（生物医学工程专业论文）斑马鱼肌间骨的自动提取.pdf

a b s 仃a c t硕士论文 a b s t r a c t a so n eo ft h em o s tv a l u a b l ef i s h ，z e b m f i s hh a st r e m e n d o u sp o t e n t i a la p p l i c a t i o n si n d i s e a s em o d e l i n ga n dm e d i c i n ei n v e n t i o n t h ea i mo ft h i sp a p e ri st op r o p o s ea na d v a n c e d m e t h o dt oi m p l e m e n tt h ea u t o m a t i cd e t e c t i o na n dr e c o g n i t i o no fs o m i t e so fz e b r a f i s h f i r s t ，v a r i o u sk i n d so fi m a g es e g m e n t a t i o nm e t h o d sa r ed i s c u s s e ds u c ha st h r e s h o l d s e g m e n t a t i o n , e d g ed e t e c t i o n , s e e dg r o w t hm e t h o d ，o u t l i n et a k i n ga n dw a t e r s h e dm e t h o d b a s eo nt h ea l g o r i t h mw em e n t i o n e da b o v e ，an o v e lm e t h o di sp r o p o s e dt or e a l i z et h ei m a g e s e g m e n t a t i o no fz e b r a f i s h , w h i c hi sf a s ta n dr o b u s tc o m p a r e dt o o t h e re x i s t e da l g o r i t h m s t h e nb yu s i n gs q u a r es t a n d a r d ，t h ew h o l em a i np a r to fz e b r a f i s hi st a k e no u t m a k i n gar o t a t e t o w a r d st h ei m a g ei sv e r yi m p o r t a n t t h u st h es o m i t e sa r ep r o j e c t e di n t ot h eh o r i z o n t a la x i s a n dw eb e g i nt ot a k et h es o m i t e s i nt h ee n d ，an e wm e t h o di sp r o p o s e dt ot a k et h es o m i t e s ， w h i c hi sb a s e do na v e r a g ed i s t a n c es t a n d a r d t h ee x p e r i m e n t ss h o wt h a tt h ea l g o r i t h mi s e f f e c t i v et o w a r d st h ez e b r a f i s hi m a g e k e y w o r d ：t h r e s h o l ds e g m e n t a t i o n ，o p e r a t o rc o m p u t a t i o n ，a n g l eo p t i m i z a t i o n , p i x e lt r a v e r s a l i i 声明尸明 本学位论文是我在导师的指导下取得的研究成果，尽我所知，在本学 位论文中，除了加以标注和致谢的部分外，不包含其他人已经发表或公布 过的研究成果，也不包含我为获得任何教育机构的学位或学历而使用过的 材料。与我一同工作的同事对本学位论文做出的贡献均已在论文中作了明 确的说明。 研究生签名： 盘! ! 垫! 当 一口侔6 月却日 学位论文使用授权声明 南京理工大学有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅或上 网公布本学位论文的部分或全部内容，可以向有关部门或机构送交并授权 其保存、借阅或上网公布本学位论文的部分或全部内容。对于保密论文， 按保密的有关规定和程序处理。 研究生签名：耋壹箜j 歹年占月哆日 硕士论文斑马鱼肌间骨的自动提取 1 绪论 斑马鱼又称蓝条鱼、花条鱼，原产于印度、孟加拉国。起初斑马鱼只是用于观赏， 但是后来随着科学研究的深入，人们意外发现斑马鱼基因和人类基因的相似度竟然达到 8 7 。这也就意味着在斑马鱼身上的实验结果在多数情况下都可以适用于人体，因此它 受到了科学家的格外重视。同时，因为斑马鱼的胚胎是透明的，所以科学家可以很容易 观察到药物对斑马鱼内部器官的影响，这是斑马鱼相比较其他实验动物的又一个重要优 势。除此之外，雌性斑马鱼可以一次产卵数百枚，这些胚胎可以在2 4 小时内发育成形， 这就使得科学家在同一代鱼身上进行不同的实验，这有利于科学家研究病理演化过程并 及时发现病因。 1 1 斑马鱼研究现状 由于基因技术的突飞猛进，人类在与疾病的斗争当中又有了新的武器。正是基因工 程的存在，人们可以更加精确地研究病毒入侵的内在机理和演化过程。而斑马鱼无疑为 我们提供了这样一个基因宝库。斑马鱼体质透明、繁殖速度快，这些都给我们的研究带 来了极大的方便。所以现在，无论是国内还是国外，斑马鱼都掀起了一阵研究的热潮。 斑马鱼成年鱼个体小，易于饲养，成年斑马鱼个体长约4 5 厘米，雄鱼体修长，雌 鱼体肥大。一个盛3 升水的鱼缸可养殖2 0 3 0 尾成鱼，因此在有限的空间可以养殖相当 大的群体，可开展对样本需求量大的研究。斑马鱼发育快速，性成熟期短，繁殖力强， 在2 8 5 摄氏度培养条件下受精后约4 0 分钟完成第一次有丝分裂，之后大约每间隔1 5 分钟分裂一次，2 4 小时后，主要的器官原基已形成，各个脑室，眼睛，耳，血细胞，体 节等均清楚可见，相当于成长了2 8 天时候的人类胚胎。在合适的条件下，3 个月就可以 达到性成熟。而且，斑马鱼在很多方面都与人类有相似之处：它的神经中枢系统，内脏 器官，血液以及视觉系统，在分子水平上8 5 与人相同，尤其是心血管系统，早期发育 与人类极为相似；另外斑马鱼本身具有自我修复破损视网膜的独特能力，并且研究人员 发现人类视网膜中也拥有类似斑马鱼能够修复视网膜的细胞。雌雄鱼的交配行为受光刺 激，可以通过调控光周期或控制雌雄鱼的接触而控制产卵时间。一尾雌鱼一般每次可产 卵1 0 0 - 3 0 0 枚，每周可产卵一次。因此，利用斑马鱼做研究材料，可以保证每天获得成 千上万的胚胎，这是用哺乳动物做研究材料所无法达到的。更重要的是：这些透明状态 的胚胎是在体外发育生长的，便于科学家对它进行观察研究。斑马鱼的这些自身特有的 特点和优势，又随着2 0 世纪9 0 年代，完善的胚胎和遗传学操作技术的发展，使得斑马 l 绪论硕士论文 鱼成为模式动物家族中重要的一员并受到越来越多的重视和利用。1 9 9 6 年，d e v e l o p m e n t 专门用一期增刊发表了3 6 篇关于斑马鱼突变体的相关论文。这些报道证明，斑马鱼是 迄今用于饱和诱变的唯一脊椎动物，因此在生命科学领域引起了极大的反响，在随后数 年中吸引了全世界大批实验室和科学家开始利用斑马鱼做模式动物，从此使其成为最重 要的模式脊椎动物之一。 目前，整个生物学领域，对斑马鱼的研究主要体现在以下几个方面： 1 ) 胚胎发育：斑马鱼发育速度快，如果能够弄清楚胚胎发育的信号机制，那么人 类也就可以实现对畸形儿的早发现、早治疗。 2 ) 心肌修复：科学家发现斑马鱼的心脏在受损后能够实现自动修复。如果能够知 道斑马鱼是如何修复这些受伤的组织，那么人类就有可能找到治疗疾病的新方法。斑马 鱼的这一优良特性给人类带来了希望。 3 ) 癌症研究：斑马鱼在癌症研究方面是一个非常有价值的模型。如果我们通过某 种途径让斑马鱼患上和人类一样的癌症，那么这对癌症病毒的机理研究以及对癌症药物 的发明具有重要的现实意义【3 1 。 1 1 1 国外研究 关于斑马鱼的研究，最初是从遗传学开始的。2 0 世纪7 0 年代初，美国俄勒冈大学 著名遗传学家乔治博士就开始研究斑马鱼的遗传特性【l 】。经过十年的研究，乔治博士的 研究组于1 9 8 1 年在自然上发表了一篇具有深远意义的论文【2 】。这也拉开了斑马鱼研 究的序幕。 目前，国外开展的斑马鱼研究项目很多，这其中就包括了斑马鱼的胚胎发育机制 5 , t o j i a 7 1 、体轴的形成【7 ，引、胚层的优化与分导1 2 1 、胚胎中的细胞发育【6 ，1 6 1 、脑部器官形 成 9 , 1 3 , 1 4 , 1 5 、药物学研究【3 】以及构建斑马鱼的疾病模型【4 1 8 】等等。 1 1 2 国内研究 目前国内对斑马鱼研究的领域主要集中在生物医学工程领域，研究的目的基本上都 是利用斑马鱼本身优良的实验特性观察特定病毒基因在生物体内的渐变和衍生过程。目 前研究的大学和机构主要包括清华大学、复旦大学、中国海洋大学、国家斑马鱼模式动 物中心【2 l 】等等。 1 ) 清华大学生物科学与技术系师生的研究论文斑马鱼d p r 2 通过n o d a l 受体的降 解抑制中胚层诱导作用，2 0 0 4 年1 0 月1 日在美国科学杂志发表。同时，与此相应 的博士论文还获得了2 0 0 7 年全国百篇优秀博士论文【2 0 】。该研究在世界上首次发现了一 种动物胚胎发育调控的新机理，这也为揭开人的出生缺陷之谜提供了新的思路。 2 硕士论i 斑马鱼肌问骨的自动提n 2 ) 复旦大学培育成功一种神奇的可直观检测环境雌激素污染的“转基因斑马鱼”， 并于2 0 0 7 年初通过专家验收。这种鱼能够直观、灵敏、方便、快速地显示水环境中雌 激素物质污染程度。即便水环境中雌激素污染物质达到极其微量的程度，转基因斑马鱼 的肝脏也会发出绿色荧光。 3 ) 中国海洋大学的医学生物学研究室，以段存明博士带头的研究团队，在分子水 平上对斑马鱼的研究也很有建树。他们在斑马鱼胚胎发育、衰老研究以及细胞模型对药 物筛选领域也发表了多篇论文。 1 2 生物图像处理 后来随着基因时代的到来，为了研究基因组之间的作用机理和器官的发育过程，人 们开始利用高通量高内涵的生物图像设备来记录生物的发育过程。渐渐地，生物图像处 理成为了斑马鱼研究的主要手段。 目前市场上已经有了一些高通量高内涵的图像信息处理系统，比如说m e t a m o r p h , u t h s c s a i m a g et o o l ，q u e di m a g e ，g ei nc e l la n a l y z e r1 0 0 0 ，b i o - r a di m a g ea n a l y s i s s o t t w a r e 和d e f m i e n sc a l l e n g e r 。由于这些软件处理系统基本是和硬件一起设计的，除 了价格昂贵之外，它们在很大程度上是为了某一种特殊用途设计的，因此很难将其应用 到更多的生物研究领域当中去。 ( a ) g e i n c e l l 成像设备 ( b ) 斑马鱼高通量高内涵图像 图1 1 高通量高内涵成像设备及图像 目前，由于高通量高内涵生物成像在国际上处于起步阶段，还远未成熟所以相应 的信息系统也处于起步阶段。现在，国际上领先的研究结构如哈佛大学医学院，卡内基 梅隆大学，加州大学芭芭拉分校，加州大学圣地亚哥分校等都针对特定高通量高内涵的 生物图像应用开友了相应的生物信息系统。但是这些系统局限性强，无法将其应用和扩 1 绪论硕士论文 展到其他的领域。 在计算机研究领域，对斑马鱼的分析主要还是来自于运用成熟的计算机图像处理技 术对斑马鱼中的某些特征进行重点提取和分析。这些特征通常情况下都是斑马鱼实验分 析过程中重要的判断指标。另外，由于准确性和数量级的原因，简单、重复地对生成的 斑马鱼图像进行海量的搜索和分析对个人来说也是不可能完成的任务。另外，实时性是 我们斑马鱼研究的一个重要指标。由于斑马鱼会在2 4 小时内会由胚胎发育到性成熟， 仅仅凭借人连续的蹲守和观察是不现实的，而且不同的实验者会有不同的选择和判别标 准。连续性、一致性是计算机处理的一个重要优势。只要选择合适的算法，完成对斑马 鱼的实时研究和分析也是完全有可能的。 现在，斑马鱼的研究工作主要涉及到以下有几个方面的内容：1 ) 斑马鱼形态测量 学算法：2 ) 斑马鱼体节量化算法；3 ) 斑马鱼脑部图像的分割算法；4 ) 粘连细胞图像 的计数和分类。 现在，国内开展斑马鱼图像相关领域研究的机构还比较少，目前为止主要集中在西 北工业大学和南京理工大学。现工作在哈佛医学院的刘天明早年毕业于西北工业大学， 他是对斑马鱼展图像进行计算机信息化处理的第一人 2 3 之6 】。另外，西北工业大学硕士生 王雅萍就斑马鱼的曲线结构提出了一些新的检测方法【2 刀。南京理工大学的陆建峰教授的 研究方向之一就是生物医学工程，斑马鱼的图像处理也是陆建峰教授积极引入和发展的 研究课题，目前已经在国际和国内期刊上发表了数篇论文，研究成果显著 2 2 , 2 5 , 2 6 】。硕士 生张东杰在陆教授的指导下对斑马鱼的视网膜细胞分类做了系统的研究幽】。 1 3 本文研究工作 斑马鱼研究项目是国家自然科学基金项目( 编号6 0 7 7 5 0 1 5 ) ，主要开展高通量高内 涵成像系统条件下斑马鱼图像分析关键算法研究。图像分析的结果，主要用于以下生物 医学研究目的： 1 ) 阿尔茨海默症基因( a l z h e i m e r sd i s e a s eg e n e s ) 的分析；2 ) 视网膜发 育的分析；3 ) 体节( s o m i t e s ) 的分析；4 ) 基因表达的量化分析。 1 3 1 研究目的 肌间骨是胚胎的自然分割，在胚胎的发育过程中，这些自然分割的数目不断增加。 因此，肌间骨的数目是胚胎发育阶段的最好指标，肌间骨的缺失与延迟出现可以很清楚 地反映胚胎的发育情况。图1 2 为不同时期斑马鱼胚胎的生长图片。 4 坝l 晓文斑马鱼肌阃骨的自动提取 | 堇1 12 斑马鱼胚胎细胞 作为在斑马鱼生长过程中具有指标性意义的肌问骨，对于整个斑马鱼前期研究工作 的开展具有十分蕈要的意义。通常对于斑马鱼肌问骨的提取，计算机无法做到一步到位， 不能直接采用模板的方法进行匹配搜寻。因为分布十整个图像的噪声难以让计算机提取 到合适的肌间骨标本，所以本文将采取渐进的手段对肌间骨进行提取。图l3 即为斑马 鱼的软体，嗬红线标注的部分即为斑弓鱼的肌问骨。 弋攀 圈】3 斑马鱼肌问骨提取 1 3 2 处理步骤 由图14 可以看出，斑马鱼肌问骨的提取主要分为图像分割和肌问骨提取两个部分。 首先，本文利用s o b e l 算子和闻值的方法实现了一种对斑马鱼软体部分进行分割的方法， 见22 小节。然后，本文利用周长和面积作为度量标准，成功地提取了斑马鱼的软体组 织部分，见3l 小节。为了保证斑马鱼肌问骨提取的正确率，我们必须尽量使图像尽量 l 绪论 硕士论文 位于一个比较水平的位置之上，所以本文提出了三种计算图像角度的方法，分别为 h o u g h 变换法、最d , - - 乘法以及最大半径法，见3 2 小节。最后，本文提出了三种不同 的肌间骨提取方法，分别为基于直线的肌间骨提取、自适应肌间骨提取以及基于中间线 的肌间骨提取方法，取得了很好的实验效果，见4 1 小节和4 2 小节。 1 4 论文结构 图1 4 斑马鱼肌间骨提取流程图 本论文共分五章。 第一章主要讨论斑马鱼研究的意义、斑马鱼研究的现状以及本文的研究工作和取得 的成果等等。 第二章主要研究如何对斑马鱼图像实施分割，用来实验的分割算法包括阈值分割、 边缘检测、种子生长、轮廓提取以及分水岭算法等等。我们从图像处理效果、算法复杂 度、空间复杂度等几个方面对这些分割算法做了一个综合的比较。最后，本文提出了一 种基于s o b e l 算子和o t s u 阈值的软体分割算法，取得了很好的图象分割效果。 第三章主要实现了肌间骨的提取和旋转角度的确定。3 1 节中采用周长和面积阈值 的方法，成功地提取出了斑马鱼的主体部分。而3 2 节则分析了三种不同的计算旋转角 度的方法。最后，本章讨论了肌间骨提取之前对图像采取的一些预处理技术。 第四章主要实现了斑马鱼肌间骨的提取和计数。为了挑选肌间骨的起始分布点，本 文提出了三种不同的肌间骨搜寻方案。接着本文提出基于阈值和宽度的肌间骨计数算 6 硕士论文 斑马鱼肌间骨的自动提取 法，并在斑马鱼图像中有了很好的应用。本文将从识对率和识全率两个方面来对这个算 法进行分析。 第五章给出了完整的肌间骨提取方案。从最初的原始图像到最后的肌间骨被完整提 取，本文将给出完整的描述和具体的实验。 最后，总结了本文的工作，并对未来的工作提出了展望。 7 2 斑马鱼图象分割硕士论文 斑马鱼图像分割 图像分割是一种重要的图像分析技术。在图像的研究和应用中，人们往往对图像中 的某些部分感兴趣，这些部分常常称之为目标或者背景，它们一般是指图像中特定的、 具有独特性质的区域。这里的独特性往往是指图像像素的灰度值、物体轮廓曲线和纹理 等等。这些独特性同时也成为了我们实现图像分割的依据和判断标准。为了识别和分析 图像中的目标，需要将它们从图像中分离出来，这样才利于对图像的进一步定性和定量 分析。 根据g o n z a l e z 对图像分割给出的一般定义，即图像分割是指将一幅离散数字图像信 号f ( m ，n ) 进行分割，将f 分割为若干相连的、非空子区域f l ，丘，6 ，f n ，且满足如 下均一性准则啪1 。 1 )f i u f 2 u f 3 u f 。= f ： 2 ) 当i = l ，2 ，n 时，f 。是相连的； 3 )对于任意i ，f ；的均一性都是满足的； 4 )对于任意两个相连的f 。和f j ，e ( f 。nf ，) = c d 。 目前图像分割的方法已有上千种，每年还有很多新方法出现。文献 4 2 , 5 0 l 对现有图像 分割算法做出了概括和总结。文献【5 7 】贝0 详细描述了图象分割技术在图像内容检索中的应 用。 传统的分割算法对于我们提出新的分割算法具有重要的借鉴意义。比如说，2 2 节 中设计的方法综合运用了阈值分割和边缘提取的思想，而3 1 节中软体部分的提取，则 涉及到了种子生长、轮廓提取和区域分类等多个方面。所以，学习经典的分割算法对于 斑马鱼图像的处理具有重要的现实意义。 2 1 传统图像分割方法 典型而传统的图像分割方法可以分为基于阈值分割的方法、基于边缘提取的方法、 基于区域生长的分割方法等等。本文下面将对灰度阈值、边缘算子、种子生长、轮廓提 取以及分水岭等五种分割方法依次进行分析和介绍。最后，本文将从时间复杂度、空间 复杂度等方面分别对它们的分割效果进行比较和分析。 2 1 1 阈值分割 最简单的图像分割算法就是把图像灰度分成不同的等级，然后设置灰度阈值确定有 意义的区域和分割物体的边界。常用的阈值化处理就是图像的二值化处理，即选择一个 8 硕士论女 斑马鱼肌问骨的自动提取 有效闽值，将图像转换成黑白二值图像，用于图像分割以及边缘提取。目前计算闽值的 方法主要有下面四种方法，即均值法、中值法、迭代法、o t s u 法。均值法就是计算所有 像素总和的平均值。中值法和均值法类似，但是它的基本思想就是：小于阈值t 的像素 数要和大于阚值t 的像素数t 基本相等。迭代法主要来自于逼近的思想，它通过不断计 算小于阈值t 的平均灰度z - 和大于闽值t 的平均灰度z 2 ，然后计算z i 和z 2 的平均值 得到新的闺值t ，新得到的t 又可以产生新的z l 和z 2 ，这样就可以不断迭代下去，当 得到的t 和t ，之间的绝对值小于l 的时候，那么迭代过程自动结束。o t s u 闻值也称之 为大津阈值，是1 9 8 9 年由日本的大律展之提出来的，它是在差别与最小二乘法的基础 之上提出来的，可以得到比较好的效果 3 9 删。 2 1 1 1 实验过程 实验选用的是一组连续的1 0 幅图像，图21 是对其中一幅图的处理效果。图2l 中 的四幅图中除了一幅图为原图之外，其他三幅图是根据中值法、迭代法和o t s u 方法得 到的效果图像。均值法采用的所有像素值叠加取平均值的方法，所以算法复杂度为 o ( m ) 。中值法、迭代法、最大方差闺值法则是建立在直方图基础之上的，因此算法复 杂度要小很多。 ( a ) 原圈中值法1 2 2 ( c ) 选代法1 2 6 ( 由o t s u l 2 6 图2 1 闽值分割 2 马鱼幽象分割 顶l 论i 2 12 实验分析 闽值分割通常是基于这样的一个假设：目标内部或者背景内部的元素是相近的。这 些信息如果反映在直方图上面就是，目标和背景形成不同的区域高峰，而高峰之间的波 谷就是我们所需要的图像闰值。好的闺值分割不仅可以大大降低图像的计算复杂度，而 且可以给后面的图像理解与模式识别带来方便。 由上面四幅图可以发现，三种方法计算得到的闽值非常地相近这表明从图像效果 来看三种方法没有太大的差异。从整体效果上说，闺值分割已经将背景和目标分开出 来。但足，我们也发现，在图像的右上方，存在部分区域和背景叠合在一起。这就为斑 马鱼软体部分的提取带来了麻烦。为了做到软组织的精确提取，我们有必要借助于形态 学的相关知识，在图象分割前做必要的腐蚀处理。 2 i 2 边缘检测 边缘检测是图像分割、目标区域识别、区域形状提取等图像分析领域中十分重要的 技术，也是图像自身的一个重要特征。在进行图像理解和图像分析时。第一步往往就是 边缘检测，目前它已经成为机器视觉口4 研究领域最活跃的课题之一，在工程应用中占有 十分重要的地位。在实际应用中，通常为了简便，我们用微分算子的形式代替真正的梯 度函数。这种卷积函数的实现方式显得更加方便和快捷。边缘检测中常用的算子有s o b e l 算子、p r c w i t t 算子、l o g 算子、r o b e r t s 算子和c a n n y 算子旧等等。防止计算值超界， 可以在相应的模板前面加上系数，比如说s o b c l 算子前面可以乘以1 ，4 。 2 12 1 实验过程 实验选用的是一组连续的1 0 幅图像图2 2 是对其中一幅图的不同处理效果。图b 、 图c 、图d 、图e 、图f 分别对应于s o b e l 算子、p r c w i t t 算子、l o g 算子、r o b e r t s 算子、 c a n n y 算子。除了c a n n y 算子外，其它四种方法的算法复杂度都为o ( m + n ) 。因为c a n n y 算子涉及到了边缘计算和闺值比较，所以c a n n y 算子的运算量要比其他方法大很多。 f a l 原幽 ( b ) s o b c l 算子 硬l 论文马鱼肌间骨的自动提取 0 ) p t e w i ( t 算子 ( d ) l o g 算子 ( e ) r o b e r t s 算子( f ) c a n n y 算子 图2 2 边缘检测 2 122 实验分析 由实验可以发现，除了l o g 算子以外，其他四种算子都可以提取出斑马鱼的软体 轮廓，尤其是s o b e l 算子和p r e w i t t 算子效果晟佳。l o g 算子的处理图像并非全部都是 黑点，只是由于自点较少，原始图像很大，所以呈现黑色状。算子分割中所呈现的图像 特性，为我们设计适应于斑马鱼图像的分割算法提供了很好的思路a 2 1 3 种子生长 种子生长的基本思想是将具有相似性质的像素集合起来构成区域m 】。先在需要分割 的区域寻找一个种子作为生长点，然后将种子周围邻域中与种子相同或相似的像素( 根 据某种事先确定的生长标准或者相似准则来判定) 合并到种子所在区域中。当新的点被 合并以后，再利用新的点重复这一迭代过程，直到没有可接受的邻域点为止，这样一个 区域就生成了。通常，对于初始种子点的选取也有如下的几种方法：( 1 ) 随机选取。这 种方法简单，如果种子点比较集中于某一区域，这种方法还是比较实用的。( 2 ) 中间点。 因为我们拍照的时候都会将人物或是风景置于图片的中央区域，所以这种方法也有一定 的可取性。( 3 ) 由上到下、由左到由依次遍历像素，直到寻找到第一个黑点为止。这种 2 斑马鱼幽象分割 硕论文 方法适用干绝大多数场合，因为通常面对一幅待处理的陌生图像时，使用者的先验知识 仍然是十分有限的。 2 13 l 实验过程 实验选用的是一组连续的1 0 幅图像罔23 、图2 4 是对其中一幅图的不同处理效 果。种子生长方法的关键在于起始点的选择和种子生长规则的确立。由于种子生长取决 于特定的图像、特定的规则，因此无法估计算法的复杂度。但是相比较其他分割算法， 种子生长需要系统分配额外的内存空间保存当前队列的种子以及矩阵中的各像素的访 问状态。线性增强是将 7 0 ，2 1 0 】内的元素映射为 0 ，2 5 5 1 的元素。直方图增强则是根据概 率分布重新计算新的映射像素值。种子点为图像的正中点。 a 直方图增强后的种子生长 ( 曲直方图增强后图像 0 ) 阈值为 b 线性增强后的种子生长 图2 , 3 直方图图像种子生长 ( a 1 线性增强刳像 ( d ) 阕值为1 6 ( b 1 闽值为6 9 | 馨 硕镕立 斑马鱼肌问骨的自动提b 7 c ) 闽值为1 1( d ) 阐值为1 6 圈2 4 线性增强图像种子生长 2 13 2 实验分析 由圈可示，随着生长规则的放松，斑马鱼的主体部分正在被一步步挖掘出来。虽然 两组图的生长点和生长规则是一样的，但是由于预处理的增强方法不一样，导致了最终 的处理效果也不一样。当生长的条件为像素之差不能大于1 6 时，先前线性增强的图像 可以生长出一定数量的肌间骨，而直方图增强的图像却不能获得满意的结果图像。当然， 除了图像分割外，种子生长也可以应用在其他很多方面，比如说区域归类等等 2 1 4 轮廓提取 图像分割的一个最终目的就是为了提取图像的轮廓。如果能寻找到一种好的轮廓提 取算法，不仅有利于图像分割，而且有利于计算机对图像进行定量运算和进一步分析- 文献口6 埘图像的轮廓提取算法做了全面的介绍，其中包括水平集、s n a k e 以及主曲线等 算法。目前比较流行的算法主要有以下两种，即轮廓跟踪算法和八邻域轮廓提取算法。 轮廓跟踪的基本方法是：先根据某些严格的初始要求找出目标物体轮廓上的像素，再根 据这些像素的某些特征拽出目标物体轮廓上的其他像素。 图a 的起始点是图像遍历中遇到的第一个黑点元素，轮廓跟踪的准则足检测当前点 的邻域中是否存在和当前点一样的边界点。 当前点的周围是否都是黑点像素，如果是， ( a 1 轮廓跟踪 图b 判断一个点是否为边界点，关键就是看 那么将当前点置为白点，否则置为黑点。 图2 5 轮廓跟踪算法 ( b ) 八邻域提取 固 2 斑马鱼图象分割 砸 论女 轮廓跟踪效果的好坏主要取决于两个因素，第一个因素是跟踪的起始点的选择，起 始点的选择直接影响到跟踪的精度，同时如果起始点选得不好，还给算法的设计增加难 度。第二个因素是跟踪准则的选择，准则既要便于理解和分析，又要便于程序的设计边 界。边界跟踪的基本方法是：先根据某些严格的初始要求找出目标物体轮廓上的像素， 再根据这些像素的某些特征找出目标物体轮廓上的其他像素。 b 八邻域的轮廓提取 八邻域的轮廓提取非常简单，就是掏空内部点：如果原图中有一点为黑，且它的八 个相邻点皆为黑，则该点删除；对于非二值图像，则需要先进行图像二值化处理 2 1 5 分水睾 分水岭的算法最初来自于地质学，后来被应用到图像处理领域。文献i 。i 针对图像分 割提出了改进型的分水岭算法，文献对分水岭的定义和算法做了定义和介绍，文献【5 0 】 提出了一种基于链表的分水岭算法，在满足一定情况下可以有效地提高算法的运行速 度。从本质上说，分水岭算法和种于生长算法是一样的，只不过分水岭算法是n 个种子 一起生长。由于无法估计原来图像中有多少个连通区域，所以不能准确得到算法的时间 复杂度。因为需要记录n 个连通区域的类别状态。同时为了后续区域生长的需要，我们 还需要记录区域的边缘信息，所以分水岭算法要比普通的种子生长算法消耗更多的内存 空间来记录这些临时信息。 2 15 1 实验过程 实验造用的是一组连续的1 0 幅图像，图2 6 是其中一幅斑马鱼的处理效果图。从本 质上说，分水岭算法和种子生长算法是一样的，只不过分水岭算法是n 个种子一起生长。 由于无法估计原来图像中有多少个连通区域所以不能准确得到算法的时间复杂度。因 为需要记录n 个连通区域的类别状态，同时为了后续区域生长的需要，我们还需要记录 区域的边缘信息，所以分水蛉算法要比普通的种子生长算法消耗更多的内存空间。 硕士论文 斑b 鱼肌问骨的自动提取 匦融 圈2 6 分水岭算祛 图中，( a ) 为原始图像，( b ) 为选择阕值1 2 0 之后变化的图像，0 ) 选择1 2 0 阈值后对图像黑点进行 聚类的图像( 其中灰色代表太于1 2 0 瞬直投有参加聚类的像素点，黑色代表轮廓边缘，白色代表类 别内部点) ，m ) 是分水岭过程结染后类别之间的边缘图像。盆地膨胀后，所有点都拥有了自己的了类 别归属。 2 15 2 实验分析 和大多数边缘提取和图像分割算法一样，噪声点对最终图像分割效果的影响是致命 的。所以，在进行图像处理之前，计算机有必要对图像进行去噪、平滑等一系列的处理， 尽管这些处理是有风险的。从本质上来说，分水岭算法集中了闽值分割和种子生长两个 方面的优势。与此同时，计算机还可以利用周长、面积等度量手段继续对它进行后期处 理。但是，它的缺点也很明显：频繁的内存分配、盆地分类中边缘点与内部点的区别处 理，这些都使得它相比一般的图像分割需要消耗更多的运算时间。 2 1 6 实验分析 实验分析主要是从算法复杂度和空问复杂度等几个方面对上面提到的几个算法进 行分析和说明。 表2 1 分割算法性能比较表 2 斑马鱼图象分割硕士论文 由表可知，阈值分割和算子计算对所有图像都具有稳定性、确定性和可操作性。轮 廓提取的方法虽然结果非常理想，但是它对图像自身的要求非常高，一般可以用来作为 图像的后续处理手段加以利用。种子算法和分水岭在某种程度上可以看成是相似的算 法，它们的计算过程都需要辅助队列的参与。尤其是分水岭，为了计算子分类的面积和 周长，还需要额外的队列对相同类别的边缘和内部点分别保存。虽然在时间复杂度上具 有一些不确定性，且它对图像本身的质量要求不是很高，所以它和阈值方法一样，都是 我们进行图像分割是优先考虑选择算法。 2 2 斑马鱼软体部分分割 基于前两章给出的算法和实验比较，本文设计出一种基于s o b e l 算子和阈值的完整 的斑马鱼肌间骨提取方法。第一部分，将给出完整的提取步骤。第二部分，给出图像的 完整流程图。第三部分，将对斑马鱼软体部分进行分割，并给出相应的实验结果。 斑马鱼软体部分的分割主要利用了已有的m a t l a b 函数，而斑马鱼软体提取、图像旋 转、骨架提取和第5 章的计数过程则是采用了c + + 语言实现，编译器为m i c r o s o f t 公司 的v i s u a ls t u d i o6 0 ，操作系统为w i n d o w sx ps p 2 ，处理器为i n t e l 的p e n t i u m ( r ) 4 ，2 8 0 g ， 部分代码参考了文献 2 9 , 3 0 , 3 4 , 3 7 , s 】，主要参考的网站有【5 5 , 5 6 】。 2 2 1 分割算法设计 本节的主要目的就是寻找一种分割算法，它能够完整地提取出斑马的软体部分。经 过2 1 节的实验，我们可以发现算子方法可以很好地保留斑马鱼的轮廓，而阈值方法可 以分清图像的背景和内容。这样，只要综合运用边缘和背景信息，我们就可以完整地设 计处提取斑马鱼肌间骨的算法。 本节设计的分割算法步骤如下所示： 1 ) 利用o t s u 方法计算获得斑马鱼的分割阈值； 2 ) 依次遍历图像中的每一个像素点，如果像素值大于o t s u 阈值，则不做处理，像 素置为黑点，反之对像素点做s o b e l 算子计算： 3 ) 分别在水平方向进行1 3 、垂直方向进行3 1 形态学膨胀运算； 4 ) 去除软体连通域之内的不可连通块，使得斑马鱼软体组织成为一个连通的大区 域，比如可以使用m a t l a b 中的i m f i l l ( i , h o l e ) 函数； 5 ) 对图像做形态学腐蚀运算，运算模板为菱形结构，这样可以使得斑马鱼软体部 分的边缘更加光滑。 1 6 砸论文 斑马鱼肌问骨的自动提取 2 2 2 软体部分分割流程图 基于阐值的s o b e l 计算 j 水平和垂直做膨胀操作 j 局部区域的孔洞剔除 j 腐蚀处理，光滑边缘 图2 7 软体分割流程 2 2 3 实验图像 223 1 实验分析 实验选用的是一组连续的1 0 幅图像。图2 8 是对其中一幅图片的处理效果。如图所 示分割算法清晰地提取了斑马鱼的轮廓取得了较好的实验效果。 m 原图 c o ) 提取边缘 ( c ) 膨胀 m 空洞剔除 2 斑马鱼图象分割 硕士论文 ( e ) 边缘光滑 图2 8 斑马鱼图象分割 如图所示，算法基本上可以提取出比较完整的斑马鱼软体图像。但是，现在图像中 仍然存在着很多的小的白点区域。计算机需要将这些小的白点进行剔除，并将相应的软 体图像提取出来，这样才能有利于本文进一步的研究。 2 , 232 传统方法下的图象分割 对2 23 1 中的图像进行传统方法分割。如图所示图a 为原图，图b 、图c 、图d 、 图c 、图f 依次为o t s a 阈值分割、s o b e l 算子分割、种子生长、八邻域分割以及分水蛉 分割得到的效果图像。 _ 翟- j 盈 碗论文 斑马鱼肌问骨的自动提取 ( e )( d 图2 , 9 图像分割效果 图b 是o t s u 阈值分割图，闺值分割已经将背景和目标分开出来。但是，我们也发 现，在图像的右上方，存在部分区域和背景叠舍在一起。这就为斑马鱼软体部分的提取 带来了麻烦。图c 是运用$ o b e l 算予的运算，算子可以将斑马鱼的软体部分清晰地表示 出来这表明只要进行略微的膨胀和去洞处理，我们就完全有可能将斑马鱼的软体部分 完全提取出来。图d 是种子生长的分割图，起始种子点就是图像的中间点，种子的生长 条件是像素值之差不能大于1 6 。图e 是八邻域分割图像，由于源图像中存在很多的噪声 点，所以处理后的图像也不是很干净，存在报多的噪声点。图f 是采用分水岭算法后得 到的效果图，在起始分割时采用的闽值是o t s u 闺值。由图可以发现，图像的分割过于 细致。很多单独的噪声点都被膨胀形成了一个独立的连通域。 综合处理效果分析，我们设计的算法可以将斑马鱼软体组织较好地分割出来，而一 般的算法不具备这样的特质。 2 3 本章小结 本章的主要目的是实现斑马鱼图像的分割。因为论文的目的是对斑马鱼的肌间骨进 行提取和计数，所以最理想的情况的就是能够完整地提取出斑马鱼的软体部分。2i 节 介绍了经典的几种图像分割算法，并且运用这几种图像分割算法对斑马鱼图像进行了分 割实验，对它们的性能做了相应的分析和比较。2 2 节提出了一种新的图像分割算法， 算法取得了良好的分割效果，这为我们下一步斑马鱼软体的提取做了很好的铺垫。 3 斑马鱼软体提取与旋转角度确定 硕士论文 3 斑马鱼软体提取与旋转角度确定 斑马鱼分割虽然已经完成，但是斑马鱼整个软体部分的分割并没有结束。运用什么 样的度量标准可以合理地将斑马鱼软体部分提取出来成为我们必须解决的一道难题。另 外，虽然斑马鱼的肌间骨在软体体内是按照一定的角度排列的，但是如果随意地对斑马 鱼肌间骨进行提取将会产生很大的错误率。所以，一个可行的方法就是让斑马鱼软体部 分尽量在一个水平面上展示出来，这样将会极大地增加我们提取的正确率。 本章内容将做如下安排：3 1 节介绍了如何按照周长法或者面积法完整地提取出斑 马鱼的软体部分，3 2 节介绍了三种计算斑马鱼旋转角度的方法，3 3 节介绍了斑马鱼肌 间骨提取之前必须要进行的一些预处理工作等等，比如增强、阈值分割以及图像滤波等 等，只有综合掌握这些技术才能最终提取出斑马鱼的肌间骨。 3 1 斑马鱼软体部分的提取 通过比较噪声白点和斑马鱼主干部分，可以发现噪声区域白点比较少，集中度高， 面积小，周长短。只要设置合理的面积和周长阈值，或者寻找到最大值的黑点区域，我 们就可以完整地把斑马鱼的主干部分提取出来。 实验选用的是一组连续的1 0 幅图像。图3 1 、图3 2 、图3 3 是对其中一幅图片的处 理效果。如图所示，随着阈值的增加，噪声区域不断被删除，直到达到某一个临界数值 时，图像上只留下斑马鱼的主干区域部分。 3 1 1 周长法 3 1 1 1 理论基础 在二值图像f 中，相互连接的黑色像素的集合成为一个( 黑) 区域。在区域分类的 基础之上，通过对图像f 内每个像素进行分类操作，将物体的像素值改为类别号，再采 用3 4 2 节的轮廓提取方法，记录每一个类别的轮廓曲线。最后对所有区域类别的轮廓 曲线进行长度计数，输出区域周长最长的那个类别区域。 3 1 1 2 实现步骤 1 ) 遍历图像像素点，直到遇到第一个像素黑点为止；如果图像中已经没有像素点 可以继续遍历，那么转3 ) ； 2 ) 利用该黑点像素作为种子生长点，生长出一个局部区域，类别标号为i ，然后i 加l ，转1 ) ； 硕士论文 斑b 鱼肌间骨的自动提取 3 ) 对每一个类别区域做3 , 42 节的八邻域轮廓提取； 4 ) 输出所有类别中周长最大的那么区域的类别号，其他的类别区域置为白点 5 ) 输出原图中与类别号对应的区域，获得的图像则为我们需要的实验结果。 3 1 13 实验部分 图3 1 为长度阈值法下斑马鱼软体部分的提取过程。其中图a 、图b 、图c 、图d 依 次为不同阈值下图像上留下来的连通区域部分。直到阈值为2 5 0 0 的时候，斑马鱼的软 体部分被完全提取出来。 麓 ( a ) 阈值为1 0 乞 磊一r 7 ( b ) 闺值为1 0 0 ( c )阈值为i o o o( d ) 闽值为2 5 0 0 图3i 根据周长提取软体部分 3 1 2 面积法 3 12 1 理论基础 和分水岭算发一样，面积法也需要对原始图像进行区域归类。不过和周长法不同的 是，我们不需要对图像进行轮廓提取，只需要计算每个区域的像素点总数即可。像素点 最多的那个部分即为我们希望的最终结果。 3 斑日鱼较体提取与旋转向度确定 硕论史 3 l22 实现步骤 i ) 遍历图像像素点，直到遇到第一个像素黑点为止；如果图像中已经没有像素点 可以继续遍历，那么转3 ) ： 2 ) 利用该黑点像素作为种子生长点，生长出一个局部区域，类别标号为i ，然后j 加1 ，转1 ) ； 3 ) 输出所有类别中像素点最多的那个区域号码，其他的类别区域置为白点； 4 ) 根据获得的区域号，输出原图对应的区域。 3 l2 3 实验部分 图3 2 为面积闽值法下斑马鱼软体部分的提取过程。其中图a 、图b 、图c 、图d 依 次为不同阈值下图像上留下来的连通区域部分。直到阈值为i 0 0 0 0 的时候，斑马鱼的软 体部分被完全提取出来。 箩 ( a ) 阈值为1 0 、- f b l 阐值为1 0 0 ，广 ( c ) 阈值为1 0 0 0 q ) 阐值为1 0 0 0 0 图3 2 根据面积提取软体 3 1 3 提取处软体部分 无论是周长的方法，还是面积闽值方法，只要我们找到原始图像中对应的连通类别 碗上论文 日鱼肌目骨自自提取 就可以提取出对应的区域，其它像素点盖为白点。图3 3 给出了一幅斑马鱼的软体提取 过程。 广 ，矿 ( a ) 面积1 0 0 0 0( b ) 提取出斑马鱼的软体部分 圈3 3 斑马鱼软体提取 3 1 4 实验分析 3 。】节中，脑着周长阈值的增加，噪声区域不断被剔除。同样，312 节中，随着 面积闻值的增加，噪声也越来越少，直到最后留下斑马龟的主体部分。这说明无论是周 长法还是面积法，只要设定好闽值，算法都可【三【完整地提取出斑马鱼的主干部分。但是 周长法需要对图像进行八邻域轮廓提取运算，所以会在算法复杂度上有所增加。此外， 在实验的过程中，我们发现周长闽值的处理效果要比面积阈值的处理效果要差一些，这 是因为由于噪声的随机分布关系，即使面积很小的噪声区域也可以形成很长的外界轮 廓。在这方面，面积闽值的鲁棒性要好很多。 3 2 斑马鱼旋转角度的确定 因为斑马鱼的肌问骨和躯干边缘紧密联系在一起的，所以本文的基本思路就是首先 对斑马鱼进行直线提取，选取一个合适的旋转角度，然后通过投影的方法对斑马鱼进行 肌问骨的自动提取。 本节主要讨论了计算图像旋转角度的几种方法，虽然它们的表现形式和基本思想有 所不同，但是它们的目的都是一样，就是在一个区域内寻找撮能代表区域走势的直线， 然后利用这条直线解释图像需要旋转的基本角度。3 2l 介绍了h o u g h 变换下的直线检 查，322 利用最小二乘法获得旋转角度，323 则是巧妙地利用最大半径的概念寻找到 斑马鱼的旋转角度。324 节给出了三种方法的实验结果并对这三种方法进行了性能方 面的比较。 3 2 1h o u g h 变换检测直线 h o u g h 变换是h o u g h 在1 9 6 2 年的时候提出来的一种直线拟合方法。有关h o u g h 变 3 斑马鱼软体提取与旋转角度确定硕士论文 换的基本原理和步骤可以参考文献【4 3 】。对于数字图像来说，h o u