr e c o g n i t i o ne x p e r i m e n t sw i t h6k i n d so fh a r m f u la l g a ei n c l u d i n g g y m n o d i n i u ms t e m ，s a l i n ea l g a e ，n o c t i l u c as c i e n t i l l a n s ，h e t e r o s i g m aa k a s h i w o ， c o s c i n o d i s c u sg i g a se h r e n b e r ga n dp ra l g a e t h er e c o g n i t i o na c c u r a c yi su pt o9 0 ， a sc o m p a r e dw i t ht h eh u m a nr e c o g n i t i o n k e y w o r d s ：r e dt i d e ；a u t of l u o r e s c e n tn a t u r e ；d o u b l e s p e c t r u mt e c h n o l o g y ；a r t i f i c i a l n e 啪ln e t w o r k 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得鑫鲞盘鲎或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：剁碧 签字日期 如一7 年f 月加日 学位论文版权使用授权书 本学位j l 1 ；匕义t f 石- 兀a - - 全了解丕盗盘鲎有关保留、使用学位论文的规定。 特授权墨鲞盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名： 签字月期：力年i f 新躲j 彬 签字日期：z 刁年f 月夕日 第一章绪论 1 1 赤潮及其危害 第一章绪论 赤潮是在特定的环境条件下，海水中某些浮游植物、原生动物或细菌爆发 性增殖或高度聚集而引起水体变色的一种有害生态现象。赤潮是一个历史沿用 名，它并不一定都是红色，实际上是许多赤潮的统称。赤潮发生的原因、种类、 和数量的不同，水体会呈现不同的颜色，有红颜色或砖红颜色、绿色、黄色、棕 色等。值得指出的是，某些赤潮生物( 如膝沟藻、裸甲藻、梨甲藻等) 引起赤潮 有时并不引起海水呈现任何特别的颜色。 随着现代化工农业生产的迅猛发展，沿海地区人口的增多，大量工农业废水 和生活污水排入海洋，其中相当一部分未经处理就直接排入海洋，导致近海、港 湾富营养化程度日趋严重。同时，由于沿海开发程度的增高和海水养殖业的扩大， 也带来了海洋生态环境和养殖业自身污染问题；海运业的发展导致外来有害赤潮 种类的引入；全球气候的变化也导致了赤潮的频繁发生。 1 9 5 6 年，联合国将赤潮列为世界二大近海污染问题之一。赤潮灾害的多发 性、普遍性极大危害了海产养殖业和渔业资源，直接威胁着人类的生存环境和健 康水平。由于发生赤潮的微藻种类、发生季节，海区及成因不同，其危害方式及 危害程度差异较大。 1 危害方式与程度包括以下两点： ( 1 ) 产生毒素：已知能够产生毒素的微藻有7 0 多种，我国有2 8 种。有些赤潮藻 类产生的毒素能使鱼类、贝类死亡：如裸甲藻、棕囊藻产生的溶血毒素对鱼类有 致死效应。有的毒素可在动物体内累积，随食物链引起人类中毒甚至死亡。因误 食含赤潮毒素的贝类、鱼类引起人体中毒、死亡的事件每年都有发生。对人类健 康有直接伤害、目前对其结构和致毒机制了解较多的藻毒素主要有麻痹性贝毒 p s p 、腹泻性贝毒d s p 、记忆缺失性贝毒a s p 和神经性贝毒n s p 等。研究表明， 我国近海广泛分布产生p s p 、d s p 毒素的有毒赤潮藻，所产毒素已广泛积累在食 用海洋贝类中。 ( 2 ) 分泌粘液及有害物质：藻类分泌的粘液吸附在海洋动物鳃上、呼吸道粘膜上 或藻体阻塞呼吸道都会使动物窒息死亡。水面赤潮藻类暴发性异常增殖还会造成 海水p h 值升高、粘稠度增大、含氧量下降、水体光照强度下降。导致赤潮藻类 过度密集而死亡。尸体的厌氧分解又会产生大量的氨、硫化氢、甲烷等。致使鱼、 虾、贝类及海带、紫菜等海洋农作物大量死亡。这样既恶化了海洋生态系统，又 严重破坏了海洋资源，对海洋生物和人类的生存构成了极大的威胁。 第一章绪论 1 2 赤潮的预测 赤潮监测是赤潮管理的重要环节，通过监测，不仅可以掌握赤潮发生的规律、 了解赤潮形成的条件及赤潮藻类的毒素情况，提供必要的海洋环境及人类生活数 据，而且是赤潮预测、预报及减灾的依据。 目前我国尚无统一的赤潮监测规范，还没有将赤潮监测业务化，尤其缺乏对 有害藻类赤潮发生时的应急监测。2 0 0 1 年国家海洋局决定突破海洋环境监测传 感器、仪器平台、系统集成等方面的关键技术，建设2 - - 3 个国家级重点实验室 和工程中心，初步形成中国近海的海洋环境立体监测业务系统，与国际g o o s 系 统接轨，提高国产监测设备的市场竞争能力，使我国的海洋环境立体监测技术总 体水平达到国际9 0 年代的先进水平。 如能成功预报赤潮，及时对养殖区的鱼、贝类采取措施，将避免重大经济损 失。保护海洋生态系统，保证沿海地区经济和社会的稳定发展。但由于赤潮的发 生不是单纯的生态学问题，而是在海洋动力环境条件控制下的生态学问题，因而 赤潮发生的机理十分复杂，较难得出一个普遍适用的规律性结论。在机理不清楚 的条件下，预报工作进展更加艰难。目前人们从理论上提出了一些预报方法及模 式：1 ) 环境因子经验预测法如王正方等提出的溶解氧预测法、矫晓阳提出的透明 度预测法；2 ) 统计预测；3 ) 人工神经网络预报；4 ) 遥感预测；5 ) 建立赤潮生态模 型等多种方法。 2 1 世纪初中国海洋科技发展目标之一是以渤海和东海赤潮多发区为试验海 区，发展赤潮卫星遥感跟踪预报、统计预报及数值预报技术，开创赤潮试预报。 1 3 赤潮的治理与防治 为了减少赤潮发生的频率，减小赤潮发生时的损失，人们在探索多种方法来 预防和控制赤潮。在赤潮发生区喷洒絮凝剂如粘土，使赤潮生物粘在一起。沉降 到海底或喷洒化学药品( 如过氧化氢、臭氧、c u s o 。等) 可直接杀死赤潮生物。 s a t o s h it a k e d a 等以贻贝作为赤潮生物的克星生物而建立一种新的赤潮控制系 统。日本石尾教授发现“孤菌性藻浸染物能直接杀死赤潮生物。此外还有把含 有赤潮的海水吸到船上过滤，用围栏把赤潮发生区围隔起来等多种方法。 在各种治理方法中，喷洒粘土法是一种比较成熟的方法。在实验室和现场取 得了很好的结果，此法已被中国、日本、韩国、美国等国家采用，并且不断改进。 但该法不适用大规模、高密度的赤潮，另外对粘土类型、喷洒方法、费用等方面 也需要考虑。向海水中添加化学物质来控制赤潮，仍处于实验阶段且需要慎重， 因为这要考虑化学品的残留及其对环境的影响。生物治理法一如人工栽培的大 型海藻具有极高的生物生产力，在快速生长的同时他们能够从周围环境中大量吸 2 第一章绪论 收氯、磷和二氧化碳，同时大量释放氧气，这样他们在降低局部海域的富营养化 方面起到极好的作用。如果此项技术得到应用，将是一种比物理治理法和化学治 理法更优越的方法。 今后研究的重点主要体现在以下几个方面1 1 】：1 ) 压舱水对赤潮生物传播的影 响以及其它的扩散途径；2 ) 营养盐和毒素水平的相关性：3 ) 赤潮信息管理系统及 数据挖掘技术在赤潮预报中的应用研究；4 ) 麻痹性贝毒受体结合检测法的建立与 应用；5 ) 有害赤潮藻的快速鉴别和计数技术研究；6 ) 主要赤潮频发区富营养化和 有害赤潮研究；7 ) 有害藻的致毒机制及毒素分类；8 ) 赤潮灾害卫星遥感业务化监 测；9 ) 赤潮藻的培养生物学和分类学研究；1 0 ) 赤潮藻类的营养动力学及生理生 态学特性研究；1 1 ) 赤潮防治的研究；1 2 ) 赤潮藻类的生活史的研究；1 3 ) 赤潮藻 类毒素的研究；1 4 ) 赤潮生消过程和统计模型研究。 1 4 应用显微图像分析方法预报赤潮的发展和现状 目前国内外对海水中赤潮浮游生物的光学测量，主要有两类方法：一是显微 镜分析法，通过实验室或“围隔”生物培养优势赤潮藻，利用显微镜，采样分析。 目前已建立了多种有害赤潮藻的显微图谱。但是，直接应用这种图谱识别现场水 体中的赤潮藻还存在很大的困难，因为，现场海水中的赤潮藻是与悬浮沙等多种 悬浮物混合在一起，尤其沿岸河口和海湾海水中有大量泥沙，对现场测量带来很 大困难。研究直接从现场海水中获得显微图的赤潮浮游生物综合测量系统与分析 技术，目前，国内外均未见有关报道和专利。另一类是通过测量海水的吸收、散 射和荧光特性来完成。近年来出现了一系列该类现场光学仪器，其代表仪器有： 美国国家基金会资助研制的叶绿素吸收测量装置；d z a n e v e l d 博士领导的俄勒 冈大学海洋光学研制组与西部环境技术实验室( 1 e t ) 合作，研制的六波长吸收 系数测量仪，该仪器是在聊三波长叶绿素a 吸收测量仪基础上开发出来的，它 可以测量6 7 6 n m 、6 5 0 n m 和7 1 5 n m 的光吸收特性，该仪器能测量叶绿素吸收的绝 对值，其分辨率等于或好于标准荧光计。 尽管显微镜分析法，可直观、精确地判定浮游生物的种类、准确的测量赤潮 藻个数，但没有现场仪器，而且利用生物显微镜观测海水样品，对赤潮优势藻种 人工分类和计数，是目前分析有毒赤潮藻种类和数量的主要手段。但是这种方法 十分原始、落后，人为因素影响大，效率和精度低。而第二类方法，可用于现场 浮游生物种类和浓度测量，缺点是数据反演困难，工作环境受水质限制( 光深 0 3 ) 。 然而图像处理与分析技术的发展，为研制基于图像处理技术的有害赤潮优势 藻自动分析系统提供了可能。自2 0 世纪7 0 年代末以来，由于数字技术和微机技 第一章绪论 术迅速发展给数字图像提供了先进的技术手段，图像科学也就从信息处理、自动 控制系统理论、计算机科学、数据通讯等学科中脱颖而出，成长为旨在研究图像 信息的获取、传输、存储、变换、显示、理解与综合利用的崭新学科。 图像处理技术首先在形状固定目标的自动识别中得到了广泛的应用。在这些 应用中，采用f o u r i e r 描述符、不变矩和h o u g h 变换等技术的物体识别研究取得 了良好的效果。 c h i m 等提出了以统计矩不变量为特征的字符识别技术。这些矩不变量包括 h u 矩不变量、放射矩不变量和t s i r i k o l i a s - m e r t z i o s 矩。在d u d a n i 的飞机识 别系统中，使用了贝叶斯判别准则和以距离为权值的k 最近邻判别准则。该实验 系统对6 种飞机型号的1 3 2 幅图像的测试表明，其识别率比肉眼识别率要高 2 】。 随着图像处理和模式识别技术的发展，这些技术在生物图像识别中，也有了 广泛的应用。在对白血球的分类研究中，s e v o k o v a 开发了一套分析系统采用 数字图像处理技术对血细胞样品进行识别【3 】，罗立民和杨晓敏采用最大类间方差 法对胞核、胞浆和背景进行分割，并从众多的特征中，选择了3 5 个最具代表性 的参数，并分层分级对六类白细胞进行判别，总体识别率达到9 0 以上，此外还 有很多基于图像处理和模式识别的白细胞识别技术【4 h 1 2 1 。陆新泉等将神经网络应 用于肺癌细胞的识别研究当中，结合了细胞的形态和颜色特征，采用神经网络技 术，其总体识别率达到了9 0 以上【”】。 g t h e o d o r o p o u l o s 对家畜的寄生幼虫图像进行识别，采集6 7 个幼虫单体 的2 5 5 幅图像，利用l v q 神经网络对提取的特征进行识别，识别的正确率达到 9 1 9 t 1 4 】。k a t s i n i s 和p o u l a r i k a 沿着这个途径对海洋生物进行分类。 t h i l e 在s t e v e n a g e 的水质量会议上提出了蓝一绿藻自动识别的原型。t h i l e 和w h i l t s h i r e 采用邻域平均和直方图均衡的方法对图像进行增强，利用基于l o g 算子的分割方法，对藻类图像进行分割。利用形态学的闭运算对得到的边缘进行 平滑和封闭处理。所选择的特征包括：6 个细胞特征( 视场内的细胞数量，细胞 的平均宽度，细胞的平均长度，宽度的标准偏差，长度的标准偏差) 、1 4 个f o u r i e r 描述符、7 个不变矩、2 0 个纹理信息。最后的识别率达到9 3 1 1 5 】【l6 】。 但是基于计算机的显微图像分析系统却很少应用于微藻的识别与计数。几乎 很少有这方面的文章被发现。然而以上这些应用中所采用的一些技术同样可以应 用到有害优势赤潮藻的识别和计数方面。 由此可见，结合图像处理和模式识别技术，对赤潮优势藻的显微图像进行分 析，利用计算机代替人工对赤潮生物进行识别和计数，可以解决人工计数所带来 的诸多问题。 4 第一章绪论 1 5 本文的研究内容和意义 从7 0 年代以来，我国赤潮发生频率以每1 0 年增加3 倍的速度上升。1 9 9 8 年至今，每年都发生了面积超过1 0 0 0 平方公里、世界罕见的特大赤潮，造成了 重大的经济损失，对海洋生态环境、资源和公众健康构成了严重威胁。它预示着 我国赤潮高发区的海洋生态环境已经受到了严重的干扰，生态系统的正常结构和 功能可能已经或正在被改变，而且生态环境一旦失衡恶化，将很难在短期内恢复。 有害赤潮已成为制约我国沿海经济可持续发展的一个重要因素，引起了我国政府 的高度重视和社会各界的普遍关注【1 7 】。因此，搞清我国海域有害赤潮形成机理、 提出预测和防治方法以减轻赤潮灾害，已成为我国海洋研究工作者的重要课题。 此时作为预报赤潮的主要手段之一的人工观察和分析，由于其劳动强度大，远远 不能满足赤潮检测的需要。 如果结合现代图像处理和模式识别技术，研制现场有毒赤潮藻优势种自动测 量仪并建立基于形貌特征的图像信息库，对赤潮优势藻的显微图像进行分析，利 用计算机代替人工对赤潮生物进行识别和计数，可以大大减轻其工作的劳动强 度。将荧光分析加入到图像处理当中，使得处理效果更加有效。因而实验用基于 双光谱的赤潮藻图像分析仪的研制可为研制现场有毒赤潮优势藻自动测量仪打 下基础，这无疑是一项具有重要意义的工作。 本文想要解决的问题有： 如何去除海藻图像包含的大量噪声； 如何对海藻图像进行有效处理； 如何提取海藻图像的特征； 如何对所提取的特征进行分析； 如何建立海藻图像库并设计分类器； 为了解决这些问题，课题的研究内容包括： 研究海藻的光谱特性： 根据海藻的光谱特性设计荧光摄像系统硬件； 设计图像处理软件，完成藻类图像处理，提取藻类特征，进行特征分析 及选取，设计藻类分类器，建立藻类形貌特征信息数据库； 在软硬件基础上进行识别实验。 第二章赤潮生物光谱特性研究 第二章赤潮生物光谱特性研究 由于海藻体内含有叶绿素，因而在不同波长激发光照射下会产生不同的光谱 特性。本文试图将藻类的光谱特性差异应用于藻类的分类识别过程。基于此，本 文中通过光谱实验研究了海藻的吸收光谱特性和荧光光谱特性，并根据光谱实验 结果为下一步设计海藻自动识别系统的硬件结构提供了理论依据。 2 1 海藻的吸收光谱特性研究 利用分光光度计测量了小球藻、盐藻、小球藻和盐藻混合、小球藻、盐藻、 泥沙混合后的吸收光谱特性曲线。以下为盐藻，小球藻等的光谱特性曲线图，其 中横坐标为吸收光波长，纵坐标为吸光度大小。 图2 - i 盐藻的吸收光谱特性曲线 6 第二章赤潮生物光谱特性研究 图2 - 2 小球藻的吸收光谱特性曲线 图2 - 3 盐藻和小球藻混合样品的吸收光谱特性曲线 图2 4 泥沙的吸收光谱特性曲线 7 第二章赤潮生物光谱特性研究 图2 5 盐藻、小球藻以及泥沙混合样品的吸收光谱特性曲线 图2 6 盐藻、小球藻以及泥沙的吸收光谱特性比较曲线 以上是对盐藻，小球藻，泥沙，盐藻和小球藻混合样品以及盐藻、小球藻 和泥沙的混合样品进行吸收光谱实验的特性曲线。由上述光谱特性曲线可以看 出，泥沙由于不含有叶绿素，因而吸收光谱较为平坦，不会对特定波长的光有明 显的吸收特性。而盐藻和小球藻由于体内含有叶绿素，因而在吸收光谱特性曲线 上有明显的吸收峰，也即对某一特定波长的光具有较为显著的吸收特性。而将盐 藻和小球藻样品混合进行实验，以及将盐藻和小球藻的吸收光谱特性曲线进行比 对可以发现，盐藻和小球藻的吸收波峰均出现在6 5 0 h m 附近，由此说明盐藻和小 球藻的吸收光谱特性不存在明显的差别。 8 第二章赤潮生物光谱特性研究 根据海藻的吸收光谱实验可以得出以下结论，由于海藻体内都含有叶绿素， 因而对特定波长的光具有较为显著的吸收作用，不同种类海藻的吸收光谱特性较 为相似，因而无法应用海藻的吸收光谱特性来识别海藻。 2 2 海藻的荧光光谱特性研究 根据相关文献，可知由于海藻体内含有叶绿素，是一种荧光性物质，在一定 波长激发光照射下会产生不同于激发光波长的荧光，本文对海藻荧光光谱特性进 行了实验研究。 2 2 1 海藻荧光特性的理论基础 当用一种波长的光( 如紫外光) 照射某种物质时，该物质会在极短时间 ( 1 0 - 8 j ) 内，发射出比照射光波更长的光( 如可见光) ，称为荧光。不同荧光性物质， 由于分子结构和能量分布的差异，各自显示出不同的吸收光谱和荧光光谱特性。 对某一待测物质，只要选择一组合适的激发滤光片和荧光发射滤光片，即可将物 质发射的荧光与激发光分离，将荧光信号检测出【墙】。由于赤潮藻中含有叶绿素a ， 从而在特定波长的激发光的照射下，赤潮藻将产生相应荧光，其荧光波长主峰在 6 8 0 h m 左右，半波宽约为2 0 n t o 。激发光波长以3 5 0 和4 5 0 h m 效果最为显著【l 9 1 。 以上参数因不同藻的叶绿素的含量不同，藻的形态结构的不同以及与其它色素的 比例不同会略有区别。为此本研究采用f - - 4 5 0 0 f l 分光光度计对多种藻类进行 荧光参数测定实验。图2 7 是新月菱形藻在各种不同波长的激发光下其荧光的产 生情况示意图，其中( a ) 图是采用3 5 0 h m 激发光的荧光效果，( b ) 图是采用4 5 0 h m 激发光的荧光效果，( c ) 图是采用5 5 0 h m 激发光的荧光效果。各图分别在各处的 激发光波长处因瑞利散射产生了一个峰，该峰不应计在荧光谱内。由图可见，在 3 5 0 和4 5 0 主峰高度最高( 由于测量浓度过高，到1 0 0 0 0 单位荧光峰被截止，峰 顶宽度越大，表明峰值越高) 但无论是哪种波长的光照射下，在6 8 0 h m 左右都 会产生荧光主峰其半波宽约为2 0 h m ，因此，以下荧光实验中采用6 8 0 h m 作为接 收峰中央频率，2 0 h m 为其接收峰半波宽。 图2 - 8 是在选定6 8 0 h m 做为接收峰中央频率的情况下，测量新月菱形藻、赤 潮异弯藻、裸甲藻对不同波长的激发光所激发的荧光强度图谱。由图可见，各藻 在3 5 0 n m 处都将产生较明显的荧光响应。为此，采用3 5 0 h m 做为激发光波长进行 荧光实验。 9 第二章赤潮生物光谱特性研究 n if 帆o ( c m 图2 7 赤谢异弯藻在不同激发光下荧光的产生情况示意圈 图2 - 8 时不同激发光的6 8 0 衄荧光响应强度曲线 2 22 拍摄海藻荧光图像 根据海藻的荧光光谱特性，运用荧光显微镜拍摄了裸甲藻，办潮异湾藻新 月菱形藻和小球藻的荧光图像。以下是各种荧光图像的效果图。 a ) 4 3 0 r m 激发光( b ) 4 5 0 衄激发光( c ) 5 1 0 r l m 激发光 罔2 - 9 裸甲藻荧光圈像 a ) 5 1 0 n m 檄茇光 第二章赤潮生物光谱特性研究 ( b ) 4 6 0 h m 激发光 图z 1 0 赤潮异湾藻荧光圈像 图2 - l l 新月菱形藻荧光圈像( 5 l o n m 辙发光) 上面的荧光图像均是在暗室条件下拍摄的，可见同一种海藻在不同波长激发 光的照射下，所产生的荧光效果是不一样的，上述荧光图像图像效果非常理想， 背景非常清晰，由于泥沙等杂质不能产生荧光，所以荧光图像中只含有海藻的信 息，从而可以有效的去除泥沙等杂质所产生的背景噪声，但是由于荧光圈像分辨 率较低，加上藻类体内的产生荧光的色素分布不均匀，使得荧光图像的中藻类的 纹理信息和轮廓信息有所丢失，所以无法单独依据荧光图像进行藻类的识别，藻 类的识别最终还是要依据灰度图像而荧光图像只能起到一定的辅助作用。 a ) 绿光檄发( b ) 红光激发( c ) 红光澈技( 含较多泥沙 图2 1 2 小球藻荧光图像 上述荧光图像中，国( a ) 是在绿光激发下拍摄的小球藻荧光图像，圈( b ) 是在红光激发下拍摄的小球藻荧光图像，图( c ) 是在小球藻内加入较多的泥沙 后用红光激发得到的荧光图像。上述荧光图像效果较差圈( a ) 由于使用绿光 激发激发光和荧光波长相差较大，荧光几乎不受激发光的影响，效果相当较好： 图( b ) 中由于使用红光激发，激发光和荧光波长相差较小所以荧光受到激发 光影响较大效果较差；图( c ) 中，由于加入了较多的泥沙杂质，而泥沙杂质 由于受到荧光的照射发生散射，也呈现出红色，导致藻类和背景无法区分，所以 第二章赤潮生物光谱特性研究 荧光效果非常差。所以在拍摄荧光图像时应该选取与荧光波长相差较大的激发 光能够得到较好的荧光图像。 2 23 同一视场下荧光图像和灰度图像对比研究 拍摄显微镜下同一视场的荧光图像和普通显微图像，对比二者可以看出荧 光图像和普通显微图像的各自优势所在。 - 毫。i ( a ) 荧光图像 ( b ) 普通显徽图像 图2 一1 3 显微镜下同一视场赤潮异湾藻荧光图像和普通显微图像对比 ( a ) 荧光图像( b ) 昔通显微图像 圈2 一1 4 显微镜下同一视场裸甲藻荧光图像和普通显微圈像对比 上述图像是在显微镜下同一视场拍摄荧光图像和普通显微图像对比，从对比 效果可以看出，荧光图像背景非常清晰，不舍有杂质信息，全部都是有用的藻类 信息，而普通显微图像中则受杂质影响较大。但由于荧光的分辨率较低加之藻 类体内的叶绿素分布是不均匀的，导致荧光图像的分辨率较低，藻类的纹理和轮 廓信息有所失真，而普通显微图像则能很好保留藻类的纹理和轮廓信息。因而可 以结合二者的优势进行藻类图像分析，结合同一视场下的荧光图像和灰度图像进 行分析可以有效去除泥沙等产生的背景噪声，首先分析荧光图像将荧光图像中 的藻类区域进行标定，然后再分析灰度图像，只分析荧光图像中标定的藻类区域， 这样就可以不去分析杂质，从而可以将杂质有效去除，然后对普通显微图像进行 藻类纹理和轮廓信息分析，可阻有效识别不同种海藻。 第二章赤潮生物光谱特性研究 2 3 小结 通过海藻海藻光谱特性实验分析，可以得出如下结论： ( 1 ) 不同种类海藻的吸收光谱特性较为相似，因而无法应用海藻的吸收光谱特性 来识别海藻。 ( 2 ) 海藻的荧光光谱特性可以应用到藻类的识别过程中，因为海藻的荧光图像背 景非常清晰，不含有杂质信息，可以拍摄在显微镜下同一视场的荧光图像和普通 显微图像，结合二者的优势，首先分析荧光图像，标定图像中海藻的区域，然后 分析普通显微图像，只分析已经标定的区域，其余部分为杂质，根据海藻的纹理 及轮廓信息等可以完成藻类的识别和分类。 第三章赤潮生物自动识别系统简介 第三章赤潮生物自动识别系统简介 赤潮自动识别系统包括硬件系统和软件系统两部分。赤潮生物识别主要是 基于赤潮海藻显微图像的分析进行的，所以首先必须获得较为清晰的海藻显微图 像，显微图像的获取取决于硬件系统。在获得较好的显微图像以后，通过软件系 统进行图像处理、特征分析、特征提取、特征选择、特征输入人工神经网络分类 器得到识别结果。图3 - 1 为赤潮生物自动识别系统的总体结构框图。 图3 - 1 赤潮生物自动识别系统总体框图 3 1 硬件系统结构 赤潮生物识别的效果取决于赤潮藻显微图像的质量，图像质量越好识别准确 率越高，而图像质量取决于硬件系统，所以说硬件系统的好坏最终决定了赤潮生 物识别的效果。本系统的硬件系统包括照明光源，显微镜，c c d 成像系统，图像 采集设备，计算机。结构框图如图3 - 2 所示。 1 4 第三章赤潮生物自动识别系统简介 图3 - 2 硬件系统结构框图 3 1 1 光源照明系统 光源部分包括若干不同色光的光源，圆形光源载板，光学聚集系统组成，如 图3 - 3 所示。为实现双光谱分析，采用周期性多种单色光源切换式照射，并对所 采集的图像分别进行传输和处理，然后再进行相关软件分析，最终得到处理结果。 光源切换装置在单片机的控制下，转动圆形光源载板，使不同色光光源分别在透 镜焦点上点亮，从而完成对光源的切换。又因为照明光源为点光源，会造成视场 不均匀，当利用体视显微镜测量诸如夜光藻之类直径在1 0 0 0 弘m 左右的赤潮生物 的时候，视场不均匀所造成的影响，就尤为明显，为后继图像处理带来很大的不 便。在改进的光源系统中，设计使得光源载板上每个点光源都位于透镜焦点上， 所以发出的光经透镜后成为平行光，从而解决了视场照明不均的问题。 图3 - 3 光源结构示意图 3 1 2 图像采集卡和c c d 透镜成 像平面 图像采集卡采用嘉恒中自公司生产的d h - c g 3 0 0 ，该图像采集卡提供了丰富 的接1 2 1 函数，分析软件通过调用这些接口函数即可以得到所需的图像，同时可以 对采集参数进行设置。需设置的参数有： 1 视频输入制式 视频输入为标准p a l 、n t s c 制信号。 第三章赤潮生物自动识别系统简介 2 输入窗口大小 对于p a l 制式t 最大窗d 尺寸为7 6 8 x5 7 6 像素。 3 输出窗口大小 输出窗1 3 必须小于输入窗口尺寸，本软件采用6 4 0 4 8 0 像素大小。 4 色彩空间 支持r g b 3 2 、r g b 2 4 、r g b l 6 、r g b l 5 、r g b 8 、y u v 4 2 2 、黑白图像 g r a y 8 等图像格式。 5 图像卡采集控制 图像卡采集控制包括：视频源路、亮度、对比度、色调、色饱和度。 6 c c d 摄像头有效视场要与光学视场匹配 为了使显微镜视场内的藻在c c d 光敏面上有效成像，c c d 摄像头的有效视场 必须大于显微镜视场，选1 2 英时c c i ) 摄像头，可满足要求。 7c c d 摄像头解像度 为了得到足够清晰的图像，根据测量范围的下限值，同时考虑到上限值，微 藻在视场内应有足够的数目用于统计测量。因此选取解像度为：6 0 0 线。 31 3 显微镜的调整 为了实现荧光成像，对普通显微镜要进行改造。一是光源的结构和光源的亮 度的选择，二是荧光滤色片的选取。根据前面光谱实验得出的结论，在入射光源 处选取的为4 2 0 r i m 中心波长，1 0 r i m 半波宽透射率为5 0 的的滤色片，在接收口 选取的为6 8 0 r i m 的高通滤色片，入射光源选取3 0 5 0 w 的冷光源灯。 ( a ) 滤色片实物圉( 黑色的为激发光 滤色片，红色的为荧光滤色片) 疆濯l甩疆疆啊翌 蝈妊换 嘞 第三章赤潮生物自动识别系统简舟 吼加澹色片拍摄荧光醐图3 - 4 荧光切换茹嬲i 色片拍摄普通显馓圈像 图 荧光切换装置实物图 3 2 软件系统结构 软件系统是本系统的核心，软件完成海藻图像的全部图像处理，特征分析， 特征选择。设计分类器，建立赤潮生物特征信息数据库等全部工作，最终的识别 结果完全取决于软件。软件系统的结构如图3 5 所示。 圈3 - 5 软件系统框图 软件系统主要由图象获取、图像预处理、图像分割、特征提取、特征选择和 分类器几个部分构成。以下为各部分的介绍： ( 1 ) 图像获取： 图像获取部分是软件和硬件系统的接口部分，可以设置图像采集卡的各种 参数，主要是控制图像采集卡获得海藻的显微图像或者荧光图像，并且存储在计 第三章赤潮生物自动识别系统简介 算机内以便进行后续的处理。 ( 2 ) 图像预处理 针对显微赤潮生物图像的特点，在赤潮生物图像分析系统中采用一系列图像 预处理技术：对于光源引起的背景不均匀的图像，利用差影的方法将原图像与背 景作减法，除去由于光源引起的背景的不均匀，即减少了背景噪声对图像分割的 影响；而平滑操作主要用来减小热电子噪声、采样、量化、传输以及图像采集过 程中环境的扰动在赤潮生物图像中产生的噪声和其他不良影响，选用中值滤波算 法，可以克服线性滤波器带来的图像细节的模糊，并且对于滤除脉冲干扰和图像 扫描噪声最为有效最后，对于反差小的赤潮生物图像要进行灰度直方图均衡增 强处理，从而达到提高对比度的效果，以利于图像分割。 ( 3 ) 图像分割及形态学处理 图像分割是图像处理中一个关键的步骤，图像分割就是将图像中要研究的部 分从背景中提取处理，将图像进行二值化处理，将图像分为目标和背景两个部分， 能否得到好的分割效果决定着最后识别的准确程度。分割后的图像，仍存在孤立 的小噪声点和目标区域内的细小空洞，在其周边存在凹坑和凸刺。主要采用腐蚀、 膨胀及其组合方法即开运算与闭运算等数学形态学算子去除干扰 ( 4 ) 特征提取 赤潮生物识别主要是基于不同种类海藻之间形貌及纹理特征的差异，所以要 能够准确识别各种海藻，必须要准确提取海藻的形貌及纹理特征信息，其特征主 要包括几何形状特征，纹理特征和灰度特征。 ( 5 ) 特征选择 在提取的海藻特征中，有些特征可能不够典型，不能准确反映各种藻类之间 的差异，所以必须从中筛选较为合适的特征。特征选择是从已经提取的特征中挑 选出最有代表性的特征，同时又要去掉冗余的特征。特征选择的过程是模式识别 中一个非常重要的过程，能否选择出最能体现海藻信息差别的特征子集决定着海 藻识别的准确率。 ( 6 ) 赤潮生物数据库的建立 赤潮生物数据库是进行赤潮藻识别的主要依据，数据库内主要存放各种赤潮 藻类的典型特征信息。建立数据库时，应首先拍摄一些某一种藻的标准样本，经 过特征分析，特征提取以后将各种特征信息存入数据库内，做为分类器设计的主 要依据。 ( 7 ) 分类器设计 分类器的设计是进行模式识别的最关键的一步，分类器最终决定了识别的准 确程度。分类器部分主要是利用已经提取的藻类特征进行判断，识别出每一种藻， 分类器的设计是十分关键的，直接决定了识别结果的准确程度。 第三章赤潮生物自动识别系统简介 3 3 小结 本章对赤潮生物自动识别系统的硬件组成和软件结构作了简要的介绍。硬件 基本结构框架包括显微镜，c c d 成像系统，图像采集卡，光源及高性能计算机， 分析了各部分的组成以及性能参数；软件部分主要包括图像的采集，图像的预处 理，特征提取，特征选择，数据库的建立与分类器的设计等几部分。图像处理软 件是本系统的核心，本文后面章节将对各部分做详细探讨。 1 9 第四章赤潮生物图像处理及分析 第四章赤潮生物图像处理及分析 本文的基本技术路线就是通过对赤潮藻类显微图像进行图像处理，图像分 析，根据各种藻类之间形貌特征的差异来识别和分类藻类。所以通过图像处理准 确提取藻类的形貌信息特征，以及如何应用这些特征建立藻类分类器实现藻类的 识别分类是本文的核心技术。 图像处理过程包括图像获取，图像预处理，图像分割，形态学处理等部分。 以下详细介绍图像处理及分析过程。 4 1 图像获取 图像获取部分即是通过图像采集设备获得海藻的荧光图像以及普通显微图 像，将其以数字图像形式存储在计算机内，以备后续处理，图像获取过程要拍摄 显微镜下同一视场对应的荧光图像和普通显微图像，在图像预处理阶段可以借助 荧光图像去除杂质等产生的背景噪声。 4 2 图像预处理 图像预处理部分主要要完成两方面的工作，第一，结合图像获取部分得到 的显微镜下同一视场的藻类荧光图像和普通显微图像进行分析，通过在荧光图像 上标定海藻的区域，然后根据海藻的区域位置信息分析普通显微图像，可以去除 杂质产生的背景噪声；第二，针对显微赤潮生物图像的特点，我们在赤潮生物图 像分析系统中采用一系列图像预处理技术：图像平滑，中值滤波，直方图均衡等 操作等减小背景噪声。 4 2 1 结合荧光图像和普通显微图像进行处理 由于荧光图像背景较为清晰，基本不含有杂质信息，在荧光图像上出现的 基本都是藻类的信息，但由于荧光图像分辨率较低，加之藻类体内产生荧光的叶 绿素分别不均匀，所以荧光图像中藻类的形貌信息有所失真，无法直接通过对荧 光图像分析进行藻类识别。而普通显微图像则很好地保留了藻类形貌特征，但受 杂质影响较大，直接对其进行分析也很难得到满意的结果。结合二者的优势，则 可以解决这一问题。首先对荧光图像进行处理，标定出荧光图像中海藻的区域信 息，而没有标定的区域就可以认定为背景或者杂质产生的背景噪声；然后再分析 与荧光图像对应的同一显微视场下的普通显微图像，根据前面标定的区域信息， 第四章赤潮生物图像处理及分析 只对标定的区域进行分析这样既可以有效去除背景噪声，又可以减小图像处理 过程中的计算量。图4 1 即是结合同一显微视场下的荧光图像和灰度图像进行处 理的效果图。 ( b ) 荧光图像 d ) 荧光图像分割 ( e ) 根据荧光图像标定分析区域 ( n 海藻计数 图4 - i 结合荧光图像和灰度图像进行图像处理 其中图( a ) 是普通显微图像，图( b ) 是荧光图像，闰( c ) 是对图( a ) 进 行图像分割的效果，图( d ) 是对图( b ) 进行图像分